PREVALENCIA DE EXPRESIVIDAD DE PROTEÍNAS … · Descriptores: Hiperplasia endometrial, OMS, EIN,...
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PREVALENCIA DE EXPRESIVIDAD DE PROTEÍNAS DEL SISTEMA * MMR ASOCIADA A INESTABILIDAD MICROSATELITAL EN HIPERPLASIA ENDOMETRIAL Y SU RELACIÓN CON LAS CLASIFICACIONES OMS Y NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ENDOMETRIAL, HOSPITAL METROPOLITANO QUITO, 2011 MD. TATIANA PAOLA BORJA HERRERA MD. CECILIA DE LOS ÁNGELES CARRIÓN GUZMÁN UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS PROGRAMA DE POSTGRADO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA QUITO, JULIO, 2014 * MMR: Sistema de reparación de malos emparejamientos
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PREVALENCIA DE EXPRESIVIDAD DE PROTEÍNAS DEL
SISTEMA *MMR ASOCIADA A INESTABILIDAD
MICROSATELITAL EN HIPERPLASIA ENDOMETRIAL Y SU
RELACIÓN CON LAS CLASIFICACIONES OMS Y NEOPLASIA
INTRAEPITELIAL ENDOMETRIAL, HOSPITAL
METROPOLITANO QUITO, 2011
MD. TATIANA PAOLA BORJA HERRERA
MD. CECILIA DE LOS ÁNGELES CARRIÓN GUZMÁN
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE POSTGRADO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA
QUITO, JULIO, 2014
*MMR: Sistema de reparación de malos emparejamientos
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PREVALENCIA DE EXPRESIVIDAD DE PROTEÍNAS DEL
SISTEMA MMR ASOCIADA A INESTABILIDAD
MICROSATELITAL EN HIPERPLASIA ENDOMETRIAL Y SU
RELACIÓN CON LAS CLASIFICACIONES OMS Y NEOPLASIA
INTRAEPITELIAL ENDOMETRIAL, HOSPITAL
METROPOLITANO QUITO, 2011
MD. TATIANA PAOLA BORJA HERRERA
MD. CECILIA DE LOS ÁNGELES CARRIÓN GUZMÁN
Trabajo de Tesis presentado como requisito parcial para optar el
Título de Especialistas en Anatomía Patológica
Tutor:
Dr. Nelson Arturo Montalvo Flores
Asesor Metodológico:
Dr. Klever Vinicio Sáenz Flor
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE POSTGRADO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA
QUITO, JULIO, 2014
iii
FORMULARIO DE AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN
EN EL REPOSITORIO INSTITUCIONAL
Nombre del autor(es): Md Tatiana Paola Borja Herrera. Md Cecilia de los Ángeles Carrión Guzmán Correo electrónico personal: [email protected] [email protected] Título de la obra: Prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociada a inestabilidad microsatelital en hiperplasia endometrial y su relación con las clasificaciones OMS y Neoplasia intraepitelial endometrial, Hospital Metropolitano Quito, 2011 Tema del trabajo de investigación: Hiperplasia Endometrial, Inestabilidad microsatelital, OMS, NIE, Relación.
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL Yo Tatiana Paola Borja Herrera y Cecilia de los Ángeles Carrión Guzmán En calidad de autor del trabajo de investigación o tesis realizada sobre: Prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociada a inestabilidad microsatelital en hiperplasia endometrial y su relación con las clasificaciones OMS y Neoplasia intraepitelial endometrial, Hospital Metropolitano Quito, 2011, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de lo que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5,6,8,19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su reglamento.
____________________ ____________________________ Md Tatiana Paola Borja Herrera Md. Cecilia de los Ángeles Carrión Guzmán
Con la portada correspondiente, El trabajo de tesis deberá ser grabado en un solo archivo en formato de texto “.doc” (Microsoft Word).
3.- Formato digital (CD):
2.- Autorización
1.- Identificación del Documento y Autor
iv
APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por las Doctoras
Tatiana Paola Borja Herrera y Cecilia de los Ángeles Carrión Guzmán para
optar el Título de Especialistas en Anatomía Patológica cuyo título es
“PREVALENCIA DE EXPRESIVIDAD DE PROTEÍNAS DEL SISTEMA MMR
ASOCIADA A INESTABILIDAD MICROSATELITAL EN HIPERPLASIA
ENDOMETRIAL Y SU RELACIÓN CON LAS CLASIFICACIONES OMS Y
NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ENDOMETRIAL, HOSPITAL
METROPOLITANO QUITO, 2011”.
Considero que dicho Trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para
ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del jurado
examinador que se designe.
En la ciudad de Quito a los 23 días del mes de julio de 2014.
Dr. Nelson Montalvo
Cd. No 1705650834
v
DEDICATORIAS
A mi querida familia y novio por su incansable ayuda y soporte
A mis maestros por sus enseñanzas y ejemplo
A todos aquellos que directa e indirectamente han contribuido con este
trabajo y con nuestra formación.
Md Tatiana Paola Borja Herrera
A mis padres y hermanos, por su fortaleza y confianza.
A mi esposo Juan Pablo, por su apoyo incondicional.
A mi hijo Emilio, fuente de inspiración y amor infinito.
Md. Cecilia de los Ángeles Carrión Guzmán
vi
RECONOCIMIENTOS
A Dios, base y luz.
A la Universidad Central del Ecuador, que por medio del Instituto Superior de
Posgrado de la Facultad de Ciencias Médicas, con la coordinación del
Postgrado de Anatomía Patológica, brinda la oportunidad de ampliar y
fortalecer la formación académica de los médicos del país.
