UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMONFACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGIAINGENIERIA QUIMICA

Aislamiento de microorganismos capaces de producir PHA (Polihidroxialcanoatos)

DOCENTE: DR. DANIEL GUZMAN DUCHENUNIVERSITARIO: NOVILLO CINTRA BRUNO ALEJANDROMATERIA: LABORATORIO DE INVESTIGACIONFECHA: 29/11/2013

COCHABAMBA-BOLIVIA

Contenido1.INTRODCCION32.ANTECEDENTES33.JUSTIFICACION44.OBJETIVOS44.1.Objetivo general44.2.Objetivos especficos45.MARCO TEORICO55.1.MICROORGANISMOS55.2.CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS55.2.1.Microorganismos Acelulares6I.-Virus:65.2.2.Microorganismos Celulares8I.Eucariontes8a)Protozoos8b)Hongos microscpicos10c)Algas Microscpicas10II.Procariotas11a)Bacterias115.3.Clasificaion de bacterias segn el medio hbitat15Termfilos15Psicrfilos16Alcalfilos16Halfilos16Otros grupos:175.4.AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS185.5.OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS195.6.PLASTICOS BIODEGRADABLES205.7.TEST DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO226.MATERIALES Y REACTIVOS297.METOLOGIA319.RESULTADOS3910.CONCLUSIONES4711.RECOMENDACIONES4812.BIBLIOGRAFIA49

1. INTRODCCIONLos polihidroxialcanoatos (PHA) son polisteres intracelulares sintetizados por diferentes especies bacterianas. Las caractersticas fsicas de los PHA como la densidad, punto de fusin, fuerza de tensin y elongacin son similares a los plsticos derivados del petrleo, pero, a diferencia de stos, los PHA se degradan completamente hasta CO2 y H2O.El costo de produccin de los PHA es superior al del polipropileno. Por esta razn, en los ltimos aos han surgido varias alternativas para mejorar la produccin de estos biopolmeros, entre las cuales se destacan: la utilizacin de microorganismos recombinantes, la polimerizacin in vitro catalizada por PHA polimerasa, y el uso de ingeniera gentica para la sntesis de PHA en plantas.12. ANTECEDENTESLos plsticos de origen petroqumico son ampliamente utilizados debido a du fcil modelamiento y alta resistencia qumica, pero son un problema ambiental, debido a su alto peso y conformacin molecular, la accin de los microorganismos en los procesos degradadores es mnima, por lo cual permanecen en el ambiente durante amplios periodos de tiempoLas medidas que se han adoptado para solucionar el problema engloba desde el reciclaje hasta la incineracin de las mismas, las cuales no son soluciones muy viables debido a los procesos son costosos, no abarcan todos los desechos y generan emanaciones gaseosas nocivas para el ambiente, las cuales en los ltimos aos estn siendo ms restringidas por las nuevas legislaciones ambientales.La sobre poblacin humana, combinado con el actual estilo de vida exige el uso racional, eficiente y auto sostenible de fuentes naturales para producir sustancias amigables para el medio ambiente como los polihidroxialcanoatos (PHA).2

El primer hidroxialcanoato en ser estudiado fue el poli 3 hidroxibutirato (PHB), el cual fue descubierto por lemoigue en 1926 (lemoigne, 1926). En 1994 se identifico el cido 3-hidroxi-2-butenoico producido por la bacteria del genero Nocardia. En 1972, a partir de estudios en aguas residuales, se confirm la presencia de otras sustancias como los cidos 3-hidroxivalerico (3HV), 3-hidrocihexanoico (3HHx) y 3_hidrociheptanoico (3HHep) mediante la extraccin con cloroformo. En 1976, la empresa inglesa Imperial Chemical Industries (ICI) empez estudios para producir1Universidad nacional de Colombia, 2008, articulo, bacterias productoras de polihidroxicalcanoatos (PHA) como una alternativa para la remocin de carga organica de aguas residuales2Sao Paulo-Brasil, Noviembre 2008, Efecto del gen FafH1 en la produccion de PHA conteniendo monmeros insaturados por Pseudomonas Putida, Diego Armando Castello Franco polihidrocibutirato (PHB) a partir de Ralstonia eutropha, depositando en 1981, una patente para la produccin del copolimero P(3HB-co-3HV). Este copolimero es conocido como BIOPOL y es obtenido a partir de glucosa y acido propionico. Cargill dow polymers comercializa sus resinas EcoPla in Japn. Algunas de las marcas que estn en el mercado actualmente son NODASTM (Copolimero de hidroxibutirato e hidroxihexanoato).33. JUSTIFICACIONEl centro de biotecnologa (CBT) de la Universidad Mayor de San Simn se encuentra trabajando desde hace ms de 10 aos con microorganismos extremofilos con el fin de investigar las posibles aplicaciones de estos microorganismos y a su vez difundir diferentes tcnicas biotecnolgicas para la transformacin de recursos naturales de inters en la regin. Entre estos microorganismos extremofilos el CBT viene trabajando especialmente con microorganismos halfilos como ser la cepa Halomonas boliviensis la cual produce grandes cantidades de plsticos biodegradables, polihidroxibutirato (PHB). Es por este motivo que se debe estudiar e identificar nuevos microorganismos halfilos para analizar sus posibles aplicaciones biotecnolgicas.La aplicacin de la difusin de las tecnologas desarrolladas en el centro estn orientadas a mejorar las condiciones de nutricin, salud y proteccin ambiental; por lo tanto su explotacin deriva en nuevas y ms eficientes formas de prevenir y combatir enfermedades, en la optimizacin de procesos industriales, el desarrollo de nuevos productos farmacuticos y el desarrollo de nuevas fuentes de energa

4. OBJETIVOS4.1. Objetivo general

Aislar microorganismos halfilos de lagunas salinas en la regin Sud Lipez (Potos) para analizar posteriormente su capacidad de produccin de polihidroxialcanoatos (PHAs)

4.2. Objetivos especficos

1. Aislar bacterias halfilas de muestras liquidas de lagunas salinas localizadas en Potos2. Obtener cepas puros de las muestras con las que se trabaje 3. Estudiar la capacidad de produccin de plsticos biodegradables (polihidroxibutirato PHB) de las colonias separada3Sao Paulo-Brasil, Noviembre 2008, Efecto del gen FafH1 en la produccion de PHA conteniendo monmeros insaturados por Pseudomonas Putida, Diego Armando Castello Franco

5. MARCO TEORICO5.1. MICROORGANISMOSUn microorganismo, tambin llamado microbio, es un ser vivo que solo puede visualizarse con el microscopio. La ciencia que estudia los microorganismos es la microbiologa. Son organismos dotados de individualidad que presentan, a diferencia de las plantas y los animales, una organizacin biolgica elemental. En su mayora son unicelulares, aunque en algunos casos se trate de organismos centicos compuestos por clulas multinucleadas, o inclusomulticelulares.El concepto de microorganismo carece de cualquier implicacin taxonmica o filogentica dado que engloba organismos unicelulares no relacionados entre s, tanto procariotas como las bacterias, como eucariotas como los protozoos, una parte de las algas y los hongos, e incluso entidades biolgicas de tamao ultramicroscpico, como los virus. Estos ltimos generalmente no son considerados seres vivos y por lo tanto no son microorganismos en sentido estricto; no obstante, tambin estn incluidos en el campo de estudio de la microbiologa.Muchos microorganismos son patgenos y causan enfermedades a personas, animales y plantas, algunas de las cuales han sido un azote para la humanidad desde tiempos inmemoriales. No obstante, la inmensa mayora de los microbios no son en absoluto perjudiciales y bastantes juegan un papel clave en la biosfera al descomponer la materia orgnica, mineralizarla y hacerla de nuevo asequible a los productores, cerrando el ciclo de la materia.45.2. CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOSLos microorganismos los podemos clasificar segn su organizacin en acelulares y celulares. En el primer grupo se encontraran los virus, priones y viroides, mientras que en el segundo grupo nos encontraramos con otros dos subgrupos: los procariotas, donde estaran las bacterias y los eucariotas donde estaran los protozoos, las algas microscpicas y los hongos microscpicos. En el siguiente cuadro, podemos observar los diferentes tipos de microorganismos, y el reino al que pertenecen, despus hablaremos detenidamente de cada uno de ellos:4http://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismo

