1

Principi rada sa eksperimentalnim životinjama

Prof. Zoran Todorović

Institut za farmakologiju, kliničku farmakologiju i toksikologijuMedicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Eksperiment na životinjama:

• “... bilo koji postupak u kome se žive životinje koriste za proveru naučnih hipoteza, prikupljanja informacija, izolovanje ili ispitivanje supstanci ili razjašnjenje efekata nekog postupka, kao i korišćenje životinja u bihejvioralnim eksperimentima...”

(Swiss Animal Protection Act; www.roche.com)

2

Principi rada sa eksperimentalnim životinjama

• Istorijat• Sistemi u eksperimentalnom radu; biološki ogled• Zakonodavstvo• Uzgoj, vrste, najčešća oboljenja, dobrobit

eksperimentalnih životinja• Bol i patnja eksperimentalnih životinja• Primena lekova• Anestezija, hirurške tehnike• Odabrani in vivo modeli

Istorijat• Eksperimenti na životinjama:

– Egipat, Kina, Indija– 5. vek p.n.e. – prvi zabeleženi– 4. vek p.n.e. - Aristotel– 2. vek n.e. – formirani prvi standardi

• Galen iz Pergamona (disekcija životinja) Vesalius (disekcija ljudi)– 17. vek – krvotok: William Harvey, Jan de Wales; Descartes –

mašine koje ne osećaju bol– 18. vek – Voltaire – 19. vek - Claude Bernard (An Introduction to the Study of

Experimental Medicine); Schopenhauer; Hume;• Jeremy Bentham: “Nije pitanje da li životinje mogu rasuđivati

ili govoriti, već da li mogu (fizički) patiti.”• Charles Bell & Francois Magendie – funkcija perifernih nerava,

neanestetisane životinje

3

Istorijat• Eksperimenti na životinjama:

– 1824. – Prvo udruženje koje sprečava surovost prema životinjama

– 1835. – pod patronatom princeze Viktorije– 1854. – dva psa – eksperimentalno izazvana epilepsija –

burna reakcija (British Medical Association Meeting)– ~1875. – udruženja protiv vivisekcije + peticija (Darwin,

Jenner, Owen)– 1926. – University of London (Udruženje za dobrobit

životinja)– 1971. – 5,5 miliona životinja u UK– 2003. – 2% porast broja eksp. procedura (na 2,8 miliona),

2,4% porast broja korišćenih životinja uopšte i 21% porast broja eksperimenata na primatima (izuzev čoveka)

Biološki ogled• Biološki ogled - merenje potentnosti leka ili nepoznatog

medijatora na osnovu intenziteta bioloških efekata koje on izaziva

• Poređenje nepoznatog preparata sa standardom (često nepouzdano, varira od laboratorije do laboratorije), na osnovu krive doza–odgovor

• Biološki odgovor - kvantalan (procenat testova sa efektom sve-ili-ništa) ili stupnjevit

• Nivoi biološke organizacije - različiti pristupi sistemumerenja– molekularne i hemijske tehnike– testovi na životinjama in vitro i in vivo– klinička ispitivanja na dobrovoljcima i pacijentima– merenje efekata lekova na socioekonomskom nivou

4

Rang et al., 2003

Nivoibiološkeorganizacije

Sistemi u eksperimentalnom radu- Prednosti -

Delovimembrana

Pojedinačnećelije

Ćelijskekulture

Izolovanatkiva

In vivo(umrtvljeni refleksi)

In vivo(intaktna živ.)

Kontrolisana koncentracija leka

Merenjeafinitetaleka zareceptor

Pojačavanje signala

Merenje primarnog odgovora

Merenje relativne efikasnosti

Refleks ne utičena odgovor

Integrisanodgovor

Kenakin T. Pharmacologic Analysis of Drug-Receptor Interaction (3rd ed). Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997

5

Biološki ogled

• Nove supstance• Endogeni medijatori• Toksikološka ispitivanja

Prednosti i nedostaciživotinjskih modela (1)

• Životinjski modeli– značajni za otkrivanje novih lekova– reprodukuju samo neke aspekte humanih

bolesti• modeli psihijatrijskih oboljenja - naročito

problematični

6

Prednosti i nedostaciživotinjskih modela (2)

• Životinjski model treba da liči na humano oboljenje po sledećim parametrima

1. sličan fenotip (manija? migrena?)2. uobičajeni uzrok (Alzheimerova bolest?

parkinsonizam?)3. patofiziološka sličnost (depresija, anksioznost?)4. odgovor na terapiju (novi lekovi?)

