PRINCIPIS DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR  Dr. Joan Bertran. Dept. Bioquimica i Biologia Molecular. UBObjectiu: unificar conceptes. 

PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

BIBLIOGRAFIA Introduction to Genetic Analysis. 7th ed.Griffiths, Anthony J.F.; Miller, Jeffrey H.; Suzuki, David T.; Lewontin, Richard C.; Gelbart, William M. New York: WH Freeman and Co; c1999. Molecular Cell Biology. 4th ed.Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. New York: WH Freeman and Co; c1999.

Genomes. 2nd ed.Brown, T. A. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers, Ltd 2002.

Human Molecular Genetics 2. 2nd ed.Strachan, Tom and Read, Andrew P. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 1999.

Ingeniería Genética y transferencia Génica.Marta Izquierdo Rojo; Editorial PirámideMadrid, 2001

PROGRAMA: 

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

 

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

 

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...).

 

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

 

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

 

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

PROGRAMA: 

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

 

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

 

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...).

 

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

 

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

 

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

PROGRAMA: 

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

 

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

 

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...).

 

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

 

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

 

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

CRE-RECOMBINASE

ataacttcgtata gcatacat tatacgaagttat

loxP

Cre recombinase

loxP loxP

loxP

A

B

Excision of a loxP flanked region

Cloning vector Size of insert

Standard high copy number plasmid 0 - 10 kb

Bacteriophage insertion 0 - 10 kb

Bacteriophage replacement 9 - 23 kb

Cosmid 30 - 44 kb

PAC (P1 artificial chromosome) 130 - 150 kb

BAC (bacterial artificial chromosome) up to 300 kb

YAC (yeast artificial chromosome) 0.2 - 2.0 Mb

PROGRAMA: 

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

 

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

 

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

 

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...). 

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

 

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

 

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

Tejido

mRNA

H2O mRNA

OvocitosXenopus

Ensayo

Selecciónpor tamaño

ABCD H2O A B C D

SintesiscDNA

1

2

3

4

5

6

H2O 1 2 3 4 5 6

Aislamiento de clones únicos

PROGRAMA: 

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

 

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

 

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

 

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...).

 

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

 

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

PROGRAMA: 

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

 

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

 

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

 

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...).

 

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

 

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

RECOMBINACIÓN IN VIVO

gene of interest

selection marker

targeting construct

X X

homology homology

double homologousrecombination

selection marker

inactivated gene

HOMOLOGOUS RECOMBINATION

egg

sperm

fertilized egg

ZYGOTE

32-64-cellstage

BLASTOCYST

inner cell mass (ICM)

Embryonic Stem cells:culture

genetic manipulation

reintroduce in host-embryo

CRE-LOXP: TISSUE-SPECIFIC GENE INACTIVATION

(only one floxed allele indicated, should be homozygous or other allele otherwise inactivated)

PROGRAMA: 

1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector.

 

2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses).

 

3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS.

 

4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...).

 

5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica.

 

6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors.

 

7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

cDNAAffinity tag

T7 promoter

Insert in an expression plasmid

TAAATG

NH4

Purify fusion protein via affinity tag

• Common affinty tags are be 6X-His & GST – both protein will bind reversibly with high affinty and specificty to a particular chromatography resin

Needs to be in frame

Liposome

Electroporation

Transfection

HEMOFÍLIA B

RECESSIVA, LLIGADA AL CROMOSOMA X

MANCA FACTOR IXSÍNTESI AL FETGEALLIBERACIÓ AL TORRENT ONPARTICIPA EN LA COAGULACIÓ

TRACTAMENTTRANSFUSIONS: RISC DE INFECCIONSVÍRIQUES (HB, HIV)FACTOR IX RECOMBINANT

VIDA MITJA CURTACARÍSSIM

HI HA MODELS ANIMALS; FACILITENEL DESENVOLUPAMENT DE NOVESTERÀPIES

Blood, 15 April 2002, Vol. 99, No. 8, pp. 2670-2676

Sustained phenotypic correction of hemophilia B dogs with a factor IX null mutation by liver-directed gene therapy

Jane D. Mount, Roland W. Herzog, D. Michael Tillson, Susan A. Goodman, Nancy Robinson, Mark L. McCleland, Dwight Bellinger, Timothy C. Nichols, Valder R. Arruda, Clinton D.

Lothrop Jr, and Katherine A. High

From the Scott-Ritchey Research Center and Department of Clinical Sciences. College of Veterinary Sciences, Auburn University, AL;

Departments of Pediatrics and Pathology, University of Pennsylvania Medical Center and The Children's Hospital of Philadelphia; and

Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of North Carolina, Chapel Hill.

Therapeutic factor VIII levels and negligible toxicity in mouse and dog models of hemophilia A following gene therapy with high-capacity adenoviral vectors

M. K. L. Chuah, G. Schiedner, L. Thorrez, B. Brown, M. Johnston, V. Gillijns, S. Hertel, N. Van Rooijen, D. Lillicrap, D. Collen, T. VandenDriessche, and S. Kochanek

Blood, March 1, 2003; 101(5): 1734 - 1743.

AAV-mediated factor IX gene transfer to skeletal muscle in patients with severe hemophilia B

C. S. Manno, A. J. Chew, S. Hutchison, P. J. Larson, R. W. Herzog, V. R. Arruda, S. J. Tai, M. V. Ragni, A. Thompson, M. Ozelo, L. B. Couto, D. G. B. Leonard, F. A. Johnson, A. McClelland, C. Scallan, E. Skarsgard, A. W. Flake, M. A. Kay, K. A. High, and B. Glader

Blood, April 15, 2003; 101(8): 2963 – 2972

(administration of AAV vector by the intramuscular route is safe at the doses tested and effects gene transfer and expression in humans in a manner similar to that seen in animals)