Analýza proteinSDS PAGE elektroforézou

Molekulárn biologickádiagnostika

n Diagnostika na úrovni DNA, RNA aprotein

n Analýza genomu, transkriptomu,proteomu, p íp. metabolomu

n Analýza kvalitativní i kvantitativní

Nejpoužívan jší techniky - proteiny

n Dvoudimenzionální ELFOn Rentgenová krystalografien NMRn Hmotnostní spektroskopien Chromatografie (HPLC)n ELISA

Metody využívané sou asnouMetody využívané sou asnou proteomikouproteomikoupro studium proteinpro studium protein

1. Dvoudimenzionální elektroforéza

Nejd íve je vzorek protein rozd len izoelektrickou fokusací zleva dopravaa pak elektroforézou podle své hmotnosti shora dol .

2. Rentgenová krystalografie

Rentgenové zá ení, stejn jako sv tlo, je druh elektromagnetického zá ení o velmi malé vlnovédélce. Jestliže zam íme svazek paralelních rentgenových paprsk na dob e vyvinutý krystal istéhoproteinu, n které paprsky budou rozptýleny ur itým zp sobem atomy v krystalu a projeví sejakour itý obrazec difrak ních skvrn na vhodném detektoru. Poloha a intenzita skvrn v obrazciobsahuje informaci o poloze atom v krystalu proteinu, ze kterého obrazec vznikl.

3. NMR - spektroskopie

Roztok proteinu se umístí do silného magnetického pole, kde je vystaven pulz m rádiové frekvence.Signály, v tomto p ípad z atomových jader vodíku v r zných aminokyselinách lze identifikovat aur it tak vzdálenosti mezi r znými ástmi proteinové molekuly.V ásti (A) je nazna eno dvourozm rné NMR-spektrum odvozené z karboxylového konce enzymucelulázy . Skvrny p edstavují interakce mezi sousedními atomy H. Výsledná struktura odpovídajícírozmíst ní skvrn je v ásti (B).

1 5 5 0 1 5 5 5 1 5 6 0 1 5 6 5 1 5 7 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 5 5 7 .7

1 5 5 8 .6

1 5 5 9 .61 5 6 0 .6

1 5 6 3 .8

1 5 6 2 .6

1 5 6 1 .6

Inte

nsity

[%]

M a s s /C h a rg e

Hmotnostní spektroskopie je fyzikáln -chemická metoda pro ur ování hmotnosti molekul a jejichástí. Hmotností spektrometr je iontov optické za ízení, které ze sm si molekul a iont separujenabité ástice podle jejich efektivní hmotnosti m/z (m je hmotnost, z je náboj) a umož uje je

stanovit. Dále poskytuje údaje o relativním zastoupení iont stejné hmotnosti v celkovém množstvíiont ve sm si. Záznam molekulárních a fragmentových iont je charakteristický pro danou látku adává cenné informace o její struktu e a na jeho základ lze v tšinou strukturu látky odvodit nebopotvrdit. Hmotností spektrometrie je metoda citlivá a umož uje analyzovat látky v množství kolem

10 9 g.

4. Hmotnostní spektroskopie

SDS-PAGE(= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel

electrophoresis)

-metoda pro separaci protein dle jejich velikosti

Pro používat akrylamidový gel kseparaci protein ?

n Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix

n Ideální pro separaci protein

n Menší velikost pór než u agarosy

n Proteiny jsou menší než

intaktní chromoz. DNA

Gel je vytvo en polymerací aktylamidu a N´,N´-methylenbisakrylamidu zahájenou volnýmí radikály vzniklými

i rozkladu persíranu amonného.

Jednotlivé kroky experimentu

*P íprava polyakrylamidových gel* íprava vzork pro SDS-PAGE*Pova ení vzork p i 95°C po dobu 4 min.*Aplikace vzork na gel*Vlastní elektroforesa probíhá p i konstantnímnap tí 200 V po 30-40 min*Barvení gelu pomocí Coomassie Blue*Odbarvení gelu MetOH/HOAc

Diskontinuální elektroforéza vPAGE

n 2 r zné gely a n kolik odlišných pufr o r zném pHn Porozitu lze volit podle o ekávaného spektra látekn licí gel (s pufrem o hodnot pH 8,8) se p ekrývá cca 1 cm vrstvou tzv.

startovacího (zaost ovacího) gelu s velkými póry (pufr o hodnot pH 6,8)n Tris-glycinový elektrodový pufr (pH 8,3-8,6) – po zapnutí proudu ionty tohoto

pufru putují z nádoby do startovacího gelu a p ed nimi postupují ionty z tohotogelu

n Ionty s elektrod. pufru se setkávají s pH, které je daleko nižší než jejich pK avytvá ejí proto nenabité (u glycinu obojetné) formy – nepohyblivé v el. poli

n Tím je zp soben lokální nedostatek nabitých ástic, vzniká velký odpor – musíbýt kompenzován (místním zvýšením intenzity el. pole). Anionty se pohybujírychleji, dokud nevstoupí do d licího gelu – rychlost je zpomalena p ítomnostívelkého množství iont v pufru⇒ ionty makromolekul vstupují do d licího gelu v podob velmi úzkých, na

sebe navrstvených proužk se azených dle své pohyblivostin Ve vyšším pH d licího gelu nabudou makromolekuly znovu svou pln nabitou

formu a dále probíhá normální elektroforetické d lení (získaná hustota zón p ivstupu makromolekul do d lícího gelu zvyšuje stupe rozlišení jednotlivýchmolekul).