Al Hospital Metropolitano, y especialmente al Servicio de Anatomía
Patológica, por brindarnos la apertura y aporte técnico, fundamental en el
desarrollo del presente trabajo.
Al Dr. Nelson Montalvo, por apoyo y colaboración generosa.
Al Dr. Klever Sáenz, Asesor metodológico de tesis, catedráticos y amigos;
por apoyarnos con sus conocimientos científicos desde la planificación hasta
la culminación exitosa de este trabajo.
Las Autoras
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CONTENIDO
CONTENIDO DE GRÁFICOS CONTENIDO DE TABLAS RESUMEN INTRODUCCIÓN
CAPÍTULO I PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Pregunta de Investigación Hipotesis Objetivos Objetivo General Objetivos Específicos Justificación
II MARCO TEÓRICO HIPERPLASIA ENDOMETRIAL Definición Epidemiología Clasificación Clasificación OMS Hiperplasia Simple Hiperplasia Compleja Hiperplasia Simple y Compleja con Atipia Sistema NIE Hiperplasia Benigna Neoplasia Intraepitelial Endometrial Comparación de la clasificación OMS y Sistema NIE INESTABILIDAD MICROSATELITAL Sistema MMR Carcinogénesis de Hiperplasias Endometriales
III ARCO METODOLÓGICO METODOLOGÍA Diseño de Investigación Matriz de Variables Operacionalización de Variables Universo, Población y Muestra Procedimiento Plan de Análisis y Estandarización Normas Éticas Limitaciones
pp ix x xi
01
03 03 06 06 06 06 06 07
08 08 08 08 09 11 11 11 12 12 13 14 17 18 19 21
23 23 23 23 24 29 30 32 33 33
viii
IV ORGANIZACIÓN ADMINISTRATIVA RECURSOS Recursos Humanos Recursos Materiales Recursos Económicos CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES V ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS RESULTADOS VI DISCUSIÓN, CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS A Técnica de microarray tisular B Protocolo para la técnica de Inmunohistoquímica usando los
anticuerpos para MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 C Esquema del patrón arquitectural glandular: Valoración de
volumen porcentual estromal (VPE) D Hoja de recolección de datos E Fotografías
CURRICULUM VITAE INVESTIGADOR 1 CURRICULUM VITAE INVESTIGADOR 2
34 34 34 35 35 35
36
36 42 42 46 47
48
58 60
61
62 64
66 67
ix
CONTENIDO DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 Distribución de edad (años) de pacientes de origen de
muestras estudiadas
pp
36
x
CONTENIDO DE TABLAS
pp TABLA
1 Evolución de las Clasificaciones de Hiperplasia Endometrial 2 Características histológicas en Hiperplasia Endometrial por
condición de menopausia 3 Citología de lesión que difiere de endometrio conservado y
dimensión lineal de la lesión por condición de menopausia 4 Porcentaje estromal promedio por condición de menopausia 5 Tipo de Hiperplasia Endometrial por Condición de menopausia.
Clasificación WHO 6 Tipo de Hiperplasia Endometrial por Condición de menopausia.
Clasficación EIN 7 Tipo de Hiperplasia Endometrial por Condición de menopausia.
Clasificación WHO y EIN 8 Prevalencia de No Expresividad de Marcadores de
Inmunohistoquímica Estudiados. Muestra General 9 Prevalencia de No Expresividad de Marcadores de
Inmunohistoquímica Estudiados por escalas de Clasificación WHO y EIN.
10 Prevalencia de No Expresividad de Marcadores de Inmunohistoquímica Estudiados por Características Histológicas
09 37
38
38 39
39
39
40
40
41
xi
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE POSTGRADO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA Prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociada a inestabilidad microsatelital en hiperplasia endometrial y su relación con las clasificaciones OMS y Neoplasia intraepitelial endometrial, Hospital Metropolitano Quito, 2011.
Autoras: Tatiana Borja Herrera, Cecilia Carrión Guzmán Tutor: Nelson Montalvo
Fecha: Julio 2014
RESUMEN
Contexto: La hiperplasia endometrial se presenta en mujeres de entre 50 a 60 años y es considerada una lesión premaligna. Para su clasificación la más utilizada es la de la OMS, pero se ha propuesto otro sistema denominado Neoplasia Intraepitelial Endometrial. La importancia en clasificar a las hiperplasias adecuadamente radica en que las atípicas pueden progresar a carcinoma. Los carcinomas endometriales tipo endometrioide son causados por: silenciamiento del PTEN, IM y mutaciones de genes p53 y Kras. La IM se debe a la inactivación por silenciamiento de MLH1 y MSH2. Objetivo: Establecer la prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR asociadas con inestabilidad microsatelital en hiperplasias endometriales, simples, complejas, benignas y neoplasia intraepitelial endometrial. Diseño: Epidemiológico analítico transversal Lugar y Sujetos: Servicio de Patología del Hospital Metropolitano, Quito-2011. Se elaboraron 8 bloques de microarreglos tisulares con 151 muestras de legrado endometrial de pacientes diagnosticadas de hiperplasia. De cada bloque se generaron 5 laminillas para Hematoxilina/Eosina, MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2. Mediciones principales: Se compararon las clasificaciones de la OMS y EIN, y la prevalencia de expresividad de proteínas del MMR. Las variables cuantitativas, cuantitativas y la prevalencia se expresaron en promedios y porcentajes, acompañado de su intervalo de confianza al 95%. Resultados: De las 151 muestras, el porcentaje de lesiones precursoras fue del 8.6% según la OMS y 27.8% según el sistema EIN. Se clasificaron como EIN al 35.7% de HSSA, 34.3% HCSA, 14.3% HSCA y 16.7% HCCA. Hubo ausencia de proteínas MMR en 31% de casos de hiperplasias atípicas (OMS) y en 16,6% de casos de EIN.
