Primerjalna študija predelave surove celuloze …Vsa uporabljena celulozna vlakna smo pred in po...

Diplomsko delo

Primerjalna študija predelave surove celuloze listavcev in iglavcev

september, 2015 Urška Hajdinjak

Urška Hajdinjak


Diplomsko delo

Maribor, 2015


Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje

Študent: Urška Hajdinjak

Študijski program: univerzitetni študijski program I. stopnje Kemijska tehnologija

Predvideni strokovni naslov: diplomirana inženirka kemijske tehnologije (UN)

Mentor: red. prof. dr. Andreja Goršek

Komentor: doc. dr. Darja Pečar

Maribor, 2015


I

Kazalo

Kazalo ......................................................................................................................................... I

Izjava ........................................................................................................................................ III

Zahvala .................................................................................................................................... IV

Povzetek .................................................................................................................................... V

Abstract .................................................................................................................................... VI

Seznam tabel .......................................................................................................................... VII

Seznam slik ........................................................................................................................... VIII

Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................. IX

1 Uvod in opredelitev problema ............................................................................................ 1

2 Materiali ............................................................................................................................. 3

2.1 Celuloza in celulozna vlakna ...................................................................................... 3

2.2 Kemikalije ................................................................................................................... 4

2.3 Steklovina.................................................................................................................... 5

2.4 Ostala laboratorijska oprema ...................................................................................... 5

2.4.1 Reaktorski sistem EasyMax 102 .......................................................................... 5

3 Metode dela ........................................................................................................................ 7

3.1 Priprava acetatnega pufra ............................................................................................ 7

3.2 Predobdelava celuloze s fosforno kislino .................................................................... 7

3.2.1 Mletje celuloze listavcev in iglavcev s kavnim mlinčkom .................................. 8

3.2.2 Toplotna obdelava celuloze s fosforno kislino ................................................... 8

3.2.3 Mešanje in dodajanje ledeno mrzle vode ............................................................. 9

3.2.4 Centrifugiranje ..................................................................................................... 9

3.3 Izvedba encimske hidrolize z encimom celulaza ...................................................... 10

3.4 Priprava umeritvene krivulje in absorbcijska spektrofotometrična analiza vzorcev 11

3.5 Analiza vzorcev s FTIR spektroskopijo .................................................................... 12

4 Eksperimentalni del .......................................................................................................... 13

4.1 Priprava standarnih vzorcev za pripravo umeritvene krivulje .................................. 13

4.2 Postopek priprave acetatnega pufra .......................................................................... 13

4.3 Priprava celuloze za encimsko hidrolizo .................................................................. 14

4.3.1 Mletje celuloze listavcev in iglavcev ................................................................. 14

4.3.2 Toplotna obdelava celuloze listavcev in iglavcev ............................................. 14

4.3.3 Predobdelava celuloze z 1-butil-metil-imidazol-kloridom (BMIMCl) ............. 14

4.3.4 Predobdelava celuloze listavcev in iglavcev s fosforno kislino ........................ 15

4.4 Encimska hidroliza celuloze z encimom celulaza ..................................................... 16

4.5 Analiza vsebnosti glukoze po encimski reakciji in izračun presnove ....................... 17

5 Rezultati in diskusija ........................................................................................................ 18

5.1 Presnove encimskih reakcij ....................................................................................... 18

5.1.1 Presnove encimskih reakcij z zmleto celulozo .................................................. 18

5.1.2 Presnove encimskih reakcij s toplotno obdelano celulozo ................................ 19

5.1.3 Presnove encimskih reakcij s celulozo raztopljeno v 1-butil-metil-

imidazolium-kloridom (BMIMCl)..................................................................... 19

5.1.4 Presnove encimske reakcije v odvisnosti od časa ............................................. 20

5.1.5 Presnove encimskih reakcij za homogenizirano celulozo ................................. 20


II

5.1.6 Presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino

po 48 h ................................................................................................................ 21

5.1.7 Presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino . 21

5.1.8 Presnove encimskih reakcij za celulozo listavcev obdelano s fosforno kislino . 22

5.1.9 Presnova encimskih reakcij za mikrokristalinično celulozo (MCC) ................. 22

5.2 Primerjava najvišjih presnov kislinsko predobdelanih celuloz ................................. 23

5.3 Mikroskopski posnetki zmlete celuloze in obdelane celuloze s fosforno kislino ..... 23

5.4 FTIR spektri celuloze po fizikalni in kemijski obdelavi ........................................... 24

6 Zaključek .......................................................................................................................... 31

7 Literatura ........................................................................................................................... 32

8 Ţivljenjepis ....................................................................................................................... 34


III

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:

Vir: ScienceDirect (http://www.siencedirect.com/)

Gesla: Število referenc

enzyme cellulose 28

pre-treatment of cellulose 14

enzymatic hydrolysis of cellulose 12

cellulose and ionic liquids 3

Vir: COBISS/OPAC (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid)

Gesla: Število referenc

encimska hidroliza celuloze 5

predobdelava celuloze 7

Skupno število pregledanih člankov: 16

Skupno število pregledanih knjig: 9

Maribor, september 2015 Urška Hajdinjak


IV

Zahvala

Zahvaljujem se mentorici, red. prof. dr. Andreji Goršek,

za vso strokovno pomoč in nasvete pri izdelavi

diplomskega dela. Posebna zahvala gre tudi somentorci,

doc. dr. Darja Pečar, za pomoč in vodenje pri

eksperimentalnem delu.

Na koncu bi se še zahvalila staršem in vsem prijateljem,

ki so mi tekom študija stali ob strani in so verjeli vame.


V


Povzetek

Osnovni cilj diplomskega dela je bil proučiti najučinkovitejšo predobdelavo celuloze

listavcev in iglavcev kot alternativnega materiala za obnovljivo energijo. Za učinkovit

potek hidrolize celuloze do glukoze smo določili ustrezne procesne pogoje in primerjali

izkoristke reakcij.

Celulozo smo predobdelovali na več načinov; z mletjem, toplotno obdelavo, ionskimi

tekočinami in fosforno (V) kislino. S predobdelavo smo zmanjšali področja kristaliničnosti,

kjer so glukozne molekule med seboj povezane z močnimi vezmi.

Encimsko hidrolizo celuloze smo izvajali v reaktorju EasyMax 102 (Mettler Toledo) z

encimi celulaze. Encimska hidroliza se največkrat izvaja v blagih procesnih pogojih, zato

so bile reakcije učinkovite pri temperaturi 45 ˚C in pri uporabi acetatnega pufra (pH = 5).

Reakcije so potekale 24 h, njihova izvedba je bila hitra in preprosta.

Produkt reakcij hidrolize je bila glukoza, katere koncentracijo smo določili s

spektrofotometrično metodo. Na podlagi dobljenih rezultatov smo primerjali izkoristke

reakcije s celulozo listavcev in iglavcev. Najučinkovitejša je bila kislinska predobdelava.

Rezultati so pokazali najvišje presnove pri celulozi listavcev, v našem primeru evkaliptusa,

saj so njegova celulozna vlakna najkrajša in najtanjša. Vsa uporabljena celulozna vlakna

smo pred in po kislinski predobdelavi mikroskopirali ter jih posneli z FTIR

spektrofotometrom. Posnetki so potrdili naše ugotovitve glede doseţenih presnov

posameznih reakcij.

Ključne besede: celuloza, vlakna, predobdelava celuloze, encimska hidroliza, encim

celulaza

UDK: 631.461.6:[633.877+674.031](043.2)


VI

Comparative study of processing raw pulp of deciduous and coniferous

Abstract

The basic purpose of the thesis was to study the most effective pre-treatment of cellulose of

deciduous and coniferous trees as an alternative material for renewable energy. For an

effective process of hydrolysis of cellulose to glucose we specified appropriate process

conditions and compared the yields of the reactions.

The cellulose was pre-treated in several ways; with grinding, thermal treatment, ionic

liquids and phosphoric (V) acid. With the pre-treatment we reduced the areas of

crystallinity, where the glucose molecules are interconnected with strong bonds.

Enzymatic hydrolysis with cellulase enzymes was carried out in an EasyMax 102 (Mettler

Toledo) reactor. Enzymatic hydrolysis is most often carried out in mild process conditions,

so we achieved the most effective reactions at the temperature of 45 ˚C and with the use of

the acetate buffer (pH = 5). The reactions lasted for 24 hours and their execution was quick

and easy.

The product of hydrolysis reactions was glucose, the concentration of which was

determined by a spectrophotometric method. Based on the acquired results we compared

the yields of reactions with the cellulose of deciduous and coniferous trees. The most

effective was the acidic pre-treatment. The results have shown the highest levels of

conversion in the cellulose of deciduous trees, in our case the eucalyptus tree, because they

have the shortest and thinnest cellulose fibres. All the used cellulose fibres were

microscoped before and after the acidic pre-treatment and filmed them with a FTIR

spectrophotometer. The images have confirmed our findings concerning the achieved

conversions of individual reactions.

Key words: cellulose, fiber, pre-treatment of cellulose, enzymatic hydrolysis, enzyme

cellulase

UDK: 631.461.6:[633.877+674.031](043.2)


VII

Seznam tabel

Tabela 4-1. Masa glukoze za dane koncentracije glukoznih raztopin .................................. 13

Tabela 5-1. Presnova encimskih reakcij z zmleto celulozo listavcev (evkaliptus) ............... 18

Tabela 5-2. Presnova encimskih reakcij z zmleto celulozo iglavcev ................................... 18

Tabela 5-3. Presnova encimskih reakcij s prekuhano celulozo listavcev (evkaliptus) ......... 19

Tabela 5-4. Presnova encimskih reakcij s prekuhano celulozo iglavcev .............................. 19

Tabela 5-5. Presnova encimskih reakcij s topilom BMIMCl predelane celuloze iglavcev .. 19

Tabela 5-6. Presnova encimske reakcije za homogenizirano celulozo iglavcev ................. 20

Tabela 5-7. Presnova encimske reakcije za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino po

24 in 48 h .............................................................................................................................. 21

Tabela 5-8. Presnova encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino . 21

Tabela 5-9. Presnova encimskih reakcij za celulozo listavcev (bukev) obdelano s fosforno

kislino ................................................................................................................................... 22

Tabela 5-10. Presnova encimskih reakcij za celulozo listavcev (evkaliptus) obdelano s

fosforno kislino ..................................................................................................................... 22

Tabela 5-11. Presnova encimskih reakcij za mikrokristalinično celulozo (MCC) obdelano s

fosforno kislino ..................................................................................................................... 23


VIII

Seznam slik

Slika 2-1. Pregled strukture lesa do celuloznih vlaken [10] ................................................... 3

Slika 2-2. Dve vzporedni celulozni verigi povezani z vodikovimi vezmi [13] ..................... 4

Slika 2-3. Reaktorski sistem EasyMax 102 ............................................................................ 6

Slika 3-1. Celuloza iz papirnice (levo) in fino zmleta celuloza (desno) ................................. 8

Slika 3-2. Kuhanje celuloze s fosforno kislino v šarţnem mešalnem reaktorju ..................... 9

Slika 3-3. Mešanje raztopine na mešalni plošči ...................................................................... 9