Tabla # 5.1 Clasificacin De Microorganismos

Fuente: https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-los-microorganismos5.2.1. Microorganismos AcelularesI.- Virus:Los virus son entidades no celulares de muy pequeo tamao. Son agentes infectivos de naturaleza obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su incorporacin al protoplasma vivo para que su material gentico sea replicado, y que pueden transmitirse de una clula a otra. Cada tipo de virus consta de una sola clase de cido nucleico (ADN o ARN, nunca ambos), con capacidad para codificar varias protenas, algunas de las cuales pueden tener funciones enzimticas, mientras que otras son estructurales, disponindose stas en cada partcula virsica (virin) alrededor del material gentico formando una estructura regular (cpsida)Estructura:Los virus presentan una amplia diversidad de formas y tamaos. Una partcula vrica completa, conocida como virin, consiste en un cido nucleico rodeado por una capa de proteccin proteica llamada cpside.-cido nucleico:contiene la informacin especfica y el potencial para modificar operaciones en la clula infectada. Los virus pueden tener distintos tipos de cidos nucleicos y las molculas de stos pueden presentar diversas formas. As pueden contener ADN o ARN. Pueden estar formados por una sola cadena, siendo entonces monocatenarios, o por dos, bicatenarios. Las molculas de cido nucleico pueden ser circulares o lineales. Algunos virus presentan el genoma fragmentado como ocurre con el virus de la gripe que posee ocho fragmentos de ARN monocatenario.-Cpside: es la estructura proteica que rodea al cido nucleico. El conjunto formado por el cido nucleico y la cpsida recibe el nombre de nucleocpsida vrica. En algunos virus la cpsida est formada por un solo tipo de protenas, pero en la mayora est formada por la asociacin de varias cadenas polipeptdicas distintas. Las cadenas polipeptdicas se asocian y dan lugar a las unidades morfolgicas de la cpsida, los capsmeros. La forma de los virus viene determinada por la forma de unin de los capsmeros. Figura # 5.1 Estructura de un virus complejo y un virus con envoltura

Fuente: https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-los-microorganismosEn general, estas son las principales morfologas vricas:-Helicoidal:es la organizacin ms sencilla, formados por un nico tipo de protenas, se disponen en torno al cido nucleico y dan lugar a estructura cilndrica. Esta formacin produce viriones en forma de barra o de hilo, pueden ser cortos y muy rgidos, o largos y muy flexibles.- Polidricos:los ms simples de este tipo son los icosadricos, que poseen 20 caras, cada una de las cuales es un tringulo equiltero formado por la unin de tres protenas distintas. Cuanto mayor sea el nmero de caras, ms esfrico parece el virus.-Complejas o mixtas:combinan las estructuras helicoidal y polidrica A la porcin polidrica, se le llama cabeza, en cuyo interior se encuentra el cido nucleico, y la porcin helicoidal constituye la cola. Algunos virus poseen una placa basal y, adems, espculas y fibras que le ayudan a unirse a la clula que van a infectar.-Envoltura membranosa:algunos virus poseen por fuera de la cpside una membranosa, que es un fragmento de la clula en la que se reprodujo. Esta membrana est constituida por una bicapa lipdica que procede de la clula hospedadora y por protenas insertadas en la bicapa codificadas por el genoma vrico.La cubierta o envoltura vrica est implicada en el reconocimiento entre la partcula vrica y su clula hospedadora, por lo que los virus dependen de ella para poder infectar. Los virus que poseen cubierta se llaman virus envueltos, y los que carecen de ella, virus desnudos.5.2.2. Microorganismos CelularesI. EucariontesSe denomina eucariotas a todas las clulas que tienen su material hereditario (su informacin gentica) encerrado dentro de una doble membrana, la envoltura nuclear, que delimita un ncleo celular.Hay tres tipos de microorganismos eucariotas, los protozoos (hetertrofos y sin pared celular), las algas microscpicas (auttrofos y con pared celular de celulosa) y los hongos microscpicos (hetertrofos y con pared celular de quitina).a) ProtozoosLos protozoos son microorganismos eucariotas, unicelulares, hetertrofos, sin pared celular. La mayora son de vida libre en medios acuticos o hmedos, aunque algunos se han adaptado al parasitismo en animales y vegetales produciendo enfermedades, o simbiosis con ellos.Se reproducen asexualmente por biparticin y sexualmente, normalmente por conjugacin.La respiracin en algunos protozoos es aerobia y en otros anaerobia. En la primera toman el oxgeno de su medio ambiente y expulsan el dixido de carbono a travs de la membrana celular. En la segunda necesitan metabolizar ciertas sustancias de las cuales obtienen el oxgeno.Estructura:En los protozoos se distingue una forma activa que se conoce en la mayora de ellos con el nombre de forma vegetativa o trofozoito. En muchos casos, el trofozoito tiene la capacidad de transformarse en una forma de resistencia, conocida como quiste.El componente fundamental del cuerpo del protozoo es el protoplasma, el cual est diferenciado en ncleo y citoplasma.Ncleo: los ncleos de los protozoos tienen formas, tamaos y estructuras variadas. La mayora de los protozoos contienen un solo ncleo, pero hay muchos que tienen dos o ms ncleos. El ncleo aparece como una vescula constituida por una membrana perfectamente definida que envuelve el nucleoplasma en el que se encuentran el o los nucleolos y la cromatina nuclear. Estructuralmente, los ncleos pueden clasificarse en dos tipos principales: vesicular (en el que casi siempre se pueden observar uno o varios nucleolos que destacan sobre el resto del material cromatnico) y compacto (en el que el material cromtico aparece de un tamao uniforme, llenando casi todo el ncleo, por lo que ste toma un aspecto denso y compacto).Citoplasma: La parte extra nuclear del cuerpo del protozoo es el citoplasma.Est compuesto de un sistema coloidal que a menudo est formado por una parte perifrica, densa, denominada ectoplasma, y otra parte medular fluida llamada endoplasma. En el citoplasma se encuentran distintos orgnulos como mitocondrias, aparato de Golgi, vacuolas (pulstiles o digestivas), retculo endoplasmtico, etc. que participan en las distintas funciones inherentes a la vida del protozoo. La superficie del cuerpo esta cubierta por una membrana cuya estructura se corresponde, en principio, con la membrana unidad de cualquier clula. Este sera el caso de la plasma-membrana o plasmalema de muchos protozoos (amebas y algunos flagelados). En otros protozoos, como en los ciliados, la membrana limitante del cuerpo presenta una estructura mas complicada y recibe el nombre de pelcula. Figura # 5.2 Estructura de un protozoo

Fuente: https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-los-microorganismos

b) Hongos microscpicosLos hongos son microorganismos eucariotas unicelulares o pluricelulares carentes de pigmentos fotosintticos, por lo que no pueden realizar la fotosntesis, tienen por lo tanto una nutricin hetertrofa mediante la absorcin de alimento orgnico muerto (nutricin saproftica) previamente digerido en el exterior de las clulas gracias a la secrecin de potentes enzimas.La mayora de los hongos viven en ambientes terrestres, bien en el suelo o sobre materia vegetal muerta, a cuya descomposicin contribuyen. Muchos hongos son parsitos de plantas y animales.Los hongos pluricelulares forman esporas que al desprenderse y germinar producen filamentos microscpicos denominados hifas, cuyas clulas pueden estar completamente separadas (hifas septadas) o bien incompletamente o bien incompletamente (sinfonadas). El conjunto de las hifas de un hongo se denomina micelio. Muchas esporas se forman despus de la reproduccin sexual mediante la fusin de gametangios, como las oosporas de los oomicetes y las zigosporas de los zigomicetes, o bien dentro de esporangios como las ascas (ascosporas) y los basidios (basidiosporas).c) Algas MicroscpicasFigura # 5.3 Algas Microscopicas

