Přínos imunofenotypizace k diferenciální Přínos imunofenotypizace k diferenciální diagnostice hematoonkologických diagnostice hematoonkologických

onemocněníonemocnění

M.Bílý, K. Klaricová, L.Novosadová,

D. Starostka, M. Wróbel

Oddělení klinické hematologie

NsP Havířov

Prim. MUDr. L. Novosadová

ImunofenotypizaceImunofenotypizaceTypizace jednotlivých buněčných populací za využití reakce antigen – protilátka. Reakce je vizualizována označením protilátky fluorochromem (FITC, PE, PC5, aj.).

Zjištění imunofenotypu dané populace.

Buněčná lokalizace antigenů (markerů, znaků):1. Povrchová (membránová).2. Intracytoplazmatická.3. Nukleární (jaderná).

Zdroje vyšetřovaného materiálu v hematologii:• periferní krev

• kostní dřeň

• tělesné tekutiny (punktáty, likvor, aj.)

• suspenze buněk ze solidních tkání po dezintegraci

Praktické provedení imunofenotypizace:1) Průtoková cytometrie.2) Fluorescenční mikroskopie.

Ymab2

PE

Ymab1 FITC

Možnosti vícebarevného značení Možnosti vícebarevného značení (multiparametrová analýza)(multiparametrová analýza)

• V jediné zkumavce vyšetřované buňky + 2 či více protilátek proti různým znakům, každá protilátka označena jiným flurochromem.

Současná analýza exprese několika znaků na jedné buňce.

Význam: Získání upřesňujících informací o charakteru vyšetřované populace, konfirmace diagnózy.

Příklad:Znaky CD19 (B-lymfocyty) a CD5 (fyziologicky T-lymfocyty) u B-CLL : patologická subpopulace CD19+CD5+ .

Přehled CD znaků (Přehled CD znaků (CD CD = = CCluster of luster of DDifferentiation)ifferentiation) T – lymfocyty : CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD2, CD1 , TCR

B – lymfocyty : CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD38, CD11c, CD79b, FMC7, CD40, CD28, CD103, CD138

NK – buňky: CD16, CD56

Granulocyty a monocyty: CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD33

Progenitorové buňky: CD34, CD38, CD117

Povrchové, event.intracytoplazmatické imunoglobuliny : těžké řetězce IgG, IgA, IgM, IgD, lehké řetězce κ, λ

Průtoková cytometrie (flow cytometry)Průtoková cytometrie (flow cytometry)

• Metoda kvantitativní a kvalitativní analýzy buněčných či jiných částic, pohybujících se v proudu tekutiny, která protéká v průtokové komůrce přes laserový paprsek.

• Identifikace různých buněčných typů uvnitř smíšené buněčné populace, analýza jednotlivých subpopulací v rámci jedné populace.

• Rychlá, přesná a reprodukovatelná metoda, umožňující současné měření několika parametrů až na 104 buněk za 1 sekundu.

Schéma průtokového cytometruSchéma průtokového cytometru

Laser (Air-cooled Argon Ion Laser)

Čočky upravující tvar paprsku„Beam Shaping Lenses“

Průtoková kyveta„High Sensitivity

Quartz Flow Cell“

Detektor pro„Forward Scatter“

Detektor pro „Side Scatter“

525BP FL1 (FITC)

575BP FL2 (RD1)

620BP FL3 (ECD)675BP FL4 (PC5)

488DL488BK

550DL600DL

645DL

Klinická aplikace imunofenotypizace Klinická aplikace imunofenotypizace v hematologii a hematoonkologiiv hematologii a hematoonkologii

Analýza erytrocytů Analýza trombocytů Stanovení retikulocytů Funkční vyšetření granulocytů Vyšetření diferenciálního rozpočtu leukocytů Typizace leukémií: AL – AML, ALL

chronické leukémie (např. CLL) Typizace lymfomů - v leukemické fázi

- vyšetření lymfatických uzlin, sleziny Imunofenotypizace dalších jednotek: myelom, MDS, PNH Analýza onkoproteinů Sortování (třídění) buněk dle antigenní výbavy

(progenitorové buňky CD34) Cytometrická DNA analýza (ploidie, obsah DNA, RNA)

Přehled hematoonkologických Přehled hematoonkologických diagnóz 1/1995 – 2/2002diagnóz 1/1995 – 2/2002

Lymfoproliferace n Akutní leukémie nB-CLL 251 AML 36

Leukem. B-NHL 40 ALL B - linie 6

B-HCL 5 T - ALL 1

T-LGL 4 Bifenotypová AL 2

M. Waldenström 4 PCL 4B-CLL / PLL 3 Jiné stavy n

T-PLL 3 MDS 12

Richterova PNH 1

transformace B-CLL 1 Myeloidní sarkom 1

Celkem vyšetřeno 4350 jednotlivých vzorků, tj. 49 870 znaků.