Slika 3-4. Dobljeni fazi po centrifugiranju ........................................................................... 10

Slika 3-5. Centrifuga 5804 R (Eppendorf) ............................................................................ 10

Slika 3-6. Spektrofotometer (Cary 1-E UV-Visible) ............................................................ 12

Slika 4-1. Obdelana celuloza po centrifugiranju (obdelana v enostavnem šarţnem mešalnem

reaktorju) ............................................................................................................................... 15

Slika 4-2. Obdelana celuloza po centrifugiranju (obdelana v EasyMax-u 102) ................... 16

Slika 5-1. Presnova reakcije hidrolize celuloze iglavcev v odvisnosti od časa ................... 20

Slika 5-2. Primerjava najvišjih presnov celuloz, obdelanih s fosforno kislino ..................... 23

Slika 5-3. Celulozna vlakna iglavca (levo), listavca bukev (v sredini) in listavca evkaliptus

(desno) po mletju .................................................................................................................. 24

Slika 5-4. Obdelana celuloza iglavca (levo), listavca bukev (v sredini) in listavca evkaliptus

(desno) ................................................................................................................................... 24

Slika 5-5. FTIR spekter celuloze evkaliptusa po fizikalni obdelavi ..................................... 25

Slika 5-6. FTIR spekter celuloze evkaliptusa po kemijski obdelavi ..................................... 25

Slika 5-7. FTIR spekter celuloze bukve po fizikalni obdelavi. ............................................. 26

Slika 5-8. FTIR spekter celuloze bukve po kemijski obdelavi ............................................. 27

Slika 5-9. FTIR spekter celuloze iglavca po fizikalni obdelavi ............................................ 28

Slika 5-10. FTIR spekter celuloze iglavca po kemijski obdelavi ......................................... 28

Slika 5-11. FTIR spekter celuloze mikrokristalinične celuloze (MCC) po fizikalni obdelavi

............................................................................................................................................... 29

Slika 5-12. FTIR spekter mikrokristalinične celuloze (MCC) po kemijski obdelavi ........... 30


IX

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli

A absorbanca (/)

c koncentracija (g/mol)

m masa (g)

M molska masa (g/mol)

pKA negativni desetiški logaritem disociacijske konstante kisline

V volumen (L)

x naklon krivuje v enačbi premice

XA presnova komponente A (%)

y presečišče premice z x osjo

Grški simboli eksponent (-)

ρ gostota (g/cm3)

Kratice AFEX ekspanzija vlaken z amoniakom (ammonia fibre expansion)

A-

konjugirana baza

BMIMCl 1-butil-3-metilimidazol klorid

D D – konfiguracija (D – configuration)

DP stopnja polimerizacije (the degree of polymerization)

GOD glukoza oksidaza (glucose oxidase)

HA kislina

ILs ionske tekočine (ionic liquids)

MCC mikrokristalinična celuloza (microcrystalline cellulose)

NMMO N-metilmorfolin-N-oksid

POD peroksidaza (peroxidase)


1

1 Uvod in opredelitev problema

Fosilna goriva povezujemo z emisijami toplogrednih plinov, ki onesnaţujejo okolje.

Uporaba bioetanola kot alternativnega goriva je pritegnila veliko pozornosti zaradi ničnega

neto izpusta ogljikovega dioksida v ozračje, saj se ta reciklira s pomočjo fotosinteze.

Celulozni substrati zagotavljajo cenejše surove materiale za proizvodnjo bioetanola in se

teţje biološko razgrajujejo v primerjavi s tistimi na osnovi škroba. Predobdelava celuloznih

materialov pred njihovo uporabo je zato pritegnila ogromno raziskovalnega zanimanja za

učinkovito in donosno proizvodnjo bioetanola. [1]

V lesu najdemo okoli 45 % celuloze, zato poraba lesa v svetu narašča ter s tem tudi teţnja

po njegovi racionalnejši uporabi in proizvodnji kakovostnejših izdelkov. Les različnega

izvora se med seboj razlikuje po zgradbi in obliki, saj je zgrajen iz različnih anatomskih

elementov, ki opravljajo različne naloge. Organizmi na Zemlji se počasi spreminjajo, kar je

posledica razlike v zgradbi lesa iglavcev in listavcev. Iglavci predstavljajo prvotnejšo

obliko drevja kot listavci, kar je posledica enostavnejše zgradbe. [2]

V papirni industriji nastajajo velike količine odpadkov, ravnanje z njimi predstavlja velike

stroške. Odpadki še vedno nimajo prave vrednosti, tudi če se uporabljajo kot sekundarna

surovina, stroški predelave pri predelovalcih pa so visoki. V procesih recikliranja papirja

velik del proizvedenih odpadkov predstavlja papirniški mulj. Suhi papirniški odpadki imajo

relativno dobro kalorično vrednost, zato je najbolj smiselno odpadke izţeti do čim večje

suhosti in jih energetsko predelati v energijo. [3] Z uporabo različnih tehnik predobdelave

(mehanična, termična, kemična in biološka) se lahko izboljša kakovost in uporabnost

posameznih odpadkov in s tem pridobi izdelke z dodano vrednostjo. Lesni odpadki se

pogosto uporabljajo kot obnovljivi vir energije ter predstavljajo potencial za pridobivanje

zelenih kemikalij in encimov. [4]

Celuloza je zaradi svojega preobilja, moţnosti obnove in nizke cene popolna surovina za

proizvodnjo različnih materialov. Pribliţno tretjino svetovne proizvodnje prečiščene

celuloze uporabljajo kot osnovno snov za številne derivate z vnaprej oblikovanimi

različnimi lastnostmi, odvisnimi od vsebovanih skupin in stopnje derivatizacije. Celuloza

ima velik potencial za pripravo novih materialov (npr. termoplastov) in ima tudi številne

znane prednosti kot npr. biokompatibilnost, visoka togost, dobre mehanske lastnosti ter

biorazgradljivost. [5]

Zaradi kompaktne kristalinične strukture je celulozo teţko hidrolizirati v fermentacijske

sladkorje. Ta visoko urejena struktura celuloze mora biti odpravljena zato, da je postopek

hidrolize izvedljiv za proizvodnjo sladkorjev. [6] Čeprav je veliko tehnologij, ki se trenutno

uporabljajo za proizvodnjo celuloze izrazito neprijaznih okolju, je precej teţko raztopiti

celulozo v najpogostejših organskih topilih, zaradi njenih togih molekul in zaprte veriţne

sestave iz številnih intermolekularnih in intramolekularnih vodikovih vezi. [7] Raztapljanje

celuloze v tovrstnih topilih zahteva visoke temperature za predelavo in včasih vključuje

tudi dodatne okoljske, energijske, varnostne in druge teţave. [8] Dobra topila so ključnega

pomena za boljše izkoriščanje celuloze. Ionske tekočine (ILs) so bile uporabljene na

številnih področjih, od medija za organsko sintezo in katalizatorjev, do maziv. Nedavno so

pridobile veliko akademskega zanimanja kot nadomestila za okoljsko škodljiva hlapna

organska topila. [7]

Osnovni namen diplomske naloge je bil poiskati primerne encime za razgradnjo celuloze iz

dreves listavcev in iglavcev ter določiti procesne pogoje teh reakcij. Celulozo smo

predobdelali in s tem pripravili pogoje za učinkovit potek hidrolize. Na osnovi primerjave


2

izkoristkov reakcij smo izbrali tisto vrsto celuloze, ki se je najbolj učinkovito razgradila.

Hidroliza celuloze je proces, ki je povezan s pH, zato smo poiskali njegov optimum in

eksperimente izvajali v ozkem področju pH vrednosti.


3

2 Materiali

Odpadni papir je postal enako pomemben vir novega papirja kot les in danes predstavlja

več kot polovico vlaken, ki so uporabljena v proizvodnji papirja, kar prikazuje slika 2-1. [9]

Slika 2-1. Pregled strukture lesa do celuloznih vlaken [10]

V tem poglavju opisujemo značilnosti celuloze in njenih vlaken. Predstavljamo uporabljene

kemikalije, ostalo laboratorijsko opremo in reaktorski sistem EasyMax 102, v katerem smo

izvajali encimske reakcije.

2.1 Celuloza in celulozna vlakna Celuloza je najbolj razširjen polisaharid v naravi. Pojavlja se v rastlinah v obliki

mikrovlaken, ki so sestavni deli strukturno močnega okvira celičnih sten. Nekatere bakterije

proizvajajo celulozo tudi v zelo hidrirani obliki, vendar so te večinoma pripravljene iz lesne

celuloze. Gre za linearni polimer iz β-(1,4)-D-glukopiranoznih enot v konformaciji C1.

Popolna ekvatorialna konformacija ostankov β-vezanih glukopiranoz stabilizira glavno

strukturo in zmanjšuje njeno fleksibilnost. Zaradi razširjenih intramolekularnih in

intermolekularnih vodikovih vezi med celuloznimi verigami ima ta biopolimer visoko

kristalno strukturo. Posledično je popolnoma netopen v vodi ali v običajnih topilih, kar vodi

do teţav pri kemijskih predelavah. [5] Dobro se topi v Schweitzerjevem reagentu (raztopini

bakrovega hidroksida v amoniaku) in 0,5 % ţveplovi kislini. [11]

Celulozne molekule so nitaste, med seboj povezane v makrofibrile, kjer se izmenjujeta

kristalinični in amorfni pas. Mikrofibrile predstavljajo temeljno ogrodje celične stene.

Kristalinični pasovi omogočajo trdnost in odpornost celične stene, amorfni pa dajejo

potrebno proţnost. V makrofibrile se zdruţuje 15 do 20 mikrofibril, kjer so 10 µm široki


4

interfibrilni prostori, napolnjeni s poliozami in manj urejenimi molekulami celuloze.

Molekule celuloze se medsebojno zdruţujejo v podolgovate paličice, imenovane miceli, ki

se v obliki snopičev-fibril linearno povezujejo med seboj in dajejo celulozni vlaknini

mehansko trdnost. [12]

Celuloza ima kristalno strukturo, v kateri so molekule glukoze povezane z močnimi

vodikovimi vezmi, zato ta struktura omogoča zelo nizko dostopnost kemikalij in encimov.

[1] Kristalno strukturo celuloze prikazuje slika 2-2.

Slika 2-2. Dve vzporedni celulozni verigi povezani z vodikovimi vezmi [13]

Pridobivajo jo iz lesa iglavcev (smreka, jelka, bor) in listavcev (bukev, topol), ki vsebuje

celulozo z ustrezno stopnjo polimerizacije. [11]

Obe vrsti lesa iglavcev in listavcev se razlikujeta po dolţini vlaken, saj imajo iglavci v

povprečju daljša vlakna. Pri iglavcih je povprečna dolţina celuloznih vlaken (3‒6) mm, pri

listavcih pa le (0,5‒1,8) mm. Premer vlaken iglavcev je povprečno (25‒45) µm, listavcev

pa (10‒36) µm. Listavci imajo v povprečju debelejše stene vlakna, ki merijo (3‒6) µm, pri

iglavcih pa (2‒5) µm. [14]

2.2 Kemikalije Pri eksperimentalnem delu smo poleg surove celuloze listavcev in iglavcev uporabili še

naslednje kemikalije:

citronsko kislino (C6H8O7); Sigma – Aldrich,

dinatrijev hidrogen fosfat dodekahidrat (Na2HPO4 * 12H2O); Sigma – Aldrich,

1-butil-3-metilimidazol klorid; Sigma – Aldrich,

fosforno (V) kislino (H3PO4), 85 %; Kemika Zagreb,

glukozni reagent; Roche,

D-(+)-glukozo; Sigma – Aldrich,

aceton, 99 %; Chem-Lab NV,

encim celulazo (Cellulase from Aspergillus sp.); Sigma – Aldrich,

natrijev acetat (CH3COONa); 99 %; Panreac,

ocetno kislino (CH3COOH); 99,8 %; Fluka,

mikrokristalinično celulozo (MMC); Sigma – Aldrich,

deionizirano vodo.