Prednosti i nedostaciživotinjskih modela (3)

• Genetski pristup– selektivno razmnožavanje (spontane

mutacije) – npr. spontano hipertenzivni pacovi

– planirana genetska manipulacija –transgene životinje

7

Prednosti i nedostaciživotinjskih modela (4)

• Transgene životinje - izazivanjem mutacija u jajnim ćelijama (ili ćelijama spermatozoida) životinje (uglavnom miševa), što omogućuje

• uvođenje novih gena („knock in”) ili• inaktiviranje ili mutaciju već postojećih gena („knock-out”) kod

kolonija priplodnih životinja– insercija ili delecija određenih gena – može da izazove

fenotipske promene slične humanim oboljenjima– veliki broj takvih modela– izazvana mutacija deluje tokom celog života i razvoja životinje, a

može biti i letalna.– uslovna mutageneze – aktivacija i inaktivacija izmenjenog gena

Pacov (Rattus norvegicus)- inbred sojevi -

– Helen Dean King – albino pacovi – Wistar Institute, Philadelphia, 1919.god.

– Uzgoj Wistar i Sprague-Dawley soja– Publikacije sa eksp. na pacovima i miševima 1,5:1

(pre mol. biol. ere 2:1)

8

Pacov (Rattus norvegicus)- Modeli -

– KV bolesti– Metabolički poremećaji

(npr. lipidi, DM)– Neurološki poremećaji

(npr. epilepsija, parkinsonizam, neuropatski bol)

– Bihejvioralni poremećaji

– Transplantacija organa

– Autoimune bolesti (npr. artritis, eksp. alerg. encefalomijelitis)

– Maligne bolesti– Poremećaji bubrega– Toksikologija...– + Genetika!

Etičnost• 3 miliona u eksperimentima vs. x00 miliona –

hrana i sl., ali:– na istraživanja – teško uticati– u istraživanjima – bol, patnja, poremećaji ili trajna

oštećenja (mučenje?)• Dilema u društvu:

– životinje su u podređenom položaju– fizička patnja postoji kod životinja– korišćenje životinja – može dovesti do njihove patnje

9

Etičnost

• Dva pristupa:– odnos koristi (za ljude!) i štete (za životinje!)– vrednost života i prava životinja

• zakoni – interpretacija moralnih načela...• suprotni stavovi: René Descartes (“preterana

sentimentalnost prema životinjama”)

Etičnost• Korist

– polio vakcina – in vivo test – jedini pouzdan za utvrđivanje potencijalne virulentnosti serije

• icv., majmuni• GM miševi sa receptorima za virus

– tehnike dijalize i transplantacije bubrega i primena ciklosporina• kunići, psi

– želudačna sekrecija i H2-antihistaminici• pacovi, zamorci

– cistična fibroza (CFTR protein; genomika i proteomika)• GM miševi

10

Etičnost

• Buduća istraživanja na životinjama (modeli in vivo) – razvoj novih lekova– infekcije rezistentnim sojevima (GM miševi)– psihički poremećaji i duševne bolesti (depresija,

shizofrenija, anksioznost)– bolesti zglobnih struktura i imunološki poremećaji– urođeni poremećaji (Duchenne distrofija)– bolesti sa gubitkom vida i sluha– HIV infekcija i AIDS– demencije– ...

Etičnost• Pitanja:

– Zašto radite taj eksperiment?• korist/šteta

– Da li to što radite pokreće pitanje etičnosti?• bol, patnja, izolacija...

– Alternative (Replacement)?• in vitro, in silico, matematički modeli, ljudi, vrsta koja je niže na

filogenetskoj lestvici– Možete li koristiti manji broj životinja (Reduction)?