Conclusión: Se identificaron más lesiones precursoras con la clasificación EIN que con la clasificación OMS. La ausencia de expresividad de MMR fue mayor entre hiperplasias atípicas que entre EIN Descriptores: Hiperplasia endometrial, OMS, EIN, Inestabilidad microsatelital.
xii
Abstract
Setting: endometrial hiperplasia in women aged 50 to 60 years is considered premalignat injuries. The most used classification is the WHO´s, but another system so-called Endometrial Intraepitelial Neoplasia. The relevance of property classifying hyperplasia lays in the fact that atipic can progress to carcinoma. Endometroid endometrial carcinomas are caused by: PTEN silencing, IM and gene mutations p53 and Kras. IM is due to inactivation for silencing MLH1 and MSH2. Objective: Establish prevalence of expressivity of the MMR system in association to microsatellite instability in simple, complex, benign endometrial hyperplasia and endometrial intraepithelial neoplasia. Design: Transversal, analytical, epidemiologic. Pleace and Subjects: Pathologic service in the Hospital Metropolitano, Quito-2011. 8 blocks with tisular micro-arrangements with 151 samples of endometrial curettage of patients diagnosed with hyperplasia. From each block, 5 plates were generated for hematoxylin/eosin, MLH1, MSH2; MSH6 and PMS2. Core Measurements: Who and EIN classifications were compared, as well as prevalence of expressivity in MMR proteins. Qualitative and quantities variables, as well as prevalence were expressed in averages and percentages, accompanied by confidence interval at 95%. Results: From 151 samples, the percentaje of precursor injuries was 8.6% pursuant to WHO and 27.8% in accordance to EIN system. They were classified as EIN to 35.7% HSSA, 34.3% of atypical hyperplasia (WHO) and 16.6% of cases in EIN. Conclusion: More precursor injuries were found with EIN classification than with WHO classification. The absence of expressivity in MMR system was higher among atypical hyperplasia than among EIN. Describers: endometrial hyperplasia, WHO, EIN, microsatellite instability.
1
INTRODUCCIÓN
La hemorragia uterina disfuncional se define como cualquier sangrado que
difiera del patrón menstrual normal en frecuencia, cantidad y duración.
La mayoría de sangrados disfuncionales de mujeres con edades
comprendidas entre 50 a 60 años se deben a hiperplasia endometrial (HE), la
cual se caracteriza por proliferación glándulo-estromal, secundaria al
estímulo estrogénico permanente. Esta entidad puede retornar a la
normalidad en forma espontánea o con tratamiento, persistir como tal o
evolucionar a carcinoma.
Es considerada una lesión premaligna, la incidencia de hiperplasia simple
(HS) sin atipia es de 142 por 100000 mujeres, compleja sin atipia es 213 por
100000 e hiperplasias atípicas (HA) 56 por 100 000 mujeres.
Se han propuesto muchos sistemas de clasificación de HE, y a lo largo del
tiempo se ha utilizado diversidad de términos para ello, sin embargo en 1994
la Organización Mundial de la Salud introdujo una clasificación, utilizando dos
criterios: complejidad glandular y atipia nuclear, creando 4 grupos: simple,
compleja, simple con atipia y compleja con atipia. La interpretación de las
características microscópicas es subjetiva, dando como resultado diferentes
criterios diagnósticos, lo cual disminuye su reproducibilidad.
Existe otro sistema de clasificación que ha adquirido importancia en los
últimos años, propuesto por el Grupo Colaborador Internacional Endometrial,
denominado Neoplasia Intraepitelial Endometrial (NIE), el cual está basado
en características morfométricas, genéticas, biológicas y pronósticas. Se
subdivide en: hiperplasia benigna (HB), NIE y cáncer. Los hallazgos
esenciales en su definición son: Arquitecturales (porcentaje de volumen
estromal y densidad glandular) y citológicos (desviación estándar del eje
nuclear). Su valoración puede realizarse en forma objetiva, mediante un
sistema computarizado llamado Referencia Estándar Morfométrica (D-
2
SCORE); o subjetiva, teniendo en cuenta parámetros establecidos
(citológicos y arquitecturales).
Se han relacionado alteraciones genéticas y epigénicas con la progresión de
un endometrio normal, a hiperplásico y por último al desarrollo de un
carcinoma. Los carcinomas endometriales (CE) tipo endometrioide suman el
70 a 80% de los casos, y son causados por: silenciamiento del PTEN, el
cual es un gen supresor de tumores que actúa en el ciclo celular previniendo
una proliferación y división celular aceleradas; inestabilidad microsatelital (IM)
(20 a 45% de los casos) asociada con defectos en la reparación de malos
emparejamientos y mutaciones del gen Kras y p53.
La IM puede observarse en tumores esporádicos, a través de la inactivación
por silenciamiento de MLH1 y MSH2, y en pacientes con Síndrome de Lynch.
El CE es el segundo tipo de malignidad más frecuente en el espectro de
carcinomas asociados a esta patología, comprendiendo el 2% de CE
diagnosticados.
3
CAPÍTULO I
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La hemorragia uterina disfuncional se define como cualquier sangrado que
difiera del patrón menstrual normal en frecuencia, cantidad y duración. Se
presenta en aproximadamente 30% de mujeres, ocasionan el 20% de las
consultas y el 25% de todas las cirugías ginecológicas, 65% de las
histerectomías y 100% de las ablaciones endometriales. Aproximadamente,
en el 15% de legrados/biopsias endometriales de mujeres postmenopáusicas
con hemorragia uterina anormal, se diagnostica hiperplasia. (Pérez, L.,
2007; Kurmann, N., 1985).