Definice lymfocytózy:Definice lymfocytózy:

Zvýšení počtu lymfocytů v periferní krvi• absolutní > 4.0 x 109 / l u dospělých• relativní

Diferenciální diagnostika pomocí membránových znaků:• monoklonální ( primární, leukemická) lymfocytóza• polyklonální ( sekundární, reaktivní ) lymfocytóza

Důležitost rozlišení patologické lymfocytózy od reaktivní.

Monoklonalita v lymfoidních Monoklonalita v lymfoidních řadáchřadách

(z pohledu imunofenotypu)(z pohledu imunofenotypu)

B-linie1. Lehké řetězce imunoglobulinů kappa, lambda.kappa, lambda. Průměrný poměr 1.5 : 1 . Normální rozsah 0.7-2.5 .

Monoklonalita κκ::λλ , , λλ::κκ > 3:1 .

2. Těžké řetězce imunoglobulinů ( molekuly Ig). Monoklonalita: 1 Ig třída k součtu ostatních >3:1 .

3. Charakteristický imunofenotyp

Monoklonalita v lymfoidních Monoklonalita v lymfoidních řadách řadách

(z pohledu imunofenotypu)(z pohledu imunofenotypu)

T linie:

1. Zvýšená exprese pan-T antigenů.2. Exprese aberantních fenotypů, uniformní

imunofenotyp.3. Porušený poměr CD4/CD8.4. Typ TCR.5. Délka trvání T- lymfocytózy ( absolutní počet

>4.0 x 109 /l po dobu minim. 3 - 6 měsíců ).

Imunofenotyp u chronických B - lymfoproliferacíImunofenotyp u chronických B - lymfoproliferací

Jednotka

Membrán. znak

Smlg -/+ ++ +/++ +/++ - +/- ++ ++ ++ +/++ +/++

Pan - B (CD19, CD20) ++ ++ ++ ++ - + ++ ++ ++ ++ ++

CD5 ++ -/+ - - - +/- ++ -/+ - -/+ -/+

CD22 -/+ ++ ++ ++ - + +/- +/++ +/- +/- ++

CD23 ++ -/+ - - - ND -/+ -/+ +/- - -/+

CD25 -/+ -/+ ++ - - +/- -/+ -/+ - -/+ -/+

CD11c -/+ -/+ ++ ND ND ND - - +/- -/+ +

CD10 - -/+ -/+ ND ND +/- -/+ +/- - - -/+

FMC7 -/+ ++ ++ ++ - + +/- + + +/- ++

CD79b - ++ + + - ND +/++ +/++ ND ND +/++

CD103 - - ++ + - ND - - - - -/+

CD43 + + + ND ND ND + - -/+ +/- +

CD38 -/+ - -/+ ND ++ + - - ND + +/-

HC2 - - ++ - - ND - - - - -/+

SLVLPCL WM

LEUKÉMIE LYMFOMYB-CLL B-PLL HCL HCL-V MCL FL MZL LPL

Legenda: B – CLL : B – chron. lymf. leukémie MCL : mantle – cell lymfom

B – PLL : B – prolymfocyt. leukémie FL : folikulární lymfom

HCL : hairy – cell leukémie MZL : lymfom z marginální zóny

HCL – V : HCL – variant LPL : lymfoplazmocytoid. lymfom (imunocytom)

PCL : plazmocelulární leukémie SLVL : splenický lymfom s vilóz. lymfocyty

WM : Waldenström. makroglobulinémie ND : neudáno

SkórovacíSkórovací systém pro B – CLLsystém pro B – CLL(podle Matutes a spol.)(podle Matutes a spol.)

BODY 1 0MEMBRÁN. ZNAK

SmIg slabá pozitivita střední/silná pozitivita

CD5 pozitivní negativní

CD23 pozitivní negativní

FMC7 negativní pozitivní

CD79b (dříve CD22) slabě pozit./negat.

střední/silná pozitivita

Rozmezí skóre od 5 (typická B - CLL) do 0 (atypická B - CLL).

