PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA
-
Upload
joyceta-bravo -
Category
Documents
-
view
33 -
download
1
description
Transcript of PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA
PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI
ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA
U ČOVJEKA
Pristupnica: Danijela Kalibović Govorko, dr.med.dent.
Mentorica: prof.dr.sc. Mirna Saraga-Babić, dr.med.
Zavod za anatomiju, histologiju i embriologiju, Sveučilište u Splitu, Medicinski fakultet, Studij dentalne medicine
Split, 25. ožujka, 2011.g.
UVOD
PREUZETO IZ:Thesleff I, Nieminen P. Tooth morphogenesis and cell differentiation. Curr Opin Cell Biol, 1996. 8(6): p. 844-50.
Ektoderm prvog
ždrijelnog luka
Zubna osnova
Ektomezenhim neuralnog
grebena
Caklinski organ
Zubna papila
Zubni vrećica (folikul)
Vratna petlja
Vanjski caklinski
epitel
Caklinska mrežica
Intermedijarni (središnji)
slojUnutrašnji caklinski
epitelCaklinski
čvorić
Hertwig-ova korjenska ovojnica
Oblik korijena
Ameloblasti Caklina
Reducirani zubni epitel
Osteoblasti
Fibroblasti
Cementoblasti
Cement
Parodontni ligament
Alveolarna kost
Odontoblasti
Nediferencirane
mezenhimne stanice
Fibroblasti
Dentin
Pulpa
Primarni epitelni
pričvrstak
Uzorak krune
PORIJEKLO DIJELOVI ZUBNEOSNOVE
STANICE ZUBNE OSNOVE
PROIZVODI
CAKLINSKI ČVORIĆ
Nakupina stanica u sredini unutarnjeg caklinskog epitela
Proizvodi niz signalnih molekula (FGF, BMP, Shh, Wnt) koje utječu na rast epitela i ektomezenhima, oblikovanje zuba, prostorni raspored, broj i oblik kvržica
Primarni caklinski čvorić nastaje na vršku zubnog pupoljka, a odstranjuje se apoptozom
Sekundarni caklinski čvorići nastaju na vrhovima budućih kvržica molara te reguliraju njihov položaj i oblik
Caklinski čvorić
PREUZETO IZ:Koyama, E., et al., Polarizing activity, Sonic hedgehog, and tooth development in embryonic and postnatal mouse. Dev Dyn, 1996. 206(1): p. 59-72.Vaahtokari, A., et al., The enamel knot as a signaling center in the developing mouse tooth. Mech Dev, 1996. 54(1): p. 39-43.
PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA
Nedostatak istraživanja o ranim stadijima razvoja zuba u čovjeka
Istraživanja na pokusnim životinjama pokazala su značajne razlike u prostorno-vremenskom izražaju proliferacijskih, pro-apoptotskih i anti-apoptotskih čimbenika tijekom razvoja zuba
PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA
Poremećaji proliferacije, apoptoze i diferencijacije tijekom razvoja zuba i čeljusti dovode do pojave raznih patoloških promjena (često u sklopu sindroma):
› Anomalije oblika, broja, veličine, građe, vremena nicanja i položaja zuba u čeljusti
› Razvojnih cista i tumora
CILJEVI ISTRAŽIVANJA
PROLIFERACIJSKI
ČIMBENICI
PRO-APOPTOTSKIČIMBENICI
ANTI-APOPTOTSKIČIMBENICI
ČIMBENICIDIFERENCIJACIJACI
JE
Ki-67 Bcl-2
Bax
Sindekan-1
Hsp70
Kaspaza-3
p53
CILJEVI ISTRAŽIVANJA
Istražiti pojavu, raspodjelu i promjenu proliferacijske aktivnosti stanica primjenom Ki-67 biljega tijekom različitih stadija ranog razvoja zuba
