PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI,...

55
PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO BIOPROSPECTIVO DELCORAL BLANDO Pseudopterogorgia elisabethae DEL ARCHIPIELAGO DE SAN ANDRES Y PROVIDENCIA Carmenza Carmenza Duque Duque Taller de Biotecnología Marina, Santa Marta, 28 y 29 de Agosto de 2008

Transcript of PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI,...

Page 1: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO BIOPROSPECTIVO DELCORAL BLANDO Pseudopterogorgia

elisabethae DEL ARCHIPIELAGO DE SAN ANDRES Y PROVIDENCIA

CarmenzaCarmenza DuqueDuque

Taller de Biotecnología Marina, Santa Marta, 28 y 29 de Agosto de 2008

Page 2: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Reino : Reino : Reino : Reino : Reino : Reino : Reino : Reino : AnimalAnimalAnimalAnimalAnimalAnimalAnimalAnimal

Phylum : Phylum : Phylum : Phylum : Phylum : Phylum : Phylum : Phylum : Cnidaria Cnidaria Cnidaria Cnidaria Cnidaria Cnidaria Cnidaria Cnidaria (COELENTERATA)(COELENTERATA)(COELENTERATA)(COELENTERATA)(COELENTERATA)(COELENTERATA)(COELENTERATA)(COELENTERATA)

Clase : Clase : Clase : Clase : Clase : Clase : Clase : Clase : OctocoralliaOctocoralliaOctocoralliaOctocoralliaOctocoralliaOctocoralliaOctocoralliaOctocorallia

Orden : Orden : Orden : Orden : Orden : Orden : Orden : Orden : GorgonaceaGorgonaceaGorgonaceaGorgonaceaGorgonaceaGorgonaceaGorgonaceaGorgonacea

Familia: Familia: Familia: Familia: Familia: Familia: Familia: Familia: GorgonidaeGorgonidaeGorgonidaeGorgonidaeGorgonidaeGorgonidaeGorgonidaeGorgonidae

Pseudopterogorgia elisabethaePseudopterogorgia elisabethaePseudopterogorgia elisabethaePseudopterogorgia elisabethaePseudopterogorgia elisabethaePseudopterogorgia elisabethaePseudopterogorgia elisabethaePseudopterogorgia elisabethae

Pseudopterogorgia elisabethaePseudopterogorgia elisabethae(Bayer 1961)

Vive en ambientes arrecifales de aguas claras y protegidas a un rango de temperatura de 26-28°C y a una profundidad de 20 a 70 m

Organísmos sésiles (se fijan al sustrato), muy ramificados y de estructura relativamente frágil

Simbiosis con zooxantellas

Crece en aguas del mar Caribe e Indopacífico

Coll, J. 1992199219921992. Chem. Rev. 92, 613-631

Page 3: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

PseudopterosinasPseudopterosinas (A(A--K)K)Look et al., 1986 J. Org. Chem., 51: 5140-5145.

Look et al., 1986 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 6238-6240.Roussis et al., 1990 J. Org. Chem., 55: 4916-4922.

Ata et al.,

Pseudopterosinas E-L, M, N, O: Variación en los tipos (fucosa, arabinosa y xilosa) y ubicación de los azúcares

(C-9 y C-10) y variación en la estereoquímica de los centros quirales de la aglicona

OR1

O OHO

OHOH

CH3

H

H3C

pseudopterosina A R1 R2 R3 R4 = Hpseudopterosina B R1 R3 R4 = H R2 = Acpseudopterosina C R1 R2 R4 = H R3 = Acpseudopterosina D R1 R2 R3 = H R4 = Ac

H3C

CH3

CH3

Bahamas PsA-PsD

Islas Bermudas PsE-PsJ

Isla Gran Abaco-Bahamas PsK-PsL

Cayos de la Florida PsM-PsO

Page 4: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Look, S.A.; Fenical, W. 1987198719871987. Tetrahedron 43, 3363-3370; Ata, A. et al., 2003200320032003. Tetrahedron 59, 4215-4222; Rodríguez, I. et al., 2004200420042004. J.