Fuente: https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-los-microorganismosSon organismos auttrofos de organizacin sencilla, que hacen la fotosntesis productora de oxgeno. Pertenecen al reino Protista. Forman un grupo muy heterogneo pues se encuentran especies unicelulares, pluricelulares microscpicas o macroscpicas, e incluso especies de gran talla (hasta mas de 20 metros) que por su forma semejan plantas superiores al disponer de falsas races, tallos y hojas. Las algas viven perfectamente en medios acuticos. Siendo de gran importancia las de origen marino (fitoplancton), pues constituyen el primer eslabn de la cadena alimentaria marina. Otras viven en aguas dulces, termales, en el fango o incluso sobre la corteza de los hongos.Las algas contienen cloroplastos donde se encuentran los pigmentos fotosintticos, entre los que hay varios tipos de clorofilas, xantofilas y carotenoides. La pared celular suele ser de celulosa, como en las plantas superiores, pero a veces se les aaden otras molculas como pectina, xilanos y mananos. En ocasiones, a los componentes de la pared celular se les aaden sustancias minerales como el carbonato clcico o slice, que endurecen la cubierta de la clula. Hay tambin algunas algas unicelulares que carecen de pared celular. Como mecanismos de locomocin tienen los flagelos y el movimiento deslizante.La clasificacin de los diferentes grupos de algas tiene en cuenta, entre otros caracteres, los pigmentos fotosintticos presentes, los materiales de reserva del citoplasma y la composicin de la pared celular. II. ProcariotasSe llama procariotas a las clulas sin ncleo celular diferenciado, es decir, cuyo material gentico se encuentra disperso en el citoplasma, reunido en una zona denominada Nucleoide.a) BacteriasAnatoma de una bacteria sencillaUna bacteria simplificada est formada por tres capas externas que envuelven las estructuras internas; la capa pegajosa protege la pared celular rgida, que a su vez cubre la membrana celular semipermeable. El flagelo es un medio de locomocin y los pelos que se extienden por fuera de la cpsula ayudan a la bacteria a sujetarse a las superficies. El material gentico est contenido en el ADN que forma el nucleoide. Los ribosomas que flotan en el citoplasma intervienen en la sntesis de protenas.El material gentico de la clula bacteriana est formado por una hebra doble de ADN circular (vase cidos nucleicos). Muchas bacterias poseen tambin pequeas molculas de ADN circulares llamados plsmidos, que llevan informacin gentica, pero, la mayora de las veces, no resultan esenciales en la reproduccin. Muchos de estos plsmidos pueden transferirse de una bacteria a otra mediante un mecanismo de intercambio gentico denominado conjugacin. Otros mecanismos por los cuales la bacteria puede intercambiar informacin gentica son la transduccin, en la que se transfiere ADN por virus bacterianos (vase Bacterifago), y la transformacin, en la que el ADN pasa al interior de la clula bacteriana directamente desde el medio.Las clulas bacterianas se dividen por fisin; el material gentico se duplica y la bacteria se alarga, se estrecha por la mitad y tiene lugar la divisin completa formndose dos clulas hijas idnticas a la clula madre. As, al igual que ocurre en los organismos superiores, una especie de bacteria origina al reproducirse slo clulas de la misma especie. Algunas bacterias se dividen cada cierto tiempo (entre 20 y 40 minutos). En condiciones favorables, si se dividen una vez cada 30 minutos, transcurridas 15 horas, una sola clula habr dado lugar a unos mil millones de descendientes. Estas agrupaciones, llamadas colonias, son observables a simple vista. En condiciones adversas, algunas bacterias pueden formar esporas, que son formas en estado latente de la clula que permiten a sta resistir las condiciones extremas de temperatura y humedad.Clasificacin:La clasificacin taxonmica ms utilizada divide a las bacterias en cuatro grandes grupos segn las caractersticas de la pared celular. La divisin Gracilicutes incluye a las bacterias con pared celular delgada del tipo Gram negativas; las bacterias de la divisin Firmicutes tienen paredes celulares gruesas del tipo Gram positivas; las de la Tenericutes carecen de pared celular y las de la cuarta divisin Mendosicutes tienen paredes celulares poco comunes, formadas por materiales distintos a los tpicos peptidoglucanos bacterianos. Entre las Mendosicutes se encuentran las Arquebacterias, un grupo de organismos poco comunes, que incluyen a las bacterias metanognicas, anaerobias estrictas, que producen metano a partir de dixido de carbono e hidrgeno; las halobacterias, que necesitan para su crecimiento concentraciones elevadas de sal, y las termoacidfilas, que necesitan azufre y son muy termfilas. Se ha discutido sobre la conveniencia de que las Arquebacterias se incluyeran en un reino aparte, ya que estudios bioqumicos recientes han mostrado que son tan diferentes de las otras bacterias como de los organismos eucariotas (con ncleo diferenciado englobado en una membrana). Estos cuatro grandes grupos de bacterias se subdividen adems en unas 30 secciones numeradas, alguna de las cuales se dividen a su vez en rdenes, familias y gneros.Las bacterias son organismos relativamente sencillos. Las principales partes en las que se divide una bacteria son:Figura # 5.4 Estructura de una bacteria

https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-los-microorganismos-Cpsula:Capa gelatinosa de naturaleza glucoproteica, rodea por la parte externa a algunas bacterias. Es una proteccin contra la accin de los anticuerpos y la fagocitosis y evita la prdida de humedad. Las bacterias con cpsula son ms virulentas (patgena).-Pared celular:Es una envoltura rgida y fuerte que da forma a las clulas bacterianas. Evita los posibles daos que producen cambios de presin osmtica. Existen dos tipos:-La Gram positiva:son ms gruesas y esta compuesta por una capa de glucopeptidos.-La Gram negativa:compuesta por dos capas, una de glucopeptidos rodeada de una bicapa fosfolipdica, lipoprotenas y glucolipdica. Son ms resistentes a los antibioticos.

Figura # 5.5 Diferencia entre Gram positivas e Gram negativas.

Fuente: https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-los-microorganismos -Membrana plasmtica: Es una envoltura que rodea al citoplasma bacteriano. Su estructura y composicin es similar a la membrana de eucariotas. Controla el intercambio de sustancias con el medio y presenta ciertas evaginaciones, llamadas mesosomas (Prolongaciones internas de la membrana plasmtica que contienen enzimas respiratorios y colaboran en el proceso de la divisin celular).-Citoplasma:Medio celular limitado por las membranas, muy semejante al de la clula eucariota. En el se realizan la mayora de las reacciones metablicas de la bacteria.-Ribosomas:Son orgnulos globulares encargados de sintetizar protenas a partir de la informacin gentica que les llega del ADN.-Cromosoma (nucleoide): es una regin irregular que contiene una molcula de ADN circular y doble no asociado a histonas. Contiene la informacin gentica.Suele haber un cromosoma accesorio, llamado plasmido o episoma, que contiene la informacin necesaria para la formacin de pilis, la resistencia a antibiticos, la degradacin de sustancias naturales,-Pilis (Pelos): Filamentos protenicos derivados de la pared que funcionan como estructuras de fijacin. Algunos estn huecos y permiten el intercambio de material gentico en el mecanismo parasexual.-Flagelos:Son prolongaciones cuya longitud es varias veces la de la bacteria. Aparecen en nmero entre 1 y 100 Intervienen en el desplazamiento y su estructura no es homloga a la de los flagelos de eucariotas.55https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-los-microorganismos5.3. Clasificaion de bacterias segn el medio hbitat

Microorganismos ExtremofilosLa palabra extremfilo proviene del griego filo, que significa afecto o amor. Es decir, el significado de extremfilo es "amante" de las condiciones extremas.Estas condiciones extremas, fuera de las comnmente llamadas normales, podramos resumirlas en:1. Temperaturas muy elevadas (44 121 C) o bajas (-2, 20C)2. Alta salinidad (NaCl 2-5M)3. Alta alcalinidad (pH arriba de 8) y/o alta acidez (pH menor de 4)Existen varias clases de extremfilos y se clasifican atendiendo al ambiente en el que viven.Figura # 5.6 Clasificacin de microorganismos extremofilos

TermfilosEstos organismos tienen un crecimiento ptimo en temperaturas situadas entre los 70-80C. Sus hbitats comunes son las fuentes termales volcnicas terrestres, termales submarinas, etc. La adaptacin de estos organismos es debido a la alta estabilidad trmica de sus enzimas.

