Produccion de Invertasa Por a[1].Niger en Fermentacion
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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
Casa abiertaal tiempo
Produccin de lnvertasa por A,spergillus niger en Fermentacin Lquida y Fermentaci6n Slida
TESIS Que para obtener grado de el Doctor en Ciencias Biolgicas PRESENTA
Sergio de Jess Romero Gmez
Abril de 2001
El jurado designado por las Divisiones de Ciencias Biolgicalsy de la Salud de las Unidades lztapalapay Xochimilco aprob la tesis que presentSergio de Jess Romero Gmez
El da 02 de Abril de 2001
Comit Tutorial:
Tutor: Dr. Gustavo Viniegra Gonzlez
Asesor: Dra. Amelia Farrs Gonzlez-Sarabia cI;&.L,
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Asesor: Dr. Christopher Augur
Sinodal: Dr. Ernesto Favela Torres
,
Sinodal: Dr. Sergio Huerta O &
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El jurado designado por las Divisiones de CienciasBiolgicas y de la Salud de las Unidades lztapalapa y Xochimilco aprob la tesis que present
Sergio de Jess RomeroIGmez
El da 02 de Abril de 2001
Comit Tutorial:
Tutor: Dr. Gustavo Viniegra Gonzlez
Asesor: Dra. Amelia Farrs Gonzlez-Sarabia
Asesor: Dr. Christopher Augur
Sinodal: Dr. Ernesto Favela Torres
Sinodal: Dr. Sergio Huerta Ochoa
El Doctorado en Ciencias Biolgicas de la Universidad Autnoma Metropolitana est incluido en el Padrn de Posgrados de Excelencia del CONACyT y adems cuenta con apoyo del mismo Consejo, con el convenio PFP-20-93.
C
" . . "
"
."
A las mujeres demi vida en estricto orden de aparicin: Mi madre, mi ta Ruth, Georgina, Tatiana y mi pequea Ruth Guadalupe
lndice lndice...........................................................................................
I
Resumen....................................................................................... Abstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1. Introduccin................................................................................
Ill VI 1 14
Hongos filamentosos ........................................................................
Aspergillus niger.............................................................................Regulacin de lasntesis de enzimas en hongos filamentosos................. Metabolismo aerbico...................................................................... Transferencia de oxgeno ................................................................. Fermentacin lquida ....................................................................... Fermentacin slida ........................................................................ Diferencias entre fermentacin slida fermentacibn lquida.................... y Poliuretano .................................................................................... Sacarosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Invertasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
10 11 16 18 21 23
25 262930 34 36
Proteasas ...................................................................................... Antecedentes................................................................................. Justificacin ................................................................................... Objetivos ........................................................................................
I
Hiptesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 . Material y Mtodos.......................................................................3. Resultados .................................................................................
37
3845
Efecto de
la concentracin inicial de sacarosa sobre
la produccin de45
invertasa por Aspergillus niger en fermentacin sliday lquida ................ Estudio de la produccin de invertasa por 3 cepas de Aspergillus niger en fermentacin slida y lquida con 100 gll desacarosa inicial..................... Estudio de la secrecin de invertasa porAspergillus niger C28B25 en
70
fermentacin slida y lquida con 100 g/l de sacarosa inicial..................... Estudio de la morfologa de crecimiento de Aspergillus niger en fermentacin slida y lquida .............................................................4 . Discusin general ........................................................................
76
9099
5 . Conclusiones ..............................................................................
107 108 111 124
Propuestas ......................................................................................6 . Bibliografa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7 Anexo 1
Resumen En este estudiose compar la produccin de la enzima invertasa(sacarasa o 13 fructo-furanosidasa EC3.2.1.26) por una cepa silvestre de Aspergillus niger C28825 usando medio lquido y slido. Se utiliz espuma de poliuretano como soporte inerte para fermentacin slida y se propone corno un sistema modelo para el estudio de las diferencias entre fermentacin slida y lquida. evaluacin del efecto deEl objetivo principal fue
la que
la adicin de cantidades crecientes sacarosa de
actuase, simultneamente como inductor de sta enzima y nica fuente de carbono. Se midieron los siguientes parmetros fisiolgicos: la velocidad especfica de
crecimiento del organismo (p), el nivel mximo de la biomasa () X ,
el rendimiento
de biomasa por gramo de substrato consumido (VX/S), el rendimiento enzimtico por gramo de biomasa producida (Yux) y la productividad de la enzima enzimtica (P).Con la comparacin de estos
indices se pretende demostrar la si
mayor
productividad enzimtica del medio slido se debe la mayor produccin de biomasa o a una mayor produccinenzimticapor relacionar con forma la fermentacin.LOS resultados obtenidos indicaron que,
gramo1 de biomasa y siestose
puede medio de
de crecimiento micelio del dentro cada de
en fermentacin slida,
la biomasa
producida fue mayor que en fermentacin lquida, aunque el consumo de substrat0 fuemuysimilar en ambosmedios.Estofuem& notable cuandoseusaron altos
niveles de sacarosa (SO 50 g/L). Es decir, los valores de YNs, corno funcin de So, > fueron mayores para la fermentacin slida que para la liquida con todos 10s niveles
111
"
~
"
de sacarosa. Adems, las tendencias de la p fueron diferentes entre los dos tipos de fermentacin (mayorpara el medio slido).Losnivelesmximos de la invertasa
fueron mucho mayores en fermentacin slida
que los obtenidos por fermentacin
lquida, con sacarosa inicial mayor a 25 g/l. La productividad de la enzima pas de ser casi igual con 6.25 gll de sacarosa inicial para ambos tipos de cultivo, a ser5
veces mayor en fermentacin slida, cuando se aiiadieron 100 gll de sacarosa inicial.
El rendimiento de la enzima por gramo de biomasa (Yvx) fue mayor en medio slidoque en medio lquido. Todas estas diferencias fisiolgicas se acentuaron cuando niveles de sacarosa fueron altos.AI estudiarse la composicin azcares de
los
del caldo de cultivo con
100 g/l de
sacarosa inicial, se encontr que en el medio lquido se acumulaban ms la glucosa y la fructosa, que en el medio slido. Esto indica una velocidad de hidrlisis mayor a la capacidad de produccinde biomasa en el medio lquido durante las primeras horas del cultivo. Por otra parte, se midieron los niveles de actividad de proteasa para comparar el efecto del sistema cultivo de sobre la estabilidad de la invertasa, actividad la enla fermentacin
proteoltica fue 6.5 veces menor en la fermentacin slida que lquida.
Los cultivos de Aspergillus niger en medio lquido produjeron agregados esfricos o pelotitas (pellets) queson la formamacroscpicacaracterstica Pero enmedio en este medio.
slido, este organismo creci en forma de un micelio disperso
adherido en parte a las trabeculas del polmero y c m parte en forma de micelio areo en contacto directo con la fase gaseosa. La observacin microscpica de poliuretanoIV
mezclado con el medio lquido mostr que Sta formaba meniscos con un espesor cercano a 60 vm. y que esta medida corresponde ;a la dispersin de 25 ml de agua en un gramo de poliuretano, en una superficie de aproximadamente 4,000 cm2. Es decir que el cocientede la superficiesobre el volumenfue de AN =160 cm2/cm3. En
cambio, la medicin del rea de contacto del medio en matraces Erlenmeyer de 125 ml con 25 ml de medio indic una relacin AN = 1.O cm2/cm3. Es decir, la superficie de transferencia de gases en el medio slido fue dos rdenes de magnitud mayor que en el medio lquido. De acuerdo con estos resultados, es posible apoy 0.98), los hongos filamentosos pueden crecer con valores deAw tan
bajos como 0.85, y por esta razn, son microorganismos muy bien adaptados para la fermentacin slida. Pandey (1992) sugiere incluso queun bajo nivel de Awfavorece lagerminacin y el crecimientomiceliarde 1998)los hongos(Pandey,1992;Raimbault,
De acuerdo con Raimbault (1998) el soporte de la fermentacin slida debe cumpllr con varios requerimientos como son: Poseer una matriz porosa que puede ser biodegradable o inerte, y requlere presentar una gran superficie de rea por volumen dentro del rango de lo3 o lo6 cm2/cm3que permita el crecimiento microbiano en la interfase slido-lquido. Debe absorber agua en una o variasvecessupropio peso conunaactividad de aguarelatrvamente de los
grande en la interfase slido-lquido para poder permitir una alta velocldad procesos bioqumicos.
La mezcla de oxgeno con otros gases y aerosoles deben pasar a traves del cultrvo conrelativafacilidad, la superficie slido-lquido debe ser un buen hbltatpara
permitir el crecimiento de microorganismos quec6ecen rpidamente como bacteriasy hongos. La matriz slida debe resistir la compresitjny un mezclado suave que podria requerir cada tipo de fermentacin. Esto requiere particulas pequeas que no tiendan a unirseunas a otras. La matriz slida debe estar libre de contaminantes y de inhibidores del creclmientoy granulosas
de los microorganismos y debe ser capaz de absorber o contener substratos para el crecimiento microbiano como carbohidratos, fuentes nitrgeno y sales minerales de Estas condiciones son cumplidas por la mayora de los soportes naturales utilizados en la fermentacin slida como el bagazo de caa, el salvado de trigo. etc Existen tambin soportes inertes que cumplencon estos requenmlentos y que se han utilizado para poliuretano. la fermentacin como slidala amberlita y, especialmente. el
Diferencias entre fermentacidn slida y fermentacin lquida.A partir del conoctmiento de las diferencias fsicas existentes entre ambos sistemas
de fermentacin. es poslble definir algunas diferencias entre ambos tipos de cultivo ySU
papel sobre la fisiologa de crecimiento de Aspergillus niger. muy diferentes entre
a) Los coeficientesdifusin de efectivos pueden ser
fermentactn liquida y fermentacin slida, porque la relacin rea/volumen del medio liquldo generalmenteesvariosrdenesdemagnitudmenorqueenla
delgada capa de agua extendida en soporte poroso se da en la fermentacin que soltda En un matraz Erlenmeyer de125 ml con 25 ml de lquido, la relacin a/v
en la interfase es del orden de 1 cm2/cm3.En cambio si tal lquido se extiende en una capa delgada y uniforme de un espesor cercanoa las 50 micras, el cocientea/v= 200 cm2/cm3. Debidoaque
el transportedeoxgenodepende
de este
cociente. se puede Inferir que ser ms rpido para para la fermentaan lquida. b) Los tlempos de mezclado sern mucho menores en liquldo agitado.Enformatpica, tendr un tlempo de mezclado
la fermentacin slida que
el medio lquido que en el200 r.p.m.
un matrazErlenmeyeragitadoa de unos pocos segundos, mientras que
en una
lmina de lquido no agitado, el tiempo de mezclado depende de la difusin delos solutos y tipicamente est dada por el cociente, L2/D~20, siendo L la distancia
promedio. entre los cmulos de esporas sembradas, que en el medio de cultivo podran estar separadas en forma tpica, por distancias aproximadas1000 mlcras. El coeficientededifusindelaglucosaenaguaes
de 100 aD= 6*106
cm2/seg. El tiempo de mezclado resultante estara en
el intervalo de I O * a l o 321
seg. Esta diferencia fsica indica que sera
ms fcil formar microgradientes de
solutos en la FS que en la FL, como, por ejemplo, gradientes de concentracin de substratos, productos, enzimas excretadas al medio. Esta propiedad es muy
usada para medir la potencia de excrecin de productos en pruebas de halos de inhibicin por antibiticosy halos de actividad enzimtica. c) forma La de crecimiento tpica para cada sistema de fermentacin muy es
diferente en FL y
FS.En forma tpica Aspergillus niger produce pellets cuando se
cultiva en FL con substratos de fcil asimilacin, en cambio, en FS, tpicamente crece como micelio disperso con una apreciable proporcin de la biomasa tipo de areo. Estas diferencias, conocidas desde hace mucho, sugieren que fisiologa la de crecimiento y metabolismo entre fermentacin slida lquida puedenser muy y grandes para cada uno de los sistemas de cultivo. Adems, pelletsdevarios activadebido es sabido que los biomasa
mm de dimetroslotienenunadelgadacapade
a los problemasdifusionalesensuinterior(Pirt,
1975), lo que
podra resultar en an mayores diferencias fisiolgicas entre ambos sistemas de cultivo.
