Producción de enzimas hidrolíticas Producción de enzimas hidrolíticas por por AspergillusAspergillus awamoriawamori

sobre orujo de uvasobre orujo de uva

C. Botella, I. de Ory, C. Webb, D. Cantero, A. Blandino

PPQ 2002-00358

Departamento de Ingeniería Química, Tecnología de Alimentos y Tecnologías del Medio

Ambiente

Universidad de Cádiz

2

Índice de ContenidosÍndice de Contenidos

1. INTRODUCCIÓN• DEFINICIÓN DE SSF Y VENTAJAS• NUEVAS APLICACIONES• PRODUCCIÓN DE ENZIMAS• SOPORTES SÓLIDOS

2. OBJETIVOS

3. METODOLOGÍA DE TRABAJO• MICROORGANISMO• SUSTRATO• CONDICIONES DE FERMENTACIÓN• CONDICIONES DE EXTRACCIÓN

4. RESULTADOS• COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL ORUJO DE UVA Y DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE

PARTICULA• PRODUCCIÓN DE ENZIMAS• AZUCARES REDUCTORES Y PH• COMPARACIÓN CON VALORES OBTENIDOS CON TRIGO

5. CONCLUSIONES

3

1.1. IntroducciónIntroducciónDefinición de SSF y ventajasDefinición de SSF y ventajas

• Fermentación en Estado Sólido (SSF):Crecimiento de microorganismos sobre soportes sólidos húmedos en ausencia de agua libre

• Ventajas:– Mayores rendimientos– Más fácil la recuperación de los productos– No se producen espumas– Volumen de reactor menor– El riesgo de contaminación se reduce dado los bajos niveles de

humedad en el medio– Se pueden emplear como sustratos materias primas o residuos de

bajo coste de industrias agrícolas o de alimentos– La biomasa agotada puede ser utilizada para la alimentación de

animales de granja– Impacto ambiental menor: se reduce el volumen de los efluentes

4

1.1. Introducción:Introducción:Nuevas AplicacionesNuevas Aplicaciones

• Control Medioambiental:– biorremediación– biodegradación de

compuestos tóxicos – destoxificación de

residuos agrícolas– las biotransformaciones

de algunos cultivos o de sus residuos para la mejora de su calidad nutricional

– pulpeado biológico

• Obtención de productos de alto valor añadido:– metabolitos secundarios– ácidos orgánicos– pesticidas– compuestos aromáticos– combustibles

– enzimas

5

1.1. Introducción:Introducción:Producción de enzimas Producción de enzimas

• El 75% enzimas usadas en industria son enzimas hidróliticas

• Celulasas: industria textil, procesamiento de materiales lignocelulósicos para la producción de alimentos, combustibles y productos químicos

• Xilanasas: industria del papel y en la preparación de alimentos y piensos

• Pectinasas: industria del vino y de zumos de frutas

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1.1. Introducción:Introducción:Soportes sólidosSoportes sólidos

SOPORTES

SÓLIDOS INERTES SUSTRATOS NATURALES

CULTIVOS Y RESIDUOS AGROINDUSTRIALES

INMOVILIZACIÓN NUTRIENTES

7

1.1. IntroducciónIntroducciónSoportes sólidosSoportes sólidos

• SUSTRATOS NATURALES– fibras y paja de trigo – maíz – arroz – bagazo de caña de azúcar y de remolacha– residuos de banana– residuos de patata– té – coco– manzana – cítricos – harinas de trigo y maíz – cáscaras de café y de arroz, alpechín, malta agotada, etc.

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1.1. IntroducciónIntroducciónSoportes sólidosSoportes sólidos

VINO

• Producción mundial de uva es 60 millones de toneladas anuales • 68% uvas son empleadas en la producción de vino• Residuo: Orujo de uva • España produce 250 millones kg/ año de orujo

ORUJO: Semillas, hollejo y raspón

Alimentación de animales : bajo nivel nutricionalObtención de alcoholes vínicos: no rentableAcumulación en áreas al aire libre: problema medioambientalesNUEVOS USOS

Producción de enzimas

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2. Objetivo:2. Objetivo:Aprovechamiento de un residuo Aprovechamiento de un residuo agrario: agrario: ORUJO DE UVAORUJO DE UVA

ORUJOSecado, molienda, tamizado y esterilización

Aspergillusawamori

FERMENTACIÓN

ENZIMAS

ORUJO

Inoculación

grape pomace

05

1015202530354045

0 1 2 3 4 5 6 7time (days)

(a)

xyla

nase

(UA/

g)

10

3. Metodología de Trabajo3. Metodología de Trabajo

•Microorganismo: Aspergillus awamori NRRL 3312

5 días 30ºC5 días 30ºC

Cepa purificada

Tubo inclinadoPreinóculo en agar

Preparación del preinóculo

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2. Metodología de trabajo2. Metodología de trabajo

• Sustrato: Orujo de uva variedad Palomino fino, seco, molido y tamizado.