La HE es la proliferación de glándulas endometriales de tamaño y forma
irregular, con mayor proporción de glándulas sobre estroma. La causa
principal constituye la exposición prolongada e intensa a estrógenos.
(García, E., 2010).
Se ha propuesto una clasificación alternativa que es el sistema NIE, en
respuesta a la pobre reproducibilidad de la clasificación OMS. El sistema NIE
está basado en parámetros morfológicos, morfométricos, moleculares y
pronósticos, que evalúan el volumen de porcentaje estromal, densidad
glandular y variación del tamaño nuclear. Existen tres categorías dentro del
sistema: HB, NIE y adenocarcinoma. NIE se define como una lesión
proliferativa, monoclonal con alteraciones moleculares similares a las vistas
4
en CE (mutaciones de gen PTEN e IM). (Mutter, G; 2000).
La OMS divide a las HE en simple y compleja con y sin atipia. El 79% de HA,
44% HC sin atipia y 5% HS sin atipia son reclasificadas como NIE. (Robboy,
S., 2009; Mutter, G., 2002).
Factores genéticos y epigénicos están relacionados con la progresión de un
endometrio normal, a hiperplásico y por último al desarrollo de carcinoma. En
el endometrio se describen dos tipos generales de carcinoma: Tipo I o
endometrioide y tipo II o no endometrioide. Esta clasificación se basa en
vías tumorogénicas distintas para cada uno. (Abal, M., 2006; Shermann, M.,
2000).
Los CE tipo endometrioide suman el 70 a 80% de los casos, y se asocian a:
silenciamiento del gen PTEN, IM (20 a 45% de los casos) asociada con
defectos en la reparación de malos emparejamientos y mutaciones del gen
Kras. (Okuda, T., 2010).
Tanto la mutación del gen PTEN como la IM constituyen vías de
carcinogénesis más frecuentes para desarrollar CE tipo endometrioide.
(Mutter, G., 2002)
Dentro del ADN existen microsatélites formados por repeticiones mono y
dinucleotídicas cortas de hasta 8 pares de bases, las mismas que se
mantienen estables en longitud y composición debido a la existencia de un
sistema de reparación de malos emparejamientos, que actúa durante la
replicación de ADN. La variación en longitud y composición de los
microsatélites se conoce como IM (Redrobán, L., 2010; Lynch, H., 2003)
La IM puede observarse en tumores esporádicos, por inactivación o
silenciamiento de MLH1 y MSH2, y así como en pacientes con SL. Se ha
llegado a proponer que la IM ocurre en un estadío temprano de la
carcinogénesis global en la que un ¨gen mutador¨ provocaría mutación
subsiguiente de genes. (Okuda, T., 2010; Perucho, M., 1996)
5
El reconocimiento de lesiones potencialmente precursoras de neoplasia
tienen como resultado, un tratamiento médico o histerectomía; mientras que
lesiones no precursoras tienen un manejo espectante. La mayoría de
estudios demuestran que las hiperplasias atípicas son las que tienen mayor
riesgo de progresión maligna. Aunque en el contexto de IM, las HC con o
sin atipia son igualmente importantes como precursoras de CE. (Silverberg,
S., 1999; Nieminen, T., 2009)
El SL es una enfermedad con herencia autosómica dominante. El CE es el
segundo tipo de neoplasia más frecuente en el espectro de carcinomas
asociados a esta patología, después del CCR. El SL se asocia al 2% de CE
diagnosticados. (Yoshihito, I., 2002; Boland, R., 2008; Van, L., 2010).
Se realizó un estudio en pacientes con SL que evaluó la expresión proteica
del sistema MMR. En ellas se identificó pérdida de la expresión del complejo
proteico en: 7% de los endometrios normales, 40% de las HS, 100% de las
HC sin atipias, 92% de las HC con atipias y 100% de los CE. (Nieminen, T.,
2009)
¨El éxito depende de los esfuerzos para identificar pacientes que se
encuentran en riesgo de desarrollar este tipo de carcinoma a través del
descubrimiento y entendimiento de sus bases moleculares¨. La detección de
IM en endometrios hiperplásicos simples, complejos con o sin atipia
determina un potencial riesgo de desarrollo de carcinoma (Okuda, T., 2010;
Nieminen, T., 2009)
Pregunta de Investigación
Por lo mencionado en los párrafos anteriores, se plantea el siguiente
problema:
6
¿Cuál es la prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR
asociada a inestabilidad microsatelital en hiperplasia endometrial y su
relación con las clasificaciones OMS y Neoplasia Intraepitelial
Endometrial?
Hipótesis
La prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR en
hiperplasias endometriales es alta y se relaciona con las clasificaciones de
severidad establecidas en las escalas OMS 2003 y NIE 2003.
Objetivos
Objetivo General
Establecer la prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR
asociadas con inestabilidad microsatelital en hiperplasias endometriales,
simples, complejas, benignas y neoplasia intraepitelial endometrial.
Objetivos Específicos
Determinar la relación entre la expresividad de las proteínas del sistema
de reparación de malos emparejamientos y las clasificaciones OMS y
Neoplasia Intraepitelial Endometrial
Establecer la relación entre la expresividad y las características
histomorfológicas de la lesión.
7
Justificación
La hiperplasia endometrial es considerada una lesión premaligna. Entre las
clasificaciones para determinar la presencia o no de atipia citológica la más
usada es la de la OMS, sin embargo su reproducibilidad es baja, existiendo
otra clasificación más objetiva como el sistema EIN. El CE es el segundo tipo
de malignidad más frecuente en el espectro de carcinomas asociados a esta
patología, comprendiendo el 2% de CE diagnosticados. Este trabajo busca
brindar información suficiente para clasificar de manera correcta a las
hiperplasias endometriales, para un adecuado manejo de las pacientes que
presenten riesgo de desarrollar cáncer y sobre todo establecer si existe
inestabilidad microsatelital para realizar una terapéutica eficaz.