Praktické zhotovení gelu

n ipravíme ELFO sklan Složíme elektroforetické kom rky pro nalití geln ipravíme základní roztok pro d licí gel, p idáme k n mu TEMED a

APS pro zahájení polymeracen Naneseme gel do elektroforetické kom rky, zarovnáme hladinu

redestilovanou vodou a necháme tuhnout (min. 45 min).

n ipravíme roztok pro zaost ovací gel, p idáme k n mu TEMED aAPS

n Nanášíme jej do elfo kom rky na povrch d licího gelu a vsadímeeben pro vytvo ení jamek a necháme jej tuhnout (min. 45 min)

n Odstraníme h eben, uvolníme elfo kom rky s gelem

n Do elektroforetické nádoby nalejeme elfo pufrn Stojan s elfo kom rkami s p ipravenými gely vložíme do elfo nádoby,

doplníme elektroforetický pufrn Naneseme vzorky (p ed nanášením se musí pova it se vzorkovým

pufrem p i 90-100°C po dobu 5 min)

n Doplníme elfo pufr a zapneme zdroj (80V po 0,5-1hod, 120 V po 1-1,5hod)

n Ukon ení elektroforézy po dob hnutí elfo barviva na konec d licíhogelu

n Rozd láme elfo kom rky, vyndáme gely a:- barvíme- p eneseme proteiny na nitrocelulózovou membránu a blotujeme…

Akrylamidový gel

akrylamid

N,N‘ - methylenbisakrylamid

Akrylamidový gel

Katalyzátor TEMEDN,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiaminCAS 110-18-9

Zdroj volných radikál APS

amonium persulfát (NH4)2S2O8

(peroxodisíran amonný)

CAS 7727-54-0

Akrylamidový gel

SDS-Polyacrylamide GelElectrophoresis (SDS-PAGE)

•SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) aniontovýdetergent

–solubilizuje a denaturuje proteiny

–dodává protein m negativní náboj

tšina protein váže SDS ve stejnémpom ru, asi 1,4 g SDS/g proteinu

•Zvýšená teplota denaturuje proteiny

O

S

O

O

O

-

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH3

SDS

-proteiny jsou tepeln denaturovány vevzorkovém pufru obsahujícím dodecylsulfát sodný (SDS)- zachována je takpouze jejich primární struktura-denaturované proteiny mají vláknitýtvar a stejný záporný náboj danývazbou SDS – migrace tedy závisí pouzena jejich molekulové hmotnosti

Pohyb takto upravených protein velektrickém poli:-proteiny mající negativní náboj se pohybujísm rem ke kladn nabité elektrod

SDS-PAGE standardy

Protein Kalibrované MW v Tris-HCl gelun Myosin 201,179n β-galactosidáza 120,284n Bovinní sérový albumin 100,236n Ovalbumin 55,925n Anhydráza 38,289n Soyben trypsin inhibitor 29,678n Lysozym 20,669n Aprotinin 6,969

Co obsahuje vzorkový pufr proSDS-PAGE?

*Tris pufr utvá í vhodné pH*SDS (dodecyl sulfát sodný) detergentposkytující protein m negativní náboj*Glycerol vzhledem ke své vyššíspecifické hmotnosti zajiš uje klesnutívzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení*“Bromophenol Blue“ barvivoumož ující sledovat pr h elektroforézy(pohyb ela v gelu)

Separace protein v akrylamidovém gelu

íprava gelu

Denaturované vzorky jsounaneseny na gel

Podmínky proelektroforézu:

•15 min, 50 V

•15 min, 100 V

•1 – 1,5 hod 150 V

K vizualizaci protein dochází v roztokuCoomasie blue.

Jak funguje SDS-PAGE?

•Negativn nabité proteinyse pohybují ke kladnéelektrod

•Menší proteiny se pohybujírychleji

•Proteiny se rozd lujípodle velikosti(molekulovéhmotnosti)

-

+

s-s

SDS, zah átí

Proteiny sSDS

Molekulová hmotnost protein

n velikost m ena v daltonech (Da) i kilodaltonech (kDa)

n Dalton = jednotka atomové hmotnosti

= p ibližn se rovná hmotnosti atomu

vodíku (1,66 x 10 -24 g)

= definován také jako 1/16 hmotnosti atomu kyslíku

n Pr rná aminokyselina = 110 Da

n Pr rný nukleotidový pár = 649 Da

Blotting protein a nukleových kyselinPro další charakterizaci nebo p i mikropreparaci je nutnéextrahovat proteiny i nukleové kyseliny z gelu, kteý jenevhodný pro manipulaci i pro provád ní detek níchchemických reakcí. Je p itom nutné zabránit smíseníseparovaných biomakromolekul.

