Prof. Dr. Alessandro Varani UNESP - FCAV

Anotação de Genomas (procariotos e eucariotos)

O que é Anotação ? Onde estão os genes (coordenadas) ? O que codificam (produto,

proteínas) ? Como interagem/relacionam (metabolismo) ?

DNAplotter: Carver, T. et al. 2008. Bioinformatics 25:119-120

Stein, L., 2001. Genome annotation: from sequence to biology. Nature Reviews 2: 493-505

Onde ?

O que ?

Como ?

→ Com o sequenciamento completo de genomas é hoje possível

fazer predições quanto ao repertório total de genes de um dado

organismo sem conhecer previamente as funções por ele realizadas

ou o seu papel ecológico. É possível, por exemplo, conhecer as vias

presentes e ausentes para biossíntese de todos os aminoácidos,

vitaminas e cofatores através da presença ou ausência de genes

codificadores de enzimas associadas a essas vias.

ANOTAÇÃO

→ Anotação Manual: Realizado manualmente, sem a assintência de um programa de computador, ou seja, a pessoa identifica onde começa e termina o gene e identifica sua função usando por exemplo a ferramenta BLAST; → Anotação automática: Um programa de computador localiza os genes e funções e “monta” o provavel metabolismo do micro-organismo automágicamente; → Anotação Semi-Automática: ídem, porém permite que um anotador verifique e corrija possíveis erros de predição; → High Quality Annotation/Biocuração: Garantia da qualidade da anotação. Um “anotador” , verifica cada gene manualmente. Geralmente é resultado de combinação entre Anotação (semi)automática e manual.

Anotação, conceitos e diferenças

Definições: Conceito de Gene

→ Um gene corresponde a um segmento de DNA que é colinear a seu produto protéico. Essa relação é geralmente encontrada nos procariotos.

Procariotos

Definições: Conceito de Gene Eucariotos

Definições: Conceito de Gene Eucariotos

→ Diz-se que as sequências que antecedem o ponto de início localizam-se à montante (upstream) e as que o sucedem localizam-se à jusante (downstream);

→ A posição das bases é numerada nos dois sentidos, a partir do ponto de início, ao qual se atribui o valor +1. Os valores aumentam (valor positivo) à jusante e diminuem (valor negativo) à montante

5’ 3’

Definições e Conceitos

→ Íntrons do grupo II: São uma classe de elemento genético móvel, e estão presente em genomas de bactérias (1/4 do genomas sequenciados) e organelas (cloroplasto e mitocôndrias);

→ A bactéria fitopatógena, Xylella fastidiosa 9a5c tem um íntron do grupo II (transcriptase reversa);

Procariotos realmente não possuem Íntrons ?

http://hudsonvalleyrnaclub.org/images/hvrc_belfort_image2.shtml

Íntrons do grupo II ?

http://webapps2.ucalgary.ca/~groupii/

Hipótese

→ Originaram o íntrons do grupo I ?

→ Originaram os retrotransposons sem LTR ?

→ Genoma essencial (ou core): é o conjunto de genes que são

compartilhados por todas as linhagens de uma mesma espécie bacteriana.

→ Genoma acessório (ou dispensável): é o conjunto de genes que estão

presentes em algumas, mas não em todas, as linhagens de uma mesma espécie

bacteriana.

→ Genoma pan (‘pan’ em grego significa ‘todo’): É o repertório global de

genes de uma espécie bacteriana, ou seja, o genoma essencial mais todos os

acessórios encontrados em diferentes linhagens de uma mesma espécie.

Definições

Princípio da anotação Genoma

1)  Identificar os Genes

Onde estão ?

Princípio

1)  Identificando os Genes

Onde estão ?

Princípio

1)  Identificando os Genes

Onde estão ?

Princípio

1)  Identificando os Genes

Onde estão ?

Princípio

1)  Identificando os Genes= Feito 2) Atribuíndo Função

O que codificam ?

Princípio

Princípio

Princípio

Princípio

Princípio

Princípio

Princípio

Princípio

Além de identificar os genes e atribuir

função a cada um deles…

O que mais deve ser levando em

consideração (procariotos) ?

Como os genomas procariotos estão organizados ?

