Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan...
Transcript of Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan...
![Page 1: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/1.jpg)
Prinsip pemeriksaan metode Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan ElektroforeseElektroforese
Dr.Ozar Sanuddin, SpPK(K)S , Sp K(K)Bagian Patologi Klinik
F k lt k d kt r USU/UISUFakultas kedokteran USU/UISUMedan
![Page 2: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/2.jpg)
Prinsip pemeriksaan ImunologisPrinsip pemeriksaan Imunologis
Umumnya berdasarkan pada interaksiUmumnya berdasarkan pada interaksi antigen(Ag) dan antibodi(Ab).I t k i ti d tib di tbInteraksi antigen dan antibodi tba :- Tingkat primer.- Tingkat sekunder.- Tingkat tertierTingkat tertier.
![Page 3: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/3.jpg)
Tingkat primerTingkat primer
Merupakan awal reaksi ikatan molekuler antara Ag dan Abmolekuler antara Ag dan AbReaksi tidak terlihat dengan mata telanjang(biasa)Perlu indikator
![Page 4: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/4.jpg)
indikator :- Radioisotop- Enzim atauEnzim atau - zat warna flouresen.
Indikator dilengketkan ke Ag atau Ab.
![Page 5: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/5.jpg)
Nama metode pemeriksaan untukNama metode pemeriksaan, untuk menentukan interaksi antara Ag danAb disesuaikan dengan namaAb disesuaikan dengan nama indikator diatas.Ilmu yang mempelajari tentang reaksiIlmu yang mempelajari tentang reaksi Ag dan Ab serologi
![Page 6: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/6.jpg)
Radioisotop Radio Immuno AssayRadioisotop Radio Immuno Assay (RIA).
Enzim Enzyme Immuno AssayEnzim Enzyme Immuno Assay (EIA) Elisa
Fl I fl iFlouresen Immunoflouresensi
Metode ini untuk menentukan kadar Agatau Ab yang rendah ngy g g
![Page 7: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/7.jpg)
Tingkat sekunderTingkat sekunder
PresipitasiPresipitasi Aglutinasi.
![Page 8: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/8.jpg)
Tingkat tertierTingkat tertier
Interaksi antara Ag dan Ab terjadiInteraksi antara Ag dan Ab terjadi dalam tubuh manusia/ invivo.
![Page 9: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/9.jpg)
Teknik ELISATeknik ELISA
Untuk menentukan kadar Ag atau AbUntuk menentukan kadar Ag atau Ab.Indikator berupa enzim dilenketkanpada Ag atau Abpada Ag atau Ab.Ada beberapa metode.
![Page 10: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/10.jpg)
Prinsip Metode ElisaPrinsip Metode Elisa
Bil kit dit k i ti (A )Bila kita mau menditeksi antigen(Ag): Ag(serum) + AbE Ag- AbE komplek
icuci Inkubasi dengan substrat kromogenik( l t k b ) b bil(semula tak berwarna) berwarna,bila dihidrolisis oleh enzim intensitas warna yang terjadi diukur denganwarna yang terjadi diukur dengan fotometer/ spektrofotometer kadar antigen.antigen.
![Page 11: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/11.jpg)
Prinsip Metode Elisa[Sambungan]Hidrolisis oleh enzim berlangsung dalam waktu ttt.a tu tttReaksi berhenti bila ditambahkan asam atau basa kuat.a au basa uaReaksi harus berlangsung dalam keaadan optimal dimana p- kadar reaktan- temperaturtemperatur- masa inkubasi yang telah ditentukan secara eksperimental setiap reagensecara eksperimental setiap reagen dari fabrik ber beda prosedur berbeda.