Nat. Prod. 67, 1672-1680; Correa, H. 2005200520052005. Trabajo de grado en Química, Universidad Nacional de Colombia. Bogotá D.C.

P. kallos Florida Florida

Providencia

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

OR1O

R2OOR3

CH3

CH3

H3C

H3C

H3C CH3

O

OH

H

OR1O

R2O OR3

O

OR1

OR2

R3OCH3

H3C

CH3

H3C CH3

OH

O

H

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

HO

OH

OH

seco-pseudopterosina E R2, R3 = H R1 = Acseco-pseudopterosina F R1, R3 = H R2 = Acseco-pseudopterosina G R1, R2 = H R3 = Ac

seco-pseudopterosina H R1, R2 = H R3 = Acseco-pseudopterosina I R2, R3 = H R1 = Ac

seco-pseudopterosina A R1, R2, R3 = Hseco-pseudopterosina B R2, R3 = H R1 = Acseco-pseudopterosina C R1, R3 = H R2 = Acseco-pseudopterosina D R1, R2 = H R3 = Ac

seco-pseudopterosina J

Page 5: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Actividad antiinflamatoriaActividad antiinflamatoria

5.5 % peso seco animal

Muy activas en detener procesos de inflamación (degranulación)

Edema Oreja ratón ED50Ps A 8 µg/orejaPs E 38 µg/orejaIndomethacin (Merck) 80 µg/oreja

Toxicidad (-)Mutagenicidad (-)

pseudopterosina A

pseudopterosina E

OR1

O OHO

OHOH

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3

O

O

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3OH

OH

OH

Page 6: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Ensayos antiinflamatorios in vivo evaluado en edema

tópico de oreja de ratón

PsA 8 µg/oreja

PsE 38 µg/oreja

Administración Tópica

PsN 88PsO 69seco-PsE 88seco-PsG 75

% de Inhibición *

* 25 µg/oreja

Look, S. A. et al.,. 1986a1986a1986a1986a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 6238-6240; Mayer, A. M. S. et al.,. 1998199819981998. Life Sciences 62, PL 401-407. Ata, A. et

al., 2003200320032003. Tetrahedron 59, 4215-4222; Potts, B. C.; Faulkner, D. J. 1992199219921992. J. Nat. Prod. 55, 1707-1717;

PsAInhibió la enzima PLA2, y la producción de prostaglandina E2 y leucotrieno (COX y LPO)

PsEInhibió la síntesis de leucotrienos, lo (LPO). Además se encontró que PsE, inhibe la degranulación de neutrofilos PMNn

Ensayos de Actividad Antiinflamatoria in vitro

Page 7: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Actividad AnalgActividad AnalgActividad AnalgActividad Analgéééésica sica sica sica

Ensayos in vivo

Se evaluó la actividad analgésica en ratones inyectados a nivel intraperitional con un agente irritante fenil quinona

PsA 4 mg/KgPsE 14 mg/KgIndometacina 40 mg/Kg

Imita a la morfina

Ensayos toxicidad in vivo

PsA 50 mg/KgPsE 300 mg/Kg Menor toxicidad y mayor

actividad antiinflamatoria

Look, S. A. et al.,. 1986a1986a1986a1986a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 6238-6240; Potts, B. C.; Faulkner, D. J. 1992199219921992. J. Nat. Prod. 55, 1707-1717;

Mayer, A. M. S. et al.,. 1998199819981998. Life Sciences 62, PL 401-407.

Page 8: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

El extracto de semipurificado de P. elisabethae (rico en Ps y seco-Ps) es usado como un aditivo para prevenir la irritación causada por la exposición al sol en cosméticos para el rostro de la firma Estée Lauder con un producto llamado Resilience®

Importancia comercialImportancia comercialImportancia comercialImportancia comercial

This product works! This product is wonderful! This product is worth the

price! This product is highly recommended from me to you.