THE MOBIL-’OME Arianne Toussaint

Julho 2003

-18%emEscherichiacoli;-16%emSynechocystissp;-10%emMethanobacteriumthermoautrophicum;-5%emHelicobacterpylorieDeinococusradiodurans

THE STAY-AT-’OME Peter Young Julho 2003

IlhasGenômicas

Profagos

TransposonConjugativos

Integrons

Transposons+IntegronsSequências

deInserçãoTransposoncomposto Adaptado de M. Chandler - http://www-lmgm.biotoul.fr/equipes/grpchand/

Anotação de um genoma procarioto

Duas importantes considerações e constatações

→ O genoma essencial, em via de regra está bem anotado (alguns necessitam de correções) nas bases de dados, e as ferramentas de anotação disponíveis são muito precisas ;

→ A qualidade da anotação do genoma acessorio (principalmente EGMs) ainda é um problema severo nas bases de dados. Pouco sabemos sobre a real diversidade, quantidade e impacto que EGMs desencadeiam nos genomas procariotos depositados nas bases de dados públicas. É necessário biocuração, e análise manual ! Ferramentas de anotação muito bem estabelecidas para identificação de genes Essas ferramentas ainda estão evoluíndo para identificação de EGMs, e poucos

grupos de pesquisa se atentam para esse detalhe, uma vez que o processo TEM QUE SER MANUAL.

TTCATACTTGGTTAAGACCTTTACAAGCCGACCAACGTGGTGACAGTGTCGTCCTTTACGCACCGAATCCCTTTATCATTGAATTAGTAGAAGAGCGATACTTAGGACGTCTTCGGATGGAATCTTGGTCCCGTTGCCTGGAACGTCTTGAAACTGAATTCCCGCCAGAAGATGTTCATACTTGGTTAAGACCTTTACAAGCCGACCAACGTGGTGACAGTGTCGTCCTTTACGCACCGAATCCCTTTATCATATTGAATTAGTAGAAGAGCGATACTTAGGACGTCTTCGGGAATTGTTATCCTATTTCTCAGGAATACGTGAAGTAGTCCTTGCAATTGGCTCACGACCTAAAACAACAGAACTACCCGTACCAGTAGACACTACAGGACGTTTGTCTTCAACAGTCCCATTTAACGGAAATCTCGACACACACTATAACTTTGATAATTTTGTTGAGGGACGAAGCAATCAACTCGCTCGTGCTGCAGCTTGGCAAGCGGCACAGAAACCGGGAGACCGTACTCACAACCCTCTATTGCTCTATGGTGGGACTGGTTTGGGTAAAACCCATTTAATGTTTGCTGCAGGTAACGTAATGCGGCAAGTAAACCCAACTTATAAAGTAATGTATCTTCGTTCGGAACAGTTTTTCAGCGCCATGATAAGAGCGTACAAGATAAAAGTATGGATCATAAGGGTAA

O jogo: Identificar onde Começa e Termina

As regras: Código genético

A tática: Primeiro passo Identificar os quadros abertos de leitura (ORFs)

O Jogador: ORF Finder ORF = Open reading frame

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/

ORF = Open reading frame

Principal ferramenta: NCBI ORFinder - Resultados

→ Começa-se escolhendo as maiores ORFs; →O anotador decide qual ORF tem que eliminar ou validar.

Ferramentas mais sofisticadas Prodigal

(Prokaryotic Dynamic Programming Genefinding Algorithm)

http://prodigal.ornl.gov/server.html

Prodigal (Prokaryotic Dynamic Programming Genefinding Algorithm)

→ Um dos preditores de genes mais simples e eficiente “do mercado”; → Atualmente considerado o “Gold standart”; → Download em: https://code.google.com/p/prodigal/ Versões para: Linux, Windows e MacOSX. →Não é necessário compilar (pré-compilado); → Execução por linha de comando ou web-service.