Přehled stavů diagnostikovaných na OKH NsP Přehled stavů diagnostikovaných na OKH NsP Havířov od 6/1997 do 2/2002Havířov od 6/1997 do 2/2002

Vyšetřeno 249 pacientů s nově zjištěnou absolutnílymfocytózou ( > 4.0 x 109 / l lymfocytů v perif. krvi ).

Soubor pacientů: 249 dospělých pacientů ve věku od 19 do 98 let ( průměrný věk 64.9 let ) Poměr muži : ženy 145 : 104 ( 1.39 : 1 ) Počet leukocytů v KO: 5.4 – 536.0 x 109 / l Lymfocyty v diferenciálním rozpočtu: 0.04 - 0.99 numfr Absolutní počet lymfocytů: 4.1 – 530.0 x 109 / l Převaha řetězců κ : λ 145 pacientů - poměr 1.1 - 776 : 1 Převaha řetězců λ : κ 100 pacientů - poměr 1.1 - 829 : 1

Přehled stavů s absolutní lymfocytózou Přehled stavů s absolutní lymfocytózou diagnostikovaných na OKH NsP Havířov diagnostikovaných na OKH NsP Havířov

od 6/1997 do 2/2002od 6/1997 do 2/2002

B-CLL 179 pacientů 71.9 %

Reaktivní lymfocytóza 36 pacientů 14.5 %

Leukemizovaný B-NHL 19 pacientů 7.6 %

MLUS 5 pacienti 2.0 %

B- CLL/PLL 3 pacienti 1.2 %

T-PLL 2 pacienti 0.8 %

T-LGL 2 pacienti 0.8 %

PCL 2 pacienti 0.8 %

B-HCL 1 pacient 0.4 %

( n = 249 )

Stavy bez absolutní lymfocytózy, Stavy bez absolutní lymfocytózy, s počtem lymfocytů s počtem lymfocytů << 4x10 4x1099/l/l

Vyšetřeno 18 pacientů bez absolutní lymfocytózy ( < 4.0x109 /l lymfocytů v periferní krvi ), u kterýchvedla imunofenotypizace k dg. lymfoproliferace.

Soubor pacientů: 18 dospělých pacientů ve věku od 41 do 79 let ( průměrný věk 63.6 let ) Poměr muži : ženy 10 : 8 Počet leukocytů v KO: 2.5 – 14.2 x 109 / l Lymfocyty v diferenciálním rozpočtu: 0.15 - 0.78 numfr Absolutní počet lymfocytů: 1.1 – 4.0 x 109 / l Převaha řetězců κ : λ 14 pacientů - poměr 2.8 – 69 : 1 Převaha řetězců λ : κ 4 pacienti - poměr 4.4 – 86 : 1

Stavy bez absolutní lymfocytózy, Stavy bez absolutní lymfocytózy, s počtem lymfocytů s počtem lymfocytů << 4x10 4x1099/l/l

Leukemizovaný B-NHL 7 pacientů 38.9 %

B-CLL 4 pacienti 22.2 %

MLUS 4 pacienti 22.2 %

Richterova transformace B-CLL 1 pacient 5.6 %

B-HCL 1 pacient 5.6 %

Waldenströmova makroglobulinemie

1 pacient 5.6 %

( n = 18 )

Kazuistika č.1Kazuistika č.1B.D., M, 60 let

• V dubnu 2000 náhodně zachycená extrémní leukocytóza na bázi lymfocytózy.

• Krevní obraz: hemoglobin 125 g/l

leukocyty 485x109/l

trombocyty 96x109/l

diff.: lymfocyty 0.91 numfr

lymfocyty absolutně 441 x 109/l

Imunofenotypizace lymfocytů (4/2000):

CD 19+ 98.5 % SmIgM 91.5 %

CD 19+/5+ 98.4 % SmIgD 90.4 %

CD 23+ 78.6 % CD 19+/+ 92.7 %

CD 79b+ 82.0 % CD 19+/+ 0.3 %

FMC 7+ 5.0 % Poměr / 309 : 1

Závěr:Závěr: B-CLL, skóre dle Matutes a spol. 3/5. B-CLL, skóre dle Matutes a spol. 3/5.

Kazuistika č.2Kazuistika č.2C.K., M, 63 let Před léčbou Po léčbě

• Dg. B-CLL od 6/1997, skóre B-CLL 4/5.