RecommendedYes

Amount Paid (US$): 80 - 100Skin Compatibility: Improved my skin

Fragrance: Pleasing scent

Overall rating:

Estée Lauder Resilience Creme

Faulkner, D. J. 2000a2000a2000a2000a. Antonie van Leeuwenhoek 77, 135–

145; Faulkner, D. J. 2000b2000b2000b2000b. Nat. Prod. Rep. 17, 1-6; Haefner,

B. 2003200320032003. DDT 8, 536-544; Kijoa, A.; Sawanwong, P. 2004200420042004.

Mar. Drugs 2, 72-82.

Page 9: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

DDT Drugs Discovery Today

Actividad Antiinflamatoria in vivo e in vitro

Page 10: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION QUE NOS PROPUSIMOS ADELANTAR

Determinar la existencia (identificación y cuantificación) de pseudopterosinas en los extractos polares del gorgonáceo

Pseudopterogorgia elisabethae de las islas de San Andrés y Providencia

Estudio de la biología de Pseudopterogorgia elisabethae (distribución y abundancia de las poblaciones, su hábitat, y otros factores)

Estudio del potencial de P.elisabethae como fuente de sustancias antiinflamatorias

Determinar la viabilidad de Pseudopterogorgia elisabethae como recurso que permita su eventual explotación en el área de San

Andrés y Providencia.

Page 11: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica
Page 12: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS

Porción distal colonias

Realizado por Mónica Puyana y Alejandro Paz

Page 13: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

RECOLECCIÓN DE MUESTRASEN LA ISLA DE SAN ANDRÉS

818-2319

182017

113316

102716

102016

1127-3015

NProfundidad (m)

Localidad

MAPAS: Andia Chaves y Alejandro Paz

San Andrés

Page 14: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

814-2014

922-2513

64012

1025-2711

1017-279

1015-178

1018-237

10176

9235

10204

10173

8232

12132

6231

9131

NProfundidad (m)

Localidad

RECOLECCIÓN DE MUESTRASEN LA ISLA DE PROVIDENCIA

MAPAS: Andia Chaves y Alejandro Paz

Page 15: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

TEJIDO SECO

EXTRACTOCRUDO

DETECCIÓN-Ps

DCM/MeOH1:1

CLAE-EM

CLAE

CCD

CCDP

IDENTIFICACIÓN-Ps

CC

POOL EXTRACTOS

CLAEp

CUANTIFICACIÓN-Ps

CLAE-EM

AISLAMIENTO-PS

UV

RMN1H

RMN13C

CLAE-EM

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

CLAE

METODOLOGIA PARA EL ANÁLISIS

Eval. Actividadantiinflamatoria

Page 16: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Primeros resultados

Quimiotipo 1

Quimiotipo 2

Separación y obtención de cada uno de los compuestos por CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC).

Identificación UV, EM (IE, APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica relativa y absoluta tanto de la aglicona como del azúcar.

Page 17: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

ESPECTRO UV COMPUESTO 3

Columna: Dynamax RP-18 (250x5 mm d.i, 5µm), Gradiente: H2O/MeCN 70→100% MeCN, 1 mL/min

λλλλ (nm) εεεε 209 34085 232 6969 284 1173

Page 18: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

ESPECTRO DE MASAS EN MODO APCI COMPUESTO 3

C25H36O6PM:432IDH: 8

O

OH

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3

OH

OHOH

OH

Page 19: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

O

OH

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3

OH

OHOH

OH

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

1'2'

3'

4'5'

RMN 1H COMPUESTO 3, 400 MHz, CDCL3, δ relativo a TMS

Page 20: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

RMN 13C COMPUESTO 3, 100 MHz, CDCL3, δ relativo a TMS

O

OH

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3

OH

OHOH

OH

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

1'2'

3'

4'5'

Page 21: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

C-9 C-10

C-9C-10

C-11C-8

C-9

C-10 C-11

C-8

C No.