Prodigal - Linha de comando Na VM: “$ prodigal -h"

Ferramentas mais sofisticadas Prodigal

(Prokaryotic Dynamic Programming Genefinding Algorithm)

web-service

http://prodigal.ornl.gov/server.html

Ferramentas mais sofisticadas GLIMMER

http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml

GLIMMER (linha de comando) Na VM: “$ tigr-run-glimmer3"

Ferramentas mais sofisticadas GLIMMER (web service)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/glimmer_3.cgi

Ferramentas mais sofisticadas GLIMMER – Resultados (web service)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/glimmer_3.cgi

Ferramentas mais sofisticadas GLIMMER – Referências

SignalP Identifica peptideo sinal em sequencias de proteínas

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

OK! ORFs identificadas Qual o próximo passo ?

Identificação de outros componentes: tRNAs, rRNAs, ncRNAs e Elementos Genéticos Móveis (EGMs);

Identificação de tRNAs

http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/

Identificação de tRNAs

http://mbio-serv2.mbioekol.lu.se/ARAGORN/

Identificação de rRNAs

http://www.cbs.dtu.dk/services/RNAmmer/

Identificação de rRNAs

http://www.vicbioinformatics.com/software.barrnap.shtml

Identificação de ncRNAs

http://rfam.xfam.org/

Identificação de ncRNAs

http://infernal.janelia.org/

Identificação e Anotação de

Elementos Genéticos Móveis (EGMs)

Transposons do tipo IS: Como Anotar ?

MITE

IS

tIS

MIC

+/- Gene Passageiro

+/- Transposase

+/- Transposase

Siguier e Varani et al., 2012

Profagos Melhor Software: PhiSpy

Porémdiversasferramentasdeprediçãoestãodisponíveis:→Prophinder:Lima-Mendezetal.,2008-(ACLAME)→ProphageFinder:MichaelBose,2006→PhageFinder:DerrickFouts,2006-(TIGR)→PHAST:YouZhouetal.,2011

http://sourceforge.net/projects/phispy/

Ilhas Genômicas

Atribuíndo Função (“Como?”) InterProScan

http://www.ebi.ac.uk/interpro/

http://www.ebi.ac.uk/interpro/

Atribuíndo Função (“Como?”) InterProScan: Resultado

http://www.geneontology.org

Atribuíndo Função (“Como?”) Gene Ontology

-> Componente Celular; -> Processo Biológico; -> Função Molecular.

Atribuíndo Função (“Como?”) Uniprot

http://www.uniprot.org/

http://www.genome.jp/kegg/

Atribuíndo Função (“Como?”) KEGG: Mapas Metabólicos

http://www.genome.jp/kegg/kaas/

Atribuíndo Função (“Como?”) KEGG: Mapas Metabólicos

-> Várias ferramentas e bancos de dados! -> Muitas ferramentas somente em linha de comando; NÃO TEM COMO AUTOMATIZAR, PELO MENOS UMA

PARTE DE TODO ESSE PROCESSO DE ANOTAÇÃO ??????

Conceito de Pipeline

-> Um bom programador pode integrar todas essas ferramentas em um único programa! -> A ordem seria (uma recomendação de pipeline!) Execute: 1) Prodigal (onde estão os genes ?);

2) SignalP (peptideo sinal: proteínas secretadas); 3) Aragorn (onde estão os tRNAs?); 4) Barnap (onde estão os rRNAs?); 5) Infernal (onde estão os ncRNAs?); 6) BLAST – GenBank; 7) BLAST – UNIPROT; 8) InterProScan; 9) Gene Ontology; 10) Keeg (kass);

Mas você não precisa fazer issso!!!! Alguém já pensou nisso e fez !

Anotação automática pipelines

Prokka: rapid prokaryotic genome annotation.

http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml

Instalado em nossa máquina virtual!

Anotação automática pipelines

RAST: Rapid Annotation using Subsystem Technology

http://rast.nmpdr.org/

Anotação automática resultado

Anotação Visualização

http://www.sanger.ac.uk/resources/software/artemis/

Anotação Visualização

http://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/

Anotação Visualização

E finalmente enviando o genoma para o GenBank!

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/Sequin/

Eucariotos

“There is no reason anyone would want a computer in their home.” — Ken Olson, president, chairman and founder of Digital Equipment Corp. (DEC), maker of big business mainframe computers, arguing against the PC in 1977.

“We will never make a 32 bit operating system.” — Bill Gates, 1983

Predições falham!!!

Literatura Recomendada

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