5

2.3 Steklovina

Pri eksperimentalnem delu smo uporabili naslednjo steklovino:

čaše (50 mL, 100 mL, 150 mL),

bučke (100 mL, 250 mL, 1000 mL),

merilni valj (50 mL),

lijake,

stekleno palčko,

urno steklo.

2.4 Ostala laboratorijska oprema

Med eksperimentalnim delom smo poleg kemikalij in steklovine uporabljali še:

reaktor EasyMax 102 (Mettler Toledo),

centrifugo (Eppendorf),

spektrofotometer Cary 1-E UV-Visible,

FTIR spektrofotometer IR Affinity-1 (Shimadzu),

mlinček za mletje,

analitsko tehnico (Mettler Toledo),

termostat, Toramix SHP-10,

ultrazvočno kopel,

pH meter (Mettler Toledo),

šarţni mešalni reaktor s termostatom (Lauda),

kalibrirane avtomatske pipete (100‒1000 µL),

filtrni papir,

filtrno nučo,

kuhalnik,

homogenizator,

mikroskop (Motic F-11).

Pri delu smo uporabljali programsko in računalniško opremo:

Simple Reads-Offline Varian (meritev absorbanc s pomočjo spektroskopske metode),

Microsoft Excel 2010 (program za risanje grafov in obdelavo rezultatov).

2.4.1 Reaktorski sistem EasyMax 102

Reaktor je nova dimenzija avtomatiziranih reaktorskih sistemov, primernih za sintezne

laboratorije. Za vzdrţevanje temperature tega reaktorja ne potrebujemo ledene kopeli ali

nevarnih olj; tako so poizkusi varni. Vse parametre (temperaturo, pH, vrtilno frekvenco

mešala ali dodatek reagenta) lahko nadzorujemo preko zaslona na dotik. Sprememba

nastavitev reaktorja je hitra in preprosta. Naprava ima vgrajen termostat, ki samostojno

vzdrţuje temperaturo v območju med ‒40 °C in 180 °C. Ima dva reaktorja, ki delujeta

neodvisno eden od drugega. Uporablja se za volumne med 0,5-100 mL. Slika 2-3 prikazuje

reaktorski sistem EasyMax 102.


6

Slika 2-3. Reaktorski sistem EasyMax 102


7

3 Metode dela

Glavni cilj diplomske naloge je bila ustrezna priprava celuloze listavcev in iglavcev za čim

bolj učinkovito hidrolizo. S primerno predobdelavo smo ţeleli zmanjšati tesno ureditev

vlaken celuloze v področjih kristaliničnosti za nadaljnjo encimsko hidrolizo do glukoze.

Poiskati smo morali učinkovite encime za hidrolizo celuloze iz dreves listavcev in iglavcev

ter določiti procesne pogoje teh reakcij. Za dosego ţelenih ciljev smo uporabili naslednje

metode dela:

priprava acetatnega pufra,

predobdelava celuloze s fosforno kislino (mletje celuloze listavcev in iglavcev s kavnim

mlinčkom, kuhanje celuloze s fosforno kislino, mešanje in dodajanje ledeno mrzle vode,

centrifugiranje),

izvedba encimske hidrolize z encimom celulaza,

priprava umeritvene krivulje in absorpcijska spektrofotometrična analiza vzorcev.

3.1 Priprava acetatnega pufra Pufer je vodna raztopina, sestavljena iz mešanice šibke kisline in njene konjugirane baze,

ali obratno. Uporablja se kot sredstvo za ohranjanje pH, saj se ta ob dodatku kisline ali baze

neznatno spremeni. To se doseţe zaradi prisotnosti ravnovesja med HA kislino in njeno

konjugirano bazo A-. [15] Delovanje pufrov lahko kvantitativno ovrednotimo z uporabo

disociacijskega ravnoteţja, npr. ocetne kisline, da dobimo zvezo, ki jo prikazuje Henderson

– Hasselbalch-ova enačba (en. 3.1) [16]:

pH = pKa + log (cA-/cHA), (3.1)

kjer je pKa negativni desetiški logaritem disociacijske konstante kisline in cA koncentracija

soli.

Puferne raztopine so potrebne za ohranjanje pravilnega pH za delovanje encimov v

številnih organizmih. Številni encimi delujejo samo pri določenih pogojih; če se pH

premakne izven ozke omejitve, potem encimi prenehajo delovati in se denaturirajo. V

številnih primerih lahko denaturacija trajno onemogoči njihovo katalitično dejavnost. [15]

Pufer, ki smo ga uporabljali pri encimski hidrolizi, je bil sestavljen iz ocetne kisline in

natrijevega acetata (NaOAc/HOAc), torej mešanice šibke kisline in njene konjugirane baze.

Pri tem smo morali najprej določiti natančno maso obeh komponent za dani pH.

3.2 Predobdelava celuloze s fosforno kislino Raztapljanje celuloze s topilom ni najbolj preprosta metoda za razpad kristalinične strukture

celuloze. Do danes so našli ţe veliko derivativnih in nederivativnih topil celuloze. Da bi jih

celuloza prepoznala in hidrolizirala, se lahko za pripravo obnovljene celuloze za encimsko

hidrolizo uporabljajo samo nederivativna topila. V zadnjem času so bili za raztapljanje

celuloze uporabljeni nederivativni reagenti, kot na primer ionske tekočine, N-

metilmorfolin-N-oksid (NMMO) in koncentrirana fosforna kislina (85 %). Celuloze,

predobdelane s hitrim obarjanjem raztopljenih adsorbentov celuloze s protitopilom, kot

recimo vodo, so pokazale veliko izboljšanje pri kinetiki encimske hidrolize. Poleg dragih

reagentov za topljenje celuloze, kot na primer ionske tekočine in NMMO, je bilo

ugotovljeno tudi to, da lahko celulozo dobro raztapljajo tudi poceni NaOH/vodne raztopine

sečnine. [17]


8

V literaturi smo zasledili, da so kljub visoki stopnji kristaliničnosti celuloze s predhodnim

raztapljanjem s fosforno kislino dosegli najvišje stopnje in rezultate saharifikacije. Pri

raztapljanju celuloze s fosforno kislino se stopnja polimerizacije (DP) in kristaliničnosti

ustrezno zmanjšata, površina celuloze se močno poveča. [18] Z večanjem površine se

poveča dostopnost encima do celuloze, kar omogoči bolj učinkovito hidrolizo. [19]

Predobdelava z raztapljanjem fosforne kisline lahko doseţe visoke reakcijske stopnje in

močno izboljša hidrolizo celuloze. Vendar je njena cena običajno višja od nekaterih

postopkov fizikalno-kemijske predobdelave, kot npr. eksplozija pare ali AFEX. Za

encimsko hidrolizo ali postopke fermentacije je potrebna nevtralizacija pH. [20]

Fosforna kislina se v zadnjem času pogosto uporablja za raztapljanje celuloze, saj lahko

kristalinično celulozo raztopi pri atmosferskem tlaku z zmerno temperaturo. [18]

Iz navedenih razlogov smo zato pri eksperimentalnem delu tudi sami poskusili s

predobdelavo celuloze s fosforno kislino.

3.2.1 Mletje celuloze listavcev in iglavcev s kavnim mlinčkom

Cilj mehanske predobdelave je zmanjšanje velikosti delcev in kristaliničnosti. Kot surovo

celulozo smo uporabili večplasten papir iz obstoječe papirnice, kar prikazuje slika 3-1 levo.

Ena vrsta celuloze je pripadala lesu listavca, druga lesu iglavca. Celulozo smo narezali na

manjše koščke in jo zmleli s kavnim mlinčkom. Mleli smo tako dolgo, dokler nismo dobili

fino zmlete celuloze, ki jo prikazujemo na sliki 3-1 desno. Ta je na videz in otip spominjala

na vato. Opazili smo, da smo iz malega koščka surove celuloze dobili voluminozno zmleto

celulozo.

Slika 3-1. Celuloza iz papirnice (levo) in fino zmleta celuloza (desno)

3.2.2 Toplotna obdelava celuloze s fosforno kislino

V reaktorsko posodo reaktorskega sistema EasyMax 102 smo nalili 85 % fosforno kislino

in dodali predhodno zmleto celulozo. Raztopino smo kuhali toliko časa, da se je celuloza

popolnoma raztopila. Za kuhanje raztopine smo uporabljali tudi šarţni mešalni reaktor s

termostatom, kar prikazuje slika 3-2.


9

Slika 3-2. Kuhanje celuloze s fosforno kislino v šarţnem mešalnem reaktorju

3.2.3 Mešanje in dodajanje ledeno mrzle vode

Čašo smo do polovice napolnili z vodo in dodali nekaj ledu. V čašo smo dali še mešalo in

jo postavili na mešalno ploščo, kar prikazuje slika 3-3. Med zmernim mešanjem smo počasi

dodajali vročo raztopino kisline. Vsebina čaše se je obarvala belo; le-to smo še nekaj časa

mešali ob zmernem mešanju.

Slika 3-3. Mešanje raztopine na mešalni plošči

3.2.4 Centrifugiranje

V centrifugirke smo nalili vso raztopino in jih dali centrifugirat. Po centrifugiranju smo

dobili dve fazi; spodnja gosta faza je bila bele barve, medtem ko je bila zgornja faza bistra

(slika 3-4). Zgornjo bistro fazo smo pri vseh centrifugirkah odlili. Vsebino celuloze na dnu

centrifugirk smo zbrali le v dveh in ju dopolnili z destilirano vodo.


10

Slika 3-4. Dobljeni fazi po centrifugiranju

Pred centrifugiranjem smo centrifugirki dobro premešali. Centrifugiranje z destilirano vodo

smo še dvakrat ponovili. Nato je sledilo centrifugiranje z acetonom, ki smo ga prav tako

dvakrat ponovili. Aceton (C3H6O) je povzročil hitrejše sušenje celuloze. Slika 3-5 prikazuje

centrifugo, ki smo jo uporabili pri eksperimentu.