8
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
HIPERPLASIA ENDOMETRIAL
Definición
La HE es una de las causas más frecuentes de sobrediagnóstico en
patología quirúrgica, se caracteriza por un índice glándulo-estromal
incrementado secundario al estímulo estrogénico permanente. Se ha visto
que el endometrio hiperplásico puede regresar a la normalidad en forma
espontánea o con tratamiento, persistir como tal o evolucionar a carcinoma.
Los factores de riesgo implicados en su desarrollo son: terapia estrogénica,
obesidad, diabetes, menarquia temprana y menopausia tardía. (Silverberg,
S., 2000; McCluggage, W., 2005; Barrero, R., 2008)
Epidemiología
La HE es una lesión premaligna. Al tomar en cuenta la clasificación OMS
2003, la incidencia de HS sin atipia es de 142 por 100000 mujeres, compleja
sin atipia es 213 por 100000 e HA 56 por 100 000 mujeres. (Sivridis, E.,
2008; Reed, S., 2009).
Es importante mencionar que no hay datos epidemiológicos de HE en
Ecuador.
9
En Colombia en pacientes con diagnóstico de HE el 68,5% corresponden a
HS sin atipia y el 19.7% a HA, el promedio de edad de las pacientes con HE
encontrado es 44.8 años. (García, E., 2010).
En Estados Unidos se registran 40320 nuevos casos de CE, con una
incidencia de 16 por 100000 en el año 2000. En la ciudad de Quito se
registran 137 casos nuevos de CE, con una tasa de incidencia de 5 por
100000. Representando el 81% de las lesiones malignas del cuerpo del
útero, cabe anotar que el cáncer de cuello de útero tiene una frecuencia
aproximada 10 veces mayor que el de endometrio en esta ciudad. (Cueva,
P., 2009; Ferlay, J.).
La edad promedio de ocurrencia de hiperplasias sin atipia es de 50 a 54
años, mientras que aquellas con atipia se presentan entre los 60 y 64 años.
(Reed, S., 2009).
El riesgo de progresión de endometrio hiperplásico sin atipia a uno con ella,
es de 10,5% (Sivridis, E., 2008).
El riesgo de progresión a carcinoma es de 0 a 27% para las hiperplasias no
atípicas y 20 a 10% para las atípicas. (James, V., 2010).
El CE tiene una incidencia de 150000 casos nuevos diagnosticados
anualmente. Aproximadamente 90% son esporádicos y 10% restante son
hereditarios (Okuda, T., 2010).
Clasificaciones
Tabla 1. Evolución de las clasificaciones
Campbell y Barter (1961)
Hiperplasia Benigna
Hiperplasia Atípica, tipo I
Hiperplasia Atípica, tipo II
Hiperplasia Atípica, tipo II
Beutler, Dockerty, y Randall (1963)
Proliferación quística
10
Hiperplasia glandular
Hiperplasia glandular con proliferación epitelial atípica
Gusberg y Kaplan (1963)
Hiperplasia adenomatosa leve
Hiperplasia adenomatosa moderada
Hiperplasia adenomatosa marcada
Gore y Hertig (1966)
Hiperplasia quística
Hiperplasia adenomatosa
Anaplasia
Carcinoma in situ
Vellios (1972)
Hiperplasia quística
Hiperplasia adenomatosa
Hiperplasia atípica
Tavassoli y Kraus (1978)
Hiperplasia quística
Hiperplasia adenomatosa
Hiperplasia atípica
Hendrickson y Kempson (1980)
Hiperplasia
Sin Atipia
Con atipia leve
Con atipia moderada
Con atipia severa
Kurman y Norris (1986) (OMS)
Hiperplasia
Simple
Compleja
Hiperplasia atípica
Simple
Compleja
Mutter 2003 (NIE)
11
Hiperplasia Benigna
Neoplasia intraepitelial endometrial
Carcinoma Endometrial
(Basado y modificado de Rosai, J., 2011; Mutter, G., 2003 )
Clasificación OMS
La Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Sociedad Internacional
de Patólogos Ginecológicos divide a la HE en cuatro subtipos de acuerdo
al grado de complejidad arquitectural y a la presencia o ausencia de atipia
nuclear, aunque la aplicación de este sistema puede ser simple, algunas
veces es difícil ponerlo en práctica. Al momento la OMS sostiene que no
existe una clasificación que pueda remplazar a la actual. (Matías, A.,
2009; Rosai, J., 2011).
Hiperplasia Simple sin Atipia
Se caracteriza por incremento del volumen endometrial y diferencias
cualitativas con el endometrio cíclico normal, existe una proliferación tanto
de las glándulas como del estroma. Está compuesta de estructuras
tubulares y quísticas, dilatadas y revestidas por epitelio
pseudoestratificado, similares a la fase proliferativa. Los núcleos son
ovalados con cromatina dispersa y nucleolos inconspicuos, las mitosis
son frecuentes en profase y metafase, lo cual explica la presencia de
células claras en el epitelio glandular. El estroma es abundante y
celular, y los vasos sanguíneos son dilatados y frecuentemente
trombosados. (Nucci, M., 2009; Dallenbach, G., 2010).
