Horacio Bouzas Ocean Portfolio Manager, Schlumberger The power of diversity.
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Prion Uptake in the Gut: Identification of the First Uptake and Replication Sites
Bouzas, Carnazolli, Gascue, Scotto
Introducción
Observaciones
- PrPSc resistentes a desnaturalización Adquisición vía oral
- Del SD invaden el SN- Causante de patologías
neurodegenerativas (enf. de la vaca loca, enf. de Creutzfeldt-Jakob)
Captación de PrPSc
Superficie intestinal:
FAE: epitelio folicular asociado a placas de Peyer
Sitio de Replicación de PrPSc
- Transmisión de priones a centros germinales.
- Allí, células foliculares dendríticas (FDC) expresan PrPC
- Acumulación y replicación de PrPSc
- Se alcanza el umbral necesario para infectar nervios periféricos PrPSc a SNC
Objetivos
Determinar si el transporte de priones es o no dependiente de células M
Materiales y métodos
Ratones
129/Ola Background
Wild type (wt) y Prnp-/-. Misma edad y sexo.
Materiales y métodos
Exposición al priónME7 scrapie prions: wt y Prnp-/- alimentados con homogenato de cerebro de ratones terminalmente afectados por el prión. Grupos control alimentados con homogenato de cerebro de ratones sanos.
Materiales y métodos
Ratones
RML scrapie prions: wt y Prnp-/- alimentados (vía sonda) con homogenato de cerebro de ratones terminalmente afectados por el prión. Grupos control alimentados (vía sonda) con homogenato de cerebro de ratones sanos. Paralelamente, se infectan grupos similares de ratones mediante un procedimiento similar, pero con homogenato de Hamsters Sirios (SHa), infectados con el prión Sc237 scrapie. En este último caso, se trató previamente con proteinasa K.
Materiales y métodos
Recolección de muestras
Los ratones fueron sacrificados en 0; 1; 2; 7; 14; 21 y 105 dpf (días post infección).
Se extraen placas de Peyer, nódulos linfáticos mesentéricos y bazo. Se preparan cortes histológicos para IF (semi-finos) y crio-inmuno (ultra-finos).
Marcación indirecta (vs directa): anticuerpo primario, seguido de un anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 488 (verde) o Texas red (rojo)
Anticuerpos primarios:•Endosomas:antiLAMP1•Macrófagos (antiferritina) vs DC (anti MCH II)•Membranas basolaterales de FAE y enterocitos: antiA33•PrP: monoclonales anti-PrP 6H4, R2, y policlonal 1B3
Materiales y métodos
Materiales y métodos
CRYO-INMUNOGOLD EMOro unido a diferentes proteínas que pueden ser usadas como detectores de Ag en reacciones de IMCQ.
Entre estas proteínas esta la Proteina A:
Se extrae la pared celular de
Staphylococcus aureus, y tiene la propiedad
de unirse muy fuertemente a la porción Fc
de los Ac. Esta unión no es de tipo inmune.
Materiales y métodos
CRYO-INMUNOGOLD EM
Fácilmente identificable en las organelas donde se encuentra el Ag por lo tanto permite su cuantificación.No interfiere con pigmentos o enzimas endógenasReacción de alto contraste y sensibilidad. Ac primarios se usan en baja concentración. Para entrar en los tejidos, cuanto menos sea el tamaño, mejor. A veces cuando la concentración del Ag es pequeña, las partículas de oro pueden visualizarse con técnicas de precipitación con Plata.Partículas de oro útiles en microscopia electrónica por su elevada electrodensidad. Muy útiles también cortes histológicos ya que se detecta fácilmente cuando se depositan en los tejidos por su color rojo intenso.
Materiales y métodos
Se usaron Ac PrP-específico (6H4) y fragmentos Fab de Ac (R2)
se conjugaron con partículas comerciales de oro muy pequeñas (0,8 nm).
Esto sirve para permitir una mayor penetración en las
cryo secciones y evitar artefactos causados por reacción
cruzada con inmunoglobulinas endógenas en el tejido.
Se realizaron reacciones de marcado en condiciones
nativas; no se aplicó ningún método de recuperación Ag.
Materiales y métodos
Para algunos experimentos de inmuno-marcación, tanto el anticuerpo primario o secundario, se detectaron a través de la proteína A-oro. Para otros se usó el kit R-GENT SE-EM (comercial) con plata.
Para el marcado doble se utilizó oro ultrapequeño (mejorado con plata) conjugado con anticuerpos anti PrP. Seguido de incubación con el segundo anticuerpo primario que se detectó posteriormente por la proteína A-oro.
Materiales y métodos
La inmunomarcación de las secciones se realizó como se describe Previamente.
En resumen:
Después de bloquear con un 1% de gelatina de pescado frío y 1% de albúmina de suero bovino durante 15 min, las secciones se incubaron con anticuerpo primario durante 60 min, se lavaron y se puente anticuerpos de conejo se aplicaron durante 30 minutos cuando necesario.
Las secciones fueron incubadas con la proteína A-oro (15 nm) durante 20 min. Las especificidades de los anticuerpos fueron controlado por omisión del anticuerpo primario. Secciones marcadas fueron vistas con un microscopio electrónico Philips CM10 (FEI Company, Eindhoven, Países Bajos) a 80 kV.
Materiales y métodos
Cuantificación:
Se llevó a cabo la cuantificación de la distribución de partículas de oro. Los datos se presentan como la media +/- 6 SD. Los datos se analizaron usando una prueba T y se consideraron significativos cuando las diferencias p < 0,05.