Istražiti prisustvo, prostorni i vremenski slijed pojavljivanja pro-apoptotskih čimbenika kaspaze-3 i p53 u različitim dijelovima zuba tijekom razvoja
CILJEVI ISTRAŽIVANJA
Utvrditi prostorni i vremenski slijed pojavljivanja anti-apoptotske bjelančevine Bcl-2, sindekana-1 i Hsp70 kao mogućih poticatelja proliferacije i diferencijacije
Dvostrukim bojenjem dokazati moguću istovremenu prisutnost različitih čimbenika u istoj stanici: › Bax i Bcl-2› Ki-67 i Bcl-2› Ki-67 i sindekan-1› sindekana-1 i Hsp70
METODE ISTRAŽIVANJA
Sakupljanje tkiva i određivanje starosti zametaka
› Tkivo normalnih ljudski zametaka starosti 5-12 tjedana (iz postojeće arhivske zbirke Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju te tkivo sakupljeno u Kliničkom zavodu za patologiju, sudsku medicinu i citologiju KBC Split, a uz suglasnost Etičkog povjerenstva za biomedicinska istraživanja MF u Splitu)
› Kriteriji očuvanosti tkiva: bez vanjskih znakova maceracije, promjene boje i anomalija
› Određivanje starosti: na temelju podataka o ovulacijskoj dobi, mjerenjem (CRL) te uspoređivanjem sa stadijima Carnegie instituta
METODE ISTRAŽIVANJA
Vođenje, uklapanje i rezanje tkiva:
› Mikrosekcija (odvajanje tkiva koje sadrži zubne zametke)
› Fiksacija u 4% formaldehidu, ispiranje u PBS-u, dehidracija, ksilol, uklapanje u parafinu
› Rezanje na sagitalne, frontalne ili transverzalne rezove debljine 5-7 µm
› Lijepljenje na predmetna stakla, orijentacijsko bojenje svakog desetog stakla H&E (razina reza, očuvanost tkiva)
METODE ISTRAŽIVANJA
Imunohistokemijsko bojenje rezova
› Primarna protutijela: Ki-67 Bax Bcl-2 p53 kaspaza-3 sindekan-1 Hsp70
› Sekundarna detekcija primarnih protutijela: Bojanje DAB-om Imunofluorescencija (TRITC i FITC)
METODE ISTRAŽIVANJA
Kvantifikacija Ki-67 pozitivnih stanica i statistički postupci:
› Brojenje pozitivnih stanica (smeđe obojenje stanice DAB-om) i računanje njihovog udjela u ukupnom broju stanica
› Određivanje moguće statistički značajne razlike u postotku pozitivnih stanica: Među razvojnim tjednima Među različitim dijelovima zuba
› Mann-Whitney test: neparametrijski test za dva nezavisna uzorka (dolaze li dva nezavisna uzorka iz iste distribucije)
› Kruskal-Wallis i Dunnov posthoc test: neparametrijski, proširenje MW testa za tri i više grupa
› Razina značajnosti je 0.05
METODE ISTRAŽIVANJA
Semi-kvantifikacija:› određivanja intenziteta obojenja i prostorne raspodjele
stanica pozitivnih na: jezgrine biljege p53 i kaspazu-3 (zanemariv broj pozitivnih
stanica koje se javljaju samo mjestimično) citoplazmatske biljege Bcl-2, Bax, sindekan-1 i Hsp70
(problem razlučivanja citoplazmi pozitivnih stanica)
Kolokalizacija: › određivanje prisustva dvaju čimbenika u istoj stanici
primjenom dvostruke imunofluorescencije te određivanje stanica koje pokazuju dvostruki izražaj
REZULTATI
Imunohistokemijsko bojenje DAB-om › Ki-67› Bcl-2› kaspaza-3› p53› sindekan-1› Hsp70
Imunofluorescentno bojenje (dvostruko bojenje) › Bax i Bcl-2 › Ki-67 i Bcl-2 › Ki-67 i sindekan-1› sindekan-1 i Hsp70
REZULTATIMORFOLOŠKE OSOBITOSTI RAZVOJA LJUDSKOG ZUBA IZMEĐU 5. I 12. TJEDNA RAZVOJA
6. tj. 8. tj.
9. tj. 10. tj.