Ejemplos:

1. Bacterias Thermus acuaticus: crecen a T mayores de 70C2. Sulfolobus acidocaldarius: crece a partir de 85C3. Pyrolobus fumarii: temperatura ptima de crecimiento es de 105C.

PsicrfilosEstos organismos presentan un desarrollo ptimo a bajas temperaturas. (Desde los 20C hasta los -5C). Las protenas poseen unas caractersticas que hacen que pierdan su rigidez y ganen flexibilidad en su estructura para la realizacin de sus funciones catalticas en las condiciones de bajas temperaturas. Las membranas contienen mayor proporcin de cidos grasos no saturados, permitiendo as que su fluidez y capacidad de transporte se mantenga bajo condiciones muy fras.

Ejemplos:

- Bacterias gram negativas: Moraxella, Psychrobacter, Polaribacter, Moritella, Vibrio y Pseudomonas.- Bacterias gran positivas: Arthrobacter, Bacillus y Micrococcus.- Arqueas: Methanogenium, Methanococcoides y Halorubrum.- Hongos y levaduras: Penicillium, Cladosporium, Cndida y CryptococcusAlcalfilosSon organismos que viven en ambientes con pH por encima de 9. Sus hbitats son muy bsicos, como lagos sdicos y suelos muy carbonatados. Estos organismos necesitan aislar el interior de la clula del medio alcalino exterior, ya que algunas molculas especialmente las hechas de ARN se rompen a pH superior a 8.

Ejemplos:

Bacterias aerbicas no marinas, muchas especies de Bacillus Spirulina (cianobacterias) Arqueas. Algunos alcalofilos son tambin halfilos, la mayor parte de estos pertenecen al dominio Archaea.HalfilosSe refiere a los organismos que habitan en medios con presencia abundante de sales. Sus hbitats son zonas litorales, salinas y lagunas salobres. En organismos normales, la sal hace que mueran por deshidratacin debido a la smosis. Si el entorno es salino, con mucha concentracin de sales, el agua del interior de las clulas tiende a salir hacia su exterior. Es decir, se desecan y mueren. Uno de los mecanismos que han desarrollado, es el de albergar en el interior de sus tejidos, concentraciones de un soluto compatible a las sales (como cido polihidroxibutrico o PHB) mayores que en el exterior. As el agua penetra por smosis. La mayora de estos halfilos pertenecen al dominio Archaea.

Ejemplos: Gnero Halobacterium, que viven en entornos como el Mar Muerto, como la Haloarcula marismortui.

Acidfilos

Organismos que viven en medios con pH menor de 5. Para soportar el bajo pH, estos organismos emplean una gama de mecanismos, como una superficie de membrana cargada positivamente, una alta capacidad reguladora interna y sistemas nicos de transporte.

Ejemplos:

Ferroplasma acidarmanus, crece en ambientes de pH cercano a cero. Cyanidyum caldariuym, es capaz de vivir en pH cercano a cero manteniendo el interior de la clula en un nivel casi neutro. Acontium cylatium, Cephalosporium sp y Trichosporon cerebriae (eucariotas del reino fung).Otros grupos: 1. Anhidrobiticos o xerfilos: Viven en ausencia de agua o son capaces de resistir la desecacin viviendo con muy poca. Ejemplo: Selaginella lepidophylla

2. Barfilo o Piezfilo: Se desarrollan en ambientes con presin muy alta (lechos ocenicos profundos de hasta once mil metros de profundidad: fosa de las Marianas)

3. Criptoendolitos: Organismo de suelos profundos. Viven a muchos metros bajo el suelo, incluso en medio de rocas; el Bacillus infernus fue aislado a 2700 metros bajo la superficie del suelo; el Desulforudis audaxviator fue encontrado entre 1500 y 2800 metros de profundidad, en el suelo de una

mina de oro (Cuenca de Witwatersand, Sudfrica) donde soporta una temperatura de sesenta grados centgrados y un pH de 9,33.

4. Metalotolerantes: Organismos que sufren altas concentraciones de metal en su entorno (cobre, cadmio, arsnico, zinc). Por ejemplo, el Ferroplasma y el Cupriavidus metallidurans, que tolera el arsnico.

5. Radifilo: Soportan gran cantidad de radiacin, como la bacteria Deinococcus radiodurans, el Thermococcus gammatolerans, o unos microbios recogidos en los acantilados de Devon, Inglaterra, que consiguieron sobrevivir casi 600 das expuestos a los rayos csmicos y sin oxgeno.

6. Poliextremfilos: Acumulan resistencias diversas a varios ambientes hostiles: Deinococcus radiodurans, Kineococcus radiotolerans, el Thermococcus gammatolerans o el Sulfolobus acidocaldarius)

7. Los tardgrados: Se deshidratan para quedar como muertos durante cientos de aos en condiciones de criptobiosis y pueden resistir en el espacio.65.4. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOSFigura # 5.7 Crecimiento De Microorganismos En Una Caja Petri

Fuente: http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/aislamiento/_img/_introduccion/image002/!6http://www.astrofisicayfisica.com/2013/05/clasificacion-de-los-extremofilos-curso.htmlEs la separacin de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por estra sobre un medio de cultivo slido adecuado dispuesta en una placa de Petri como se puede observar en la figura # 5.7.Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las clulas bacterianas. Tras la incubacin en condiciones adecuadas, cada clula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas caractersticas determinadas en cuanto a su forma, borde, elevacin, tamao , consistencia, etc.. Los tipos de bacterias presentes en la muestra original es visible como tipos diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor nmero de estras posible. En las primeras estras aparecern colonias confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estras finales debern aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido inculo de partida. La sucesiva disminucin del tamao de la poblacin sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de cultivo, debe asegurar que finalmente algunas clulas queden suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie. Criterios para la diferenciacin de colonias El aspecto de las colonias, su coloracin, tamao, etc. permiten diferenciar diferentes bacterias, aunque son propiedades generales muy influenciadas por las condiciones de cultivo, por lo que a continuacin se realiza una descripcin muy general. Las colonias pueden ser opacas, translucidas o transparentes. Algunas producen pigmentos fluorescentes cuando se iluminan con luz ultravioleta. Otras aparecen con superficie pulverulenta, otras son lisas, o rugosas, o poseen anillos concntricos. En ocasiones el olor es tambin caracterstico. 5.5. OBTENCIN DE CULTIVOS PUROSSe trata de obtener el cultivo de un solo tipo microbiano en un medio de cultivo, por ejemplo en un tubo inclinado de agar nutritivo. Para ello, se obtiene una pequea cantidad de masa bacteriana de una colonia separada en el aislamiento. Con ella se inocula un nuevo medio de cultivo haciendo estras muy juntas. La

Incubacin en condiciones adecuadas proporcionar un cultivo puro. Puede repetirse el proceso con cada tipo de colonia. Se obtendr una coleccin de cultivos puros, separados, de los microorganismos que coexistan en la muestra original. Es aconsejable hacer un segundo aislamiento antes de proceder a la obtencin del cultivo puro. Si todas las colonias de la segunda placa resultan idnticas, puede usarse una de ellas para establecer el cultivo puro. Obtenido el cultivo puro es conveniente comprobar su pureza mediante una tincin de Gram. Los cultivos puros de microorganismos son mantenidos en el laboratorio por resiembras (pase de un medio de cultivo a otro) sucesivas. Una de las copias puede ser liofilizada para su conservacin.7 5.6. PLASTICOS BIODEGRADABLESEl plstico biodegradable est fabricado con materias primas orgnicas que proceden de fuentes renovables, como la fcula de patata , que al final de su vida til, al ser eliminado como residuo orgnico, este se descompone en un corto perodo de tiempo, en presencia de microorganismos; sirviendo de abono orgnico para las plantas.