• Léčba nejprve chlorambucilem (Leuke- ran), poté fludarabinem ( 5 kúr, 2/2000- 7/2000)

Charakteristika Charakteristika Před léčbou Po léčbě Před léčbou Po léčbělymfocytů fludarabinem fludarabinemlymfocytů fludarabinem fludarabinem

Leukocyty (109/l) 149.8 3.3Lymf. diff.(numfr) 0.92 0.31Lymf. absol. (109/l) 137.8 1.0

CD 19+ 87.5 % 91.2 % CD 19+/5+ 87.5 % 91.2 %CD 23+ 81.0 % 85.2 %CD 19+/+ 1.6 % 0.3 %CD 19+/+ 90.7 % 87.2 %Poměr / 57 : 1 291 : 1

Závěr:Závěr: I přes leukopenii a lymfopenii není po léčbě B-CLLremise na úrovni imunofenotypu dosaženo !

Kazuistika č. 3Kazuistika č. 3J. K., M, 42 let V 5/2001 při preventivní prohlídce zjištěna

trombocytopenie, leukocyty početně v normě, v diff. lymfocytóza. Dále splenomegalie. Cytomorfologicky některé lymfocyty s vilózními

výběžky, pojato podezření na HCL.

KO v 5/2001: Hb 171 g/l leuk. 5.4 x 109/l tromb. 53 x 109/l diff.: segm. 0.14 ly 0.82, mo 0.04 numfr

Imunofenotypizace patologických buněk PK:Imunofenotypizace patologických buněk PK:CD19 CD19 89.5% CD19+/ CD19+/κκ+ + 4.8%CD11c CD11c 94.1% CD19+/ CD19+/λλ+ + 75.6%CD22 CD22 86.7%CD25 CD25 81.6% λλ : : κκ = 16 : 1CD103 CD103 88.3%CD5 CD5 8.8% SmIgG SmIgG 90.8%CD23 CD23 6.4% SmIgA SmIgA 79.5%

Závěr:Závěr: Vlasatobuněčná leukémie (HCL). Vlasatobuněčná leukémie (HCL). (Potvrzeno histologií kostní dřeně.)(Potvrzeno histologií kostní dřeně.)

Závěry I.Závěry I. Imunofenotypizace představuje u hematoonkologických onemocnění

zásadní diagnostickou a diferenciálně diagnostickou metodu. Multiparametrová analýza buněk zvyšuje přesnost diagnózy a lépe charakterizuje imunofenotyp vyšetřované populace.

Jednotlivé hematoonkologické jednotky se vyznačují poměrně charakteristickým až zcela diagnostickým imunofenotypem, který může mít i prognostický význam a jehož lze např. využít k průkazu relapsu onemocnění a monitoraci minimální reziduální choroby.

Imunofenotypizace průtokovou cytometrií se vyznačuje vysokou senzitivitou a specifitou (citlivost metody cca 10-3 buněk), rychlostí a reprodukovatelností.

Závěry II.Závěry II.

Při záchytu absolutní lymfocytózy, zejména perzistující, je nutné vyloučit monoklonální charakter lymfoidní populace. K tomuto účelu se jeví imunofenotypizace ve většině případů jako suverénní diagnostická metoda, která často objasní monoklonalitu i u lymfoproliferací s relativní lymfocytózou.

Vysoká senzitivita i specifita při stanovení imunofenotypu buněk vede často k odhalení patologického lymfoidního klonu podstatně dříve než při vyšetření dalšími běžnými metodami.

Pacient s monoklonální lymfocytózou by měl být komplexně vyšetřen. U dosud nevyhraněného imunofenotypu jsou nutné dispenzarizace a kontroly.

Spolupracující pracovištěSpolupracující pracoviště FNsP Ostrava: ÚKH Interní klinika

NsP Karviná – Ráj: HTO Interní oddělení Oddělení TRN ORL oddělení

Karvinská hornická nemocnice, a.s. : Interní oddělení

Nemocnice Třinec : Interní oddělení HTO

Krevní centrum Frýdek - Místek Nemocnice Hranice : HTO

Nemocnice Frýdek – Místek : HTO Interní oddělení Urologické odd. Odd. následné péče

Nemocnice Bohumín : Interní oddělení Chirurgické odd.

Městská nemocnice Český Těšín : OKBH Interní oddělení

Nemocnice Orlová a LDN : Interní oddělení Neurologické odd. LDN Praktičtí lékaři