Azúcar unido en C-9 a

(δδδδ ppm) Azúcar en 5

(δδδδ ppm) Azúcar unido en C-10 a

(δδδδ ppm) Azúcar en 3

(δδδδ ppm) 8 132 – 134 132.5 126 – 128 128.0 9 142 – 143 142.7 144 – 146 145.0 10 145 – 146 145.2 142 –143 143.1 11 121 – 122 121.8 126 – 127 126.7

Roussis et al., 1990 J. Org. Chem., 55: 4916-4922.

Page 22: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

O

OH

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3

OH

OHOH

OH

Compuesto 3

Compuesto 4

OH

O

CH3O

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3

OH

OH

OH

H

ESTEREOQUÍMICA C-1Corey et al., 2000. Org. Lett., 2: 2389-2392.

Page 23: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

HMBC para compuesto 3

H

OH

O

H

O

HOOH

CH3H3C

CH3

H3C

CH3

O

COCH3HH

Page 24: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Estructura planar del compuesto 3

O

OH

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3

OH

OHOH

OH

Page 25: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Determinación de la estereoquímica de la pseudopterosina (compuesto 3)

O

OH

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3

OH

OHOH

OH

CH3

OBn

OH

CH3

H

CH3

CH3CH3

Azúcar

+

1) K2CO3, BnBr

2) HCl/MEOH

(arabinosa)

Los datos de RMN de la aglicona benzoilada preparada desde el compuesto 3, fueron iguales a una aglicona sintetiza da reportada en literatura (Org. Lett. 2000, 2389-2392) cuya estere oquímica corresponde a (1S, 3S, 4R, 7S). Adicionalmente el v alor de αααα de nuestra aglicona benzoilada, coincidió con el reporta do en la literatura para este compuesto sintético.

Page 26: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Estereoquímica de la aglicona

CH3

OH

O-arabinosa

CH3

CH3CH3

HCH3

1S, 3S, 4R, 7S

Page 27: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Determinación de la configuración de arabinosa (D o L) en el compuesto 3

HS

H3N+

H

COOCH3

Cl-

S

N

H

H

COOCH3OH

OHOH

OH

H

O

HHO

OH

O

OH

OH

H

OH

OH

OH

OH

L-arabinosa D-arabinosa

?

Compuesto 3

PsT Ps (aglicona) + arabinosaH+

Arabinosa (?) + L-cisteina metil ester

Luego conversión a TMS y CG

CGAR quiral: Formación de diastereoisómeros

O

OH

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3

OH

OHOH

OH

Page 28: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Determinación de la configuración del azúcar de la pseudopterosina

L-arabinosa

D-arabinosa

EstándaresAzúcar proveniente de la pseudopterosina

D-arabinosa

Análisis por CGAR

Page 29: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Compuesto 3Pseudopterosina T

O

OH

CH3

H

H3C

H3C

CH3

CH3

OH

OH

OH

OH

Page 30: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Puyana, M. et al., 2004. J. Chem. Ecol. 30, 1183-1201; Duque, C. et al., 2004. Tetrahedron 60, 10627-10635;

…………PRIMEROS RESULTADOSPRIMEROS RESULTADOSPRIMEROS RESULTADOSPRIMEROS RESULTADOS

Quimiotipo 1

Quimiotipo 2

Perfil cromatográfico (CLAE-EM) de la fracción polar del extracto crudo de P. elisabethae de especímenes recolectados en la Isla de Providencia y de San Andrés. Columna Thermo Hyper-Keystone

C-18, con un sistema isocrático ACN/H2O (7:3), 0.2 mL/min.