Por lo tanto, en este estudio comparativo de produccin de enzimas de Aspergillus laniger entre FL y FS deben de tomarseencuentaestasdiferenciaspara poder
analizar y en su caso, explicar las posibles variaciones de productividad enzimtica en cada medio de cultivo, y es importante estudiar dichas diferencias fisiolgicas, usando coeficientescinticosdecomparacinrelacionndolos microscpicas del crecimiento del micelio. con observaciones
22
PoliuretanoUn novedoso mtodo fermentacin estado de en sohdo se ha desarrollando
utilizando espumas de poliuretano (PUF) como soporte Inerte Impregnando sobre I un mediodecultivo lquido sinttico, donde sesimula la cornposicion nutricional y
condiciones de cultivo que anteriormente se llevaba a cabo en salvado de tngo. Con este sistema, la biomasa, que es un parmetro limportante para la evaluacin de la
fermentacin en estado slido puede ser medido directamente (Zhu y c o l . . 1994). El PUF anteriormente fue utilizado por Fujishima1972. en En1994Zhu para la producciny c o l . . utlllzaron PUF para
enzimtica de varias especies de hongos.
producir nucleasa P1 de Penicillium citrinium. Desde entonces
el PUF ha sido
utilizado ms como un proceso de inmovilizacin celular que como un proceso limpio de produccin enzimtica para la bsqueda de dliseo de (inmovilizacin, detoxificacin, obtencinde metabolitos). La composicindelmediodecultivoesfactorimportanteyaqueinfluye diversidad y la calidad de las enzimas. La produccin de enzimas en medio con medios de cultivo sintticos impregnados sob're soporte Inerte, permite elcomportamientode mediodecultivo, sobre la slido estudiar reactores ms eficientes
los hongosfilamentososconrelaclna
la composicin del
la influenciadelaactividaddelagua,
la Ilberacin de calor, as
como la influencia de la transferencia de gases. L.a recuperaan de metabolitos en stas condiciones obtener un se realiza por prensado lo qlue permlte producto
concentrado. En cultivos slidos en los cuales el soporte es tamblen el substrata, es dificil evaluar la influencia un desolo factor sobre el comportamiento un de
microorganismo ya que en gran parte, estos substratos son muy complejos y dada SU23
composicin se dificulta la determinacin de en cultivos slidos (Orioly col., 1988). Lacomposicindelpoliuretanoloconvierte
los diferentes parmetros importantes
en unmedio ideal para el cultivo de
hongos al permitir el crecimiento del hongo sobre las trabeculas que se forman en la espuma, adems el poliuretano no atrapa el agua, por lo que no disminuye la Aw del medio de cultivo y no compite conel organismo por el agua libre. La espuma atrapa una gran cantidad de airelo que permite al hongo crecer en un
medlo rico en oxgeno. A no serbiodegradablenoproduceefectossecundarios I sobre la induccin o secrecinde
las enzimas y permitedeterminarde
manera
adecuada la biomasa producida por el microorganismo. Nosotrosusamospoliuretanocomosoporteinertea realmenteestpasandodurante el cultivode fin de poder medir
lo que
Aspergillus niger enfermentacin
este permite regular perfectamentepresencia la slida. El uso de soporte inductores que determinanproduccin enzimas. ventaja la de Otra poliuretano es no biodegradable, lo que permite llevar a es que
de el
cabo la determinacin del
peso seco real del hongo por gravimetra. La tercera ventaja est en la porosidad del material, que permiteque fcilmente utilizado el por hongo
los espaciosdelpoliuretanosellenen
de aire que es
y que cumple todas requerimientos con los
estipulados Raimbault 998) por (1 como necesarios un para soporte inerte fermentacin slida. Este trabajo representa estudio un sobre filamentoso en soporte slido inerte.la metodologia cultivo de
de
de hongos
24
I
SacarosaLa sacarosa, comnmente conocida como azcar mesa, un de es disacrido compuesto por molculas de a-[>-glucosa y p-D-fructosa unidas por enlaces a-l,4glucosdico. Cuando este enlacees roto, mediante una reaccin hidroltica, se liberan cantidadesequimolaresdeglucosa y fructosa.Esta mezcla demonosacridosse
llamaazcarinvertida,estosederivadelhechoquelasacarosadesvalaluz polarizada hacia la derecha (dextrorrotatorio) + 6 . 1 ,mientras que los productos de 6.5' hidrlisisrotan la luzpolarizadahacialaizquierda(levorrotacin)
- 0 ' parala 21
mezcla (52.1' paralaD(+)glucosa
y 92.1' paralaD(-)fructosa).Otrosdisacridos
comunes son la maltosa y la lactosa. La sacarosa es hidrolizada por
la enzima invertasa o sacarasa de acuerdo con la
reaccin que se presenta a continuacin.
Sacarosa + H20 ---> glucosa + fructosa.
Esta reaccin es de gran inters para las industrias de bebidas y confites, porque el azcar invertido es ms dulceque la sacarosa, adems, no se cristaliza y por ello es posible usarlo como jarabes concentrados estables, que de paso, tienen el doble de osmolaridad que los jarabes obtenidos como soluciones de sacarosa.Por esa razn, lahidrlisis de la sacarosa ha sido estudiada desde hace mucho tiempoy en
especial, desde principios del siglo XIX, ha sewido como modelode mediada por la enzima sacarasa, o ms comnmente, invertasa.
la catlisis
25
lnvertasa El nombre oficial de la invertasa es S-fructofuranosidasa (EC3.2.1.26). Esto implica
que la reaccin catalizada por esta enzima es la hidrlisis de residuos terminales no reductores fructofuranosidos de p-fructofuranosidols. Esta reaccin es compartida por la a-D-glucosidasa, adems sacarosa la puede intewencin de la invertasa. La invertasa se utiliza principalmente en la indust.ria de alimentos (confitera) dondela fructosa es preferible a la glucosa debido a quie es ms dulce y
hidrolizarse en medio cido
sin
no cristaliza tanque la glucosa
fcil. Sin embargo uso el de
la invertasa limitado es debido a
isomerasa puede ser utilizada para convertir directamente la glucosa fructosa a un en costo ms bajo. Para el uso dela invertasa en alirnentos se requiere de una protena altamente purificada, afin de no alterar el sabor y preservar la salud de las personas. La invertasa es producida por una gran variedad de organismos que pueden utilizar la sacarosa como fuente de carbono. En el mbito comercial la invertasa se produce principalmente por de cepas levaduras cornlo Saccharomyces cerevisiae o mismo cultivo de invertasa pesa
Saccharomyces carlsbergensis (Carlson,1987).Andentrodel
levaduras existen diferentes especies invertasa. ejemplo, de Por la intracelular tiene un peso de 135 KDa, mientras que la invertasa extracelular
270 KDa (Gascon y col., 1968; Gascon y Lampen, 1968; Carlson y Botstein, 1982).
Contrariamentealamayorade
las enzimas,lainvertasa
es muy tolerantea
los
cambios de pH, presentando una actividad relativamente alta entre pH
de 3.5 a 5.5
con el mximo a pH 4.5. La actividad mxima se alcanza a 55OC. Los valores de Km
26
varan mucho de una especie a otra pero la mayora se encuentran entre 2 mM a 5 mM, con un valor tpico de 3 mM parala enzima libre (Boddy y col. ,1993; Chen-Tien y col., 1994; Chen y Lui, 1996). La invertasa es una enzima que es producida por plantas y microorganismos,en los ltimos aos esta enzima ha recibido mucha atencin como un buen modelo para el estudio de enzimas glucosiladas secretadas por levaduras y hongos filamentosos que tienen como inductores de la sntesis de esta enzima alos azcares, sacarosa y la rafinosa
los cuales tambin funcionan substratos la corno para invertasa
extracelular de Aspergillus niger (Mukherjee y Sengupta, 1985; Quiroga y col., 1995; Perez y col., 1996). Se ha estudiado recientemente la produccinAspergillus nidulans en los siguientes reportes:
de! invertasa por Aspergillus niger y
Andres y Peberdy (1974) encontraron que la invertasa de Aspergillus nidulans fue localizada el enmedio cultivo dey en la1 fraccin micelio de
lavado. La
comparacin de sus constantes cinticas les permiti determinar que se trata de la misma enzima.AI parecer la enzima est IocAizada en el espacio intramural, al igual que en Neurospora crassa. La glucosa presenta un importante papel en la represin de la produccin invertasa en A. niclulans. El micelio crecido en medio con glucosa present represin catablica y produjo 6 veces menos invertasa queel micelio crecido en sacarosa. Altas concentraciones de glucosa produjeron una
dilacin en el tiempo de produccin de la invertasa, pero al disminuir la cantidad de glucosa en el medio de cultivo se inicila produccin de la invertasa.