La norma europea UNE 13432 especifica los requisitos y procedimientos para determinar la biodegradabilidad y compostabilidad de este material en un mximo de seis meses sin ecotoxicidad del humus. Es importante tener en cuenta que no todos los plsticos biodegradables son compostables y viceversa, nicamente los que cumplan la normativa UNE 13432 cumplen estas especificaciones.8

5.6.1. Clasificacin de los Plsticos Biodegradables:1. Polmeros qumicamente sintetizados: son susceptibles a la accin de microorganismos y no pueden ser usados con fines comerciales debido a su alta tasa de biodegradabilidad Ejm: cido poliglicolicol, alcohol polivinilico, etc2. Pastico biodegradables a base de almidn: en este tipo de plstico, el almidn acta como complemento y la vez sirve como relleno y agente adherente para crear una mezcla entre pastico y almidn (almidn polietileno). Las bacterias del suelo degradan el almidn y tambin alteran la matriz del plstico, aumentando la biodegradabilidad pero generando nuevos compuestos recalcitrantes que quedaran en el ambiente durante largos periodos de tiempo3. Polihidroxialcanoatos son los nicos polmero 100% biodegradables7Universidad de Granada, 2006, artculo cientfico, Tcnicas de cultivo. Aislamiento. Obtencin de cultivos puros8 http://es.wikipedia.org/wiki/Pl%C3%A1stico_biodegradable5.6.2. PolihidroxialcanoatosPolihidroxialcanoatos (PHAs) son una familia de polisteres compuestos principalmente de cidos hidroxialcanoicos acumulados en forma de granulos intracelulares acumulados en forma de grnulos, que pueden representar hasta el 80% de la masa celular figura # 5.2. Los cuales sirven como fuente de carbono y enegia y equivalentes reductores. Son producidas bajo condiciones desbalanceadas de cultivo, decir con exceso en la fuente carbono y limitacin en los elementos esenciales (Nitrgeno N, Azufre S, Oxigeno O, Fosforo P, Magnesio Mg)

Figura # 5.8. Microfotografia electrnica de Pseudomonas putida con grnulos de PHA (luengo et al. 2003)La acumulacin de este polmero se puede considerar una estrategia desarrollada por las bacterias para su supervivencia en ambientes cambiantes. Ademas de servirle a la clula como fuente de carbono, los PHA tambin sirven como fuente de energa para el proceso de enquistamiento (Azetobacter sp.) y esporulacin (bacillus sp.), para la fabricacin la proteccin de complejo nitrogenasa en las bacterias fijadorasd de nitrgeno, ya que el PHA actua como compuesto oxidable y tambin es constituyente de la membrana citoplasmtica de bacterias.9

9Sao Paulo-Brasil, Noviembre 2008, Efecto del gen FafH1 en la produccion de PHA conteniendo monmeros insaturados por Pseudomonas Putida, Diego Armando Castello Franco5.7. TEST DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO

El Biolog GN2 (gram negativas) de microplacas est diseado para la identificacin y caracterizacin de muy amplia gama de bacterias gram negativas aerobias. Microplacas y base de datos de Biolog se introdujeron por primera vez en 1989, que emplea un novedoso patentado qumica redox . Esta qumica, basado en la reduccin de tetra sodio, responde al proceso de metabolismo en lugar de a metablica por productos. La qumica de Biolog funciona como un reportero universal de metabolismo y simplifica el proceso de prueba como productos qumicos de revelado de color no necesitan ser aadido. Desde el GN2 de microplacas no depende de crecimiento para producir identificaciones que proporciona la capacidad de superior para todos los tipos de organismos gram negativos; fermentadores, los no fermentadores y organismos fastidiosos todos se identifican con un solo panel de la base de datos para la microplaca GN2 es ahora ms de 500 especies es , con mucho, la base de datos de identificacin basada en kit ms grande disponible .

5.7.1. GN2 MICROPLACAS

La biologa GN2 microplacas realizar 95 pruebas discreto al mismo tiempo y da un patrn de reacciones caracterstico llamado una huella dactilar metablica. Estos patrones de reaccin de huellas digitales proporcionan una gran cantidad de informacin contenida convenientemente en una sola biologa de microplacas. Los patrones de huellas dactilares metablicas se comparan un especimen identificado con el software de base de datos Microlog . Otros mtodos de identificacin por medio de kits aerbicos se basan en un nmero mucho menor o prueba. En consecuencia, la limitacin significativa de estos productos es el nmero limitado de especies y tipos de organismos que se pueden identificar. Adems, estos productos fueron diseados para abordar las necesidades de la prueba clnica / hospital de rutina. La biologa GN2 microplacas fue diseado para atender las necesidades de ms amplio rango para los usuarios, incluyendo los laboratorios de pruebas ambientales y de los animales y los laboratorios de enfermedades de las plantas , as como laboratorios de referencia clnica .Hay aproximadamente 4.000 especies de bacterias nombradas y esto es slo una fraccin del nmero total de especies en el medio ambiente. El Sistema MicroLog ofrece la caracterstica nica de las bases de datos definidas por el usuario personalizados. Si un organismo se encuentra fuera de la base de datos MicroLog , el usuario puede guardar el patrn a una base de datos personalizada para referencias futuras. Si el organismo se asla de nuevo, el laboratorio tendr el patrn guardado en lugar de simplemente obtener una " sin identificacin. Algunos otros mtodos proporcionan suplementarios pruebas fuera de lnea para su uso junto con el panel de identificacin. Este enfoque es inconveniente y no produce una biblioteca patrn expandido. Una identificacin de la microplaca Biolog GN2 es superior a mtodos menos precisos debido a que:1. El Sistema MicroLog basa su identificacin en aMayor nmero de pruebas . Hay ms de 4 x 1.028 patrones posibles de una sola microplaca2. El Sistema MicroLog cubre muchas ms especies3. mtodos o de edad avanzada se han desarrollado para detectar patgenos clnicos de rutina , y no se identifican adecuadamente otros organismos importantes, tales como: . spp Acinetobacter , Aeromonas spp , Bordetella spp , Haemophilus spp , Pseudomonas spp , Vibrio spp y Yersinia spp

Varios mtodos tienen diferentes nmeros y tipos de organismos dentro de su base de datos. La Tabla 5.2 , compara varios mtodos por medio de kits populares. El Biolog GN2 microplaca tiene nmero mucho mayor de pruebas , que proporciona una mayor discriminacin de huellas digitales y una base de datos mayor .fabricanteNmero de especies aerobias en la base de datosNmero de pruebas usado para la deteccin

Biolog , Inc Microlog50195

BioMerieux Vick GNI +10429

API BIoreieux 20 y NFT18020

BBL Crystal10528

Tabla 5.2. Comparacin de la prueba Commercial Kits para Gramnegativos

Para ms de un nmero limitado de pruebas utilizadas para identificar un desconocido, algunos mtodos se basan principalmente en la fermentacin de azcares. Este enfoque no proporciona la necesaria medio ambiente para cada organismo de inters. Muchas bacterias no pueden utilizar azcares a travs de un proceso fermentativo y reaccionar dbilmente o nada en absoluto con estos mtodos. El nmero ms grande y ms diversa gama de pruebas en el GN2 microplaca proporcionar para mayor exactitud y precisin.El GN2 microplaca ha demostrado una precisin comparable a los mtodos moleculares y sin el gasto. Tabla 3, proporciona resultados representativos de un estudio independiente con no rutinaria aislados en comparacin con un mtodo molecular:10

porcentaje de respuestas correctas a nivel de especieBIOLOG INC MicrologMetodo molecular

fermantadores80%72%

no fermentadores88%100%

global85%89%

Tabla 5.3: Tcnicas de Comparacin de la fenotpica y genotpica10Comparison of Phenotypic and Genotypic Techniques of Identification of Unusual Aerobic Pathogenic Gram Negative Bacilli. Y.W. Tang, N.M. Ellis, M.K. Hopkins, D.E. Dodge, and D.H. Persing,Journal of Clinical Microbiology, December 1998, p. 3674-36795.7.2. Biolog Gen II Revolucionario