Amf A y B

secoPsK

elisabetatrienol

amfilectadiona

Page 31: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

OH

O

H O

OH

OHOH

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

OH

H

O

O

OH

OHOH

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

OR1

R3OOR2

CH3

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

OR1

R3OOR2

pseudopterosina G pseudopterosina K pseudopterosina P R1, R2, R3 = Hpseudopterosina Q R2, R3 = H R1 = Acpseudopterosina S R1, R2 = H R3 = Ac

pseudopterosina T R 1, R2, R3 = Hpseudopterosina U R 2, R3 = H R1 = Ac 3´-O-acetil-Pseudopterosina U R 3 = H R1, R2 = Ac

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

HO

OH

OH

seco-pseudopterosina J

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

HO

OH

OH

CH3

seco-pseudopterosina K

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

HO

OH

OH

CH3

H3C

CH3

O

OH

H

O

HO

OH

OHH

HCH3

H3C

amfilectosina A amfilectosina B

Page 32: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

OH

H

OAc OH

OAc

H

H

OH

O

O

H3- PsT 6- PsP 9- PsU 12-PsR

4- PsK 7- seco-Ps 10- PsV 13-PsS

5- PsG 8- seco-Ps 11-PsQ

Composición del quimiotipo 2 (isla de San Andrés)

Page 33: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

OH

O

H O

OH

HO

OH

CH3

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

OH

H

O

O

OH

HO

OH

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

OH

HOOH

CH3

CH3

seco-PsJ

PsG PsK PsP

seco-PsK

amfilectosina A amfilectosina B

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

OR1

R3OOR2

CH3

CH3

PsQ R2, R3 = H R1 = AcPsS R1, R2 = H R3 = Ac

PsU

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

OAc

HOOH

CH3

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

OH

HO

OH

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

OH

HOOH

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

OH

HO

OH

CH3

H3C

CH3

H3C

CH3

O

OH

H

O

OH

HO

OH

H

H

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

O

OH

H

O

OH

HO

OH

PsT

F-1

F-2

ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA

Page 34: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

CH3

H3C

CH3

H3C CH3

OR2

OR1

H

10-acetoxi-9-hidroxi-amfilecta-8,10,12,14-tetraene R1 = H R2 = Ac9-acetoxi-10-hidroxi-amfilecta-8,10,12,14-tetraene R2 = H R1 = Ac

F-3

Page 35: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Propiedades antiinflamatorias de los extractos crudos y fracciones usando ensayos in vivo (edema de oreja de ratón)

Resultados de bajos niveles de inhibición para los extractos crudos, pero niveles comparables a los obtenidos con la droga comercial (antiinflamatoria) indometacina, para las fracciones

Page 36: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Usando los exudados del edema de oreja de ratón se midióla liberación de MPO al sitio de la inflamación

Se encontró una marcada inhibición de la actividad de MPO por todos los extractos y fracciones

Page 37: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Ensayo in vitro de inhibición de MPO liberado por neutrófilos humanos

F-3, PsQ, PsS, PsT, PsU exhibieron niveles altos de inhibición comparados con dexametasona y niveles similares de actividad cuando se comparan con indometacina

Page 38: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Inhibición de la liberación in vitro de NO (usando como fuente células J-774)

Las PsP y PsT mostraron la mayor potencia y las PsG, PsK, PsQ, PsS, PsU y seco-PsK mostraron baja actividad

Page 39: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Las PsG, PsP y seco-PsK no mostraron actividad

F-3 y las PsQ, PsS, PsT y PsU mostraron actividad moderada pero suficiente para confirmar que estos compuestos inhiben la liberación de NO por las células macrófagas debido a la acción de captación

Ensayos de captación de NO in vitro

Page 40: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

• En Conclusión, los resultados aquí mostrados nospermiten afirmar que los compuestos aislados e identificados como pseudopterosinas P-V, seco-PsK y diterpenos relacionados, son moléculas promisorias con actividad antiinflamatoria interesante.