27
0
Vainstein y Peberdy (1990)encontraron
qule aproximadamente el 50% de la
invertasa total producida por Aspergillus nidukms en FL est asociada al micelio y parece estar localizada en el espaclo penplsmlco. De sta, aproximadamente el 60% puede ser liberada por tratamiento mecnlco del mismo. El resto se libera
por accin de qumicos comoel DTT y la proteasa K. La liberacin de la invertasa por accin mecnica, por la accin de agentes reductores o por la proteasa K, les permite suponer la que invertasa fsi(camente esta confinada periplsmico en lugar de estar asociada a la piared celular. Boddy y col. (1 993) purificaron la invertasa de Aspergillus niger y localizaron dos genes de expresin de esta enzima. Encontraron que la actividad ptima de la en el espacio
invertasa se lleva a cabo a un pH de 5.5, y 5OOC. Su peso molecular fue de 115 KDa, mientras que el peso nativo fue de 225 KDa, AI parecer el 50% de la masa molecular est formada por hidratos de carbono. Chen y col. (1996) purificaron dos invertasas de Aspergillus nidulans producidas
por fermentacin lquida. Estas invertasasse sintetizan al parecer del mismo gen. Las invertasas presentaron caractersticas muy parecidas y se diferenciaron por presentar un patrn de corrimiento en electroforesismuydiferente.Una pesa
alrededor de 135 KDa y la otra alrededor de 250 KDa. AI parecer, la diferencia en el peso se debe la presencia de una gran cantidad de glucosilacin uno de los en tipos moleculares. Wallis y col. (1997) reportaron que Aspergillus niger produce dos invertasas que Se Secretan y quepresentancaractersticas muy semejantes, an cuandoson
sintetizadas a partir de dos genes diferentes. Se les diferencia por la cantidad de28
glucosilacin que contienen, aunque, no queda claro responden a diferentes condiciones de cultivo.
si se trata de genes que
ProteasasLos hongos filamentosos soncapaces de secrletar cantidades muy la degradacin stas de por grandes de las proteasas
protenas al medio de cultivo, pero
secretadas al mediodecultivodisminuyeengran cultivos (Archer, 1994). Se han buscado variosmtodosparadisminuir cultivos de hongos filamentosos.Unodeellos utilizadaparadisminuir
medida el rendimiento de los
la secrecindeproteasasenes la inmovilizacin,que
los
ha sido
la produccindeproteaslasporLiu
y col. (1998), quienes
demostraron que al cultivar Aspergi//us niger sobre partculas metlicas recubiertas con ltex se secretaron menores cantidades de proteasas y mayores cantidades de glucoamilasa. Desde 1993, RamamurthyyKothari,mostraronquealcultivar superficie produjeron se menos proteasas que lquida.Porotraparte,los trabajosdeAguilar Rhizopus sp,
en
en los cultivos fermentacin eny Diaz-Godnez(comunicaciones
personales), dado han indicaciones que de
al cultivar a
Aspergillus niger en
fermentacinslidasesecretaronmenorescantidadesdeproteasasal cultivo.
medio de
Antecedentes.
A continuacin se presenta un resumen de los trabajos que comparan la produccin
de metabolitos en fermentacin slida y liqulda y que se han publicado durante los ltimos aos: Ramesh y Lonsane, (1991a) cultivaron Bacillus lichenifomis en fermentacin lquiday slida para producir a-amilasa y compararonambos tipos de cultivo. En FL se
produjeron 480 U/ml de extracto a las 60 horas de cultivo y al aadir 1YO de glucosa al medio de cultivo solo se obtuvieron 30 U/ml. Mientras que en fermentacin slida se produjeron 13860 U/ml de extracto a las borlas de cultivo. 48
El anlisis de la concentracin de glucosa libre en ambos medio dio un 0.2% en FLcontra un 8.5% de glucosa libre en el salvado de trigo donde se llevo a cabo la FS, esto es una concentracin 42 veces mas alta de glucosalibre en FS comparada conFL.
La presencia de 1% deglucosaen
el mediodecultivodisminuy
en un 84
OO /
la
produccin de a-amilasa en FL. La produccin de a-amilasa fue 29 veces mas alta que en FL, la productividad enzimtica de la fue 36 veces ms altaque en la FL. FSLa presencia de una alta concentracin de substrato sin represin catablica,permite
la produccin de altos niveles de enzima productividad del medio slido
y por lo tanto es la responsable de la alta
Posteriormente Ramesh y Lonsane, (1991b) estudiaron el efecto del tipo de cultivo sobre represin la catablica delichenifomis. Encontraron que
la produccin de a-amilasala presencia mas de
por Bacillus
de 1% de glucosa
inhibi30
225707totalmente la sntesis de a-amilasa en FL, mientras que al aadir un 15% de glucosa se incremento en un 50% la produccin de amilasa de la FS. en FS no se observ efecto de represin, y esta cantidad de glucosa acort el tiempo de produccin de 71 a 48 horas. Formulan la hiptesis que en la FS s8 forman gradientes en la vecindad del organismo debido a la falta de mezclado, dle tal manera que la concentracin
local de substrato es menor ala real. Por lo que el organismo puede desarrollarse sin
represin catablica. Sols-Pereira y c o l . (1993) compararon la produccin de pectinasas por Aspergillusniger enfermentacinslida
y lquida.Aadieronconcentraciones
3.5 a 10% de
sacarosa, glucosa y cido galacturnico al medio de carbono. Con adicin de 3.5% la de monosacridos se inhibi la produccin de endopectinasa, pero en fermentacin slida la adicin de hasta un produccin de pectinasas exopectinasas queenla10% de monosacridos result en el incremento de la
19 veces endopectinasas mas
y 4.9 veces mas
FS controlsinmonosacridos.Seacumularonazucares de en el
reductores en FL, pero no se acumularon en FS, encontraron que la produccin pectinasas estarelacionada con la concentraci6ndeazcaresreductores
medio de cultivo.Atribuyeronestasdiferencias
a lafalta de mezcladoen FS y a
problemas de difusin de los nutrientes en FL, un papel importante a la presencia de altos niveles de azcares reductores que producenrepresin catablica en FL y queno estn presentes en FS.
Antier y col. (1993) obtuvieroncepasde
Aspergillus niger sobreproductorasdey fermentacin liquida. Las
pectinasas especializadas fermentacin para s6lida
31
cepas sobreproductoras en fermentacin slida resultaron productoras mediocres en fermentacinlquida y viceversa. Esto sugiere l idea de lapresenciadegrupos a genes bajo regulacin pleiotrpica que le permiten a las cepas presentar resistencia 2DG a y una menor represin catablica en la produccin de pectinasa
especializadas para FS yFL . Lekha y Lonsane (1994) compararon la produccitjn de tanasa porAspergillus niger
en FS sobre bagazo de caa,FL, fermentacin lquida superficial. Encontraron quela produccin de tanasa en FS fue de 150 U/ml a las 96 h de cultivo, mientras que en FL obtuvieron 50 Ulml a las 144 h de cultivo, la produccin de tanasa fue cerca de 3 veces ms grande en FS que en FL, y se necesito menor tiempo para obtener la
produccin mxima, por lo que la productividad de FS fue 5 veces mayor que la de FL. La tanasa producida en fermentacin slida fue totalmente extracelular, mientras que fue totalmente intracelular en FL durante las primeras 48 horas de cultivo. La
tanasa obtenida por FS present una mayor estabilidad a temperaturay pH extremo que las producida por FL. Atribuyeron estas diferencias a cambios en la expresin y conformacin de las protenas, as como a una secrecin activa la tanasa en FS. de Acua-Argelles y col., (1995) compararon la produccin de pectinasas por A. niger en fermentacinlquida y fermentacinslidasobre bagazo decaa.Losttulos
enzimticos fueron 3 a20 veces ms altosy se obtuvieron entre 24 y 72 horas y ms rpido en FS que en FL, la FS result ser entre 6 y 51 veces ms productiva que laFL, dependiendo del tipo de enzima. Atribuyen estas diferencias a
la presencia de
altas cantidades de azcares reductores en la FL, no se acumulanen la FS y por clue
32
ende suponen la existencia de represin catablica en lquido que no se presenta en slido. Lapadatescu yBonnarme, (1999) compararon la1 produccindearomatizantesporBjaerkandera adusta
en fermentacin lquida
y slida sobre salvado trigo. de
Obtuvieron la mxima produccin con 0.34 @Kg de materia hmeda a los 4 idas en FS y 0.04 g/l de medio a los 8 das en FL. La prloduccin result ser casi 10 veces mayor en FS y la productividad de los cultivos de fue 27 veces ms altaque la de IFS
los cultivos de FL. Atribuyeron el buen comportamiento del hongo en FS a que lascondiciones de cultivo son muy parecidas a las de su habitat natural. De los trabajos anteriores se puede extraer siguiente informacin relevante: la FS 5. La produccin de metabolitos en es mayor y los picos se obtienenen menores tiempos de cultivo. Por lo tanto los cultivos de FS son mas productivos que los de FL, pero las razones de esto son desconocidas.6. La menor represin catablica en FS se asociia con la mayor productividad este
tipo de fermentacin.Aunquesedesconoceelnivel resultado.7. La presencia
de participacin en este
de azcares reductores en
FI- y su ausencia en
FS ha sidoen la
relacionada varios por autores
con las diferencias que se presentan
represin catablica de ambos sistemas de cultivo.8 . La formulacin de la hiptesis de que las diferencias entre FS y FL podran estar
relacionadas con las formacin de gradientes en FS.
33
9. El que todos estos trabajos sido han llevados sobre cabo soportes a blodegradables. Esto impedido ha crectmlento y produccln enzimtica. la obtencin parmetros de cinticos de
Justificacibn Las cttas antenores reportan muchas ventajas de la
FS sobre la FL, pero se dan
tambten una serte muy amplia de posibles explicaciones. De acuerdo con Pandey y col. (1999). es clara la ventajade la FS sobre la FL, pero hasta el momento se ignora cul es la razn exacta de esta mayor productividad de la FS. Esta diferencia puede deberse mayor a una productividad la de biomasa, mayor a un rendimiento enzlmatlco porgramo de biomasa,aunamenordesrepresincatablica
o a la
combmactn de vanos de estos factores. Saber cul
es el origen de las diferencias
ms Importantes entre ambos sistemas de cultivo puede ser de gran inters para el diseo, operacin y mejoramiento de la produccicin, pero la falta de estudios bsicos de laFS, comounadeterminacindirectade
los parmetrosdecrecimiento
y
produccin enzimtica ha impedido que se determine de manera clara cuales son las razones de la mayor produccin enzimtica en este sistema de cultivo. Por esto en este trabajo nos proponemos responder a cual 'de estas posibles razonesprincipales para explicarlas diferencias reportadas entre y FL. FS
son las
La seleccln del sistema modelo de la produccin de invertasa por Aspergillus niger, para el estudio de las diferencias existentes entre FL y FS, se bas en los siguienteshechos
34
" "
Aspergillus niger esunhongofilamentosoqueseempleaampliamenteparaobtencin de enzimasycidoctrico
la
a nivelindustrial.Ademhs,
es unorganlsrno
modelo muy utilizado para e estudio del crecimiento y la secrecin de enzlmas por l hongos filamentosos. La invertasa es una enzima modelo muy adecuada para el estudio de la produccln y secrecin enzimtica. Ha sido estudiada a fondo durante los ltimos aos. se conoce la secuenciacompletade
los dos genesdeinvertasade
Aspergillus mger y se
conoce que en condiciones normales solo se expresa uno de estos genes.
Objetivos
Describir y comparar el crecimiento, produccin enzimtica substrato en
y consumo de
Aspergillus niger durante su cultivo en fermentacin liquida y
fermentacin slida. Documentar y comparar el tipo y las condicioines de cultivo de Aspergillus niger crecidos en fermentacin lquiday fermentacin slida.