Sistema de Identificacin Microbiolgica. La segunda generacin de ID microbiolgica con las siguientes ventajas:Sin tincin Gram Sin Pre Test ni Post TestEn un solo panel ID de todas las bacterias Gram Positivo y Gram Negativo Slo un minuto para la configuracinMs de 1000 especies detectables.El gran avance es la nueva qumica oxido reduccin, que permite la inspeccin de las bacterias Gram positivas y Gram-negativas en el mismo panel. Ya no son necesarias las tinciones de Gram y otras pruebas previas. Se consigue la configuracin de un protocolo en menos de 1 minuto.Incluso con un Biolog Gen II el usuario puede detectar un nuevo microorganismo e incluirlo en su base de datos.Biolog dispone de tecnologa con mltiples plataformas para todas las necesidades, desde las ms simples sistemas manuales a los ms completos sistemas automticos.Las microplacas de 96 recipientes permiten un seguro diagnosticoLos sistemas Omnilog permiten identificacin de bacterias Gran negativo, Gran positivo, aerbicas, anaerbicas, hongos filamentosos, levaduras y fenotipos por micro array.

5.7.3. Anatoma de una identificacin Biolog Gen II

La nueva qumica de xido reduccin de Biolog Gen II es aplicable a una gama sin precedentes de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. Como se muestra a continuacin, Biolog Gen II disecciona y analiza la capacidad de la clula de metabolizar todos los tipos principales de productos bioqumicos, adems de determinar otras importantes propiedades fisiolgicas tales como el pH, salinidad, la tolerancia al cido lctico. La identificacin se puede realizar manualmente o con todos los instrumentos Biolog incluyendo el MicroStation semi-automtico y el automatizado OmniLog. Figura # 5.9. Placas BIOLOG GN2 determinacin de propiedades fisiolgicas71 Fuentes de carbono ms 23 ensayos de Sensibilidad Qumica

5.7.4. LAS PLATAFORMAS DE IDENTIFICACIN DE BIOLOG

A) OmniLog Combo Plus

Automatizar la identificacin de bacterias aerobias y permitir identificar tambin hongos filamentosos, levaduras y bacterias anaerobias.Lectura de Resultados a tiempo real y plenamente automatizada Permite la posibilidad de emplear el sistema para realizar pruebas de fenotipado microbiano empleando los Phenotype Microarrays Software de introduccin e interpretacin de resultados Software Retrospect 2.0 de gestin de datos para evaluar tendencias

B) OmniLog Plus ID System

Automatizar la identificacin de bacterias aerobias y permitir identificar tambin hongos filamentosos, levaduras y bacterias anaerobias. Lectura de Resultados a tiempo real y plenamente automatizada Software de introduccin e interpretacin de resultados Software Retrospect 2.0 de gestin de datos para evaluar tendencias

C) OmniLog Combo System

Automatizar la identificacin de bacterias aerobiasLectura de resultados a tiempo real e incubacin plenamente automatizadaPermite la posibilidad de emplear el sistema para realizar pruebas de fenotipado microbiano empleando los Phenotype MicroarraysSoftware de introduccin e interpretacin de resultadosSoftware Retrospect 2.0 de gestin de datos para evaluar tendencias

D) OmniLog ID System

Automatizar la identificacin de bacterias aerbiasLectura e incubacin de resultados a tiempo real y plenamente automatizadaSoftware de introduccin e interpretacin de resultadosSoftware Retrospect 2.0 de gestin de datos para evaluar tendencias

E) GEN III Microstation System

Automatizar la identificacin de bacterias aerobias y anaerbias, levaduras y hongos filamentosos Registro y lectura de resultados automtica (carga manual de las microplacas e incubacin independiente)Software de introduccin e interpretacin de resultadosSoftware Retrospect 2.0 de gestin de datos para evaluar tendencias

F) GEN III MicroLog M System

Registro y lectura de resultados manual para la identificacin de bacterias (incubacin y lectura a cargo del usuario)Software de introduccin e interpretacin de resultados11

AutomatizacinLecturaGEN III(Aerbios)YT(Levaduras)FF(Mohos)AN(Anaerbios)PM(Phenotype Microarrays)

OmniLog Combo Plus.Lectura Contnua

OmniLog PlusLectura Contnua

x

OmniLog Combo SystemLectura Contnua

xxx

OmniLog Lectura Contnua

xxxx

GEN III MicrostationLectura Puntual

x

GEN III ML- Mxxxxx

Tabla 4 Plataforma de sistema de identificacin de microorganismos BIOLOG

11Microbial identification state of sciencia performance with unmatched power & versatily Biolog Inc 21124 Cabot blvd, Hayward, CA USA (www.biolog.com)6. MATERIALES Y REACTIVOS6.1. EQUIPOSAutoclave Cmara de flujo laminarBalanza analticaPhmetro OrinRefrigerador 4CMicro pipetas gilson de 20-200 LCmara fotografa6.2. MATERIALES DE LABORATORIOAsa vidrioCajas Petri 100*20mmVasos de precipitadoPipetas mecanica reguladas para tipsTips de 20-200 LAsa de vidrioAsas plsticas esterilizadasMicro tubos (tubos Eppendorf)Tubos falcnMicroplacas Biolog de IdentificacinGradillas para microtubos de ensayoAlgodnGasaPapel toallaPapel higinicoGuantes desechablesGuantes trmicosEsptulaEnvases para pesarBolsas plsticasPapel aluminioPara filmMarcador de vidrioCmara fotogrfica6.3. REACTIVOSACIDO SULFURICO H2SO4NaClMgSO4*7H2OCaCl2*2H2OKClNaBrPeptonaExtracto de levaduraGlucosaAgarK2HPO4NH4ClFeSO4*7H2OGLUCOSAGLUTAMATO DE SODIOAGUA DESTILADASALES MARINASAlcohol al 70%

7. METOLOGIA 7.1. PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVOEl medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos halfilos, esta detallado en la tabla:Tabla # 1. Medio HMCOMPUESTO%(w/v)

NaCl4,5

MgSO4*7H2O0,025

CaCl2*2H2O0,009

KCl0,05

NaBr0,006

Peptona0,5

Extracto de levadura1

Glucosa0,1

Agar( solo para medio solido)2

Para Un Volumen VtSe procede al clculo segn la formula

7.1.1. Preparacin del medio liquido HMPesar los compuestos de la tabla # 1 en una balanza analtica, sin la adicin de agar.

Figura 7.1.- medio liquido HMRegular el PH entre un valor 8 y 8,5Separar el medio en matraces con un volumen aproximado de 60 a 80mlSellar los matraces con un tapon de algodn y aluminio para proceder a su esterilizacin en el autoclave a 121C y 1,2 atm durante 15 minutos

Figura # 7.2.- Autoclave7.1.2. Preparacin de medio solido HMPesar los compuestos en una balanza analtica para la gelificacion del medio de cultivo utilizar agar Proceder a su esterilizacin en el autoclave a 121C y 1,2 atm durante 15 minutosY separarlo en cajas Petri evitando su contaminacin usando una cmara de flujo laminar o un mechero bunsen, la adicion del medio solido debe ser hasta la mitad de la caja petri. Tal y como se puede observar en la figura # 7.3.