• El perfil encontrado demuestra que Pseudopterogorgiaelisabethae, es un organismo marino de gran valor comofuente de compuestos con actividad antiinflamatoria.

Narvaez, 2003. Trabajo de grado, UNAL de ColombiaPuyana et al., 2004. J. Chem. Ecol. 30, 1183-1201.Duque et al. 2004. Tetrahedron, 60, 10627-10635.Arias, 2005. Trabajo de grado, UNAL de ColombiaDuque et al. 2006. Tetrahedron 62, 4205-4213.Correa, 2006. Trabajo de grado, UNAL de ColombiaCorrea, 2007. Tesis de Maestría, UNAL de Colombia.Correa et al., 2008, J. Inflamm. Submitted to.

Page 41: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Concentración de pseudopterosinas totales (promedio + error estándar) de muestras de P. elisabethae recolectadas en las islas de San Andrés y Providencia

0 5 10 15 20 25

1314

1-131-232-132-23

3469578111215

16-2016-2716-33

1719

Site

% dry mass

Providencia: localidades 1-14

San Andrés:Localidades15-20

Puyana, Narváez, Osorno y Duque. 2004. Journal of Chemical Ecology, 30(6): 1183-1201.

Page 42: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Balance parcial

• Especímenes de P. elisabethae con pseudopterosinasdiferentes al que actualmente se comercializa, pero con actividad biológica comparable. Algunas de ellas tienen un valor de actividad antiinflamatoria muy alto.

• Especímenes de P. elisabethae en la isla de Providencia con un contenido muy alto de psedopterosinas, aprox. unas 3 veces mayor al que actualmente se comercializa.

• Parece atractiva, la explotación sustentable de esta especie.

Page 43: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

• Primero que todo hay que ocuparse de cómo obtener cantidades significativas de estos compuestos aislados.

• Este es el reto que enfrentamos todos los que hacemos química de productos naturales marinos y que queremos continuar trabajando en su desarrollo para obtener algún producto que pueda ser comercializado. Esta etapa requiere de grandes cantidades del compuesto para realizar los desarrollos necesarios para lograr su conversión en drogas, o en agroquímico,…etc y luego pasando estas etapas, se requiere de mayores cantidades de compuesto para suplir la demanda que origine el mercado.

Por ejemplo para el tratamiento de cáncer se estima que se necesitarían 1- 5 Kg por año de compuesto, lo cual equivale en promedio a unas 3.000-16.000 toneladas métricas de biomasa de esponja.

Page 44: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Estimación de la distribución y abundancia de las poblaciones naturales y su relación con parámetros ambientales

Establecer de forma preliminar si existen condiciones ambientales, biológicas y/o ecológicas que favorezcan la producción de las pseudopterosinas: localidad, patrones de circulación, profundidad, temperatura, luz, depredación etc.

Determinar la viabilidad de Pseudopterogorgia elisabethae como recurso que permita su eventual cultivo en el área

de San Andrés y Providencia.

Morfología de la especie

Puyana et al., estudios aún sin publicar

Page 45: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Densidad poblacional de P. elisabethae

0.19 ± 0.030.21 ± 0.03San Andrés

0.40 ± 0.060.45 ± 0.03Providencia

21-35 m

colonias/m2

9-20 m

colonias/m2

Page 46: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Considerando el aislamiento y el reducidonúmero de parches de P. elisabethae en la región de las islas de San Andrés y Providencia comparado con lo que sucedeen otras áreas del Caribe, nosotros no creemos que estas poblaciones puedanaguantar una recolección sustentable quepueda proveer la demanda de la industriafarmacéutica y cosmética con extractosorgánicos ricos en pseudopterosinas.

Page 47: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Obtención de los compuestos bioactivosdirectamente de la fuente natural ?