36
Hiptesis
Se supone que
la mayor productividadla de fermentacin slida
sobre la
fermentacin lquida, es debida principalmente una mayor y ms rpida produccin a de biomasa en fermentacin slida, dando como resultado acumulacin de enzimas hidrolticas en medio dle cultivo. el un mayor y mas rpida
37
Material y Mtodos
Microorganismos:Seutilizarontrescepasde
Aspergillus nlger. C28825 que fue
y recolectada de un cafetal de Chiapas seleccionada como productora de pectinasas
por Boccas y col. 1994); Aa20 proveniente del cepario UAM-IRD y la cepa sllvestre N402, ampliamente utilizada como modelo cepa para estudlar la genetica de
Aspergi//us niger (80s y col., 1988). Todas las cepas fueron mantenidas en wales de
resiembra con medio PDA a 4 C y se resembraron cada 4 meses. Los cultlvos para O inculo se cultivaron en PDA durante las 72 horas previas a las fermentaclones
Medios de cultivo: Se formul el medio de cultivo en (Pontecorvo y col.1953)modificadode
base al medlo de Pontecorvo
la siguientemanera, NaN03 15.0, KHzP04
1.76, KC1 0.76, MgS04 0.76, FeC12 0.001, CuSO, 0.001, MnCl 0.001, ZnCl 0.001 en g/l. El pH del medio se ajust a4.5 y se aadieron 100 g/l de sacarosa, el medio
completo se utiliz diluido hasta ajustar la concentracin iniclal de sacarosa a 6.25, 12.5, 25, 50 y 100 g/l. el medio se esteriliz a 1O PSI por 15 mlnutos La inoculacin se realiz con 2 x
lo7 esporas por gramo de fuente
de carbono. El mismo medio
inoculado se reparti enlos cultivos lquido y slido.
Fermentacin Lquida: La fermentacin lquida se realiz en matraces Erlenmeyer de 125 ml de capacidad, llenos con 25 ml de medio ya inoculado Se incubaron a 3OoC en una incubadora orbitala 200 r.p.m. por el tiempo requerido
38
-
" "
FermentacinSlida:
25 ml medio de inoculado mezclaron se con
1 gramo de
poliuretano estril preparado como se describe adelante dentro de un matraz de miis Erlenmeyerde cosecharlos.250 mi. Seincubarona 3OoC por el tiemporequeridoantes
de
Preparacin del Poliuretano: La espuma de poliuretano con una densidad media de17 Kg/m3, se comprde un proveedor comercial, se cort en cubos de 5mm por lado
y se lav dos veces con agua caliente. El poliuretano ya lavado se escurri se sec y
en un horno a 70 C durante toda la noche. Posteriormente, se introdujo 1 gramo de poliuretano seco en cada de uno los matraces Erlenmeyerse y esteriliz en
autoclave a 15 psi por 15 minutos.
Determinacin de la Biomasa en Fermentacin Lquida: Los cultivos de fermentacin lquida se retiraron en los tiempos adecuados y se filtraron a travs de papel filtro
Whatman No. 1; la biomasa retenida se lav con 1O m de agua destilada y se sec 0 1 en el horno a 7OoC, ocasionalmente una cuarta parte utilizparadeterminar de la biomasa se retir y se
la actividad de invertasaintracelular, en estos cultivos la medio de la fraccin usada para la determinacin de la
biomasa se determin por biomasa seca.
Determinacin de la Biomasa de Fermentacin Slida: El poliuretano utilizado para el crecimiento del hongo se extrajo del matraz y se presion para obtener el extracto de39
fermentacinslida;estepoliuretanolavado fraccin de pesosecopertenecientea gramo en pesofresco
SE! seca
7OoC, paradeterminarla
la biomlasa. Ocasionalmentese utiliz uny se
del poliuretanoparadeterminaractividadintracelular
procedi igual que enFL.
Determinacin de la Evaporacin del Medio de Cultivo en fermentacin slida: Se prepararon 4 matraces de peso seco conocido con un gramo de poliuretano estril,
se les aadieron 25 ml de medio estril a dos de ellos y 25 ml medio inoculado a otros dos. Se determin el peso total al inicio y c;Bda 24 horas hasta las 72 horas de cultivo. Al final se extrajo el poliuretano, se lav con50 ml de agua destilada y se
determin la cantidad de biomasa producida.A partir de estos datos se determin la y cantidad de agua evaporadaen los matraces con sin micelio.
Extraccin de Enzimas: Los extractos de fermentacin lquida se filtraron a travsNo. 1. El filtradoseensayfrescoparadeterminar
de papel filtro Whatman
la actividad de invertasa. La
enzima de FS se extrajo por presin suave del polliuretano. lquido se filtr a travs El de papel filtro WhatmanNo. 1. El filtrado se utiliz fresco para determinar actividad la de invertasa.
ExtractosIntracelulares:
Los extractosintracelularesseobtuvieron
congelando el
micelio o el micelio ms el poliuretano y molindolo en un mortero fro hasta obtener un polvo fino que se resuspendi en buffer fro de acetatos0.1 M (pH 5 4 , la parte40
soluble se separ por filtracin se ensay en menos de horas. A la parte insoluble y 6 se le determinlaactividaddeinvertasasinencontraractividadsignificativa ninguno de los dos sistemas de cultivo. en
Ensayos Enzimticos: Laactividaddeinvertasasedeterminpormedio reductores, los cuales se determinaron por de la liberacindeazcares DNS (Miller, 1959). Las condiciones de
ensayo fueron 30 minutos a 3OoC, , 0.1 M de sacarosa 0.35 ml, buffer de acetatos O.?
M con pH 5.5, 0.5 ml y se utilizaron 0.15 ml de extracto enzimtico diluido
de ser
necesario. Una unidad enzimtica se defini como la cantidad de enzima necesaria para liberar un micromol de azcares reductores por minuto.
Aspartato-amino-transferasa: La
Aspartato-amino-transferasa se determin porcomo
medio de un kitenzimtico de Manhiem Boherinlger. Estaenzimaseutiliz marcador de protenas intracelulares en medio extracelular. el
Determinacin de Actividad de Proteasas: Las proteasas se determinaron acuerdo de con el mtodo de Chavira y col. (1984) por medio de la liberacin del grupo azo del azocoll (Sigma, USA) se incub a3OoC por 15 minutos en un mililitro de buffer de
acetatos 0.1 M pH 4.5 y 50 microlitro de azocoll con 200 microlitros de extracto, una unidad se define como la proteasa necesaria para incrementar la absorbancia de la mezcla de reaccin en0.01
Determinacin de Azcares Residuales: Se utili26 un
kit enzimtico de Boehringer-
Mannheim, No 716-260 para poder determinar los niveles de sacarosa, glucosa y fructosa en los extractos de fermentacin.
Clculo de Variables de Crecimiento: La velocidad de crecimiento(p) se estim por medio de ecuacin logstica: la
X =X 1 [ / ,
+ C*exp (-@)I
Donde, C = (X,,,-X,)/X,,
siendo X, el valor puntual de la biomasa, X (gX/I), el valor .
inicial de biomasa en (gX/I), Xmax el valor mximo de biomasa (gX/I), p, la velocidad especfica de crecimiento (l/h) y t el tiempo de cultivo(h). Para estimar el valor de 1.1 se ajustaron los datos experimentales por la minimizacin de la sumadelos errorescuadradosusandounalgoritmoNewton-Raphson
de
optimizacin presenteen el programa E c l de Ofifice Microsoft. xe
El rendimiento de enzima por gramo de biomasa producida (YEM=u/gx), se estim
considerando a YWX AUAX. Donde, E es la produccin enzimtica en U/I y X es la = produccin de biomasa en gX/I. Se ajust una recta a los datos experimentales por el mtodo de mnimos cuadrados.Solo se consideraron adecuados los ajustes con unaR2 mayor a 0.85.
La productividad enzimtica (P=U/lh). fue estlmacla en termino del lquido empleado en el valor pico de producci6n enzlmtlca en ambos tipos de cultivo cada una de para las cepas.
El rendimientodebiomasa
por gramodesubstrato
consumido (Yxls=gX/gS),se la cantidad de substrato
calcul dividiendo biomasa la maxlma obtenlda entre consumido por el hongo durante lafermentaaon.
La tasa especfica de consumo de substrato (qs=gS/gXh), se calcul al de dividir el valor de lap entre YXJS para cada unode los cultlvosanalizados.
La tasa especfica de produccion enzimtica
q p (U/gXh), se calcul por el producto
de el valor de la p por el valorde la YE/Xpara cada uno delos cultivos analizados.
Los resultados presentados en la tabla 3.2.3 se compararon por anlisis de varianzade una sola va ( prueba de F) con dos nlveles dle significancia estadstica pc0.01 ** muy significativa (**)( y ~ ~ 0 . 0 5 slgnlficatlva (.). consideraron no significativas. El resto de las diferencias se
Microfotografas: Las microfotografias se obtuvieron por medio de unfotomicroscopioNIKON modeloHFX-DX,dotadodeIluminacinporcampoclaro,
interferencia de
fasesiluminacln e Indirecta fibra por ptica. fotografas tomaron Las se ampliaciones de SOX a 400X. tal como se indica en cada imagen.
con
44
. "
1 _ _ 1
" .
.-
3 Resultados y discusin 3.1 Efectodelaconcentracininicial desacarosasobre la produccinde invertasa por Aspergi//us niger en fermentacin slida y lquida.
Se compar el efecto de la cantidad inicial de substrato sobre el crecimiento y la produccin de invertasa por Aspergillus niger en fermentacin slida y fermentacinIqu ida
Lafigura
3.1.1 sepresenta
la produccindebiomasa
por la cepa C28825 conen fermentacin
concentracionesquevande liquida.
6.25 a 100 g/l de sacarosainicial
OI
12
24
I
36 Horas
48 72
60
Figura 3.1.1 Biomasa producida por Aspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida diferentes con concentraciones de substrato inicial, los valores experimentales se representan como smbolos y los valores ajustados por la ecuacin logstica se representan como lneas continuas.El cultivo con 6.25 g/l de sacarosa alcanz un valor de 1.6 g/l de biomasa mxima;
con 12.5 g/l de sacarosa inicial la biomasa se acumul hasta los 2.7 g/l; al aadir 25
g/l de sacarosa el cultwo acumul biomasa hasta 6.9
g/l; durante las primeras 60
horas de cultlvo, con 50 gA se observ que la biolmasa se acumul hasta un mximo de 11.3 g/l. con 100 g/l se obtuvieron 13 gll de biomasa. La biomasa seacumulentrelas24horas y las 60 horas en la mayora de los
cultivos y no se observaron diferencias delos tiempos de fermentacin, a pesar de la utilizac~n altas cantidades de sacarosa inicial como seria de esperar. Esto ya ha de sido reportado por Favela-Torresy c o l , 1996, quienes encontraron que al utilizar 50 o100 g/l de glucosa inlclal en cultivos de Aspergillus niger no hay efecto sobre
los
tiempos de germlnacln por la alta concentracin de glucosa y solo los cultivos con 200 g/l de glucosa mostraronun retraso en los tiempos de germinacin. La figura 3.1.2 muestra la produccinbiomasala C28B25 de de cepa en
fermentacin slida con concentraciones de 6.25 100 g/l de sacarosa inicial. a Se obtuvieron 2.7, 4.7, 8.7, 14 y 33 g/l de biomasa mxima con 6.25, 12.5 25, 50 y 100 g/l de sacarosa inicial respectivamente. Los tiemposde fermentacin necesarios para alcanzar la biomasa mxima con todas las concentraciones sacarosa fueron de menores en FS (alrededor de las 42 horas) que en FL (alrededor de las 60 horas). Estos tiempos son parecidos a los reportados por Favela-Torres col, 1996, quienes y observaron que son necesarias 40 horas de cul1:ivo en la fermentacin slida y 60
horas en la fermentacin liquida para llegar a la mxima acumulacin de biomasa de
los cultivos utlltzando 50 y 100 gil de glucosa. Las curvas de crecimiento sontambinmuy pareadas a las reportadas en ese trabajo.