Figura # 7.3.- medio solido HM

7.2. CRECIMIENTO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOSPara el cultivo de microorganismos agregar 1ml de la muestra seleccionada en el medio liquido HM y proceder a su incubacin en el shaker a una temperatura de 37C. con 200 rpm durante 24 horas aproximadamente

Figura # 7.4.- incubacin medio liquido7.2.1. Mtodo de dilucinLuego de 24hr se puede observar la turbiedad en el medio de cultivo HM lo cual indica que el crecimiento de los microorganismos de la muestra problema. Para el aislamiento de estos microorganismos se utilizara un medio HM solido, se debe trabajar en un ambiente adecuado para evitar contaminar las muestras.Para el aislamiento de microorganismos se utilizara el mtodo de diluciones que ser detallado en la Figura # 7.5. , para esto de proceder llenar 7 micro tubos con 0,9 ml de medio liquido HM del tubo falcon y rellenar 0,1 ml de la muestra en el primer micro tubos agitar bien y trapazar 0,1ml del primer micro tubos al segundo as sucesivamente:

Figura # 7.5.- Mtodo De DilucinDependiendo de la turbiedad de la dilucin proceder a su seleccin y sembrar 20L de la solucin en una caja Petri contenido medio solido HM ya preparado y con la ayuda de una aza de vidrio esterilizada esparcir en el medio para su posterior seleccin, sellar bien la caja Petri y llevar a la incubadora a 37C durante 24 hrs a 48 hrs.

Figura # 7.6.- Dilucin de microorganismos

Figura # 7.7.- Siembra de microorganismos

7.2.2. Seleccin de microorganismos

De manera cualitativa observamos si en las diluciones la formacin de colonias, si podemos diferenciar los microorganismos en la caja petri podemos proceder a su seleccin, segn sus caractersticas morfolgicas, un ejemplo de una caja petri donde se puede diferenciar los microorganismos aislados se ve en la figura # 7.6.

Figura # 7.6.- colonias de microorganismos de flora epifitica

7.2.3. Replicacin de microorganismosLa colonia seleccionada es retirada con una asa y cultivada de nuevo en una caja Petri contenido el medio solido HM, proceder a la numeracin de la colonia y anotando los datos de la colonia con un marcador de alcohol con el nmero de la cepa.Sellar bien la caja Petri y llevar a la incubadora a 37C durante 24 hrs.

7.3. PRODUCCION DE PLASTICO BIODEGRADABLE7.3.1. Preparacin del medio liquidoPara la produccin de plsticos biodegradables se utilizo el medio HM2 el cual tiene una concentracin elevada de fuente de carbono (Glucosa) y una concentracin baja de fuente de nitrgeno (Glutamato de sodio) lo cual provoca en los microorganismso la acumulacin de plstico biodegradable, este medio esta detallado en la tabla # 2:Tabla 2.- medio HM2NCompuesto%(W/V)

1NaCl5

1MgSO4*7H2O0,5

1K2HPO40,22

1NH4Cl0,4

1FeSO4*7H2O0,005

2GLUCOSA2,5

3GLUTAMATO DE SODIO0,2

Para Un Volumen VtSe procede al clculo segn la formula

Pesar Se utilizara un volumen de cultivo de 150ml, la produccin se la realizara en matraces Erlenmeyer de 1000 L Separar los compuestos N 1 en un matraz Erlenmeyer e aadir un volumen de agua destilada igual a 2/3 del volumen total Vt. Regular el PH de la solucin a 7 Separa 100ml de la solucin en varios matraces de 500ml o 1000ml Sellar con tapn de tela y aluminio para su procedente esterilizacin Separar los compuestos N 2 en un matraz Erlenmeyer de 500ml e aadir un volumen de agua destilada equivalente a 1/6 del volumen total Vt. Sellar con tapn de tela y aluminio para su procedente esterilizacin Separar los compuestos N 3 en un matraz Erlenmeyer de 500ml e aadir un volumen de agua destilada equivalente a 1/6 del volumen total Vt. Sellar con tapn de tela y aluminio para su procedente esterilizacin en el autoclave a 121C y 1,2 atm durante 15 minutos

7.3.2. Siembra de microorganismos productores de plstico

Se utilizara microorganismos obtenidos del aislamiento del aislamiento de las muestras problema, estos deben tener no ms de 48-72 horas de cultivo en cajas Petri con el medio HM. Para esto se toma una cepa seleccionada y se toma una buena cantidad de la misma con una asa de cultivo, esta se coloca en tubo Eppendorf que contiene 1ml de medio de cultivo HM2 y se procede a diluir la completamente la muestra. Posteriormente se siembra en los matraces preparados (figura # 9 y 10) y se procede a incubarlos por 30 horas a T= 37C y 200 rpm

Figura 9.- Medio liquido HM2

Figura 10.- replicacin de microorganismos

7.3.3. Centrifugacin de microorganismos

Una vez que han crecido los microorganismos el medio se torna de un color conciso y lechoso lo cual nos indica un crecimiento positivo de la cepa seleccionada en el medio HM2 (figura # 11)

Figura # 11.- Crecimiento del microorganismos en el medio HM2

Separar 10 ml de la muestra en tubos falcn e introducirlos en la centrifugadora de 3000 rpm de manera opuesta durante 5 minutos (figura # 12).

Figura # 12.- Centrifugadora

Una vez centrifugado se formaran dos fases desechar la fase liquida y volver a realizar el mismo procedimiento hasta concluir el medio de cultivo restante, se obtendr un pellet que son los microrganismos obtenidos al final de todo el cultivo (figura # 13)

Figuura 13.- Separacin De Microorganismos

7.3.4. Secado de microorganismosUna vez desechado la fase liquida se procede a secar los microorganismos, se introduce los tubos falcn en la estufa a 60C por aproximadamente 24-48hrs

7.3.5. Hidrolisis PHBUna vez que la biomasa este completamente seca se pes 10mg de esta es tubos de ensayo, posteriormente se aadi 10 ml de H2SO4 y se llev a la estufa a una temperatura de 100C por un tiempo de 1 hora.

El H2SO4 se aade para romper la pared celular y de esta manera dejar salir en su interior los plsticos biodegradables, las cuales se hidrolizan por la accin de este compuesto

Se procede a hacer diluciones 1/10, 1/100, 1/1000, para su posterior lectura en el espectrofotmetro.

7.3.6. Seleccin de microorganismos capaces de producir PHBLa presencia de un polmero se verifica por medio de un barrido en el espectrofotmetro desde 200nm a 400nm, siendo la presencia de plstico cuando la elevacin de la curva o pico se extiende en 235nm

8. Test de Identificacin de bacterias GRAMNEGATIVAS

8.1. PROCEDIMIENTO PARA UTILIZAR GN2 MICROPLACAS

El procedimiento de prueba es rpida y sencilla, con la participacin slo 5 pasos: 1) Un cultivo puro en medio liquido de una bacteria se cultiva en un Biolog Crecimiento universal w/5%.2) Las bacterias se tomaron muestras de la superficie del agar placa, y se suspendieron a una densidad especificada en el documento GN / GP Fluido de inoculacin 3) 150 L de suspensin bacteriana se pipete en cada microplaca del GN2 4) La microplaca se incuba a 30 o 35 C (dependiendo de la naturaleza del organismo) de 4-24 horas. 5) Las microplacas se leen visualmente o con el Biolog MicroStation o Sistema OmniLog, en comparacin con la base de datos GN, y un resultado se determina.