Slika 3-5. Centrifuga 5804 R (Eppendorf)

3.3 Izvedba encimske hidrolize z encimom celulaza Celulaza se najpogosteje uporablja za hidrolizo celuloze v glukozo zaradi blagih reakcijskih

pogojev in specifičnega delovanja pri hidrolizi, pri čemer ne proizvede praktično nikakršnih

snovi, ki povzročajo razgradnjo glukoze. [17]

Celulaza je encimski kompleks, ki je sestavljen iz endo-1,4-β-D-glukanaz ali endoglukanaz,

ekso-1,4-β-D-glukanaz ali celobiohidrolaz in 1,4-β-D-glukozidaz. Endoglukanaze sproţijo

postopek hidrolize, prekinejo notranje β-1,4-glikozidne vezi vzdolţ celulozne verige in

povečajo število koncev celuloznih verig, ki so na voljo za eksoglukanaze. Te hidrolizne

reakcije potekajo preteţno na amorfnih območjih celuloze. Eksoglukanaze lahko nato

razcepijo dve celobiozni enoti od vsakega konca teh krajših celuloznih verig. Glukozidaze

hidrolizirajo celobiozne enote disaharidov v dve monosaharidni (glukozni) enoti.

Učinkovitost encimske hidrolize je odvisna od tesnega stika med celulazo in celulozo. Po

drugi strani pa je dostopnost celulaze celulozi odvisna od drugih reakcij celuloze v


11

heterogenem (trdnem/tekočem) stanju, od strukturnih značilnosti, npr. površine, poroznosti,

indeksa kristaliničnosti. [21]

Dostopnost celulaze do omejenih območij adsorbcije na kristaliničnih strukturah celuloze

na splošno velja za pomemben dejavnik pri določanju stopnje hidrolize celuloze. Za

povečanje površine, dostopne za adsorpcijo celulaze, so substrati celuloze pogosto

izpostavljeni fizični ali kemični predobdelavi, ki prekine tesno ureditev vlaken celuloze v

področjih kristaliničnosti. [17]

Encimske reakcije smo izvajali v reaktorskem sistemu EasyMax 102. V reaktorsko posodo

smo zatehtali celulozo, ki smo jo predhodno obdelali s kislino in temu dodali acetatni pufer

(pH = 5). Vse reakcije smo izvajali 24 h. Na začetku reakcije smo dodali še encim celulaza,

ki je bil ključnega pomena za hidrolizo celuloze.

3.4 Priprava umeritvene krivulje in absorbcijska spektrofotometrična analiza vzorcev

Kemijsko sestavo materiala, vsebnost določenih kemijskih elementov ali delcev v vzorcu

lahko določimo s spektrofotometrično metodo. Ta temelji na principu absorbcije svetlobe

(UV, vidne) v raztopini. [22]

Koncentracijo glukoze je mogoče enostavno testirati s pomočjo naslednje metode. Enačbi

3.2 in 3.3 prikazujeta encimsko kolorimetrično metodo [23]:

→ (3.2)

→ (3.3)

Glukoza se ob prisotnosti encima glukoze oksidaze (GOD) in atmosferskega kisika oksidira

v glukonolakton. Pri tem nastaja tudi vodikov peroksid, ki se pri nadaljnji reakciji ob

prisotnosti encima peroksidaze (POD) porabi za oksidacijo indikatorja 4-

aminoantipirin/fenola v barvilo kinonimin. Intenziteta rdečega barvila je sorazmerna s

koncentracijo glukoze, zato jo lahko merimo fotometrično. [23]

Za umeritveno krivuljo smo pripravili standardne raztopine glukoze z masnimi

koncentracijami, ki so pokrivale celoten interval pričakovanih koncentracij spojin v

vzorcih. S spektrofotometrom smo izmerili absorbanco za slep poskus in vse standardne

raztopine pri določeni valovni dolţini ter z računalniškim programom Excel narisali graf

umeritvene krivulje. Na podlagi predhodno pripravljenih umeritvenih krivulj smo lahko

določili koncentracijo glukoze v vzorcu. Slika 3-6 prikazuje spektrofotometrični sistem.


12

Slika 3-6. Spektrofotometer (Cary 1-E UV-Visible)

3.5 Analiza vzorcev s FTIR spektroskopijo

Za analizo strukture celuloze smo uporabili FTIR spektrometrijo. Gre za vibracijsko

spektroskopsko metodo, kjer se vzorec obseva z infrardečo (IR) svetlobo. Molekule v

izbranem območju absorbirajo za njih značilne frekvence infrardeče svetlobe. [24]

Tehnika se uporablja za določanje funkcionalnih skupin in molekul. IR spektroskopija meri

vibracije atomov in na podlagi tega je mogoče določiti funkcionalne skupine. Na splošno

bodo močnejše vezi in lahki atomi vibrirali pri visoko raztezajoči se frekvenci. [25]

IR spektri so pridobljeni na posebnem orodju, ki ga imenujemo IR spektrometer. Uporablja

se za zbiranje informacij o strukturah spojin, ocenjevanje njihove čistosti in včasih tudi

njihove identifikacije. Infrardeče sevanje je del elektromagnetnega spektra med vidnimi in

mikrovalovnimi polji. Infrardečo sevanje absorbirajo organske molekule in jo pretvorijo v

energijo molekularnih vibracij (raztezanje ali zvijanje). Različne vrste vezi, in s tem

različne funkcionalne skupine, absorbirajo infrardeče sevanje različnih valovnih dolţin.

[26]

S FTIR spektrofotometrom IR Affinity-1 smo posneli spektre celuloze po kemijski in

fizikalni obdelavi in jih primerjali.


13

4 Eksperimentalni del

V tem poglavju podrobneje predstavljamo naše delo in vse izvedene izračune. Predstavili

bomo vse predpriprave celuloze, ki smo jih izvedli za nadaljnjo encimsko reakcijo hidrolize

do glukoze.

4.1 Priprava standarnih vzorcev za pripravo umeritvene krivulje Za umeritveno krivuljo je bila potrebna priprava glukoznih standardnih vzorcev. Pripravili

smo raztopine glukoze z različnimi mnoţinskimi koncentracijami (0, 5, 10, 15, 20, 25 in

30) mmol/L. Po enačbi 4.1 smo izračunali ustrezne mase za dane koncentracije; te so

podane v tabeli 4-1. V 100 mL bučkah smo zatehtano maso glukoze raztopili z deionizirano

vodo in analizirali standardne vzorce glukoze.

, (4.1)

kjer je:

Mglukoze = 180,1559 g/mol

Tabela 4-1. Masa glukoze za dane koncentracije glukoznih raztopin

cglukoze (mmol/L) mglukoze (g)

0 (deionizirana voda) 0

5 0,0901

10 0,1802

15 0,2702

20 0,3603

25 0,4504

30 0,5405

Pred analizo smo izmerili absorbanco praznih kivet pri valovni dolţini 500 nm. Iz vseh 7

pripravljenih standardnih raztopin smo odpipetirali 10 µL raztopine v prazne kivete. K

temu smo dodali 990 µL glukoznega reagenta in začeli z merjenjem časa. Raztopine so se

zaradi tvorbe barvila obarvale rdeče. S pomočjo vorteksa smo jih dobro premešali in jih

termostatirali pri 35 °C. Po 10 min od vnosa glukoznega reagenta smo s spektrofotometrom

izmerili absorbance in z računalniškim programom Excel narisali graf za umeritveno

krivuljo.

4.2 Postopek priprave acetatnega pufra Acetatni pufer smo pripravili iz natrijevega acetata (c = 0,2 mol/L) in ocetne kisline (c = 0,2

mol/L). Za pripravo 1 L acetatnega pufra smo zmešali 16,406 g natrijevega acetata in 11,47

mL ocetne kisline. Maso natrijevega acetata smo izračunali po enačbi 4.2:

(4.2)


14

Volumen ocetne kisline smo izračunali po enačbi 4.3:

(4.3)

Za pripravo acetatnega pufra s pH 5 smo zmešali 70 mL pripravljenega natrijevega acetata

in 30 mL ocetne kisline, kar je razvidno iz tabele v literaturi. [27]

Vrednost pH smo uravnavali s pH metrom, ki meri elektromotorično silo koncentracijske

celice in je sestavljen iz steklene in kalomelove elektrode.

Pri delu smo uporabili tudi pufer iz 0,2 mol/L citronske kisline in 0,2 mol/L Na2HPO4. V

hladilniku je prišlo do izločanja Na2HPO4, zato je bil pH niţji od 5. Acetatni pufer se je v

našem primeru izkazal kot boljša moţnost.

4.3 Priprava celuloze za encimsko hidrolizo

4.3.1 Mletje celuloze listavcev in iglavcev

Dobljeno celulozo iz papirnice smo narezali na manjše koščke in jo zmleli s kavnim

mlinčkom. Zmleta celuloza listavcev in iglavcev se na videz in na otip ni razlikovala. To

celulozo smo potem uporabili za hidrolizo z encimom.

4.3.2 Toplotna obdelava celuloze listavcev in iglavcev

Po mletju smo celulozo dali v ekonom lonec in jo 3 ure prekuhavali v destilirani vodi na

kuhalni plošči. Celulozo smo nato prenučirali, sušili ter po sušenju ponovno zmleli. Opazili

smo, da je postala na otip mehkejša in bolj fina, kot po samem mletju brez prekuhavanja.

4.3.3 Predobdelava celuloze z 1-butil-metil-imidazol-kloridom (BMIMCl)

Topila celuloze so ključnega pomena pri boljšem izkoriščanju celuloze. V zadnjem času so

veliko zanimanja pridobile ionske tekočine kot nadomestila za okoljsko škodljiva hlapna

organska topila. Ugotovljeno je bilo, da se celuloza lahko raztopi brez derivatizacije v

visokih koncentracijah z uporabo ionskih tekočin, kot so 1-alil-3-metil-imidazol-klorid, 1-

alil-3-metil-imidazol format, 1-butil-metil-imidazol-klorid in tako naprej. V literaturi smo

zasledili, da so se ionske tekočine izkazale kot učinkovita topila za raztapljanje celuloze

zaradi svojih edinstvenih lastnosti, kot so nizka tališča, zanemarljiv parni tlak, nehlapljivost

in vnetljivost. Zato smo poskusili z uporabo topila 1-butil-metil-imidazol-klorid

(BMIMCl).

V 50 mL čašo smo zatehtali 0,25 g zmlete celuloze in 5 g BMIMCl. Čašo smo za 2 h

postavili v ultrazvočno kopel. Najprej smo poskusili z raztapljanjem pri sobni temperaturi,

ker ni bilo nobene spremembe, smo zvišali temperaturo na 50 °C. Takrat je prišlo do

počasnega raztapljanja, zato smo povišali temperaturo do 90 °C ter čašo pustili v

ultrazvočni kopeli še 2 h. Dobili smo ţelatinasto snov rumene barve, kjer so bili vidni

mehurčki. V čašo smo dali mešalo in destilirano vodo, ter na kuhalni plošči segrevali do

100 °C. Opaziti ni bilo nobenih sprememb, zato smo čašo spet postavili v ultrazvočno kopel

pri temperaturi 90 °C. Ţelatinasto snov smo s pinceto natrgali na manjše koščke, ki so čez

čas postali bele barve. Vsebino čaše smo prenučirali, celulozo na filter papirju pa dobro

sprali z destilirano vodo, da smo odstranili celotno ionsko tekočino. Celuloza, ki je ostala

na filter papirju, je bila bele barve in gumijaste strukture. Filter papir s celulozo smo en dan


15

sušili na sobni temperaturi. Po sušenju smo celulozo prekuhali in dobro sprali z destilirano

vodo ter jo ponovno sušili. Ta celuloza je bila bele in modre barve. Celulozo smo v

nadaljevanju uporabili za encimsko reakcijo.