46
-.
35
30h
-2 3m
25
2015
cn
O .-
m 10
5
OO12 24HorasFigura 3.1.2 Biomasa producida por Aspergi//us niger C28B25 en fermentacin los valores slida con diferentes concentraciones de substrato inicial, experimentales se representan como smbolos y los valores ajustados por la ecuacin logstica se representancomo lneas continuas.
36
48
En la figura 3.1.3 se presenta la produccin de irlvertasa por 6.25 a 100 g/l de sacarosa inicial.
Aspergillus niger, con
La actividad mxima de 215 U/I de invertasa se alcanzaron en el cultivo con 6.25 g/l de sacarosa inicial, con 12.5 g/l. Se obtuvieron 244 U/1, con 25 g/l se obtuvieron 350U/I. AI utilizar 50 g/l de sacarosa se alcanzaron 500 U/I de invertasa y el cultivo con1O0 g/l de sacarosa inicial produjo 1380U/I. El incremento con 1O0 g/l no corresponde
a lo esperado con la hiptesis de que una alta cantidad de sacarosa en el substrato inicial debe resultar una produccin en baja enzimtica debida a catablica.la represin
O!
12.
24
Horas
36
48
60
72
Figura 3.1.3 Produccininvertasa de por Aspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida con diferentes cantidades de sacarosa inicial. AI comparar esta figura con la de crecimiento se puede observar que el aumento en
la produccin de invertasa con 100 g/l es mayor al aumento
de la biomasa de los
mismos cultivos. De hecho parece que puede dividirse en dos grupos con el de 100 gll de sacarosacomouncultivo
sui generis, quenoparecepresentarrepresin
catablica, pero, si muestra limitaciones en la biomasa producida por el cultivo. Esto puedeexplicarsedeacuerdoconXuy col.(1989) y Kubicek-Pranz y col. (1990)
quienes afirman que la presencia de 50 gramos o ms de una fuente de carbono de fcil asimilacin sacarosa como o glucosa la induce sntesis alta de unala velocidaddela
concentracindeFru-6P.LaconcentracindeFru-6Pregula
gluclisis, lo que a su vez modifica la concentraclin de piruvato resultante, afecta la velocidad del ciclo de Krebs medio la por de regulacin de sintetasa.CuandolaconcentracindepiruvatoES
el cual la citrato
muyalta,
la Fru-6Pse
desvia
hacia el ciclo de las pentosas, y provoca la substitucin del ciclo de Krebs por el ciclo anaplertico del citrato, en el cual no se produce NADH. Todo utilizar a la gluclisis como fuente principalde lo anterior obliga a un mayor
ATP, lo queobligaa
consumo de glucosa y fructosa. Lo que de acuerdo con Nielsen, (1992) podra ser responsable de una produccin aumentada de invertasa en cultivos lquidos con alta concentracin de sacarosa o glucosa. En la figura 3.1.4 se presentan las curvas de produccinde invertasa por Aspergillusniger C28625 conconcentraciones crecientes de s8acarosa inicial.
5000n
\
4000
"m 0 0 0 3u?c1
3
a
20001 O00
S -
>
OO12
24 Horas
36-_
48
Figura 3.1.4 Produccin de invertasa por Aspergi//us niger C28825 en fermentacin slida con diferentes cantidades de sacarosa inicial.Los cultivos con 6.25 g/l de sacarosa produjeron 220 U/I de invertasa, con 12.5gil de
sacarosa la produccin mxima de invertasa se alcanz con 713 U/I, en los cultivos con 25 g/l de sacarosa la invertasa lleg hasta 2128 U/I, con 50 g/l de sacarosa se
alcanzaron las 3460 U/I, al aadir 100 g/l de sacarosa inicial al cultivo se obtuvieron4650 U/I de invertasa.
La figura 3.1.5 muestra la concentracindeazucares lquida.
residuales en fermentaen
. "
+6.25 "12.5 +25
-
~
* "IO
g
g 9 g
-
I
I
i
O
12
24
36 Horas
48
60
72
Figura 3.1.5 Concentracindeazcaresresiduales (Az Res)en cultivos de Aspergillus niger C28825 en fermentacin lquida con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
En la figura 3.1.5 se observa que durante la fase die adaptacin de los cultivos (24 h) elconsumo de sacarosafuemuybajo.Despusde consumida de manera continuay se agot entre
este tiempo, la sacarosa fue las 60 y las 72 horas decas1
fermentacin.Esdeespecialintersindicarquelasacarosafueconsumida
totalmente en todos los cultivos, hasta en aquello:; con 100 g/l de sacarosa, ya que
en este cultivo el consumo de la substrato resulta muy alto dada la baja cantidad de biomasa que se produjo. En la figura 3.1.6 se muestra la concentracin fermentacin slida. de azcares residuales en
+6.25 gi -4- 12.5 gi
~
20 10
O O12
24 Horas
36
48
Figura 3.1.6 Concentracindeazcares residuales (Az Res) en cultivos de Aspergillus niger C28B25 en fermentacin slida con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
El consumo de sacarosa en fermentacin slida se inici tras 12 horas, lo que podracorresponder con el tiempo de germinacin de los cultivos. La sacarosa se agot alrededorde las 42 alas48 horas en todos
los niveles desacarosa inicial. El
consumo total de sacarosa se llevo en menor tiempo en fermentacin slida que en fermentacin lquida y esto se correlaciona con 10s resultados presentados en esta seccin,donde
los cultivosslidos tienen unamayorvelocidad
de crecimiento y
51
mayores rendimientos de biomasa por fermentacin lquida. La figura
g de substrato
ms altos que en la
3.1.7 muestra los perfiles de pH cultivo de
de Aspergi//u niger en
fermentacin lquida con cantidades crecientes de sacarosa inicial.
7I
1
5
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4.5 4
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I
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I
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36Horas
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72
Figura 3.1.7 Perfil de pH de cultivos de Aspergilhs niger C28825 en fermentacin lquida con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
Puede observarse que todos los cultivos presentaron un descenso en el valor de pH durante el tiempo de cultivo, y esta disminucin es; mayor al aumentar de la cantidad desacarosainicial.Enespecial
os cultivoscon 50 y 100 g/l desacarosalos tiempos finales
inicial de
mostraron una mayor disminucin durante del pH
fermentacin. Este comportamiento, unido a la baja produccin de biomasa, podra atribuirse a la produccin de cidos orgnicosy polioles liberadosal medio de cultivo.
52
En la figura 3.1.8 puede observarse quelos cultivos siguieron perfilesde disminucin de pH muy parecidos entre s y que el cultivo de 6.52 g/l en medio slido mostr un pequeo ascenso del pH al final de la fermentacidm, mientras que el cultivo de 100 g/I desacarosapresent
los valores ms bajos de pH detodos.
Los valoresde pH
fueron en casi todos los casos general mayores que los obtenidos en fermentacin lquida. Lo que indica una menor produccin de cidos orgnicos en fermentacin slida
~
5.5
I
II!
s4.54
1j
i
/I, I 11
3.5
1 I i
32.5
1
O
12
24Horas
36
4E
Figura 3.1.8 Perfil de pH de cultivos de Aspergillus niger C28825 en fermentacin slida con diferentes cantidades cle sacarosa inicial.
En la tabla 3.1.9 se muestran los valores obtenidos para los parmetros cinticos deAspergillus niger en fermentacin slida y liquida con concentraciones crecientes de
sacarosa inicial, como fuente carbono. deTabla 3.1.9 Parmetros calculados para slida y lquida.qP
Aspergillus niger en fermentacin
Lquido Slido22.1415.66
14.30 27.35
7.33 70.045.49
41.36
11.77 33.25
Se muestran los valoresobtenidos de los ajustesdela
p,la Y m , junto con los .
valores de correlacin de los valores experimentales y los valores calculados para ambos parmetros. Los valores de correlacin de los ajustes son altos para ambos parmetrosEs de especial importancia comentar los altos valores de correlacin de los ajustes
de la YE/Xlo que nos permite afirmar que la produccin de invertasa esta al menos parcialmente relacionada con la produccin de biomasa en ambos tipos de cultivo,
54
.
. .. "
. "
.-
sin embargo el nivel de anlisis de este trabajo impide determinar el nivel exacto de relacin entre ambas. Las tendencias de los valores se presentany anallizan en las paginas siguientes. La figura 3.1.10 muestra los valores de p obtenidos para los cultivos de fermentacin lquida y fermentacin slida de Aspergillus niger con concentraciones crecientes de sacarosa inicial.
0.3~
0.25n
0.2
c
t 0.15i
o. 10.0 5
O
Figura 3.1.10 Velocidad especfica de crecimiento (p) de Aspergillus niger C28625 condiferentesconcentracionesde substrato inicial en fermentacin lquida (O) y fermentaci6n s6lida (O).
Los cultivos de fermentacin lquida presentan valores
de p entre 0.1 a 0.14 con un
mximo de O. 17 a los 12.5 g/l de sacarosa inicial. Los cultivos de fermentacin slida estn entre 0.15 a 0.22, con un mximo de 0.26 con 25 g/l de sacarosa inicial. coeficiente de correlacin (
E l
?) entre los valores experimentales y los ajustados por la
ecuacin logstica fueron superiores a 0.98 en todos los casos. Las curvas de p en lquido siguen tendencias slido y en muy parecidas aunquelos valores de
55
fermentacinslidasonmayoresque
los de felrmentacln
liquidaparatodos
los
valores de sacarosa inicial, las diferencias no son muy grandes. En lafigura 3.1.11 se muestran los valores de biomasa mxima obtenidos en cultivos de fermentacin slida y lquida.