Hiperplasia Compleja sin Atipia
Está caracterizada por glándulas empaquetadas con cambio del índice
glándulo-estromal a favor del componente glandular. Las glándulas son
irregulares y muestran pliegues papilares proyectados hacia la luz. La
12
estratificación y polaridad nuclear está conservada, las figuras mitóticas y
cuerpos apoptóticos son frecuentes. (Nucci, M., 2009)
Es común observar cambios metaplásicos escamosos, células claras y
ciliadas. El estroma es celular y compacto y las arteriolas espirales no
son prominentes. La proliferación glandular compleja puede ser focal
dentro de una HS, caracterizada por empaquetamiento glandular
moderado y alteración arquitectural. (Dallenbach, G., 2010)
Hiperplasia Simple y Compleja con Atipia
La HA muestra un crecimiento adenomatoso difuso y extenso con
formación micro alveolar focal, incremento de la pseudoestratificación o
estratificación nuclear con yemas intraluminales epiteliales. Hay una
alteración en la relación núcleo-citoplasma y pérdida de la polaridad axial,
los núcleos usualmente son grandes y redondeados, pleomórficos e
hípercromáticos. Los nucleolos son prominentes de cromatina irregular y
dispersa. Las mitosis y cuerpos apoptóticos son frecuentes. (Mehmet, C.,
2010)
Sistema de Neoplasia Intraepitelial Endometrial (NIE)
La clasificación NIE está basada en estudios morfométricos, genéticos,
biológicos y pronósticos, fue propuesta por el Grupo Colaborador
Endometrial Internacional, en el año 2003 liderado por Mutter.
Las clasificaciones morfológicas dentro de este sistema son una
expresión evolutiva de la exposición a estrógenos sin oposición de
progesterona (Mutter, G., 2007).
Existen tres categorías en la clasificación NIE:
1. Hiperplasia benigna (HB)
2. Neoplasia Intraepitelial
3. Cáncer.
13
Los hallazgos esenciales en su definición son: Arquitecturales (porcentaje
de volumen estromal y densidad glandular) y citológicos (polaridad
nuclear). (Baak, J., 2004).
Hiperplasia Benigna
Es una lesión policlonal de topografía difusa que muestra incremento del
índice glándulo-estromal (porcentaje estromal del 75%), resulta de una
constelación de cambios histológicos secundarios a exposición
estrogénica, por lo que su apariencia histológica es única en cada
individuo. En cualquier momento se pueden producir o sobreponer
cambios histológicos sugestivos de un efecto progestágeno. El cambio
constante de las influencias hormonales produce alteraciones
microscópicas variables y singulares para cada muestra. (Mutter, G.,
2007).
La exposición prolongada a estrógenos sin oposición, primero da lugar a
un endometrio proliferativo desordenado, y con el tiempo a una
disposición glandular irregular y progresiva, conocida como HB. (Baak,
J., 2005).
El material endometrial es abundante, las glándulas son quísticas,
dispuestas al azar, asociadas generalmente con ciclos anovulatorios. A
menor magnificación presenta un patrón de distribución glandular
regularmente irregular y a mayor aumento se observa metaplasia
tubárica. Ante la persistencia de exposición estrogénica los vasos
sanguíneos presentan trombosis fibrinoide, con el consecuente
desprendimiento endometrial (Zaino, D., 2002; Mehmet, C., 2010).
Entonces tanto el endometrio proliferativo desordenado como las
primeras fases de la HB comparten una patogenia común. Presentan un
espectro de cambios morfológicos superpuestos en lugar de patrones
14
histológicos específicos que permitan su diferenciación. (Robboy, S.,
2005).
Neoplasia Intraepitelial Endometrial
Es una lesión premaligna, neoplásica monoclonal, constituida por una
proliferación glandular con arquitectura y citología alteradas. Es propensa
a la transformación maligna hacia adenocarcinoma endometrial tipo
endometrioide (Tipo I). Al momento del diagnóstico en la mayoría de los
casos es focal, solo el 20% de las lesiones son difusas. (Mutter, G.,
2007).
Inicialmente las lesiones NIE exhiben mutación de los genes PTEN, p53,
Kras y PAX2, que permiten proliferación monoclonal de glándulas
densamente empaquetadas, que responden a estímulos hormonales y
son susceptibles de reversión bajo dicha influencia (fase latente). A
medida que el tiempo transcurre y el estímulo persiste acumulan
alteraciones genéticas, provocando heterogeneidad molecular con
transformación maligna. (Mutter, G., 2002).
Los criterios diagnósticos son cinco y de cumplimiento obligatorio para el
diagnóstico:
1. Dimensión lineal de por lo menos 1mm o 5 a 10 glándulas.
2. Incremento del número de glándulas con un porcentaje de volumen
estromal menor al 55% o D-SCORE menor de 1.
3. Hallazgos citológicos que difieren de la arquitectura del endometrio
conservado adyacente.
4. Exclusión de lesiones con arquitectura similar (endometrio basal,
secretor, pólipos, reparación endometrial)
5. Excluir carcinoma (Kindelberger, S., 2002)
15
Arquitectura:
El agrupamiento glandular es característica fundamental. El parámetro de
evaluación es el volumen porcentual estromal (VPS), que se define como
la cantidad de estroma expresada en porcentaje frente al componente
glandular. El umbral cuantitativo de corte para las lesiones NIE
corresponde a VPS menor al 50% con respecto a las glándulas. Las
áreas con grandes quistes se deben evitar al evaluar. A pesar de que NIE
es una enfermedad epitelial, la evaluación de la densidad glandular se
realiza concentrándose en el compartimiento estromal. Las lesiones NIE
tienen un VPS medio de alrededor de 40% y las no NIE un VPS de 75%
(Hecht, J., 2005) (Ver Anexo C)
Citología:
No existe una norma absoluta para las características citológicas de las
lesiones NIE. Los intentos de definir un estándar absoluto son afectados
por la plasticidad morfológica extrema de las células glandulares del
endometrio, en respuesta a los cambios hormonales, estados de
reparación y metaplasia. (Palazzo, R., 2005).
