Principes des vecteurs non réplicatifs Virus défectifs Un ou plusieurs gènes essentiels à la...
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Principes des vecteurs non réplicatifs
Virus défectifs
Un ou plusieurs gènes essentiels à la réplication sont délétés afin de
rendre les virus incompétents pour toute réplication dans l’hôte.
« Packaging cell line »
Une lignée cellulaire exprimant les gènes essentiels délétés dans le
vecteur est construite afin de produire les vecteurs viraux.
Séquences essentielles aux vecteurs
Séquence : séquence d ’encapsidation du vecteur recombinant
Séquence poly A : séquence permettant la stabilisation des ARNm
Séquences promotrices : Promoteur adapté en amont du TG
Transgène
Réplication des rétrovirus
pol envgag
LTR LTR
NoyauNoyau
CytoplasmeCytoplasme
Fixation et entrée
Bourgeonnement
Décapsidation
Rétrotranscription
IntégrationTransport au noyau
Vecteurs rétroviraux
Particularités des rétrovirus
Virus enveloppés pseudotype HIV/VSV env (ou autre protéines
d ’enveloppe)
Leur génome est un ARN + de taille réduite (10kb) limitation de la
taille des inserts
Ils intègrent leur matériel génétique de manière aléatoire risque
de transformation
Ils infectent largement les cellules mammifères
Les lentivirus infectent les cellules quiescentes
Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (1)
Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (2)
LTR LTRTransgène
Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (3)
Vecteurs lentiviraux (HIV)
Vecteurs rétroviraux commerciaux
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Avantages et limitations des vecteurs rétroviraux et lentiviraux
AvantagesTropisme : large choix de protéines d ’enveloppe Pas de réplication autonome et production minimum de protéines virales chez l’hôte Réponse immunitaire très limitée Intégration aléatoire et persistance du DNA rétrotranscrit (sauf méthylation des promoteurs)Survie des cellules infectéesGrand choix de promoteurs possiblesRisque de recombinaison limité par le fractionnement des constructionsLes vecteurs lentiviraux transduisent des cellules quiescentes
InconvénientsProduction difficile de hauts titres infectieuxIntégration aléatoire, risque pathogèneInsert de petite taille (max 10 kb) « Packaging cell lines » : constructions complexes exprimant gag, pol et envLes vecteurs rétroviraux classiques ne transduisent pas les cellules quiescentes
Vecteurs alphaviraux (SFV)
Virus à ARN+ simple brin
Matériel génétique de petite taille (10kb)
Virus enveloppés
Entrée dans la cellule, via des récepteurs spécifiques
Ils infectent tous les systèmes eucaryotes dont les cellules mammifères
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sont requis pour visionner cette image.Réplicases
Protéines de structure
Cycle des alphaviraux
(SFV)
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Vecteurs alphaviraux (SFV)
T7
3.Co-transfection
2. Clonage des protéines de structures et
mutagénèse du site de clivage de la protéine
d’enveloppe par un site sensible à la
chymotrypsine
4.Traitement à la
chymotrypsine
1.Transcription in vitro (T7 polymérase)
ARNm
Avantages et limitations des vecteurs alphaviraux
AvantagesFacilité de constructions et d’études de nombreux mutantsTropisme : infecte tous les types cellulaires eucaryotes Choix possible des protéines d’enveloppe (mutagénèse du site de clivage/sécurité) Pas de réplication autonome Survie des cellules infectéesChoix de promoteurs possiblesIdéale pour la vaccination
InconvénientsDifficulté de production des ARNm en grande quantité industrielleProduction difficile de hauts titres infectieuxPas d ’intégration, expression transitoireInsert de petite taille (max 10 kb) « Packaging cells lines » : exprimant les protéines de structureProduction des réplicases virales chez l’hôte
Non déterminéRéponse immunitaire ? Infection des cellules quiescentes?