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Figura 3.1.11 Biomasa mxima (Xmax) producida por Aspergillus niger C28B25 con diferentes concentraciones de substrato inicialen fermentacibn lquida (O) y fermentacin slida (O). EnestafigurasepuedeobservarqueenFL, la biomasaseacumulde
manera
proporcional al aumento de la sacarosa inicial de 6 25 hasta 25 g/l; pero al aumentar
la sacarosa, la biomasa mxima aumenten menor medida. Los valores de biomasamxima obtenidos en FS aumentaron con la concsntracrn de sacarosa inicial todas las concentraciones iniciales de sacarosa.Los valores obtenidos para las concentraciones
para
die 50 y 100 g/l de sacarosa en FL
son parecidos a los reportados por Favela-Torres y col. (1996 y 1998), en donde se
reportaron valores de alrededor de 15 gA de biomasa al cultivarA. niger con 50 y 1O0 g/l de sacarosa como fuente de carbono. Lo obtenida en fermentacinslidamismo
pasa con el valor de biomasa
con 100 g/l de sacarosa, de 32 g/l,valormuy y col. (1996, 1998)
parecido al reportado en ambos trabajos Favela-Torres de
cultivando A. niger en amberlita con 100 g de glucosa como fuente de carbono. Sin A embargo, los valores reportados en 50 gil de glucosa son de 33 g/l, mientras que en este trabajo se obtuvieron 14 g/l. Es difcil explicar esta diferencia en los valores de50 g/l de sacarosa inicial y de hecho los valores reportados por Favela-Torres y col.
(1996, 1998) estn por arriba de los valores normales reportados para esta cantidad de carbono (alrededor de 209/1). Esta diferencia puede estar relacionado al hecho de que en esos trabajos la biomasa no se determin de manera directa, sino por medio de la determinacin de las protenas presentes en el cultivo, de manera que si por alguna causa se sobreproducen protenas los valores dela biomasa que se obtienen seran mayores a la biomasa real obtenida. La diferencia en la biomasa mxima se acentu al aumentar la concentracin inicial de sacarosa inicial. Esto ha sido atribuido a la limitacin en la capacidad de
crecimiento de Aspergillus niger en FL conaltasconcentraciones
de fuente de
carbono. En este caso el factor limitante obvio paIra el crecimiento de A . niger es la disponibilidad de oxgeno debido a la baja solubilidad del oxgeno en el medio de
cultivo, lo que ya ha sido postulado en el trabajo de Righelato (1975), quien reporta que la limitacin de la cantidad de oxigeno en el medio de cultivo limitael crecimiento de los hongos filamentosos. A pesardeserorganismosaerbicosestrictos son
57
capaces de crecer con concentraciones de oxgeno muy bajas, pero requieren
de
altas concentraciones de oxgeno enel medio para alcanzar crecimiento mximo. su Mavituna y Sinclair, (1985) puntualizaron esta limitacin de la fermentacin lquida
con la siguiente frase: Es posible suplementar fiiicilmente altas concentraciones de substratosa
los cultivoslquidos,peroalgunosslidos
no solubles,lquidos
que
forman fases o gases poco solubles como el metano1 y el oxgeno, representan un problema importante para este tipo defermentacidin, de todos estos, esel oxgeno el ms importante, de hechola mayora de los procesos microbianosque se realizan en fermentacin sumergida estn limitados por oxgenlo. En la figura 3.1 . I 2 se muestra el perfil de rendimiento de biomasa por gramo substrato consumido (YWS) fermentacin slida y lquida. ende
I m~
m0.4
! m
1
0.1
i
O
25
,
50 so (g/I)
75
100 1
Figura 3.1.12 Rendimiento debiomasa por gramo de substrato consumido (YNs) por Aspergillus niger (28625 en fermentacin lquida (O) y fermentacin slida (U) con diferentes cantidades de substrato inicial.
58
__
En fermentacin lquida puede observarse que el
YX/Saumenta hasta 25 g/l con un
valor mximo 0.27. AI aumentar la concentracin inlcial de sacarosa hasta 100 g/l se observauna cada importanteenelrendimientodelcultivo,hasta0.15.En
FS se
observa una disminucin del rendimiento del culttvo al aumentar la sacarosa de a 6.225 g/l de 0.45 a 0.36, mientras que al incrementar la sacarosa de 50 a 100 g/l la YwS
se mantiene alrededor de 0.3, por lo que no se observan diferencias importantes en el rendimiento de la fermentacin slida con altas concentraciones de sacarosa. Aun cuando los valores de YNS de fermentacin lquida son menores los reportados a por Favela-Torres y col. (1996) para la fermentaclln lqulda. Los valores de biomasa obtenidasonmuyparecidosenamboscultivos.Por
lo cual, la diferenciaenlos
valores de la YX/Spuede deberse a quelos cultivos de este trabajo consumieron ms substrato.Ladisminucindel YX/S en los cultivoslquidosconaltaconcentracin
inicial de sacarosa podra estar relacionado con la baja velocidad de transferencia de oxgeno en este tipo de fermentacin, puesto que es bien sabido que los matraces en agitacin (FL) no permiten una buena transferencia de masa cuando la demanda de oxgeno es alta (Pirt, 1975). desviacin metabolismo del Deacuerdocon la literatura esto podra resultar en la
haca la sntesiscidos de orgnicos
y polioles.
Provocando una menor conversin del carbonodel substrato en biomasa (Righelato, 1975). otra Por parte en fermentacin slida la transferencia oxigeno de podra
realizarsemsrpidamentedebidoaque
existe solounadelgadacapadeagua
entre el aire y la biomasa, lo que puede permitir un metabolismo aerbico con alto rendimiento de biomasa.
De acuerdoconRighelato(1975)yFavela-Torres
y col.(1998),elcrecimientode
Aspergillus niger enfermentacinlquidaestlimitadopor
la concentracin de en el medio de cultivo.
oxgeno en los cultivos debido a la baja solubilidlad de este
Esto est de acuerdo con Berry y col. (1977) quien afirma que la baja tensin de oxgeno en los medios de cultivo induce rutas metablicas disminuyen que produccindebiomasayprotena la
en los cultivos lquidos de Aspergillus sp. De
acuerdo con Mukhopadhyay y Ghose (1976), en muchas fermentaciones aerbicas, el crecimiento celular vara con niveles de oxgeno la capacidad de aireacin del sistema. Cuando
losel
en el medio de cultivo se vuelven limitantes para
microorganismo, la fosforilacin oxidativa se desacelera y
la gluclisis se convierte
en la fuente principal de ATP. De tal manera que, una disminucin importante en la cantidad de oxgeno disponible representa disminucin grande una muy de la
cantidad de energa disponible para la clula y, por lo tanto, para su crecimiento. Se requierenexperimentosadicionalesparaprobardemaneradirectaestaidea, cuales se enumeran la seccin de propuestas. La figura 3.1.1 muestra 3 la tasa especfica de consumo de substrato(qs) de
los
Aspergillus niger en fermentacin slida y liquida, con concentraciones crecientes de
sacarosa inicial. La tasa especfica de consumode substrato en fermentacin slida es muy parecida a la de fermentacin lquida para las concentraciones de sacarosa inicial estudiadas.El valorquepresentadiferenciasmsgrandesson
los de 100 g/I,con 0.7 para
fermentacin slida y 0.94 para fermentacin lqui'da. Los cercano de los valores de
debe a que en lquido hay una menor cantidad de biomasa, substrato a una tasa mas alta.
pero esta consumi el
~
0.75m
I
O
Figura3.1.13Tasa especfica deconsumode substrato (qs) de cultivos de Aspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida (O) y fermentacin slida (O) con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
Los resultados presentados en esta figura coinciden con los resultados presentados con anterioridad en esta seccin y muestran de manera congruente que los cultivos defermentacinslidaparecennecesitarunamenor crecer en fermentacin slida en que ferment'acin cantidad de substratopara lquida. Esto podria estar
relacionado con un metabolismo aerbico de alta eficiencia en fermentacin slida y el metabolismo micro o anaerbico en fermentacin lquida. Este metabolismo
requiere de un mayor consumo de substrato que no es completamente oxidado y porlo tanto rinde unamenorcantidadde
ATP. Esto junto con la induccin derutaslos cultivos lquidos,61
metablicas de formacin productos de secundarios en
disminuye la cantidaddecarbonoquepuedeserasimiladoparalaformacin biomasa. Estos procesos pueden representados ser siguiente esquema, adaptado de (1975): Pirt De acuerdo al balance propuesto por (1975): Pirt de manera simple
de por el
Carbono total = Biomasa + C05 + Productos.
La cantidad de biomasa , C02 y productos suman el total de carbono consumido por el hongo y el destino final del carbono consumido depende de las condiciones cultivo, lacarenciadeoxigenoaumentara secundariosreduciendolasntesisde el flujo carbono de haca de
productos
ATP y poir ende la formacinde biomasa,
disminuyendo el valor de YNS,tal como se explic con anterioridad.
GLUCOSA
P,RODUCTOS SECUNDARIOS
Figura 2: Diagramasimplificadode hongos filamentosos.
la asimilacin y destino del carbono en
En la figura 3. l . 14 se muestran los valores de rendimiento de enzima de gramo de biomasa producida porAspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida slida. y
I
i
I
O
25
I
so
50
75
1O0
Figura 3.1.14 Rendimiento de enzima por gramode biomasa producida ( ) Y , de lquida (O) y cultivos de Aspergi//us niger C28B25 en fermentacin fermentacin slida (O) con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
La FS mostr un mximo de rendimiento por gramo biomasa producida con 25g/l de de sacarosa (270 UIgX). La Y w disminuy al (aumentar los nivelesdesacarosa inicial en el cultivo a 148 U/gX con 1 O0 g/l de sacarosa inicial. En la FL la actividad especifica de los cultivos disminuy al aumentar la concentracin inicial de sacarosa en el medio hasta los 50 g/l (44 U/gX). AI incrementarse la sacarosa a 100 g/l la YEX del cultivo aument a 86 U/gX. Este aumento parece estar relacionado con la
utilizacin de la gluclisis como fuente principal de ATP en los cultivos lquidos con altas concentraciones de sacarosa inicial, como sle explico anteriormente (Xu y col..
1989; Kubicek-Pranz y col., 1990; Nielsen, 1992) . Esto obliga a aumentar la sntesis de invertasa a fin de cubrir la mayor necesidad de glucosa como fuente de carbono para la produccin de ATP. El valor de la YVX se calcul por el ajuste lineal de los datos experimentales de la parte ascendente de la produccin enzimtica contra la produccin de biomasa para cada una de las condiciones estudiadas, los valores de correlacin entre los datos experimentales y las lneas ajustadas son muy altos, solo el de lquido con 6.25 g/l de sacarosa estuvo por debajo de 0.9. Esta alta correlacin
nos indica que la produccin enzimtica esta al menos parcialmente asociada la conproduccindebiomasaenambossistemas de fermentacin,aunquedebido al
mtodo de clculo no es posible.determinar el grado de asociacin que existe. Esto
nos permite afirmar que la mayor produccin de biomasamayor produccin enzimtica en fermentacin slida.
es la responsable de la
En la figura 3. l. se muestran los valores de productividad enzimtica de cultivos 15 de Aspergillus niger en fermentacin slida lquida. y
Figura 3.1.15 Productividad (P) de cultivos de Aspergi//usniger C28B25 en fermentacibn lquida (O) y fermentacin slida (O) con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
La productividad aumento en ambos tipos de cultivo, pero pas de ser igual con 6.25g/l de sacarosa inicial a ser mas de 5 veces mayor en FS (121 U/lh) que el valor de
FL (21 U/lh) con 100 gll desacarosa inicial. Estasdiferencias en los valores de
productividad comparativa de FS contra FL han sido reportadas antes
por diversos
grupos. Acua-Argelles y col (1995) reportan que la FS result ser entre 6 y 51 veces ms productiva que la FL dependiendo del tipo de enzima medida. Lekha y
Lonsane. (1994) reportaron que la productividad del medio slido para la produccin de tanasa fue 5 veces mayor en FS queen FL.En este caso la mayor productividad delos cultivos de FS es el resultado combinadode la mayor velocidad de crecimiento, mayor valor de YNSy el mayor valor de YUX el
de los cultivo de fermentacin slida comparados con la fermentacin liquida.