Pri naslednji obdelavi celuloze z 1-butil-metil-imidazoli-kloridom, kot topilom, smo v 50

mL čašo zatehtali 0,25 g zmlete celuloze in 5 g BMIMCl. V ultrazvočni kopeli smo

raztopili vsebino čase in jo dali na grelno ploščo pri 300 °C. Iz rumene ţelatinaste snovi

preide v temno rdeče-rjavo tekočino. Dodali smo še destilirano vodo in čašo postavili v

ledeno vodo, vse skupaj pa smo ves čas mešali. Nič se ni izločilo, zato smo sklepali, da smo

raztopino pregreli. Encimske reakcije tako nismo mogli izvesti.

4.3.4 Predobdelava celuloze listavcev in iglavcev s fosforno kislino

Zatehtali smo 3 g predhodno zmlete celuloze v reaktorsko posodo reaktorja EasyMax 102

in dodali 50 mL 85 % fosforne kisline. Pri 50 °C in vrtilni frekvenci mešala, fm = 200 min-1

smo kuhali 2 h. Medtem smo si pripravili 1000 mL čašo z mešalčkom in jo do polovice

napolnili z deionizirano vodo in ledom. Čašo smo postavili na mešalno ploščo. Ob

zmernem mešanju smo počasi dodajali raztopino. Raztopino, ki se je obarvala belo, smo še

nekaj časa pustili mešati. Z raztopino smo napolnili 9 centrifugirk do 50 mL in

centrifugirali 5 min pri vrtilni frekvenci mešala 5000 min-1

. Dobili smo dve fazi, zato smo

zgornjo, bistro, fazo odlili, spodnjo, belo, fazo (celulozo) pa zbrali iz vseh centrifugirk in jo

porazdelili v dve centrifugirki. Obe centrifugirki smo do 50 mL dopolnili z destilirano vodo

in ju pred naslednjim centrifugiranjem dobro premešali. Enak postopek centrifugiranja smo

ponovili še dvakrat pri istih pogojih. Sledilo je še drugo centrifugiranje, po katerem smo

odlili zgornjo fazo, dopolnili centrifugirki z acetonom do 25 mL in ju dobro premešali. To

centrifugiranje z acetonom smo ponovili še dvakrat. Zgornjo bistro fazo smo nato še

zadnjič odlili, vsebino (celulozo) na dnu obeh centrifugirk pa s pomočjo spatule prenesli na

urno steklo in sušili pri sobni temperaturi. Za spiranje z acetonom smo se odločili zaradi

hitrejšega sušenja, saj aceton hitreje izhlapi.

Kuhanje celuloze v fosforni kislini smo nekaj krat izvedli v preprostem šarţnem mešalnem

reaktorju s termostatom. Po celotni predobdelavi je bila ta celuloza še vedno mokra in

prozorne barve, kar je razvidno iz slike 4-1. Celuloza, ki smo jo kuhali v reaktorju

EasyMax 102, pa je bila bele barve, podobna prahu. Razlog za to je bila dobro prečiščena

celuloza, kar prikazuje slika 4-2.

Slika 4-1. Obdelana celuloza po centrifugiranju (obdelana v enostavnem šarţnem mešalnem

reaktorju)


16

Slika 4-2. Obdelana celuloza po centrifugiranju (obdelana v EasyMax-u 102)

4.4 Encimska hidroliza celuloze z encimom celulaza Dejavniki, ki vplivajo na encimsko hidrolizo celuloze so vrsta substrata, aktivnost celulaze

in pogoji reakcije (temperatura, pH in drugi parametri). [20]

Temperatura je pomemben dejavnik, ki ne vpliva le na hitrost encimske reakcije, temveč

tudi na aktivnost celulaze. Ko se temperatura v določenem razponu poveča, se praviloma

pospeši tudi encimska reakcija. Toda ko se temperatura poveča nad tem razponom, encim

postane denaturiran, kar vodi do zmanjšanja hitrosti encimske reakcije. Optimalna

reakcijska temperatura za celulazo je med 45 °C in 55 °C. Vsebina reducirajočega sladkorja

se postopoma zmanjša po 30 h reakcije. To je lahko posledica zaviranja encimske

aktivnosti zaradi nakopičenih produktov hidrolize. Spremembe vrednosti pH lahko

povzročijo izgubo aktivnosti celulaze ali disociacije med substratom in katalitično skupino

aktivnega centra encima, kar vodi do zmanjšane hitrosti encimske reakcije. Zato mora biti

pH v hidrolizni reakciji, katalizirani s celulazo, nadzorovan, da se doseţe maksimalna

aktivnost celulaze. Maksimalno hitrost reakcija doseţe pri pH 5. Ko je pH višji ali niţji od

5, se hitrost encimske reakcije zmanjša. [28]

Koncentracija substrata je eden glavnih dejavnikov, ki vplivajo na proizvodnjo in začetno

stopnjo encimske hidrolize celuloze. Pri nizkih ravneh substrata povečanje koncentracije

substrata običajno povzroči povečanje proizvodnje in stopnje reakcije hidrolize. Vendar

lahko visoka koncentracija substrata povzroči oviranje substrata, kar močno zniţa stopnjo

hidrolize, obseg oviranja substrata je odvisen od razmerja med skupnim substratom in

skupnimi encimi. [20]

Raziskave so pokazale, da je bila ob povečanju substratov izboljšana povratna inhibicija s

celobiozo in glukozo, kar je vodilo do zmanjšane proizvodnje reducirajočih sladkorjev pri

encimski reakciji. Ko je bila koncentracija substrata manjša od 3 %, se je hitrost encimske

reakcije povečevala v skladu z večanjem koncentracije substrata. Ko je postal substrat

nasičen in se je njegova koncentracija dodatno povečevala, se je koncentracija reducirajočih

sladkorjev postopno zmanjševala. [28]

Vse encimske reakcije smo izvajali pri 45 °C in 200 min-1

v reaktorju EasyMax 102.

Posamezna reakcija je trajala 24 h.

Najprej smo uporabljali pufer iz citronske kisline in Na2HPO4 pri pH 5. K 50 mL pufra smo

dodali 1 g predelane celuloze in nato še 500 µl encima celulaze. Zaradi slabih izkoristkov

smo sklepali, da lahko visoka koncentracija substrata povzroči lastno inhibicijo, kar moţno

zniţa stopnjo hidrolize. V nadaljevanju smo uporabili 0,1 g predelane celuloze. Za reakcijo


17

smo uporabili 50 mL acetatnega pufra, ki se je izkazal kot boljša moţnost. Drugi pogoji

reakcije so bili enaki.

Reakcije hidrolize smo poskusili tudi z uporabo mikrokristalinične celuloze (MCC). Gre za

prečiščeno, delno depolimerizirano celulozo, ki se pridobiva iz pulpe vlaknatega

rastlinskega materiala z mineralnimi kislinami. Stopnja polimerizacije mikrokristalinične

celuloze je običajno manjša od 400. V vodi je netopna in zagotavlja naraven vir vlaknin z

disperzijskimi lastnostmi.

4.5 Analiza vsebnosti glukoze po encimski reakciji in izračun presnove Vzorce smo pred analizo glukoze kuhali v vreli vodi pribliţno 10 min, da je prišlo do

denaturacije encima, s tem pa do prekinitve reakcije. Neznanemu vzorcu smo najprej

izmerili absorbanco. Vsebnost koncentracije v neznanem vzorcu smo grafično določili iz

umeritvene krivulje s pomočjo enačbe 4.4:

, (4.4)

kjer je:

A absorbanca neznanega vzorca (/),

cA koncentracija glukoze neznanega vzorca (mol/L),

x naklon krivulje,

y presešišče premice z x-osjo.

Za ravnoteţno encimsko reakcijo velja, da encim katalizira reakcijo:

( ) ( ) ( ) ( )

Zato velja:

Presnovo reakcije smo določili po enačbi 4.5:

, (4.5)

kjer je:

XA presnova,

cA koncentracija glukoze na koncu reakcije (mol/L),

cAO koncentracija glukoze na začetku reakcije (mol/L).


18

5 Rezultati in diskusija

Najpomembnejši del raziskav so rezultati z ugotovitvami, ki so lahko v pomoč pri

izboljšanju ter razširitvi procesa. V tem poglavju predstavljamo presnove encimskih

reakcij, ki smo jih izvajali z različno predobdelanimi celuloznimi materiali. Na osnovi

primerjav presnov smo ugotavljali, katera metoda predobdelave je bolj učinkovita za

nadaljnjo hidrolizo. Primerjali smo celulozna vlakna dveh vrst listavcev in iglavca po

mletju ter po obdelavi s fosforno kislino, kar smo posneli z mikroskopom Motic F-11.

Spremembo celulozne strukture smo primerjali tudi z FTIR spektri.

5.1 Presnove encimskih reakcij Vse encimske reakcije smo izvajali 24 h v reaktorju EasyMax 102 pri 45 °C in 200 min

-1, s

500 µL encima celulaze. Koncentracijo glukoze in presnovo reakcije v naslednjih tabelah

smo izračunali po enačbah 4.4 in 4.5. Zaradi ponovljivosti rezultatov smo za vsako reakcijo

izvedli dve ponovitvi. Iz umeritvene krivulje smo izračunali koncentracijo glukoze.

5.1.1 Presnove encimskih reakcij z zmleto celulozo

Za reakcijo hidrolize smo uporabili 50 mL pufra (0,1 mol/L citronske kisline in 0,2 mol/L

Na2HPO4) pri pH 5 in 1 g zmlete celuloze listavcev (evkaliptus).

V tabeli 5-1 so prikazane presnove encimskih reakcij z zmleto celulozo listavcev

(evkaliptus).

Tabela 5-1. Presnova encimskih reakcij z zmleto celulozo listavcev (evkaliptus)

Reakcija

hidrolize Obdelava

mceluloze

(g)

cglukoze

(mmol/L)

XA

(%)

1. serija mletje 1 5,2388 4,71


V naslednjem koraku smo za reakcijo uporabili 50 mL pufra (0,1 mol/L citronske kisline in

0,2 mol/L Na2HPO4) pri pH 5 in 1 g zmlete celuloze iglavcev.

V tabeli 5-2 so prikazani rezultati encimskih reakcij z zmleto celulozo iglavcev.

Tabela 5-2. Presnova encimskih reakcij z zmleto celulozo iglavcev

Reakcija

hidrolize Obdelava

mceluloze

(g)

cglukoze

(mmol/L)

XA

(%)



Iz tabel 5-1 in 5-2 vidimo, da je presnova reakcij hidrolize s predhodnim mletjem celuloze

v primeru iglavcev in listavcev zelo majhna, tj. od 4 do 5 %. Vzrok za to je kristalinična

struktura celuloze, kjer so molekule izpostavljene močni vezavi z vodikom, zato ta

struktura omogoča le nizko dostopnost encima.

Če primerjamo presnovo listavcev in iglavcev, je ta pri listavcih minimalno boljša. Zaradi

slabih izkoristkov samo mehansko obdelane celuloze smo poskusili še s prekuhavanjem

celuloze z destilirano vodo.