Vecteurs adénoviraux (Ad2, Ad5)
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Virus non enveloppés génome ADN 2 brins linéaires 36kb infectent les cellules quiecentes tropisme large (récepteur aux intégrines v5 et v3 ) niveau d’expression élevée
Infection par les adénovirus
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Cycle viral des adénovirus
Organisation génétique des adénovirus
E1A : transactivation et entrée en phase S
E1B : fonction anti-apoptotique
E2 : réplication du DNA
E3 : contrecarre les défenses innées
E4 : régule le processing et l’export des ARNm tardifs
IVa2 : transactivation du promoteur tardif
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Première génération de vecteurs adénoviraux
Formation de virus recombinants
Particularité des protéines E1 et E3 : •E1 transactive l ’expression des gènes viraux et transforme les cellules•E3 une protéine non essentielle qui contrecarre les défenses de l’hôte anti-adénovirus la délétion de E1 et E3 libère 7kb pour insérer un transgène
Transfection
Recombinaison homologue
Noyau
MCS
Transgène
Cellules 293(expriment E1)Adénovirus
recombinant
ITRPoly A
Promoteur
Séquences de recombinaison homologue
(E2)ITR
Génome viral 3’
Vecteurs adénoviraux commerciaux
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Vecteurs adénoviraux commerciaux
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Deuxième génération de vecteurs adénoviraux
Avantages et limitations des vecteurs adénoviraux
AvantagesTropisme pour des récepteurs largement exprimés (sauf lignées lymphoïdes) Pas de réplication autonome et production minimum de protéines virales chez l’hôte Survie des cellules infectéesChoix de promoteurs, niveau d ’expression élevéProduction de hauts titres infectieuxVecteur transduisant des cellules quiescentes« Packaging cell lines » : les cellules 293 expriment les protéines E1
InconvénientsPas de choix possible des récepteursLa réponse immunitaire reste un obstacle majeur (80% de la population est séropositive)L ’ADN ne s ’intègre pas (épisome) persistance limitée dans le temps du DNA (2 semaines)Insert de petite taille (max 7 kb) Risque de recombinaison théorique avec des infections endogènes
Vecteurs adéno-associés
Utilisation principale : expression de protéines en cellules mammifères à des fins de thérapie génique (cellules quiescentes)
Cycle réplicatifVirus nusADN simple-brin linéaire (5 kb)Leur cycle réplicatif implique :
L ’entrée dans la cellule par endocytose, via les héparines sulfates et récepteurs secondaires (v5, FGF) (large spectre de cellules infectées)Adressage de l ’ADN au noyauTranscription en ADN double-brin (nécessite un virus helper du type adéno (E4), herpes)Intégration dans le chromosome 19Expression des ARNm (facilitée par les virus helper )La production de particules virales (très résistantes : pH, température, détergents)
Ils infectent la plupart des cellules mammifères
Formation de virus recombinants
Particularité des vecteurs adéno-associés : •Tous les gènes viraux sont délétés•Les « packaging cell lines » sont complémentés pour les protéines virales et helper
Transfection
Noyau
MCS
Transgène
Cellules 293(expriment E1)Virus adéno-associé
recombinant
ITR
Promoteur
Gènes rep
Gènes cap
ITR
Poly APlasmide E2 et E4
adénovirus
Avantages et limitations des vecteurs adéno-associés
AvantagesTropisme pour un récepteur largement expriméPas de réplication autonome et absence de production de protéines virales par
l’hôte Survie des cellules infectéesProduction de hauts titres infectieuxL ’ADN s ’intègre dans le chromosome 19 persistance de l ’expression
intégration aléatoire limitée Réponse immunitaire très faible Les vecteurs transduisent des cellules quiescentes
InconvénientsPas de choix possible des récepteursInsert de petite taille (max 4 kb) « Packaging cell lines » : expriment rep, cap (adéno-associées) E1, E3 et E4
(adénovirus)
Stratégies d’utilisation des alphavirus
réplicases Pro Transgène
3’5’
Poly A
Transcription in vitro (SP6 ou T7 polymérase)
ARNm
Packaging cell lineexprimant les
protéines de structures Noyau
SFVrecombinant
Transfection
*
* Possibilité de transfecter l’ADN sous le contrôle d ’un promoteur eucaryote
SP6ouT7