9. RESULTADOS

9.1. Crecimiento y Aislamiento de microrganismos

9.1.1. Muestra: Laguna de Palpani

Cultivo de microorganismosHubo considerable respuesta por parte de la flora epifita de esta seccin aportando un crecimiento considerableMtodo de dilucinSe realizaron diluciones de 10-5 10-6 10-7 pero no se observaron resultados de adaptacin al medio solido HM

9.1.2. Muestra: Laguna de Coruto

Cultivo de microorganismosHubo considerable respuesta por parte de la flora epifita de esta seccin aportando un crecimiento considerableMtodo de dilucinSe realizaron diluciones de 10-6 10-7 se observ aporte y adaptacin por parte de los microorganismoSeleccin de microorganismosSe procedi a la seleccin cualitativa de microorganismos por caractersticas morfolgicasReplicacin de microorganismosNo se realiz la replicacin de estas especies

9.1.3. Muestra: Laguna Kollpa

Cultivo de microorganismosHubo una respuesta satisfactoria por parte de la flora epifita de esta seccin aportando un crecimiento considerableMtodo de dilucinSe realizaron diluciones de 10-6 10-7 se observ aporte y adaptacin por parte de los microorganismo, adquirindose las colonias bien separadas en la dilucin 10-6Seleccin de microorganismosSe procedi a la seleccin cualitativa de microorganismos por caractersticas morfolgicasReplicacin de microorganismosSe procedi a la numeracin de colonias y cultivo de las mismas en medio HM solido aislados

9.1.4. Muestra: Laguna hedionda

Cultivo de microorganismosPara una primera instancia el medio se coloro obscuro se procedio a realizar una vez mas el cultivoPara una segunda instancia hubo una respuesta satisfactoria por parte de la flora epifita de esta seccin aportando un crecimiento considerableMtodo de dilucinSe realizaron diluciones de 10-6 10-7 se observ aporte y adaptacin por parte de los microorganismo, adquirindose las colonias bien separadas en la dilucin 10-6Seleccin de microorganismosSe procedi a la seleccin cualitativa de microorganismos por caractersticas morfolgicasReplicacin de microorganismosSe procedi a la numeracin de colonias y cultivo de las mismas en medio HM solido aislado

9.2. Produccin de plstico biodegradable

9.2.1. Muestra: Laguna kollpa 2 (agua) cepa N5

Replicacin de microorganismosSe realiz el paso de microorganismos del medio solido HM al medio lquido HM se llev a 200 rpm durante 30 hrs no se obtuvo respuesta de crecimiento por parte de esta especie

Morfologa Lisa Contorno regular Colonias pequeas Convexa Su color es Crema Claro Brillosa

Figura # 9.1. Laguna kollpa 2 (agua) Cepa 5 toma microscopio

9.2.2. Laguna Bush salina (agua) Cepa N5

Replicacin de microorganismosSe realiz el paso de microorganismos del medio solido HM al medio lquido HM2 se llev a 200 rpm durante 30 hrs no se obtuvo respuesta de crecimiento por parte de esta especie

Morfologa Lisa Contorno regular Convexa Su color es crema claro Brillosa

9.2.3. Figura # 9.3.Laguna Bush salina (agua) Cepa N5 toma microscopio

9.2.4. Laguna hedionda 2 (suelo) cepa N2

Replicacin de microorganismosSe realiz el paso de microorganismos del medio solido HM al medio lquido HM2 se llev a 200 rpm durante 30 hrs no se obtuvo respuesta de crecimiento por parte de esta especie

Morfologa Formacin de una colonia enorme Crecimiento Rpido Semi Lisa Aterciopelada Plana Su color es blanco Opaca

Figura # 9.4.Laguna hedionda 2 (suelo) cepa N2 toma microscopio

9.2.5. Laguna hedionda 2 (suelo) cepa N6

Replicacin de microorganismosSe realiz el paso de microorganismos del medio solido HM al medio lquido HM2 se llev a 200 rpm durante 30 hrs no se obtuvo respuesta de crecimiento por parte de esta especie

Morfologa Lisa Contorno Regular Convexa Color crema suave Brillosa

Figura # 9.5. Laguna hedionda 2 (suelo) cepa N6 toma microscopio

9.2.6. Laguna hedionda 2 (suelo) Cepa 5

Replicacin de microorganismosSe realiz el paso de microorganismos del medio solido HM al medio lquido HM2 se llev a 200 rpm durante 30 hrs, se obtuvo respuesta satisfactoria de crecimiento por parte de esta especie, el medio claro se torn un color lechoso

Morfologia Rugosa Contorno irregular Planas Su color es Blanco Opaca

Figura # 9.6.Laguna hedionda 2 (suelo) Cepa 5 toma microscopio

Centrifugacin y secadoSe realiz la sedimentacin de la biomasa, su procedente secado

Hidrolisis10 mg de muestra seca se diluyo en 10ml de H2SO4, se llev a la estufa a 100C durante y se realizaron diluciones con H2SO4 a 1/10, 1/100, 1/1000 para su posterior medicin

Seleccin de microorganismos capaces de producir PHBEn el espectrofotmetro se realiz un barrido desde 200nm a 400nm, siendo la presencia de plstico cuando la elevacin de la curva o pico se extiende en 235nm la grfica que pudimos observar fue la siguiente:

Donde observamos que se form un pico aproximadamente a 235nm con una absorbancia de 0,712TEST DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS GRAMNEGATIVAS GN2

Figura # 9.7. Pigmentacin de microplacas BIOLOG GN2 de bacterias de la laguna hedionda 2 (suelo) cepa5

Figura # 9.8. Resultado de las microplacas BIOLOG GN2 de bacterias de la laguna hedionda 2 (duelo) cepa5

Comparando los resultados con la grfica 5.9. ilustrada anteriormente con los obtenidos por la prueba de tincin GRAMNEGATIVA consideramos que las condiciones ptimas de vida para el microorganismos son:

PH ligeramente acido. Concentraciones altas de NaCl. Azucares importantes como: Cyclodextrin, Adotinol, D-fructuosa, D-glucosa, Minositol, D-meliblose, L-Rhamnose, Sorbitol, Sucrose. Contenidos altos de hexosa (fosfatos) No suele ser Reductor. cidos carboxlicos importantes como: L-Histidina, Acido Urocanico, Inosine, 2,3-Butadeniol, Fenilalina, L-Prolina, Glycerol.10. CONCLUSIONES

1. Se logr aislar algunos microorganismos de laguna kollpa y se procedi a su respectiva numeracin, pero una vez realizadas el anlisis de produccin de plsticos se pudo evidenciar que ninguno de los microorganismos separados fueron capaces de producir plsticos2. Se trabajaron con una serie de microrganismo extrados de lagunas como ser laguna palpani, laguna de coruto, laguna kollpa, laguna bush salina, laguna hedionda, donde se encontr un cepa de microorganismo capaces de producir plstico biodegradable extrada de la laguna hedionda, despus del tratamiento de hidrolisis se realiz un barrido en espectrofotmetro obteniendo una curva en 235nm con una absorbancia de 0,7123.

4. La cepa 5 de la laguna hedionda 2 (Suelo) productora de plstico biodegradable tiene una morfologa especialmente caracterstica con respecto a las dems cepas la cual es Rugosa de Contorno irregular Planas y opaca a diferencia de las dems cepas que son lisas brillosas y de contorno regular

5. Mediante la prueba de identificacin de bacterias gramnegativas Biolog GN2 en microplacas cualitativamente podemos observar que las bacteria identificada en la prueba metabolica es de carcter gram positiva por la cantidad de With positivos adems que el patrn de respuesta genera algunos resultados sobre las carateristicas de optimo crecimiento de la bacteria como: PH ligeramente acido. Concentraciones altas de NaCl. Azucares importantes como: Cyclodextrin, Adotinol, D-fructuosa, D-glucosa, Minositol, D-meliblose, L-Rhamnose, Sorbitol, Sucrose. Contenidos altos de hexosa (fosfatos) No suele ser Reductor. cidos carboxlicos importantes como: L-Histidina, Acido Urocanico, Inosine, 2,3-Butadeniol, Fenilalina, L-Prolina, Glycerol.

11. RECOMENDACIONES

Es recomendable del estudio ms amplio de las muestras para clasificar las bacterias productoras de alguna fuente para as descubrir la funcin adecuada de cada producto producido

Ampliar la cantidad de especies de bacterias productoras de plsticos biodegradables tendr que ser el objetivo global de esta rea de investigacin

De igual manera es recomendable probar con diferentes medios de cultivo para el aislamiento de bacterias con el fin de adecuar un medio que maximice la produccin de (PHA)

12. BIBLIOGRAFIA

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Diego Armando castillo Franco, Pontifica Universidad JAVARIANA, Nov. 2008, Efecto del gen FafH1 en la produccin de PHA conteniendo monmeros insaturados por Pseudomas putida

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Microbial identification state of sciencia performance with unmatched power & versatily Biolog Inc 21124 Cabot blvd, Hayward, CA USA (www.biolog.com)

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