19

5.1.2 Presnove encimskih reakcij s toplotno obdelano celulozo

Za reakcijo smo si pripravili celulozo listavca (evkaliptus), ki smo jo predhodno prekuhali v

destilirani vodi. V 50 mL pufra (0,1 mol/L citronske kisline in 0,2 mol/L Na2HPO4) pri pH

5 smo odtehtali 1 g celuloze in izvedli reakcijo.

V tabeli 5-3 so prikazani rezultati encimskih reakcij s prekuhano celulozo listavcev

(evkaliptus).

Tabela 5-3. Presnova encimskih reakcij s prekuhano celulozo listavcev (evkaliptus)

Reakcija

hidrolize Obdelava

mceluloze

(g)

cglukoze

(mmol/L)

XA (%)

1. serija toplotna 1 5,2201 4,70


Enak postopek smo izvedli še s celulozo iglavcev. Za reakcijo smo uporabili 50 mL pufra

(0,2 mol/L natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne kisline) pri pH 5 in 1 g v destilirani vodi

prekuhane celuloze iglavcev.

V tabeli 5-4 so prikazani rezultati encimskih reakcij s prekuhano celulozo iglavcev.

Tabela 5-4. Presnova encimskih reakcij s prekuhano celulozo iglavcev

Reakcija

hidrolize Obdelava

mceluloze

(g)

cglukoze

(mmol/L)

XA (%)



Primerjava rezultatov tabel 5-3 in 5-4 pokaţe, da smo s prekuhavanjem celuloze dobili

nekoliko boljše rezultate (če gledamo obe seriji). Vendar je presnova glede na naše ţelje še

vedno prenizka. Pri iglavcih smo uporabili acetatni pufer (pH = 5).

5.1.3 Presnove encimskih reakcij s celulozo raztopljeno v 1-butil-metil-imidazolium-kloridom (BMIMCl)

Zaradi slabih presnov smo se odločili za predobdelavo celuloze s topilom 1-butil-metil-

imidazol-klorid (BMIMCl). Za reakcijo smo v 50 mL pufra (0,1 mol/L citronske kisline in

0,2 mol/L Na2HPO4) pri pH 5 odtehtali 0,23 g celuloze iglavcev.

V tabeli 5-5 so prikazane presnove encimskih reakcij s topilom BMIMCl predelane

celuloze iglavcev.

Tabela 5-5. Presnova encimskih reakcij s topilom BMIMCl predelane celuloze iglavcev

Reakcija

hidrolize Obdelava

mceluloze

(g)

cglukoze

(mmol/L)

XA

(%)

1. serija raztapljanje v BMIMCl 0,23 5,4137 21,18

Pri tej reakciji smo dosegli boljšo presnovo, kot pri mletju in prekuhavanju. Iz tega

rezultata lahko sklepamo, da predhodno raztapljanje celuloze z močnim topilom poveča

učinkovitost reakcije hidrolize.


20

5.1.4 Presnove encimske reakcije v odvisnosti od časa

Odvisnost presnove od časa smo dobili tako, da smo vzorec vzeli pred dodatkom encima

celulaze, po 1 h, po 2 h in po 24 h reakcije. Celulozo iglavcev smo pred tem obdelali s

fosforno kislino. V reaktorsko posodo smo k 50 mL pufra (0,2 mol/L natrijevega acetata in

0,2 mol/L ocetne kisline) s pH 5 odtehtali 1 g celuloze in izvedli reakcijo.

Presnove so bile tudi po 24 h zelo nizke. Koncentracija glukoze, in s tem presnova, sta

naraščali premosorazmerno s časom, kot je prikazano na diagramu slike 5-1.

Slika 5-1. Presnova reakcije hidrolize celuloze iglavcev v odvisnosti od časa

Reakcije hidrolize smo izvajali 24 h, saj so bile v tem času doseţene najvišje presnove.

Naše ugotovitve so v skladu s pregledano literaturo. Vsebnost reducirajočih sladkorjev je

bila v tem času najvišja. Po 30 h pa je prišlo do zaviranja encimske aktivnosti, predvsem

zaradi nakopičenih produktov hidrolize.

5.1.5 Presnove encimskih reakcij za homogenizirano celulozo

Zanimalo nas je, ali s homeniziranjem celuloze izboljšamo presnovo reakcije, zato smo

celulozo iglavcev homogenizirali. Za reakcijo smo uporabili 50 mL pufra (0,2 mol/L

natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne kisline) pri pH 5. Izvedli smo še reakcijo, ko smo

maso homogenizirane celuloze iglavcev 3-krat zmanjšali in poskusili ugotoviti, kako masa

celuloze vpliva na končno presnovo.

V tabeli 5-6 so prikazani rezultati encimskih reakcij za celulozo iglavcev, ki smo jo

homogenizirali. V tem primeru nismo izvajali ponovitev.

Tabela 5-6. Presnova encimske reakcije za homogenizirano celulozo iglavcev

Obdelava mceluloze

(g)

cglukoze

(mmol/L)

XA (%)

homogeniziranje 0,9 8,7568 8,76

nehomogenizirana

celuloza 0,9 7,2417 7,24

homogeniziranje 0,3 9,5405 28,62

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30

XA (

%)

t (h)


21

Na podlagi vrednosti tabele 5-6 lahko primerjamo presnovo, ki smo jo dosegli z 0,9 g

homogenizirane in nehomogenizirane celuloze. Presnova homogenizirane celuloze je bila

nekoliko višja, vendar bistvene razlike s homogeniziranjem nismo dosegli. S trikratnim

zmanjšanjem mase predhodno obdelane celuloze pa smo dobili 3-krat večjo presnovo.

Torej lahko trdimo, da z zmanjšanjem koncentracije substrata povečamo stopnjo reakcije

hidrolize. Visoka koncentracija substrata povzroči, da je vse več encima v kompleksu s

substratom. Encim postaja tako vse bolj nasičen s substratom, kar se kaţe v zniţanju

stopnje hidrolize.

5.1.6 Presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino po 48 h

Glede na prejšnje rezultate, smo za reakcijo uporabili manjšo maso s kislino obdelane

celuloze iglavcev. Vzorce smo vzeli po 24 in 48 h.

Za reakcijo hidrolize smo zatehtali 0,2 g celuloze iglavcev. Uporabili smo 50 mL pufra (0,2

mol/L natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne kisline) pri pH 5 in reakcijo izvajali 48 h.

V tabeli 5-7 so prikazane presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev, ki smo jo

predhodno obdelali s fosforno kislino.

Tabela 5-7. Presnova encimske reakcije za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino po 24 in

48 h

Reakcija hidrolize Čas odvzemanja

vzorcev

cglukoze

(mmol/L)

XA

(%)

mceluloze = 0,2 g 24 h 13,6569 61,46

48 h 21,8606 98,37

Tabela 5-7 prikazuje, da smo z zmanjšanjem mase dobili še višjo presnovo. Po 48 h pa smo

dosegli ţe skoraj 100 % presnovo. Zaradi dobrih izkoristkov smo se odločili, da bomo pri

naslednjih reakcijah za reakcijo hidrolize uporabili 0,1 g obdelane celuloze s fosforno

kislino.

5.1.7 Presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino

Raztopine, ki smo jih uporabili za umeritveno krivuljo, smo v tem primeru termostatirali pri

35 °C, maso celuloze pa zmanjšali na 0,1 g. Celulozo iglavcev, ki smo jo uporabili za

reakcijo, smo kislinsko obdelali. Vse reakcije hidrolize smo izvajali 24 h.

Pri tem smo uporabili 50 mL pufra (0,2 mol/L natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne

kisline) pri pH 5.

V tabeli 5-8 so prikazani rezultati encimskih reakcij za celulozo iglavcev, ki smo jo

obdelali s fosforno kislino. Pri tem smo izvedli 4 ponovitve reakcije.

Tabela 5-8. Presnova encimskih reakcij za celulozo iglavcev obdelano s fosforno kislino

Reakcije hidrolize Obdelava mceluloze

(g)

cglukoze

(mmol/L)

XA

(%)

1. serija kislinska 0,1 9,7192 87,47





22

Vse presnove so dosegle vrednost nad 80 %. Z zmanjšanjem mase celuloze na 0,1 g smo

torej še povečali presnovo. Za primerjavo iglavcev z listavci smo izvedli še serijo reakcij s

celulozo listavcev.

5.1.8 Presnove encimskih reakcij za celulozo listavcev obdelano s fosforno kislino

Za reakcijo smo uporabili 50 mL pufra (0,2 mol/L natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne

kisline) pri pH 5 in celulozo listavcev (bukev). Celulozo smo pred reakcijo obdelali s

fosforno kislino. Masa celuloze je bila 0,1 g.

V tabeli 5-9 so prikazane presnove encimskih reakcij za celulozo iglavcev, ki smo jo

predhodno obdelali s fosforno kislino.

Tabela 5-9. Presnova encimskih reakcij za celulozo listavcev (bukev) obdelano s fosforno kislino


(g)

cglukoze

(mmol/L)

XA

(%)




Prav tako smo kislinsko obdelali še celulozo listavcev (evkaliptus) in nato izvajali reakcije

pri enakih pogojih, kot v prejšnjem primeru.

Tabela 5-10. Presnova encimskih reakcij za celulozo listavcev (evkaliptus) obdelano s fosforno

kislino


(g)

cglukoze

(mmol/L)

XA

(%)



Iz tabel 5-8, 5-9 in 5-10 vidimo, da s predobdelavo celuloze z raztapljanjanjem v fosforni

kislini doseţemo visoke presnove. Glede na literaturo lahko pojasnimo, da sta se v fosforni

kislini stopnja polimerizacije in stopnja kristaliničnost celuloze močno zmanjšali, saj se je s

tem povečala površina celuloznih vlaken. Dostopnost encima je zato večja, kar vpliva na

učinkovitost hidrolize. Če primerjamo presnove, ki so prikazane v tabelah 5-8, 5-9 in 5-10,

lahko vidimo, da smo s celulozo listavcev dosegli boljše presnove. Predvidevamo, da so

vzrok za to povprečno daljša celulozna vlakna pri iglavcih, ki jih je nekoliko teţje

razvlakniti.

5.1.9 Presnova encimskih reakcij za mikrokristalinično celulozo (MCC)

Encimsko hidrolizo smo poskusili izvesti tudi z mikrokristalinično celulozo, ki je bila delno

ţe depolimerizirana.

Za reakcijo smo uporabili 50 mL pufra (0,2 mol/L natrijevega acetata in 0,2 mol/L ocetne

kisline) pri pH 5 in 0,1 g mikrokristalinične celuloze (MCC). To celulozo smo pred reakcijo

obdelali s fosforno kislino.

V tabeli 5-11 so prikazane presnove encimskih reakcij za mikrokristalinično celulozo

(MCC), obdelano s fosforno kislino.