• Densidades poblacionales pobres

CONCLUSION: Hay que desarrollar otros métodos para la producción de las pseudopterosinas y seco-pseudopterosinas. Poblaciones de P. elisabethae de

Providencia

Page 48: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Suministro de pseudopterosinas y seco-pseudopterosinas

• Uso de la fuente natural en forma controlada y sustentable

• Maricultura (cultivo del organismo en su medio natural)• Acuacultura (cultivo del organismo en condiciones

artificiales)• Hemisíntesis química• Síntesis química• Cultivos celulares o agregados celulares• Procedimientos biotecnológicos (por ej. cultivo del

simbionte, cuando éste sea el responsable de la producción del compuesto activo)

• Producción transgénica (Intervención genética)

Page 49: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Cultivo del simbionte

• Cuando se mire en la dirección del simbionte como posible productor del compuesto bioactivose debe tener en cuenta lo siguiente:

– Establecer que realmente el simbionte sea quien estáproduciendo el compuesto y no que éste proceda de la dieta del macroorganismo.

– Proceder al cultivo del simbionte

Page 50: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Producción de pseudopterosinas� Se comprobó primero que P. elisabethae era capaz de hacer biosíntesis de

pseudopterosinasOrg. Lett. 1, 2173-2175 (1999)

� Del gorgónido P. elisabethae, se aislaron las células del simbionte (el dinoglagelado Symbiodinium sp)Experimentos de aislamiento e identificación permitieron comprobar que el simbionte tenía apreciables cantidades de pseudopterosinas endógenas.Experimentos del cultivo del simbionte a escala de laboratorio

Células de Symbiodinium sp

� Bacterias de P. elisabethaeo bacterias del Symbiodinium sp

� Cultivo de bacterias a gran escala ?� Ingeniería genética ?

Producen pseudopterosinasluz

24-48 h

Chemistry & Biology, 10, 1051-1056 (2003)

Russell Kerr, 2008, Comunicación personal

Producen pseudopterosinas

Page 51: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Suministro (supply)

• Uso de la fuente natural en forma controlada y sustentable

• Maricultura (cultivo del organismo en su medio natural)• Acuacultura (cultivo del organismo en condiciones

artificiales)• Hemisíntesis química• Síntesis química• Cultivos celulares o agregados celulares• Procedimientos biotecnológicos (por ej. cultivo del

simbionte, cuando éste sea el responsable de la producción del compuesto activo)

• Producción transgénica (Ingeniería genética)

Page 52: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Conclusiones

• De los resultados de los estudios anteriores puede concluirse claramente que la biodiversidad en fauna y flora marina es una fuente de riqueza inexplotada. Hacia el futuro, Colombia debe poner especial énfasis en el desarrollo de las aplicaciones tecnológicas que de estos estudios se derivan.

• El ambiente marino con su inmensa diversidad química, tiene un enorme potencial para proveer compuestos químicos que sirvan de punto de partida para el desarrollo de productos de importancia comercial.

• Hay un gran futuro en esta línea

Page 53: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Agradecimientos• Coinvestigadores: Leonardo Castellanos, Mónica

Puyana, Oscar Osorno, Catalina Arévalo, Freddy Ramos, Sven Zea, Luis Fernando Ospina.

• Estudiantes de posgrado: Hebelín Correa y EdissonTello, Alba Lucía Valenzuela y Jennyfer Mora.

• Estudiantes de pregrado: Ginna Narvaez y Andrea Arias.

• Financiación: UNAL de Colombia, Colciencias y Fundación para la Ciencia y la Tecnología del Banco de La República.

También gracias a todos Uds. por su atención

Page 54: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica
Page 55: PRIMERAS ETAPAS EN EL ESTUDIO … · CC, CCD preparativa y finalmente por CLAE (HPLC). ... APCI, baja y alta resolución), RMN mono y bidimensional, análisis de la estereoquímica

Financiación: DIBColcienciasFondo para la promoción de la Ciencia y la Tecnologíadel Banco de la República

Gracias a todos por su atención

Taller de Biotecnología Marina, Santa Marta, Agosto 28 y 29 de 2008