Postotak Ki-67+ stanica u zubnom grebenu i zubnom zametku (DC) te okolnom ektomezenhimu (M)• u 6.-7. tj. DC 39%, M 37% • u 8. tj. DC 41%, M 28%• u 8.-9. tj. DC 35%, M 24%• u 10. tj. DC 14%, M 25%• od 8.-10. tj. postoji statistički značajna razlika u % Ki-
67+ stanica između DC i M (Mann-Whitney, P<0.0001)
Postotak Ki-67+ stanica u različitim epitelnim dijelovima zubnog zametka u 10. tjednu razvoja• IEE 37%• OEE 39%• ER 33%• DC 10% • postoji statistički značajna razlika u %Ki-67+ stanica
između IEE i DC i OEE i DC (Kruskal-Wallis, Dunn-ov posthoc test, P<0.001)
Postotak Ki-67+ stanica u ektomezenhimu zubnog zametka (M1) i ektomezenhimu čeljusti (M2)• u 6.-7. tj. M1 50%, M2 34% • u 10. tj. M1 28%, M2 27%• u 6.-7. tj. postoji statistički značajna razlika
u % Ki-67+ stanica između M1 i M2 (Mann-Whitney, P<0.05)
Postotak Ki-67+ stanica u područjima između zubnih zametaka: zubni greben (DC), ektomezenhim oko DC (M1) i ektomezenhim čeljusti (M2)• DC 35%• M1 23%• M2 15%• postoji statistički značajna razlika u %Ki-67+ stanica
između DC i M1 te DC i M2 (Kruskal-Wallis, Dunn-ov posthoc test, P<0.001)
Kaspaza-3
P53
6.-7. tj. 7.-8. tj. 9.-10. tj. 11.-12. tj.
Izražaj kaspaze-3 i p53 bjelančevine u zametku ljudskog zuba između 6.-12. tj.
Izražaj sindekana-1 u zametku zuba između 6. i 12. tjedna razvoja
6.-7. tj. 7.-8. tj.
9.-10. tj. 11.-12. tj.
Izražaj Hsp70 u zametku ljudskog zuba između 6. i 12. tjedna razvoja
6.-7. tj. 7.-8. tj.
9.-10. tj. 11.-12. tj.
Bcl-2
Ki-67
merge
merge
BaxBcl-2
Dvostruko imunofluorescentno bojenje Bcl-2 i Ki-67 (7. tj.) te Bcl-2 i Bax (9. tj.) biljezima
Ki-67
Ki-67
merge
merge
sindekan-1
sindekan-1
Dvostruko imunofluorescentno bojenje biljezima Ki-67 i sindekan-1(7. i 9. tj.)
Dvostruko imunofluorescentno bojenje biljezima Hsp70 i sindekan-1
Hsp70 sindekan-1 merge
7. tj.
10. tj.
12. tj.
ZAKLJUČCI
PROLIFERACIJSKA AKTIVNOST STANICA ZUBNOG ZAMETKA (Ki-67)
Intenzivna proliferacijska aktivnost u zubnom zametku rasla je od 6. do 8. razvojnog tjedna, a zatim značajno pala u 10. tj. razvoja. Takav uzorak proliferacijske aktivnosti stanica mogao bi biti povezan s rastom i ranim oblikovanjem osnove ljudskog zuba od stadija pupoljka, preko stadija kape do ranog stadija zvona
Od 9. tjedna nadalje, u području caklinskog čvorića nije nađena proliferacijske aktivnosti, što bi moglo ukazivati na početnu diferencijaciju specifičnih dijelova caklinskog organa u smjeru odontoblasta i ameloblasta
ZAKLJUČCI
U 10. tjednu razvoja, stanice zubnog grebena imale su značajno nižu proliferacijsku aktivnost od one u ranijim razvojnim stadijima, što bi se moglo povezati s postupnim nestajanja zubnog grebena
Postotak proliferirajućih stanica bio je veći u dijelovima ektomezenhima koji se uključuje u buduću osnovu zuba od dijelova ektomezenhimu buduće čeljusti
ZAKLJUČCI
ANTI-APOPTOTSKA I APOPTOTSKA AKTIVNOST U STANICAMA ZUBNOG ZAMETKA
Bcl-2 Izražaj anti-apoptotske Bcl-2 bjelančevine bio je jači u