23

Tabela 5-11. Presnova encimskih reakcij za mikrokristalinično celulozo (MCC) obdelano s fosforno

kislino

Reakcija

hidrolize

mceluloze

(g)

cglukoze

(mmol/L)

XA

(%)

1.serija mikrokristalinična

(MCC) 0,1 9,7192 87,47

2. serija mikrokristalinična

(MCC) 0,1 9,2808 83,53

Presnove, ki smo jih dosegli s hidrolizo mikrokristalinične celuloze (tabela 5-11), so

podobne presnovam celuloze iglavcev, obdelane s fosforno kislino. Presnova je visoka, ker

gre za delno depolimerizirano celulozo, zato je bila razgradnja laţja.

5.2 Primerjava najvišjih presnov kislinsko predobdelanih celuloz

Kislinska predobdelava je bila pri vseh vrstah celuloze najučinkovitejša. Na koncu

encimskih reakcij smo dobili zelo visoke presnove. To smo dosegli tudi z uporabo

acetatnega pufra. Slika 5-2 prikazuje primerjavo najvišjih presnov celuloze iglavca, listavca

(bukev in evkaliptus) in mikrokristalinične celuloze, ki smo jih predhodno obdelali s

kislino. Iz slike 5-2 je razvidno, da je celuloza evkaliptusa najbolj razgradljiva, sledi

celuloza bukve in nato z enakima presnovama celuloza iglavca in mikrokristalinična

celuloza.

Slika 5-2. Primerjava najvišjih presnov celuloz, obdelanih s fosforno kislino

Razlog za razlike v presnovi so celulozna vlakna, ki se od drevesa do drevesa razlikujejo.

5.3 Mikroskopski posnetki zmlete celuloze in obdelane celuloze s fosforno kislino

Z mikroskopom (Motic F-11) smo posneli celulozna vlakna listavcev in iglavcev po mletju

pri 100-kratni povečavi. Celulozna vlakna vseh treh drevesnih vrst so trakaste oblike in se

med seboj prepletajo, kar prikazuje slika 5-3. Vlakna se razlikujejo po dolţini in debelini.

60

65

70

75

80

85

90

95

100

evkaliptus bukev iglavec MCC

X [

%]

vrsta celuloze


24

Slika 5-3. Celulozna vlakna iglavca (levo), listavca bukev (v sredini) in listavca evkaliptus (desno)

po mletju

Primerjava celuloznih vlaken vseh treh dreves pokaţe, da so po mletju celulozna vlakna

iglavcev najdaljša. Premer celuloznih vlaken je prav tako največji pri iglavcih, zato smo ta

celulozna vlakna teţje razgradili pred hidrolizo. Pri listavcu bukev so vlakna manjšega

premera, medtem ko so najkrajša in najtanjša pri listavcu evkaliptus. Posledica tega so

najvišje presnove. Pri evkaliptusu nam je uspelo celulozna vlakna najbolj skrajšati in s tem

zmanjšati stopnjo polimerizacije. Dobljene presnove so v skladu z mikroskopskimi

posnetki.

Posnetke smo naredili tudi po obdelavi celuloze s fosforno kislino. Slika 5-4 prikazuje vse

tri drevesne vrste po obdelavi.

Slika 5-4. Obdelana celuloza iglavca (levo), listavca bukev (v sredini) in listavca evkaliptus (desno)

Po obdelavi celuloze s fosforno kislino smo dobili najbolj groba zrna pri iglavcih, najbolj

fina pri evkaliptusu. Posnetki na sliki 5-3 torej potrjujejo, da je predobdelava s fosforno

kislino najučinkoviteje razgradila celulozo evkaliptusa. Posledica tega so bile najvišje

presnove encimske hidrolize.

5.4 FTIR spektri celuloze po fizikalni in kemijski obdelavi Celulozo smo proučili tudi s FTIR spektrometrijo. Metoda je občutljiva na strukturne

spremembe. Ţeleli smo ugotoviti, kakšne so strukturne spremembe celuloznih vlaken po

kemijski in fizikalni obdelavi.

Slika 5-5 prikazuje FTIR spekter celuloze evkaliptusa po mletju, torej po fizikalni obdelavi.


25

Slika 5-5. FTIR spekter celuloze evkaliptusa po fizikalni obdelavi

Na sliki 5-6 je prikazan FTIR spekter celuloze evkaliptusa po kemijski obdelavi s fosforno

kislino.

Slika 5-6. FTIR spekter celuloze evkaliptusa po kemijski obdelavi

Spektra na sliki 5-5 in 5-6 sta si zelo podobna. V obeh so prisotni enaki vrhovi, značilni za

celulozo, vendar se razlikujeta v vibraciji OH. Po kemijski obdelavi je ta vrh nekoliko širši,

ker je prišlo do modifikacije, zmanjšanja kristaliničnosti. Opazne so tudi razlike v območju

500750100012501500175020002500300035004000

1/cm

67.5

75

82.5

90

97.5

%T

Evkalipt-zmlet

500750100012501500175020002500300035004000

1/cm

50

60

70

80

90

100

%T

Evkalipt-obdelan

C=N

C-H

O-H

C-O

O-H

C-H

C=N

C-O


26

valovne dolţine med 1800 cm-1

in 2500 cm-1

, kjer je po kemijski obdelavi najverjetneje

prišlo do zdruţevanja absorbcijskih trakov. To se kaţe v zmanjšanju urejenosti strukture.

Pri valovni dolţini 1430 cm-1

so značilne vibracije CH2, upogibanje HCH in OCH v ravnini

in vibracije medmolekulskih vodikovih vezi. Te se izrazito kaţejo pri fizikalno obdelani

celulozi, medtem, ko pri kemijski obdelavi vrh ni tako izrazit in se razširi.

Slika 5-7 prikazuje FTIR spekter celuloze listavca bukev po fizikalni obdelavi, slika 5-8 po

kemijski obdelavi.

Slika 5-7. FTIR spekter celuloze bukve po fizikalni obdelavi.

500750100012501500175020002500300035004000

1/cm

85

90

95

100

%T

Listavec-zmlet

C-O

O-H

C-H C=N


27

Slika 5-8. FTIR spekter celuloze bukve po kemijski obdelavi

Če primerjamo dobljena spektra na slikah 5-7 in 5-8, lahko opazimo, da sta tudi ta podobna.

Povsod se pojavljajo enaki vrhovi, ki se med seboj razlikujejo v širini in ostrini. Pri valovni

dolţini 3425 cm-1

variira močna vodikova vez. Za močne vezi in lahke atome pa je

značilno, da variirajo pri visoki raztezajoči se frekvenci. Po kemijski obdelavi se je ta vrh

nekoliko razširil. V območju med 1800 cm-1

in 2000 cm-1

je prišlo po obdelavi s kislino do

zdruţevanja absorbcijskih trakov. Pri zmleti celulozi listavca je viden vrh pri valovni

dolţini 1316 cm-1

, ki po kemijski obdelavi skoraj izgine. Tu se pojavi novi izraziti pik pri

1371 cm-1

, kjer so variiacije COH in HCC, celuloze in hemiceluloze. Razlika se pojavi tudi

pri dolţini pika 900 cm-1

, v variaciji COC glikozidnih vezi. Po kemijski obdelavi je ta pik

daljši in bolj izrazit.

Naslednji sliki, 5-9 in 5-10, prikazujeta FTIR spekter celuloze iglavca po kemijski in

fizikalni obdelavi.

500750100012501500175020002500300035004000

1/cm

50

60

70

80

90

100

%T

Listavec-obdelan

O-H

C-H

C-O

C=N


28

Slika 5-9. FTIR spekter celuloze iglavca po fizikalni obdelavi

Slika 5-10. FTIR spekter celuloze iglavca po kemijski obdelavi

FTIR spektra na sliki 5-9 in 5-10 sta si načeloma precej podobna. Do razširitve spektra po

kemijski obdelavi pride pri valovni dolţini 3425 cm-1

, kar je posledica strukturnih

sprememb celuloze. Na območju 1800 cm-1

do 2500 cm-1

pride po kislinski obdelavi

listavcev do vidnega zdruţevanja absorcijskih trakov, kar pa pri iglavcih ni tako očitno. Pri

500750100012501500175020002500300035004000

1/cm

67.5

75

82.5

90

97.5

%T

Iglavci-zmleto

500750100012501500175020002500300035004000

1/cm

80

85

90

95

100

%T

Iglavci-obdelano

O-H

C-H

C-O

C=N

O-H

C-H

C-O

C=N


29

iglavcih nismo bili tako uspešni pri zmanjšanju kristaliničnosti celuloze. To lahko potrdimo

tudi z rezultati presnov hidrolize, ki so bile zato pri iglavcih nekoliko niţje. Vrh pri valovni

dolţini 1430 cm-1

, kjer so vibracije medmolekulskih vezi, je izrazitejši po fizikalni

obdelavi. Ponovno se pojavi razlika v daljšem vrhu po kemijski obdelavi, kjer variirajo

glikozidne vezi.

Slika 5-11 prikazuje FTIR spekter mikrokristalinične celuloze (MCC) po fizikalni obdelavi.

Slika 5-11. FTIR spekter celuloze mikrokristalinične celuloze (MCC) po fizikalni obdelavi

Na sliki 5-12 je prikazan še FTIR spekter mikrokristalinične (MCC) celuloze po kemijski

obdelavi.

500750100012501500175020002500300035004000

1/cm

60

70

80

90

%T

Mikroceluloza

O-H

C-H

C-O

C=N


30

Slika 5-12. FTIR spekter mikrokristalinične celuloze (MCC) po kemijski obdelavi

Spektra 5-11 in 5-12 sta zelo podobna spektroma celuloze iglavca. V območju valovne

dolţine 1800 cm-1

in 2500 cm-1

tudi pri mikrokristalinični ni prišlo do bistvenih razlik.

Razlog za to so enake presnove encimskih reakcij celuloze iglavca in mikrokristalinične

celuloze.

Rezultati FTIR spektrov so bili prav tako v skladu z ugotovitvami raziskav, da je celuloza

listavcev nekoliko laţja za obdelavo, kakor celuloza iglavcev.

500750100012501500175020002500300035004000

1/cm

60

67.5

75

82.5

90

97.5

%T

Mikroceluloza-obdelana

O-H

C-H

C=N

C-O


31

6 Zaključek

Etanol je trenutno najbolj razširjen obnovljiv izdelek na globalnem trgu goriva. Ţe od

nekdaj je veljal za eno najboljših alternativ večini goriv, saj zniţuje odvisnost od rezerv

surove nafte in zagotavlja čistejše izgorevanje, kar vodi do bolj zdravega okolja. Na splošno

skoraj vsa gospodarsko izvedljiva proizvodnja bio-etanola temelji na fermentaciji saharoze

iz sladkornega trsa in melase ali glukoze, ki izvirata iz poljščin na podlagi škroba, npr.

koruza, pšenica in maniok. Po drugi strani so lignoceluloze najbolj razširjena in

nizkocenovna biomasa na svetu in zato trenutno velja za eno najboljših alternativnih

surovin za proizvodnjo etanola kot goriva.

Papirniški mulj je trden ostanek, ki nastane zaradi postopkov mečkanja lesa in izdelave

papirja, ki ga trenutno odlagajo na smetišča ali kurijo, s tem pa ne tratijo samo potencialno

dragocenih sredstev, ki jih je mogoče spremeniti v bioenergijo, ampak tudi onesnaţujejo

okolje.