![Page 12: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/12.jpg)
Reaksi optimal sudah ditentukanReaksi optimal sudah ditentukan secara eksperimental,dengan penetapanpenetapan - kadar reaktan
t t- temperatur- masa inkubasi
setiap reagen dari fabrik berbeda prosedur berbeda.p
![Page 13: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/13.jpg)
Metode ElisaMetode Elisa
Metode kompotitifMetode kompotitifNon kompotitif [Langsung]I di k t d i hIndirek atau sandwich
![Page 14: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/14.jpg)
Metode kompotitifMetode kompotitif
Umumnya untuk menentukan AgUmumnya untuk menentukan Ag.Ab spesifik [dilekatkan pada partikel
/sumur ] dicampur bersama sama Ag */sumur ] dicampur bersama sama Ag * tambahkan serum [Ag] yang akan b i d A * t k ik tbersaing dengan Ag*untuk mengikat Ab diatas kompleks Ag*-Ab-Ag
![Page 15: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/15.jpg)
Metode Elisa[sambungan]Metode Elisa[sambungan]
Non kompotitif[ menentukan AbNon kompotitif[ menentukan Ab atau AgIndirek/sandwich menentukan AbIndirek/sandwich menentukan Ab dan Ag
A Ab A tiAb* tib di- Ag-Ab-AntiAb* antibodi yang dicari- Abs –Ag –Ab* Ag yang dicari
![Page 16: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/16.jpg)
ElektroforeseElektroforese
Dikenalkan oleh Tiselius 1930Dikenalkan oleh Tiselius,1930 berkembang menentukan protein
serum dan urinserum dan urinElektroforese merupakan teknik pemeriksaan yang berguna untukpemeriksaan yang berguna untuk pemisahan dan mengukur kadar makromolekul (protein)makromolekul (protein)
![Page 17: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/17.jpg)
Komponen komponen El kt fElektroforese
Dapar/BufferDapar/BufferMedia pendukung.
M di l- Media gel agarosa- Media selulosa asetat Power suply unitPewarna ProteinPewarna Protein Densitometer
![Page 18: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/18.jpg)
Power suply unit
Menghasilkan energi pada kedua elektroda pergerakan dan p gpemisahan molekul protein.Tegangan dan besar arus dapatTegangan dan besar arus dapat dikendalikan.
![Page 19: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/19.jpg)
Pewarna ProteinPewarna Protein
Panceou redPanceou redamino black C i blCoomassie blue
![Page 20: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/20.jpg)
DensitometerDensitometer
Alat pengukur kuantitas berdasarkan intensitas warna pita padaintensitas warna pita pada elektroforese, saat media pendukung melalui sistem optik yang bekerjamelalui sistem optik yang bekerja seperti fotometer
![Page 21: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/21.jpg)
Prinsip Dasar ElektroforesePrinsip Dasar Elektroforese
Tergantung pada :Tergantung pada :A. Muatan partikelB K t i iB. Kecepatan migrasi.
![Page 22: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/22.jpg)
A. Muatan :A. Muatan Partkel bermuatan, dalam media pendukung nya bila terpapar dengan medan listrik akannya, bila terpapar dengan medan listrik, akan bergerak kearah elektroda yang berlawanan.Molokul protein bersifat ampoter Bila proteinMolokul protein bersifat ampoter. Bila protein berada pada lingkungan pH dibawah titik iso elektrisnya protein akan bermuatan neto y ppositip dan sebaliknyaPada pH isoelektrik protein tidak bermuatan listrik atau muatannya nol
![Page 23: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/23.jpg)
B. Kecepatan Migrasi.B. Kecepatan MigrasiKecepatan migrasi protein tergantung
pada :1.Kekuatan medan listrik.
Makin besar perbedaan muatan neto makin cepat gerakan.neto makin cepat gerakan.
2.Ukuran molekul : Makin kecil mol makin cepatMakin kecil mol makin cepat
gerakan
![Page 24: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/24.jpg)
3.Media pendukung :3.Media pendukung : Pori pori media bersifat filter.
4 Viscositas media4.Viscositas mediaMakin tinggi viscositas makin lambat gerakangerakan
5.Kekuatan medan listrik : tegangan listrik besar migrasi cepatbesar migrasi cepat.
