PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA
description
Transcript of PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA
uvod problematika i cilj istraživanja hipoteza metode istraživanja rezultati pilot studije znanstveni doprinos
PREUZETO IZ:Thesleff I, Nieminen P. Tooth morphogenesis and cell differentiation. Curr Opin Cell Biol, 1996. 8(6): p. 844-50.
Ektoderm prvog
ždrijelnog luka
Zubna osnova
Ektomezenhim neuralnog
grebena
Caklinski organ
Zubna papila
Zubni vrećica (folikul)
Vratna petlja
Vanjski caklinski
epitel
Caklinska mrežica
Intermedijarni (središnji)
slojUnutrašnji caklinski
epitelCaklinski
čvorić
Hertwig-ova korjenska ovojnica
Oblik korijena
Ameloblasti Caklina
Reducirani zubni epitel
Osteoblasti
Fibroblasti
Cementoblasti
Cement
Parodontni ligament
Alveolarna kost
Odontoblasti
Nediferencirane
mezenhimne stanice
Fibroblasti
Dentin
Pulpa
Primarni epitelni
pričvrstak
Uzorak krune
PORIJEKLO DIJELOVI ZUBNEOSNOVE
STANICE ZUBNE OSNOVE
PROIZVODI
Nakupina stanica u sredini unutarnjeg caklinskog epitela
Proizvodi niz signalnih molekula (FGF, BMP, Shh, Wnt) koje utječu na rast epitela i ektomezenhima, oblikovanje zuba, prostorni raspored, broj i oblik kvržica
Primarni caklinski čvorić nastaje na vršku zubnog pupoljka, a odstranjuje se apoptozom
Sekundarni caklinski čvorići nastaju na vrhovima budućih kvržica molara te reguliraju njihov položaj i oblik
Caklinski čvorić
PREUZETO IZ:Koyama, E., et al., Polarizing activity, Sonic hedgehog, and tooth development in embryonic and postnatal mouse. Dev Dyn, 1996. 206(1): p. 59-72.Vaahtokari, A., et al., The enamel knot as a signaling center in the developing mouse tooth. Mech Dev, 1996. 54(1): p. 39-43.
Nedostatak istraživanja o ranim stadijima razvoja zuba u čovjeka
Istraživanja na pokusnim životinjama pokazala su značajne razlike u prostorno-vremenskom izražaju proliferacijskih, pro-apoptotskih i anti-apoptotskih čimbenika tijekom razvoja zuba
Poremećaji proliferacije, apoptoze i diferencijacije tijekom razvoja zuba i čeljusti dovode do pojave raznih patoloških promjena (često u sklopu sindroma):
› Anomalije oblika, broja, veličine, građe, vremena nicanja i položaja zuba u čeljusti
› Razvojnih cista i tumora
PROLIFERACIJSKI ČIMBENICI
PRO-APOPTOTSKIČIMBENICI
ANTI-APOPTOTSKIČIMBENICI
ČIMBENICIDIFERENCIJACIJACIJE
Ki-67Bcl-2
Bax
Sindekan-1
Hsp-70
Kaspaza-3
p53
Ki-67
p53
Bax
Kaspaza-3
Stanična smrt
Bcl-2
Preživljenje
Sindekan-1
Hsp 70
Stanična specijalizaci
ja
Stanica
Istražiti pojavu, raspodjelu i promjenu proliferacijske aktivnosti stanica primjenom Ki-67 biljega tijekom različitih stadija ranog razvoja zuba
Istražiti prisustvo, prostorni i vremenski slijed pojavljivanja pro-apoptotskih čimbenika kaspaze-3 i p53 u različitim dijelovima zuba tijekom razvoja
Utvrditi prostorni i vremenski slijed pojavljivanja anti-apoptotske bjelančevine Bcl-2, sindekana-1 i Hsp-70 kao mogućih poticatelja proliferacije i diferencijacije
Dvostrukim bojenjem dokazati moguću istovremenu prisutnost različitih čimbenika u istoj stanici: › Bax i Bcl-2› Ki-67 i sindekan-1› Ki-67 i Bcl-2
Imunohistokemijsko istraživanje ranih faza u razvoju ljudskog zuba ukazati će na moguću ulogu istraživanih čimbenika u normalnom razvoju i diferencijaciji specifičnih dijelova zuba
Promjene u izražaju i prostornom rasporedu svih navedenih čimbenika analizirat će se tijekom ranog razvoja zuba (5.-10. tjedan):
› Ki-67 biljeg očekujemo u svim dijelovima zuba, očekuje se promjena u njegovoj zastupljenosti i prostornom rasporedu paralelno s rastom i diferencijacijom zuba
› Pojava Bcl-2 biljega očekuje se u epitelnoj osnovi zubnog pupoljka i nešto slabiji izražaj u okolnom mezenhimu
› U ranijim razvojnim fazama zuba očekuje se manja uloga kaspaze-3 i veća uloga p53 apoptotskog čimbenika
› Porast izražaja Hsp-70 očekuje se tijekom ranog razvoja i diferencijacije zuba i nešto manji izražaj u okolnom ektomezenhimu
› Pojavu sindekana-1 očekujemo u specifičnim područjima osnove zuba te naročito u pripadajućem zubnom ektomezenhimu tijekom kasnijih razvojnih faza
Interakcije istraživanih čimbenika mijenjati će se tijekom razvoja zuba te omogućavati rast i diferencijaciju zubne osnove i razvoj specifičnih staničnih linija:
› Prevladavanje proliferacijskih i anti-apoptotskih čimbenika u ranijim razdobljima
› U kasnijim razdobljima oblikovanja osnove zuba, veći izražaj apoptotskih čimbenika i čimbenika diferencijacije
Sakupljanje tkiva i određivanje starosti zametaka
› Tkivo normalnih ljudski zametaka starosti 5-10 tjedana (iz postojeće arhivske zbirke Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju te tkivo sakupljeno u Kliničkom zavodu za patologiju, sudsku medicinu i citologiju KBC Split, a uz suglasnost Etičkog povjerenstva za biomedicinska istraživanja MF u Splitu)
› Kriteriji očuvanosti tkiva: bez vanjskih znakova maceracije, promjene boje i anomalija
› Određivanje starosti: na temelju podataka o ovulacijskoj dobi, mjerenjem (CRL) te uspoređivanjem sa stadijima Carnegie instituta
Vođenje, uklapanje i rezanje tkiva:
› Mikrosekcija (odvajanje tkiva koje sadrži zubne zametke)
› Fiksacija u 4% formaldehidu, ispiranje u PBS-u, dehidracija, ksilol, uklapanje u parafinu
› Rezanje na sagitalne, frontalne ili transverzalne rezove debljine 5-7 µm
› Lijepljenje na predmetna stakla, orijentacijsko bojenje svakog desetog stakla H&E (razina reza, očuvanost tkiva)
Imunohistokemijsko bojanje rezova
› Primarna protutijela: Ki-67 Bax Bcl-2 p53 kaspaza-3 sindekan-1 Hsp-70
› Sekundarna detekcija primarnih protutijela: Bojanje DAB-om Imunofluorescencija (TRITC i FITC)
Kvantifikacijska analiza Ki-67, sindekan-1 i Hsp-70 pozitivnih stanica i statistički postupci:
› Brojenje pozitivnih stanica (smeđe obojenje stanice DAB-om) i računanje njihovog udjela u ukupnom broju stanica
› Određivanje moguće statistički značajne razlike u postotku pozitivnih stanica: Među razvojnim tjednima Među različitim dijelovima zuba
› Mann-Whitney test: neparametrijski test za dva nezavisna uzorka (dolaze li dva nezavisna uzorka iz iste distribucije)
› Kruskal-Wallis test: neparametrijski, proširenje MW testa za tri i više grupa
› Razina značajnosti je 0.05
Semi-kvantifikacijska analiza: određivanja intenziteta i prostorne raspodjele pojedinih čimbenika u raznim dijelovima zubne osnove tijekom razvoja (označeno kao odsustvo, slaba ili jaka izraženost)
Kolokalizacijska analiza: određivanje prisustva dvaju čimbenika u istoj stanici primjenom dvostruke imunofluorescencije te određivanje stanica koje pokazuju dvostruki izražaj
Imunohistokemijsko bojenje DAB-om › Ki-67› Bcl-2› kaspaza-3› p53› sindekan-1› Hsp-70
Imunofluorescentno bojenje (dvostruko bojenje) › Bax i Bcl-2 › Ki-67 i Bcl-2 › sindekan-1 i Hsp-70
Kalibović Govorko D, Bečić T, Vukojević K, Mardesic-Brakus S, Biočina-Lukenda D, Saraga-Babić M, Spatial and temporal distribution of Ki-67 proliferation marker, Bcl-2 and Bax proteins in the developing human tooth. Arch Oral Biol (2010)
Mardešić-Brakus S, Kalibović Govorko D, Vukojević K, Alujević Jakus I, Carev D, Petričević J, Saraga-Babić M, Apoptotic and antiapoptotic factors in early human mandible development. Eur J Oral Sci (2010)
Ki-67
Bcl-2
Bcl-2
Ki-67
merge
merge
BaxBcl-2
Syndecan-1/Hsp-70 merge
Dobivanje novih saznanja o ranom razvoju zuba u čovjeka o kojima ne postoje literaturni podaci te o raspodjeli, vremenu i mjestu pojavljivanja pojedinih razvojnih čimbenika
Određivanje % pozitivnih stanica za pojedini istraženi čimbenik (tijekom 5.-10. razvojnog tjedna) ukazat će na slijed razvojnih zbivanja koji su uvjet normalnog razvoja zuba
Pokazati će se da je fina regulacija izražaja genskih proizvoda u stanicama osnove budućeg zuba ključna za normalni razvoj zuba
Istraživanje procesa normalnog oblikovanja i diferencijacije zuba i susjednih struktura od velike je važnosti za razumijevanje nastanka razvojnih anomalija, cista i tumora
Poremećaji stanične proliferacije, diferencijacije i apoptoze, odnosno perzistencije embrionalnih tvorbi dovode do patoloških promjena
Istraživanje mehanizama nastanka patoloških promjena ima kliničku primjenu u području dentalne medicine:
› Oralna kirurgija: razvojne ciste i tumori› Ortodoncija: anomalije broja, oblika, položaja zuba i
čeljusti (od preko 5000 poznatih genetskih sindroma, u više od 700 postoje dentalne/oralne/kranio-facijalne anomalije)
Hvala djelatnicima Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju studija Medicina i Dentalna medicina Medicinskog fakulteta Sveučilišta u
Splitu