La citología de NIE suele ser claramente delimitada y divergente de la
existente del endometrio benigno vecino. Las descripciones clásicas de
atipia celular se cumplen en muchos casos de NIE pero no en todos, por
lo tanto la atipia citológica no es un requisito previo para el diagnóstico de
NIE. El tipo de cambio citológico en NIE varía considerablemente de
paciente a paciente y puede incluir pero no limitarse a: variación de
tamaño y contorno nuclear, agrupación y cromatina granular, presencia
de nucleolos, cambios en el índice núcleo/citoplasma, y tinción
citoplasmática. (Mutter, G., 2001; Palazzo, R., 2005)
Algunos cambios citológicos en lesiones NIE, involucran la diferenciación
hacia fenotipos tubáricos, micropapilares, mucinosos o eosinofílico. Este
16
hallazgo debe ser cuidadosamente diferenciado de las metaplasias
superficiales aisladas que se producen por cambios en el patrón
hormonal (Reed, S., 2008).
Tamaño:
La lesión debe tener un tamaño mayor a 1 mm de diámetro y abarca 5 a
10 glándulas. El requisito de tamaño se debe cumplir en un fragmento
único de tejido, sin sumar diámetro entre varios fragmentos sospechosos
(Mutter, G., 2005).
Exclusión de entidades benignas (Robboy, S., 2002)
Bajo este término se agrupan patologías que deben descartarse antes de
diagnosticar NIE
1.- Cambios reactivos.
2.- Alteraciones glandulares artefactuales
3.- Efecto estrogénico persistente.
4.- Endometrio secretor medio o tardío.
5.- Pólipos endometriales.
6.- Cambios endometriales menstruales
Exclusión de carcinoma (Mutter, G., 2007)
Un carcinoma puede coexistir con NIE pero debe ser diagnosticado
correctamente. NIE está compuesto de glándulas individuales revestidas
por un epitelio simple, que puede ser pseudoestratificado y ausencia de
arquitectura cribiforme o áreas sólidas de células epiteliales.
La presencia de cualquiera de los siguientes hallazgos es compatible con
carcinoma:
1. Luces serpenginosas, laberínticas.
17
2. Sábanas epiteliales.
3. Arquitectura cribiforme.
4. Patrón glandular en mosaico, con glándulas poligonales y estroma
filiforme.
5. Mioinvasión: raramente observada en biopsias o curetajes.
Comparación de la Clasificación OMS y Sistema NIE
Existe una considerable variación inter e intraobservador en el
diagnóstico de hiperplasia endometrial, debido a que los criterios
diagnósticos de la clasificación OMS son muy subjetivos, mientras que la
clasificación NIE utiliza parámetros morfométricos para identificar
pacientes en riesgo real de progresión a cáncer. Aún cuando la
concepción original de NIE fue morfométrica computarizada, es posible
utilizar criterios semicuantitativos (Hecht, J., 2005).
La mayoría de casos de NIE corresponde a hiperplasia compleja (HC) con
atipia (79%), de HS no atípica el 2% y de HC sin atipia el 44% (Allison, K.,
2008).
El riesgo de CE en presencia de hiperplasia compleja atípica es del
26.4% y en NIE de 24.3% (Lacey, J., 2008).
Varios autores mencionan que la clasificación OMS tiene pobre
reproducibilidad diagnóstica, predicción pronóstica subóptima y tampoco
relación biológica, ni terapéutica. En un estudio que evalúa 2601
especímenes endometriales asignados a dos equipos de patólogos
expertos, hubo desacuerdo diagnóstico en 22.2% de casos, sobre todo en
aquellos casos que incluían HC sin atipia y con ella. El mayor acuerdo
diagnóstico se encontró en los casos de HS o ausencia de hiperplasia
(Allison, K., 2009; Baak, J., 2005).
18
El Grupo Oncológico Ginecológico (GOG) revisaron casos con
diagnósticos establecidos de hiperplasia compleja atípica (HCA) que en el
30% de casos fueron reclasificados como carcinoma, mientras otro 40%
tuvieron un menor grado de hiperplasia o fueron muestras completamente
benignas (Baak, J., 2005).
La sensibilidad de NIE para detectar lesiones precursoras es del 92%
comparada con el 67% para las HA de la clasificación OMS, y con el 46%
de HCA. La clasificación NIE provee beneficios para el paciente
relacionados con el manejo de la enfermedad (Baak, J., 2005).
INESTABILIDAD MICROSATELITAL
La inestabilidad genética es una propiedad común de muchos cánceres
humanos; una de sus formas se caracteriza por acumulación de mutaciones
somáticas en las secuencias repetitivas simples o microsatélites; la
aglomeración de mutaciones clonales es secundaria a la presencia de un
gen mutador en la replicación del ADN, o en factores de reparación que
provocan una disminución de la fidelidad de replicación, errores que no son
corregidos, y que finalmente llevan a IM. (Perucho, M, 2003).
La IM se debe a defectos en los genes del sistema de reparación de malos
emparejamientos (MMR), la misma que puede ser identificada en el 25 a
40% de CE tipo endometrioide y en el 2% asociados al síndrome de Lynch
(Van, L., 2010; Okuda, T., 2010; Rigau, V., 2003).
Existe inestabilidad asociada a mecanismos epigénicos, no hereditarios, que
se deben a la metilación del promotor del gen que codifica para la proteína
MLH1, teóricamente esta puede ocurrir en cualquier otra de las proteínas del
sistema (Hsieh, P., 2009).