6.Endoosmosis yaitu gerakan berlawanan arah dalam media pendukungarah dalam media pendukung.
7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion rendah migrasi cepatrendah migrasi cepat
8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.
![Page 25: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/25.jpg)
6.Endoosmosis:yaitu gerakan berlawanan arah dalam media pendukung.p g
7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion rendah migrasi cepatkadar ion rendah migrasi cepat
8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.
![Page 26: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/26.jpg)
Fraksi fraksi Serum Protein Elektroforesis
Dengan gel agarosa :Prealbumin- Prealbumin
- Albumin- Alfa 1 globulin- Alfa 2 globuling- Beta globulin
Gama globulin- Gama globulinFraksi fraksi protein terlihat berupa pita
it ifik l t k dpita yang spesifik letaknya dan digambarkan densitometer berupa kurva
![Page 27: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/27.jpg)
Fraksi fraksi protein terlihat berupa pitaFraksi fraksi protein terlihat berupa pita pita yang spesifik letaknya.
Densitometer menghasilkan fraksiDensitometer menghasilkan fraksi protein berupa kurva
![Page 28: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/28.jpg)
Berdasarkan Pergerakan SPEBerdasarkan Pergerakan SPEPrealbumin
F k i t i b i i li- Fraksi protein yang bermigrasi paling dekat ke anoda.
Albumin,- Fraksi protein terbanyak.p y- Fungsi mempertahankan tekanan
osmotikosmotik
![Page 29: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/29.jpg)
Alfa1 globulinAlfa1 globulinAlfa 2 globulin.B t 1 l b liBeta1globulin.Beta 2 globulin.Gamma globulin migrasi terdekat ke katoda.
![Page 30: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/30.jpg)
Polymerase Chain Reaction(PCR).ym ( ).
Metode yang cepat dan sederhanaMetode yang cepat dan sederhana,untuk mengkopi dan memperbanyak urutan DNA spesifik yang dinginkanurutan DNA spesifik yang dinginkan dan divisualisasikan sebagai pita yang jelas pada agarose geljelas pada agarose gel.
![Page 31: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/31.jpg)
Scara mendasar sebenarnya PCRScara mendasar sebenarnya PCR mengulangi siklus :
Denaturasi- Denaturasi- Hibridasi dari DNA yang dinginkan
d b t DNA idengan bantuan DNA primer- Extensi regio DNA tsb oleh enzim
DNA polymerase.
![Page 32: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/32.jpg)
Pada PCR konvensionalPada PCR konvensional - Target amplifikasi adalah asam
nukleat harus dilakukan terlebihnukleat harus dilakukan terlebih dahulu sampai selesaiB didit k i- Baru diditeksi.
Pada PCR yang baru amplifikasi dilakukan terhadap sinyal sedangkan target asam nukleat tidak diamplifikasi.
![Page 33: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/33.jpg)
Pada PCR yang baruPada PCR yang baru Amplifikasi dilakukan terhadap sinyal.T t kl t tid k diTarget asam nukleat tidak diamplifikasi.
![Page 34: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/34.jpg)
Prinsip PCR1 Ekstraksi DNA1. Ekstraksi DNA 2. Alat PCR
a. Target DNAgb. Persiapan larutan reaksi PCR (d NTP,,bufer,primer DNA
danTaq DNA polymerasec Denaturasi DNAc. Denaturasi DNA
Initial denaturation : 5 menit,t 94 CDenaturation : 1 menit 94 CPrimer annealing : 1 menit 50 CCopying of DNA by DNA polymerase fi l l ti 10 it 72 Cfinal elongation 10 menit ,72 C
Program alat PCR bisa dilakukan 25 -30 siklusg
![Page 35: Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforeseocw.usu.ac.id/course/download/1110000102-basic-biology-of-cell-3/... · Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan Elektroforese](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022052123/5c88e52c09d3f2224c8c4c36/html5/thumbnails/35.jpg)