La figura 3.l. 16 muestra los valores de la tasa especfica de produccin enzimticaqp (U/gXh) obtenidos para cultivos de
Aspergillus niger en fermentacin lquida y
slida con diferentes concentracionesde sacarosa.
75
Figura 3.1.16 Tasaespecficadeproduccinenzimtica (qp) en cultivos de Aspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida (O) y fermentacin slida (O) con diferentes cantidades de sacarosa inicial. Las lneas punteadas muestran la tendencia de los puntos .
Como puede observarse en la figura 3.1.16, los cultivos de fermentacin lquida, en la tasa especfica de produccin enzimtica qp de FL disminuye hasta un valor de
5.5 U/gXh con 50 g/l de sacarosa inicial y aumenta hasta 11.2U/gXh con 100 g/l de
sacarosa inicial. Mientras que en FS el mximo se alcanzo con 70 WgXh con 25 g/l de sacarosa inicia y disminuy hasta 31 con 100 g/l de sacarosa inicial. Estas diferencias en metablicosparacada qp podran relacionadas diferentes estar con estados uno de los sistemasdefermentacin.Deacuerdo con los
66
"s ".
." . " . "I
resultados previos la diferencia
en la qp esta relacionada con la mayor velocidad
especifica de crecimiento y la mayor Y ~ de los cultivos de FS. x Una explcaan posible para el comportamiento de los cultivos de FL con respecto a la transferenciadeoxgenopodraestaren observ que la cantidad
los trabajosde
Sols (1969). Quien
de oxgenoel de en mediocultivo parece regular y bas en ellounmodeloderegulacinde
mdlrectamentelasntesisdeglu-6-P,
transporte de carbohidratos y metabolismoenlevaduras.Proponequeeloxgeno regula de manera indirecta la acumulacin de citrato al regular la velocidad de la fosfonlacin oxidativa, al cual a su vez controla la actividad de glucblisis, debido a la concentracin limitante oxgeno, dela hexocinasa en la
el metabolismo sera
desvlado haca la gluclisis y haca la fermentacin en las levaduras. Esto resulta eny el efecto Pasteur que se observa como una mayor produccin de hidrolasas mayor
consumo de substrato con bajo crecimiento. An cuando Nielsen (1992) puntualiz que los hongos no presentanel efecto Pasteur como tal, debido a que son aerbicos estrictos y no pueden generar suficiente energa para crecer por medio de la
conversin de piruvato en etanol, acetato lactato. Durante el cultivo lquido con baja o cantidad de oxgeno disuelto la fosforilacin oxidativa se convierte botella con la acumulacin de etanol, acetato, lactato en un cuello de
o intermediarios del ciclo dey col. (1 989) y por
Krebs por ejemplo cido ctrico, esto ha sido observado por Xu Kubcek-Pranz y col. (1990)
en Aspergillus niger, quienes observaron o glucosa por arriba de
que al
aumentar la concentracin de sacarosa
50 gll se satura la
fosfori~acinoxidativa y se acumula citrato como una manera
de poder desviar el
exceso de glucosa utilizada en la gluclisis. Carter y Bull (1 969) encontraron que la67
disminucin de la concentracinoxgeno de disuelto resulta distribucin de glucosa
en una mayor
en la ruta de las pentosas, y debido a que el rendimiento
energtico de la ruta de las pentosas es bajo, sera necesario aumentar el consumo de glucosa cuando una mayor parte de la glucosa se Todo lo anterior explica el aumento metabolita por ese medloy como
en el consumosubstrato de
consecuencia el bajo rendimiento de biomasa por gramode substrato consumldo delos cultivos de FL y por ultimo el por que cultivos de 100 g/l no parecen presentar los
represin catablica. Los resultados parecen confirmar que el hongo se encuentra limitadoporoxgeno inicial.El aumento en la concentracin inicial de sacarosa tuvo efectos diferentes entre la FL
en FL cuandosepresentaunagrancantidaddesubstrato
y la FS. Mientras, que en FS la ,,X , manera significativa por
aument y el rendimiento no seafect
de
el aumento la enconcentracin substrato de
inicial. las pesar de
indicando que no existe una limitante obvia para tipo cultivo este de bajo condiciones estudiadas. En FL la biomasa mxima (Xmax) est limitada, a
que se use una mayor cantidad de substrato inicial. Por lo cual, el rendimiento de la biomasa disminuy de manera significativa aumentar la concentracin de substrato al inicial.Ambosresultadosindican aumentarlaconcentracin
la presenciadeunalimitantequeseagudizaal
del substratoinicial y tal como seindici, en el prrafo
anterior esta limitante podra ser la cantidad de oxgeno en el medio de cultivo. Otro aspectointeresantedelasdiferenciasencontradasesladispersin del medio de
Cultivo sobre la superficie de cultivo de la fermentacin slida, Esto podria hacer que el Cultivo se Compode como un lote alimentado donde la concentracin de substrato68
se mantiene baja a pesar de
la existencia de una altay
concentracin de substrato Lonsane (19916). Este
final, tal como ha postulado Ramesh sido por comportamiento ha sido reproducido
en fermentacin lquida por Aguilar y Huitrn
(1987), quienes aadieron pequeas cantidades de cido galacturnico y glucosa a
cultivos de Aspergillus niger durante la produccin de pectinasas con pectina como
I fuente de carbono. A mantenerbajalaconcentracintemporal
de los represores
stos produjeron un efecto de estimulacin para la produccin enzimtica en lugar de la represin esperada. La explicacin de
los autores es que bajas concentraciones
de glucosa o del represor adecuadoen realidad sirven como inductores de la sntesis de la hidrolasa correspondiente.
Los altos valores de correlacin de los ajustes de YUX permiten afirmar que la mayorproductividad de los cultivos de FS se debe a la combinacin del mayor rendimiento de biomasa porgramodesubstratoconsumido slidos. El aumento eny a la mayor YVX de los cultivos
la cantidad biomasa de con
los niveles superiores
de
sacarosa fue suficiente para mantener una mayor
productividad enzimtica de los
cultivos de fermentacin slida, a pesar de la disminucin de valores de la YEIX. los Todos estos resultados apoyan la idea de alta disponibilidad que en la fermentacin slida existe una niger mantener un
de oxgeno que permite a Aspergillus
metabolismo aerbico que resultaen una alta velocidad de crecimiento y por lo tanto una mayor velocidad de consumo de substrato.
3.2 Estudio de la produccin de invertasa por 3 cepas Aspergillus niger en de fermentacin slida y lquida con 100 g/l de sacarosa inicial.
Se compar el crecimiento y la produccin de invertasa tres cepas deAspergillus porniger en fermentacin lquida y slida a fin de probar que las diferencias reportadas
de FS y FL con altas concentraciones de sacarosa inicial, son resultado del sistema de cultivo y no variaciones atribuibles a una sola cepa. La figura 3.2.1muestra el perfil de crecimiento de tres cepas de Aspergi//usniger en cultivo FL y FS.iI
A
40
30' 0 W
10
o
O 12 24 36 48 60 72' Horas
l
O
11
O 12 24 3648 60 72
I
II L
O 12 24 36 48 60 72: Horas Horas !
Figura 3.2.1Crecimiento de las cepasAa20(A), N402 (B) y C28B25 (C) en fermentacin lquida (O) y slida(0) con 100 g/l de sacarosa inicial. Los valores experimentales se representan como smbolos y los valores ajustados se representan como lneas continuas.El crecimiento de las cepas Aa20, N402 y C28825 en FL es muy parecido entre s.
Las cepas presentan un tiempo de germinacin de entre 12 a 24 horas, despus de eso sepresentaunafasedecrecimientocontinuoquepuededurarhasta las 60
70
horas, En la FS las cepas mostraron perfiles de creclmlento pareados entre si. con un periodo de adaptacin de alrededor de12 horas, alcanzando la
produccin
mxima a las 48 horas. Comparando las curvas de creamlento (Flg 3 2 1A. B y C) se observa que todas las cepas crecieron ms rpido y acumularon mayor cantldad de biomasa en fermentacinslidaqueen fermentaaon liqulda Los indlces dey X ,,
crecimiento especfico (p) fueronmayoresenslido
fuetresveces
mas
elevada en FS (34.5 g/l vs. 11.04g/1) comparado con FL. La X , es estadsticamente significativa ( ~ ~ 0 . 0y1muestra claramente que A. nrger )
es capaz de crecer mucho ms en un soporte slido que en un matraz en agltacln cuando el nivel de substrato es alto. En ambos sistemas de cultlvo la parecida entre las cepas. Un examen microscpico de los cubosdePUF (seccln 3.4). mostrun
X,,
es muy
mlcelio
enredado en la red de poliuretano con grandes espaclos
llenos de are. As pues,
parece razonable la propuesta de que el cultivo en FS funclona como un cultivo en superficie para el hongo, el cual por lo tanto no est limltado por la transferencia de oxgeno como en el caso del sistema de fermentacin liqulda.Los cultivos de fermentacin mostraron lquida pellets
con un centro
muy
densamente agregado lo que seguramente aumentalos problemas relaclonados con la transferencia de oxgeno al interior de la biomasa.y podria ser un lndlcaclon del
metabolismo de tipo microaerbico anaerbico en la FL o Lafigura3.2.2 (A, 6 , y
C),muestran los tiempos de evoluclonde los titulos de
invertasa para cada cepa.
71
"
_ _ I
B 5000
4000
S h
h
m69
3000
5 3000S -
m 'Ic~
4000
E 2000 al > c -
m
5 2000 >1O00
m 69 m
1 O00
OO 1 2 243648 6072 Horas
O O 12243648607211 Horas I/ O 122436486072 Horas
Figura 3.2.2 Produccin de invertasa por las cepas Aa20 (A), N402 (B) y C28B25(C) en fermentacin lquida (O) y slida(U).
Los crculos corresponden a los ttulos medidos en experimentos con FL mostrando
un valor pico alrededor de
las 60 horas y decreciendomastarde,lamediade(Emax)fue de 1179f
la
produccin mxima enzimtica
138 U/I. Los cuadrados
corresponden a los ttulos de invertasa medidos en experimentos con el sistema FS,
la media de la ,E ,,
es de 3663 228 UII, ms del doble que en FL.