Secado, molienda, tamizado y esterilización

Orujo preparado para la inoculaciónOrujo de uva Palomino fino

Análisis Químico

HumedadMineralesGlucosaNitrógenoProteínasFósforo

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3. Metodología de trabajo3. Metodología de trabajo

• Condiciones de la Fermentación– Estático – Placas petri con 10g de sólido– Humedad del sólido 60%– Temperatura 30ºC – Concentración de esporas 5x105 esporas/g– Tiempo total de la fermentación 7 días

Orujo

Fermentación en Placa Petri

Aspergillus awamori10 g 5x105 esporas/g

30ºC, 7 días

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3. Metodología de trabajo3. Metodología de trabajo

• Condiciones de la Extracción– Matraz erlenmeyer 50ml agua Milli Ro– Temperatura 30ºC– Tiempo 30 min– Agitador orbital a 220rpm– Centrifugación del extracto a 10000 rpm durante 10 min

Extracto Enzimático

AnálisispHAzucares Red CelulasaXilanasaExo-PGEndo-PG

14

4.Resultados4.ResultadosComposición Química del Orujo de uva y Composición Química del Orujo de uva y distribución del tamaño de partículadistribución del tamaño de partícula

0

20

40

60

80

100

0 0,4 0,8 1,2 1,6

Diámetro (mm)Ac

umul

ació

n (%

men

or q

ue

el d

iam

etro

)

ANÁLISIS QUÍMICOComponente Composición

(g/g) peso seco

Humedad 7.66%

Sales minerales 6.20%

Glucosa 7.13%

Nitrógeno 1.5%

Proteínas (N × 6.25) 9.32%

Fósforo 0.14%

D50=0.74 mm.

15

4.Resultados4.Resultados4.2 Producción de enzimas4.2 Producción de enzimas

0,05,0

10,015,020,025,030,035,040,045,0

0 1 2 3 4 5 6 7tiempo (días)

Xila

nasa

(UA

/g)

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

0 1 2 3 4 5 6 7tiempo (días)

Celu

lasa

(UA

/g)

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

0 1 2 3 4 5 6 7tiempo (días)

Exo-

PG (U

A/g)

0,0000,0200,0400,060

0,0800,1000,120

0 1 2 3 4 5 6 7

tiempo (días)

Endo

-PG

(UA

/g)

16

4.Resultados4.ResultadosProducción de enzimasProducción de enzimas

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

0 1 2 3 4 5 6 7tiempo (días)

Xila

nasa

(UA

/g)

XILANASA

•Valor máximo 40,4 ±15.6 UA/g

• Máximo alcanzado tras 24h de incubación

•Reducción de la actividad hasta 3,5 UA/g en el séptimo día

17

4.Resultados4.ResultadosProducción de enzimasProducción de enzimas

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

0 1 2 3 4 5 6 7tiempo (días)

Celu

lasa

(UA

/g)

CELULASA•No se excreta hasta transcurrido 17 h de fermentación

•Valor máximo 9,6 ± 0,76 UA/g

• Máximo alcanzado el 1er día de fermentación y permanece constante hasta el 3er día

•Reducción de la actividad hasta 1,0 UA/g en el 5º día

18

4.Resultados4.ResultadosProducción de enzimasProducción de enzimas

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

0 1 2 3 4 5 6 7tiempo (días)

Exo-

PG (U

A/g)

EXO-PG

•Valor máximo 25,0 ± 9,61 UA/g

• Máximo alcanzado a las 11,2 horasde fermentación

•Reducción de la actividad hasta 1,7 UA/g en el 5º día

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4.Resultados4.ResultadosProducción de enzimasProducción de enzimas

0,0000,0200,0400,0600,0800,1000,120

0 1 2 3 4 5 6 7

tiempo (días)

Endo

-PG

(UA/

g)

ENDO-PG

•Actividad despreciable hasta transcurrido 24h

•Valor máximo 0,113 ± 0.0033 UA/g

• Máximo alcanzado entre 5º-7º día de fermentación

20

4.Resultados4.ResultadosAzucares Reductores y pHAzucares Reductores y pH

0,000

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100

0,120

0,140

0,160

0 1 2 3 4 5 6 7

tiempo (días)

Azuc

ares

Red

ucto

res

(mM

)

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

0 1 2 3 4 5 6 7

tiempo (días)pH

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4.Resultados4.ResultadosComparación con valores obtenidos Comparación con valores obtenidos con trigo y hongos filamentososcon trigo y hongos filamentosos

Sustrato

Actividad Máx.

Orujo de uva Trigo

Xilanasa (UA/g) 40,4 18,93 (Cori, 2000)Celulasa (UA/g) 9,6 9,05 (Yang, 2001)Exo-PG (UA/g) 25,0 7,7 (Blandino, 2002)

Endo-PG (UA/g) 0,113 0,012 (Blandino, 2002)

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5.Conclusiones5.Conclusiones

• El orujo de uva es un buen medio natural para la SSF, rico en nutrientes y de bajo coste.

• La producción por el hongo Aspergillus awamori de las enzimas xilanasa, celulasa y exo-PG sigue el mismo patrón. Rápido crecimiento en las primeras etapas de incubación alcanzando el máximo en el primer día.

• La actividad de la celulasa se ve inhibida posiblemente por la presencia de lignina.

• Endo-PG presenta represión catabólica cuando la concentración de azucares es alta y su actividad crece cuando los azucares son consumidos.

• Las actividades Xilanasa y Exo-PG presentan valores altos comparados con los valores encontrados en la bibliografía, mostrando buenas perspectivas para posteriores estudios y aplicaciones industriales .