stanicama koje proliferiraju tj. u Ki-67 pozitivnim stanicama, što ukazuje na ulogu Bcl-2 u poticanju proliferacije i preživljenju stanica
Izražaj Bcl-2 bjelančevine prevladavao je u dijelovima zubnog zametka (unutrašnji caklinski epitel, caklinski čvorić) od kojih će nastati specifični dijelovi zrelog zuba, potičući njihovu diferencijaciju
ZAKLJUČCI
Vrlo slab izražaj Bcl-2 bjelančevine u ektomezenhimu zuba podudarao se s nižom proliferacijskom aktivnošću u istom području, što je sukladno s kasnijom diferencijacijom ektomezenhimskih od epitelnih dijelova zubne osnove
ZAKLJUČCI
Bax
Izražaj apoptotske Bax bjelančevine prevladavao je u stanicama zubne osnove čija je sudbina da tijekom razvoja nestanu procesom stanične smrti (vanjski caklinski epitel, caklinska pulpa)
Iste stanice zubnog zametka pokazivale su istovremenu prisutnost i pro-apoptotskog Bax i anti-apoptotskog Bcl-2 čimbenika, a razlika u njihovom prostorno-vremenskom izražaju ovisila o razvojnoj sudbini stanice
Ravnoteža navedenih razvojnih čimbenika važna je za normalno oblikovanje zuba
ZAKLJUČCI
Kaspaza-3
Raspodjela kaspaza-3 pozitivnih stanica u epitelnoj osnovi zuba (u području caklinskog čvorića i caklinske pulpe) ukazuje na ulogu stanične smrti u nestanku primarnog caklinskog čvorića i caklinske pulpe kao preduvjeta normalnog oblikovanja zuba
Prisustvo kaspaza-3 pozitivnih stanica u ektomezenhimu zuba i čeljusti, govori u prilog sudjelovanju ovog razvojnog čimbenika u oblikovanju ektomezenhimskih dijelova zuba, odnosno procesu okoštavanja čeljusti
ZAKLJUČCI
P53
Raspodjela p53 pozitivnih stanica u ektomezenhimu zuba ukazuje na njegovu ulogu u oblikovanju korijena, odnosno u diferencijaciji zubne vrećice u cementoblaste i fibroblaste
Prisustvo p53 pozitivnih stanice u blizini primarnog caklinskog čvorića, govori u prilog sudjelovanja ovog čimbenika u nestanku čvorića, tj. kontroli stanične proliferacije bez koje nema normalnog oblikovanju zuba
ZAKLJUČCI
DIFERENCIJACIJA STANICA ZUBNOG ZAMETKA
Hsp70
Jaki izražaj Hsp70 bjelančevine u epitelnoj osnovi zuba od 6.- 10. tjedna razvoja u skladu je s intenzivnom proliferacijskom aktivnošću u tom području
Jaki izražaj Hsp70 u područje caklinskog čvorića, u kojem se intenzivno sintetiziraju razne signalne molekule, ukazuje na njegovu ulogu u regulaciji stanične homeostaze i zaštiti stanice od apoptoze
ZAKLJUČCI
Slabiji izražaj Hsp70 u ektomezenhimu zuba poklapao se s nižom proliferacijskom aktivnošću u istom području, što potvrđuje kasniju diferencijaciju ektomezenhimskih dijelova zuba u odnosu na njegove epitelne dijelove
ZAKLJUČCI
Sindekan-1
Istovremena prisutnost izražaja sindekana-1 i proliferacijskog biljega Ki-67 u stanicama zubnog pupoljka, podudara se s njegovom ulogom u poticanju stanične proliferacije i rasta zubnog zametka
Izražaj sindekana-1 bio je najintenzivniji u području epitelno-mezenhimskih interakcija i pojačavao se s napredovanjem razvoja zuba, što govori u prilog njegovoj ulozi u staničnoj diferencijaciji