En el cultivo lquido de las tres cepas de AspergillusnigerAa20, N402 y C28625, hay una fase debajaproduccin a 24 horas,trasestolaactividaddeinvertasase
acumula de manera continua durante todo el tiempo de fermentacin hasta alcanzarel mximo a las 60 horas, tras este mximo la actividad
de invertasa disminuye en
las trescepas.Laproduccindeinvertasaenfermentacinlquidapareceserla misma independientemente cada de cepa. esto En pueden intervenir factores72
relativos a las limitaciones del medio y en el caso de producidaporAspergi//us niger seadependient:ede
que la cantidad de invertasa la cantidaddebiomasa
se
explicara el parecido por la limitacin del crecimiento por sistema de cultivo. el La produccin de invertasa por las tres cepas de Aspergi//us niger en fermentacin slida presenta un periodo de baja produccin alrededor de las24 horas, tras este
periodo la produccin de invertasa se incremental de manera exponencial hasta las
36 horas y 48 horas de cultivo. Tras este periodo la actividad de invertasa tiende adisminuir pero parece hacerlo a un ritmo diferente para cada cepa. Las diferencias que se presentan en fermentacin no slida parece relacionada estar con limitaciones intrnsecas del medioo sistema de cultivo y en el que las limitaciones de produccin que se observan son las relativas a cada cepa. En la tabla 3.2.3 se muestran los resultados obtenlidos a partir del crecimiento de las cepas AA20, N402 y C28B25 en fermentacin lquida y slida. Los resultados
obtenidos se compararon por anlisis estadstico ANOVA de una sola va. deNo seencontrdiferenciaestadstica
en el rendimientodeenzimapor
gramo de
biomasa producida entre los experimentos FL y FS. Mientras que las cepas C28B25y Aa20 mostraron valores de Y a ms altos en
FS que en FL, la cepa N402 mostr
un valor de YVX ms alto en FL que en FS, an wando los valores para cada cepa
en FL y FS fueron cercanos.La productividad enzimtica (P=U/hl) se estim en trmino volumtrico, debido a que
se utiliz elmismovolumen produccin mxima
en ambossistemasldecultivo.Setomelvalordey todas las cepas mostraron una
de cada cepa
mayor
productividad en FS que en FL, tal como ha sido previamente reportado por
Sols73
.
. "
.. .
"
Pereira y c o l . (1993); Lekha y Lonsane (1994) y Acua-Argelles y col, (1995), estos autores reportaron que los cultivos por FS produjeron niveles enzimtica ms altay en menortiempoquelosqueenFL,yatribuyeron de produccin este
comportamiento principalmente a diferencias en la induccin y represin enzimticas (Sols-Pereira y col. , 1993); o a diferencias en la calidad de las enzimas producidas en cada sistema de cultivo (Lekha y Lonsane, 19941; Acua-Argelles y col., 1995).Tabla 3.2.3 Biomasa, produccin enzimhtica, velocidad de crecimiento, productividad volumtrica y productividad por gramode biomasa de tres cepas de Aspergillus niger en fermentacin liquiday sllida.
-xiz++FN402 C28B25
Parametros Lquido Slido
Lquido I S6lido )Lquido~:S6lido~Lquido~Slido~Lquido/Slido 1 1261 I 3 4 1 1 10.12 0.99 1O20 3089 0.1 1 0.97 1258 4487 0.14 I I 10.99 0.99 1180 13662 1 0.12 138 732 0.004 33.29 10.161 79 0.99 0.88 0.86
II
9-5 12.6
I1
31.9 30.3
Desv std Pr>F promF
1
0.002 49.85
1
I 10.17 I
0.99 0.21
2
I
98
I
21
I
71
0.93 0.90 0.93 10.87 93 I 119 18 28 0.24 1.91 ns
1
I
19.7
I I
11I
1
I
86.7
I
0.02 10.04 0.08'65.1 5
I
2.30 33.05 0.025 12.28
I
I
**
ns
*
Nuestros resultados muestran que no solo existe una mayor produccin de biomasa en FS comparada con la FL, si no que la velocidad de crecimiento en FS es tambin mayor que en FL, esto resulta en mayores cantidades de biomasa acumuladaen FS enmenortiempo.Debidoaquenoencontramosdiferenciassignificativa en los
valores de YOX entre fermentacin slida y fermentacin lquida y a que los valores
de correlacin obtenidos en el calculo de la YUX son altos, podemos pensar que la produccin de invertasa est ligada al menos parcialmente de manera directa a la
produccin de biomasaen ambos sistemas de cultivo con 100 g/l de sacarosa inicial.Y por lo tanto, la produccin enzimtica quedara1 determinada por la capacidad del
cultivo para acumular biomasa. AI ser mayory mfis rpida la produccin de biomasa en fermentacin slida esto podra explicar tanto los mayores niveles de produccin como la mayor productividadde los cultivos slidos.
Las diferencias observadas en este experimento podran ser inherentes a las cepasutilizadas y dependerdelorigen de cadaunade las cepas. Este resultado es adaptadas
consistente con la propuesta de que ciertas cepas parecen estar mejor para alguno de los sistemasdecultivo(Shankaranand
y col., 1992;Antier y col.,
1993). El hallazgo ms importante de esta seccin del trabajo es la confirmacin de
que las diferencias encontradas entre fermentaciijn slida parecen dependientes ser de la cepa de
y fermentacin lquida no
Aspergillus niger utilizada, sino
que
dependen del sistema de cultivo. Estos resultados se publicaron enel trabajo titulado Invertase production by Aspergillus niger in submerged and solid-state fermentation, que se incluye en el anexo 1.
3.3 Estudio de lasecrecindeinvertasa par Aspergillus niger fermentacin slida y lquida con 100 g/lde sacarosa inicial. Se cultiv Aspergillus niger C28825 con 100 gramos de sacarosa como carbono,afindeanalizarla
C28825 en
fuente de
produccin Intra y extracelular de la invertasa.La
produccin de proteasas se comparo entre ambos sistemas de cultivo. Se
compar
la acumulacin y el consumo de monosacndos en los cultivos de ambos sistemas de cultivo En la figura 3.3.1 se muestra la acumulacln de! biomasade la cepa C28B25 en fermentacin lquida y slida con 100 g de sacarosa como fuente de carbono. A
:O E i 10 O"
m
20
1
O
12.
24
36Horas
48
60~
72.~.
~
"~
"_
Figura 3.3.1 Biomasa producida por Aspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida (O) y fermentacin s6lida (O) con 100 lgll de sacarosa como fuente de carbono.
Se observa que en fermentacln liquida la blomasa presenta una fase de adaptacin larga con un aumento de la biomasa muy pronunclado entre las 48 y las 60 horas, la76
biomasa acumulada pasa de aproximadamente 4 lg/l hasta 11 g/l en solo 12 horas y es a las 60 horas cuando se Inicia la esporulacin de los pellets del cultivo, posterior a este momento la acumulaan de biomasa disminuye llegando a 12 horas. Los resultados de fermentacin slida presentan un g/l a las 72
perfil parecido a los de
fermentacin lquida; la fasede adaptacin es ms corta, aproximadamente 18 horasy la fase de crecimiento exponenclal llega hasta las42 horas momento en que se
inicia la esporulacin en el cultlvo, es8 para momento
se han acumulado
aproximadamente 32 gll de biomasa, valor que se incrementa muy poco para el final de la fermentacin 33 g/l a las 48 horas. An cuandolos dos cultivos presentan una curva clsica de creclmiento formada la porfase de adaptacin, crecimiento
-
exponencial y fase estaaonaria. los tiempos y relaciones entre ellos son diferentes. Andres y Peberdy (1974) observaron altas que concentraciones glucosa de sacarosa en elmediodecultivoenfermentacinlquidaresultaronenun o retraso
importante en los tiempos de crecimiento y produccin de invertasa por Aspergillusnidulans en fermentacin lquida. De acuerdo con IVielsen (1 992) este retraso podra
estar relacionado con la alta concentracin de sacarosa el medio, que acta como en inhibidor de la germinaciny alarga el tiempo de adaptacin. La figura 3.3.2 presenta los perfiles de secrecin de invettasa por Aspergillus nigerC28B25 cultivada en fermentacln lquida slida con 100 g/l de sacarosa. y
En la curva de produccin de rnvertasa de fermentacin lquida se pueden observarlo que parecen ser dos fases de produccin, la primera alcanza
un mximo de 400
U/I a las 36 horas y la segunda. que se inicia a las 48 horas y alcanza el mximo de
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1500 U/I a las 60 horas. La produmn de invertasa en fermentacin slida se inicia
lentamente durante las primeras 24 horas con s610 500 U/I y presenta un aumento importante entre las 24 y las 36 horas. Tras ese tiempola velocidad de produccin de invertasa disminuye para alcanzar un mximo de 4600 U/I a las 42 horas. Tras ese tiempo la actividad de los extractos disminuye.
n
\ 33000 mv,
4000
m
-E 2000 al>S
- 1000OO 12
24
36 Horas
48 1
60
72
Figura 3.3.2 Produccin de invertasa extracelular por Aspergillus niger C26B25 en fermentacin lquida (O) y fermentacin slida (O) con 100 g/l de sacarosa.
Los perfiles deproduccin de invertasa en ambossistemasdecultivosiguen perfiles crecimiento de presentados en la figulra 3.3.1, lo que ratifica la que
los
produccin de invertasa est ligada al crecimiento de la biomasa en ambos medios de cultivo. En la figura3.3.3 puede observarse que la invertasa intracelular seacumula
ms
rpidamente en el cultivo y representa a la mayora de la actividad de invertasa en durante todo el tiempo de cultivo.
3000
I I
O
12
24
36 Horas
60
Figura 3.3.3 Comparaci6n de la actividad intra (O), extracelular (+) y total de invertasa por Aspergillus niger C28B25 en fermentacin liquida. La invertasa total se representa como una lnea punteada, ya que se obtuvo por la suma de las otras dos.
(o)
La invertasa intracelular presenta valor un mximo produccin de aproximadamente es que el mismo mximo valor obtenido para
de 1500 U/I la invertasa cultivo se eleva a
extracelular, con esto la produccin real de inverl:asa para este
cerca de 2700 U/I. En el momento de mxima produccin intracelular se tienen 1500U/I deinvertasa y 500 U/I deinvertasaextracelular,
lo que daunafraccin
intra-
extracelular 75/25%, lo que coincide con lo reportadoporPeberdy afirma que Aspergillus niger presenta el 70% de la invertasa total como intracelular. Por otra parte, Vainstein y
(1994) quien
invertasa
Peberdy (1990) observaron que,
aproximadamente el 50% de la invertasa total producida por Aspergillus nidulans en fermentacin liquida est asociada al micelio y parece estar localizada en el espacio
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periplsmico,aproximadamente
el 60% de