• promena dizajna, faktorska analiza, uzajamno korišćenje iste životinje za više eksperimenata, inbred sojevi, ponovno korišćenje iste životinje (nekada moguće uz dozvolu)

– Usavršavanje metode (Refinement)?• bolje hirurške tehnike (laparoskopija umesto laparotomije), promena

uslova uzgoja ili smanjenje doze/zapremine leka

11

Etičnost

– “3 R” (Russel & Burch, 1959)• Replacement

– kulture ćelija, tkiva i organa– mikroorganizmi– hemijske i druge metode (transkranijalna magnetna

stimulacija – TMS, privremeno remeti funkciju mozga)– in silico – kompjuterski modeli– filmovi– modeli, statistika– ljudi

Etičnost

– “3 R” (Russel & Burch, 1959)• Reduction; npr.

– izazivanje reverzibilnih lezija mozga (hladan FR) umesto trajnog uklanjanja određenih delova

– nove tehnike vizuelizacije– nove hirurške tehnike (gubitak samo jednog kvadranta

vidnog polja – životinja je sama sebi kontrola)

12

Etičnost

– “3 R” (Russel & Burch, 1959)• Refinement

– korišćenje životinja kontrolisanog zdravstvenog stanja– vrsta i soj; inbred sojevi; GM

» 90% gena bolesti čoveka prisutno kod miša» npr. SOD1 gen i ALS

– obuka i vežba– statističke metode; eksperimentalni dizajn

» greška kod talidomida u dizajnu, a ne u pouzdanosti animalnih modela!

Etičnost

• Neprekidno, tokom eksperimenta: “Može li se smanjiti patnja životinja i povećati korist od istraživanja?”

• Kontrola/Inspekcija!

13

Eksperimenti na životinjama- Zakoni -

• Privilegija izvođenja eksperimenta na živim životinjama u cilju zaštite i unapređenja zdravlja životinja i ljudi

• Prilika i sposobnost da se unapredi nauka za dobrobit čovečanstva

• Najviši mogući standardi za dobrobit životinja, u skladu sa ciljevima istraživanja

Eksperimenti na životinjama- Zakoni -

– Principi eksperimentalnog rada na životinjama (Marshall Hall, 1831.):

• ne raditi eksperiment ako se podaci mogu dobiti posmatranjem

• eksperiment samo ako su ciljevi definisani i realni (dostižni)• informacije o prethodnim istraživanjima – izbeći ponavljanje• patnja – svedena na minimum (npr. niže vrste)• što jasniji rezultati istraživanja, tako da je potreban broj

životinja najmanji moguć

14

Eksperimenti na životinjama- Propisi -

• EC: 1985., 26 zemalja: “Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for the Experimental and Other Scientific Purposes” (ETS 123) – nema snagu zakona, ali je prihvaćen (ratifikovan u nekim zemljama, pa u EU 1998.)

– Council Directive, 1986. - EU Directive for the Protection of the Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes (86/609/EEC)

– Council Directive, 2003. - 2003/65/EC

Eksperimenti na životinjama- Propisi -

• Eksperimenti na životinjama:– UK (“animal lovers”)

• 1986. – The Animals (Scientific Procedures) Act 1986

– SAD, Kanada, Australija...• Animal Welfare Act (SAD)

– Zakonska regulativa – promene u korist životinja i obrnuto

15

Zakonodavstvo - Srbija

• Eksperimenti na životinjama:– 2003/04. – Pravilnik za rad sa

eksperimentalnim životinjama – MF Univ. u Beogradu (pre toga – Univerz. u NS, VMA, inicijativa FDJ...)

– Zakon RS u pripremi

Pravilnik MF u Beogradu• Zaštićene životinjske vrste:

– živi kičmenjaci (osim čoveka), uključujući sve stadijume razvoja, od sredine gestacije (do trajnog prekida cirkulacije ili destrukcije mozga)

• Etičke eksperimentalne procedure:– postupci sa eksperimentalnim životinjama koji imaju za cilj da

stvore nova znanja iz biomedicine, a mogu uzrokovati bol, patnju, trajno oštećenje

– namerno žrtvovanje eksperimentalnih životinja u cilju dobijanja izolovanih organa ili usmrćivanje na kraju eksperimenta

• Obučenost istraživača (dokaz! – kurs, radovi)• Etički komitet za rad na eksperimentalnim životinjama

MF• Dozvola za rad• Nepoštovanje

16

Eksperimentalne procedure• Prema intenzitetu

oštećenja:– neklasifikovane– blage– srednjeg intenziteta– teške

• Prema nameni:– medicinska istraživanja– (ostala osnovna i

primenjena) naučna istraživanja

– zaštita životne sredine– nastava– sudsko-medicinska– uzgoj– genetske manipulacije