Celuloza je najbogatejši obnovljivi vir v naravi. Njena pretvorba v energijo z dodatno

vrednostjo in kemikalije je pritegnila globalno pozornost. Vendar je celulozo teţko

hidrolizirati v fermentacijske sladkorje zaradi kompaktne kristalinične strukture, ki se

oblikuje predvsem z inter- in intramolekularnimi vodikovimi vezmi.

V diplomskem delu smo ţeleli čim bolj »zmotiti« tesno ureditev vlaken v področju

kristaliničnosti. Za raztapljanje celuloze se v zadnjem času uporabljajo nederivatna topila,

kot so ionske tekočine in koncentrirana fosforna kislina (85 %), zato smo tudi sami

poskusili s tem. Raztapljanje celuloze z ionskimi tekočinami v našem primeru ni bilo

uspešno; sklepamo, da smo raztopino pregreli.

Na podlagi dobljenih rezultatov lahko trdimo, da je predobdelava celuloze bistvenega

pomena za bolj učinkovito hidrolizo, saj s tem povečamo njeno površino, ki je zato

dostopnejša za encim celulazo. Najboljše presnove smo dobili pri predobdelavi celuloze s

fosforno (V) kislino, ki je najbolj zmotila tesno ureditev vlaken celuloze v področju

kristaliničnosti. Boljše izkoristke smo dobili pri listavcih zaradi krajših celuloznih vlaken.

Na encimsko hidrolizo celuloze je vplivalo več dejavnikov, kot so substrat, dejavnost

celulaze in pogoji reakcije (temperatura, pH in drugi parametri). Reakcije so bile uspešne

po 24 h encimske hidrolize z uporabo acetatnega pufra (pH = 5) in pri temperaturi 45 °C. Ti

pogoji so bili skladni s pregledano literaturo.

Encimsko hidrolizo smo izvedli z encimi celulaze, ki so zelo specifični. Stroški encimske

hidrolize so v primerjavi s kislinsko ali alkalno nizki, saj se encimska hidroliza običajno

izvaja v blagih pogojih (pH 5, temperatura od 45 oC do 50 °C) in ne povzroča teţav s

korozijo. Vse reakcije smo uspešno izvajali v reaktorju EasyMax 102. Izvajanje reakcij je

bilo preprosto in hitro. Reaktor EasyMax 102 smo uporabljali tudi pri predobdelavi

celuloze s fosforno kislino (85 %). Ta reaktor se je izkazal kot boljša moţnost v primerjavi

s šarţnim mešalnim reaktorjem.

Produkt hidrolize je bila glukoza, katere vsebnost je bila največja pri celulozi evkaliptusa.

Najvišja presnova je dosegla 94,67 %, torej se je celuloza tega drevesa najbolj razgradila.

Vzrok za to so krajša in tanjša celulozna vlakna, kar smo potrdili tudi z mikroskopskimi

posnetki. Višja vsebnost glukoze je pomembna pri nadaljni fermentaciji sladkorjev v etanol.


32

7 Literatura

Vamashita Y., Sasaki C., Nakamura Y. Development of efficient system for ethanol [1]

production from paper sludge pretreated by ball milling and phosphoric acid.

Carbohydrate polymers, 79, 250-254, 2010.

Mihelač J. Anatomija s tehnologijo in sušenjem lesa. Škofja Loka: Poklicna lesna [2]

šola, 1975.

Gornjak I., Samec N. Ali je papirniški mulj strošek ali energent? Okolje, 80, 42-44, [3]

2013.

Seţun M. 2013. Moţnosti ponovne uporabe trdnih odpadkov iz papirne industrije. V: [4]

»Novi časi za tradicionalno papirno industrijo«. Zbornik povzetkov 17. Dneva

papirništva in 40. Mednarodnega letnega simpozija DITP. Bled 20.-21. november 2013.

Prebil Bašin P., Fister A. (ur.). Ljubljana. 31-31.

Gemos S., Zarafeta D., Kekos D., Kolisis F. Direct enzymatic acylation of cellulose [5]

pretreated in BMIMCl ionic liquid. Bioresource Technology, 102, 1378-1382, 2011.

Zhang J., Zhang B., Zhang J., Lin L., Liu S., Ouyang P. Effect of phosphoric acid [6]

pretreatment on enzymatic hydrolysis of microcrystalline cellulose. Biotechnology

Advances, 28, 613-619, 2010.

Ding Z. D., Chi Z., Gu W. X., Gu S. M., Liu J. H., Wang H. J. Theoretical and [7]

experimental investigation on dissolution and regeneration of cellulose in ionic liquid.

Carbohydrate Polymers, 89, 7-16, 2012.

Xu A., Zhang Y., Zhao Y., Wang J. Cellulose dissolution at ambient temperature: [8]

Role of preferential solvation of cations of ionic liquids by a cosolvent. Carbohydrate

Polymers, 92, 540-544, 2013.

Paperonline. Production, 2015. http://www.paperonline.org/paper-making/paper-[9]

production (dostop 2. 8. 2015).

Hierarchical Wood Structure, 2008. [10]

https://www.flickr.com/pHotos/fswoodlab/11437846663 (dostop 4. 7. 2015).

Pipa R. Anatomija in tehnologija lesa. Ljubljana: Lesarska zaloţba, 1997. [11]

Iglič B. Tehnologija pridobivanja vlaknin za izdelavo papirja: Pridobivanje [12]

lesovinskih vlaknin. Ljubljana: Tehnična zaloţba Slovenije, 1993.

Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. [13]

W. H. Freeman, 2005.

Novak G. Papir, karton, lepenka. 1. izdaja. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, [14]

Naravoslovnotehniška fakulteta, Oddelek za tekstilstvo, 1998.

Wikipedia, the free encyclopedia. Buffer solution, 2015. [15]

https://en.wikipedia.org/wiki/Buffer_solution (dostop 5. 7. 2015).

Henderson - Hasselbach-ova enačba. [16]

http://www.fkkt.um.si/sites/default/files/9_Ravnotezje_Dodatno%20gardivo.pdf

(dostop 5. 7. 2015).

Kuo C. H., Lee C. K. Enhancement of enzymatic saccharification of cellulose by [17]

dissolution pretreatments. Carbohydrate Polymers, 77, 41-46, 2009.

Shen F., Xiao W., Lin L., Yang G., Zhang Y., Deng S. Enzymatic saccharification [18]

coupling with polyester recovery from cotton-based waste textiles by phosphoric acid

pretreatment. Bioresource Technology, 130, 248-255, 2013.

http://www.paperonline.org/paper-making/paper-production

http://www.paperonline.org/paper-making/paper-production

https://www.flickr.com/photos/fswoodlab/11437846663

https://en.wikipedia.org/wiki/Buffer_solution


33

Abels C., Thimm K., wulfhorest H., Spiess A. C., Wessling M. Membrane-based [19]

recovery of glucose from enzymatic hydrolysis of ionic liquid pretreated cellulose.

Bioresource technology, 5, 1-26, 2013.

Sun Y., Cheng J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a [20]

review. Bioresource Technology, 83, 1-11, 2002.

Ogeda T. L., Silva I. B., Fidale L. C., El Seoud O. A., Petri D. F. S. Effect of [21]

cellulose physical characteristics, especially the water sorption value, on the efficiency

of its hydrolysis catalyzed by free of immobilized cellulase. Journal of Biotechnology,

157, 246-252, 2012.

Lobnik A., Skripta za vaje pri predmetu okoljska analitika. Maribor: Fakulteta za [22]

strojništvo, 2010.

Custombiotech. Glucose, 2011. [23]

http://custombiotech.roche.com/content/dam/internet/dia/custombiotech/custombiotech

_com/en_GB/pdf/Glucose_Test_Principle_05837804990_03.11.pdf (dostop

29.10.2015).

Kavkler K., Demšar A. Uporaba FTIR in ramanske spektroskopije pri kvalitativni [24]

analizi strukturnih sprememb celuloznih vlaken. Tekstilec, 55 (1), 32-44, 2012.

Infrared Spectroscopy. [25]

http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Vibrational_Spectrosco

py/Infrared_Spectroscopy (dostop 9.9.2015).

IR Spectroscopy Tutorial, 2011. [26]

http://orgchem.colorado.edu/Spectroscopy/irtutor/tutorial.html (dostop 9.9.2015).

Acetate buffers for amine coupling of proteins to Biacore sensor chip surfaces. [27]

http://www.fbs.leeds.ac.uk/facilities/biomolecular/documents/AcetatebuffersforSPRami

necoupling.pdf (dostop 4. 7. 2015).

Han L., Feng J., Zhang S., Ma Z., Wang Y., Zhang X. Alkali pretreated of wheat [28]

straw and its enzymatic hydrolysis. Brazilian Journal of Microbiology, 43, 53-61, 2012.

http://custombiotech.roche.com/content/dam/internet/dia/custombiotech/custombiotech_com/en_GB/pdf/Glucose_Test_Principle_05837804990_03.11.pdf

http://custombiotech.roche.com/content/dam/internet/dia/custombiotech/custombiotech_com/en_GB/pdf/Glucose_Test_Principle_05837804990_03.11.pdf

http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Vibrational_Spectroscopy/Infrared_Spectroscopy

http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Vibrational_Spectroscopy/Infrared_Spectroscopy

http://orgchem.colorado.edu/Spectroscopy/irtutor/tutorial.html


34

8 Življenjepis

OSEBNI PODATKI Urška Hajdinjak

Kruplivnik 88/c, 9264 Grad, Slovenija

+386 2 553 15 80 +386 31 610 707

[email protected]

Spol Ţenski | Datum rojstva 20. januarja 1991 | Drţavljanstvo slovensko

ŽELENO PODROČJE DELA

Kemik, kemijski tehnolog

DELOVNE IZKUŠNJE

01. marca 2013 – 30.

marca 2013

Praktično usposabljanje Pomurske mlekarne d.d

Industrijska ulica 10

9000 Murska Sobota

▪ delo v laboratoriju

IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE

september 2006 – julij

2010

oktober 2010 – oktober

2015

Gimnazijski maturatnt Gimnazija Murska Sobota

Šolsko naselje 12

9000 Murska Sobota

univ. dip. inž. kemijske tehnologije

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Smetanova ulica 17 2000 Maribor

KOMPETENCE

Materni jezik Slovenščina

Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE

Slušno razumevanje Bralno

razumevanje Govorno

sporazumevanje Govorno

sporočanje

angleščina B2 B2 B2 B2 B1

nemščina B2 B2 B1 B1 B1

Stopnja: A1/A2: Osnovni uporabnik - B1/B2: Samostojni uporabnik - C1/C2: Usposobljeni uporabnik

Skupni evropski jezikovni okvir

Komunikacijske kompetence

▪ komunikacijske in delavne veščine

▪ sposobnost dela v skupini

Računalniške kompetence

▪ dobro obvladovanje orodij Microsoft Office™ (Word, Excel, PowerPoint)

▪ hitro iskanje po svetovnem spletu

Vozniško dovoljenje ▪ B

Primerjalna študija predelave surove celuloze …Vsa uporabljena celulozna vlakna smo pred in po...

Documents

Transcript of Primerjalna študija predelave surove celuloze …Vsa uporabljena celulozna vlakna smo pred in po...