Nej ast ji se používají techniky tzv. blottingu (angl. blot =skvrna, ka ka, esky p enos) . P i blottingu se pásyseparované elektroforézou p enášejí na ur itou membránu,kde jsou uchyceny adsorpcí nebo kovalentní vazbou. Povazb na membránu je pak možné provád t analýzu

znými zp soby.

DNA analýza (Southern blotting, Southern 1975)RNA analýza (Northern blotting, Alwine et al., 1977)PROT analýza (Western blotting, Towbin et al., 1979)

Southern blottingDNA je z gelu p enesena na nitrocelulózovou nebonylonovou membránu. ítomnost ur itéjedno et zcové DNA je pak potvrzena hybridizací -vazbou komplementárního DNA et zce (sonda iproba), který je zna en radioaktivn , biotinylací nebovazbou antigenu pro imunodetekci. Použití nap . pro

azení fragment restrik ního št pení genomové DNAjednotlivým gen m.

Northern blottingSeparovaná RNA je p enesena na membránu. Specifickádetekce se d je hybridizací s komplementární DNAsondou, která je zna ena.

Ob metody mají velký význam pro molekulární biologii,ale v sou asné dob jsou ast ji zastupovány PCRtechnikami.

Western blottingProteiny jsou separovány SDS-PAGE a následn p enesenyna nitrocelulózovou nebo polyvinylidendifluoridovou(PVDF) membránu. Barvení na membrán se provádípomocí Ponceau S, Fast Green nebo Amido erni10 B.

Specifická detekce protein se provádí použitímprimárních protilátek; vzniklý imunokomplex se visualizujevazbou zna ené sekundární protilátky nebo zna enéhoproteinu A i G (zna ení nej ast ji vazbou enzymu - nap .alkalické fosfatasy a peroxidasy, ale i koloidním zlatem,radioaktivn , luminiscen i fluorescen . Detekceglykoprotein se d je modifikovanou Schiffovou reakcí,alcianovou mod í, vazbou lektin . N které enzymy lzeprokázat b žnou reak ní sm sí nebo p i blottingu astodochází k renaturaci již denaturovaných bílkovin.

BlokováníVzhledem k tomu, že v tšina používaných detek níchsystém po blottingu obsahuje jako indika ní složkyproteiny, je nutné po vlastním p enosu blokovat zbývajícívazebná místa na membrán , aby zde nedocházelo knespecifické vazb t chto bílkovin. Nesmí však dojít kvyt sn ní vzorku, jeho modifikaci nebo k interferenci sdetek ní reakcí. Používají se: inertní proteiny BSA,kasein, hemoglobin, želatina p íp. nízkotu né mléko.

Nespecifické vazb protein na membránu p i detekcibrání v n kterých aplikacích použití neionogenníchdetergent .

Obdobn je nutné inaktivovat volné reaktivní skupinydiazotovaných membrán a membrán aktivovaných CNBr.To se d lá použitím 10% roztoku ethanolaminu.

Rozd lení metod blottingu podle provedení

Difuzní blotting - prostá difuze v tanku s p enosovým pufrem,dlouhá doba 36-48 hodin, velkou nevýhodou difuze do stran -zhoršení rozlišení vlastní elektroforetické separace.

Kapilární blotting - blotovací membrána umíst na na povrchugelu, který leží na porézní podložce v nádob s p enosovýmpufrem, na ní pak vrstva vlhkého filtra ního papíru a ada vrstevsuchých filtra ních papír . Celá jednotka je zatížena. Suchý papírnasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu namembránu. Trvá zhruba 12 hodin.

Vakuový blotting - obdobné uspo ádání jako u kapilárníhoblottingu, místo kapilárních sil vzorek tažen vakuem. Podstatnrychlejší (30 min). Výhodou též ost ejší pásy (potla ení difuze).

Kapilární blotting

Rozd lení metod blottingu podle provedení

Elektroblotting - nejrychlejší a nejú inn jší metoda. Hnací silouje v tomto p ípad síla elektrického pole. Podle provedení serozlišuje tzv. „tankový (tank, wet)“ blotting a „polosuchý (semi-dry)“ blotting. Jediný pro vysokomolekulární biopolymery.

Hlavními výhodami polosuchého blottingu v porovnání s tankovýmjsou:

1) homogenní elektrické pole, 2) možnost vyššího nap ovéhogradientu , 3) menší spot eba p enosového pufru, 4) možnostsimultánního p enosu z n kolika gel

Volba p enosového pufru je podmínkou pro úsp šný blotting.ležitý pro výb r složení je zejména typ použité membrány, u

elektroblottingu p istupuje ješt pH pufru a iontová síla.

Elektroblotting

Difuzní blotting a tankový elektroblotting

Polosuchý elektroblotting