Uginuće• Bezbolno• Uz što brži gubitak svesti i samo žrtvovanje• Pouzdanom, ireverzibilnom metodom• Uz minimalan stres za životinju i onoga ko

žrtvuje• Bezbedno za onoga ko žrtvuje• Kompatibilno sa eksperimentom• Jednostavno• Ekonomski prihvatljivo

17

Potvrda uginuća

• Trajan prekid cirkulacije• Iskrvarenje• Destrukcija mozga• Cervikalna dislokacija• Mrtvačka ukočenost (rigor mortis)• Razaranje celog organizma

Metode žrtvovanja odraslih jedinki

• Predoziranje anestetika• CO2

• Cervikalna dislokacija• Kontuzija lobanje

18

Uzgoj...

• Standardi (prostorije, osvetljenje, provetravanje, pristup, smeštaj, mikrobiološka kontrola, čišćenje, transport)

• Vrste– genetička podela: autbredni zapati, inbredni sojevi, F1

hibridi, koisogene i kongene životinje, nokaut i transgene životinje

– gnobiotička podela: aksenične, gnobiotičke, SPF (specific pathogen free), VAF (virus antibody free) i konvencionalne životinje

Uzgoj...

• Autbredni sojevi –životinje u zatvorenim kolonijama, nepoznatog genotipa– dobra fertilnost, rast i razvoj, otpornost,

preživljavanje, jeftinije• Inbredni sojevi – dobijeni uzastopnim

sparivanjem u srodstvu (≥ 20 x), tako da nastanu 99% homozigotne jedinke– smanjene - reproduktivna sposobnost,

preživljavanje, otpornost, masa i veličina okota, a povećana agresivnost

19

Eksperimentalne životinjeiz registrovanih uzgajališta

• Miš• Pacov• Hrčak• Gerbil• Zamorac• Kunić• Pas• Mačka• ...

Praćenje zdravstvenog stanja životinja

• Za dobrobit životinja• Za kvalitet naučnih istraživanja• Za bezbednost osoblja i istraživača

20

Patologija (1)

• Miš– virusi – adeno, CMV...– bakterije – stafilokoke, streprokoke, Salmonella

enteritidis– paraziti – Hymenolepis nana...

• Pacov– virusi – parvo, adeno, CMV...– bakterije – P. aeruginosa (pluća, slezina, bubreg)...– paraziti – Hymenolepis nana...

Patologija (2)

• Redosled praćenja oboljenja kod eksperimentalnih životinja

1. zoonoze2. bolesti koje su u subkliničkom obliku, a

mogu postati manifestne tokom eksperimenta

3. bolesti koje mogu uticati na validnost rezultata

21

Bezbednostlaboratorijskog osoblja

• Alergije– alergeni

• proteini urina, pljuvačke, lojnih žlezda, krzna...• Infekcije• Povrede

Bol, patnja, distres kod eksperimentalnih životinja

- Opšti skor -• Izgled• Unos hrane i vode• Klinički znaci• Spontano ponašanje• Indukovano ponašanje

22

Primena lekova kod eksperimentalnih životinja

• Putevi primene: p.o., i.v., i.d., i.p., i.m., s.c., p.r., direktno

• Lokalni i sistemski efekti• Uzimanje uzoraka krvi (pacovi – repna vena...)• Zapremine:

– miš – 0,2 ml (i.v.), 1-2 ml (i.p.), 0,4 ml (p.o.)...– pacov - 1 ml (i.v.), 2-4 ml (i.p.), 5 ml (p.o.)...– kunić - 4 ml (i.v.), 10-15 ml (i.p.), 10 ml (p.o.)...

Osnovne hirurške tehnike- Halstead-ovi principi -

• Pažljivo rukovanje tkivom• Dobra hemostaza• Očuvano snabdevanje krvlju ciljnog tkiva• Striktna asepsa• Minimalno tenzija tkiva• Odgovarajuća apozicija tkiva, šavovi• Obliteracija zaostalih šupljina

23

Anestezija

• Definicija - Reverzibilna inhibicija funkcije CNS-a tokom koje se mogu obaviti hirurške procedure uz– gubitak svesti– gubitak osećaja bola– gubitak refleksa, odbrambenih i nevoljnih

pokreta• Lokalna, opšta