19
Sistema de Reparación de Malos Emparejamientos (MMR)
La replicación es un proceso extraordinariamente fiel, pueden ocurrir
mutaciones con una frecuencia de 1 en 109 a 1 en 1010 pares de bases por
división celular. La ADN polimerasa (ADN pol) es responsable del proceso de
lectura y corrección inicial de estas mutaciones. La vía MMR repara los
malos emparejamientos no identificados por la ADN pol, mejorando la
fidelidad de la replicación en 50 a 1000 veces (Kazuhiko, A., 2008; Boland,
R., 2008).
El MMR permite corregir los errores de replicación del ADN. Su ausencia
incrementa el índice de mutaciones espontáneas y está asociada con una
considerable proporción de carcinomas esporádicos (Hsieh, P., 2008).
El sistema MMR está conformado por una familia de proteínas
(heterodímero) llamadas MutS homólogo (MSH2, MSH6, MSH3) y MutL
homólogo (MLH1, PMS2, MLH3). Cada una de las familias participa en la
configuración del heterodímero con dos proteínas integrantes, siendo
obligatoria la presencia de MSH2 y MLH1.
Las combinaciones MSH2 con MSH6 son específicas para detectar malos
emparejamientos, mientras que MSH2 y MSH3 reconocen las inserciones y
deleciones (Lynch, H., 2009).
La secuencia de eventos para el funcionamiento del sistema MMR se inicia
con el reconocimiento del mal emparejamiento por MutS alfa (MSH2-MSH6)
o MutS beta (MSH2-MSH3). Esto permite la unión a MutL alfa (MLH1-PMS2)
con actividad de endonucleasa, que separa la zona marcada por la primera
fracción del heterodímero. Posterior a esto, la ADN pol III replica la porción
de cadena faltante (Chen, S., 2010).
La ausencia de MLH1 o MSH2 provoca inactividad completa del sistema
MMR, mientras que la ausencia de las proteínas acompañantes produce una
atenuación de la actividad (Boland, R., 2008).
20
La IM se ha estudiado como modelo en el síndrome de Lynch (SL). Este es
un transtorno autosómico dominante que predispone a carcinomas
colorrectales (CCR), endometriales, ováricos, gástricos, pancreáticos, de
intestino delgado y cerebro, así como tumores benignos (queratoacantoma,
entre otros) (Garg, K., 2009).
Tradicionalmente ha sido asociado a CCR, sin embargo en las mujeres su
incidencia se iguala o es superada por el CE. En más del 50% de casos, el
CE es la malignidad centinela (primera malignidad) de estas pacientes. La
frecuencia de mutaciones en el sistema MMR en población no seleccionada
con CE es de 1.8 a 2.1%. En pacientes menores de 50 años, la incidencia de
este trastorno asociado al CE es superior a 9% (Shannon, A., 2002).
El patólogo debe sospechar el diagnóstico de SL y hacer un screening de IM
frente a CCR o CE antes de los 50 años, de un segundo CCR antes de los
70 años o CCR en menores de 70 años con otros tumores metacrónicos y
sincrónicos asociados al SL (Van, L., 2009).
La mutación de las proteínas obligatorias del sistema MMR (MLH1 y/o
MSH2) da lugar al SL clásico; la mutación de las proteínas alternas se
acompaña de predisposición a carcinomas en edades más tardías que el
síndrome clásico. Se ha visto que las pacientes con mutaciones de MSH6
frecuentemente presentan CE a edades mayores a 50 años y su prevalencia
aproximada es 1.6% de todos los casos de síndrome de Lynch (Goodfelow,
S., 2003).
Técnicas de Investigación del Sistema de Corrección de Malos
Emparejamientos
Para la detección de IM puede aplicarse ensayos basados en PCR e
inmunohistoquímica (IHQ) para la valoración de expresión proteica. (Chialina,
S., 2006).
21
La IHQ se emplea para valorar la expresión proteica de los genes del
sistema MMR. En una célula normal existirá positividad nuclear, mientras en
aquellas con mutaciones del sistema, la expresión desaparece. Las proteínas
a evaluarse son MLH1, MSH2, MLH6 y PMS2 (Van Lier M, 2009)
El sistema basado en PCR compara perfiles alélicos de marcadores
microsatelitales, generados por amplificación de ADN. Utiliza sondas
marcadas con un material fluorescente, que incluyen 5 repeticiones
mononucleotídicas, BAT25, BAT26, NR21, NR24 y MONO27; y dos
pentanucleótidos: PENTA C y PENTA D. Los marcadores mononucleotídicos
son utilizados para la determinación de IM, y los marcadores
pentanucleótidos son utilizados para detectar errores y/o contaminación. Los
productos de la prueba de PCR son sometidos a electroforesis. (Chialina, S.,
2006).
Carcinogénesis en Hiperplasias Endometriales
La mayoría de hiperplasias simples y algunas complejas son policlonales y
consideradas procesos reactivos debido a hiperestrogenismo y pueden ser
revertidas con progesterona. En contraste la mayoría de hiperplasias atípicas
y un grupo de complejas sin atipia son monoclonales. (Lax, S., 2004; Doll, A.,
2008).
En las hiperplasias atípicas están presentes alteraciones del gen PTEN, Beta
catenina, K ras, p53, PAX2 e IM. La mutación de PTEN, junto con IM
constituyen las vías genéticas más frecuentes de CE endometrioide. En
hiperplasias simples y endometrio normal también se ha visto inactivación del
PTEN, de significado desconocido (Norasate,S., 2010; Westin, G., 2009).
En HA y estadíos tempranos de carcinoma pueden observarse pérdida de
PTEN en 35 a 50%, mientras que IM en 20 a 40%. En ocasiones pueden
coexistir (63%). (Okuda, T., 2010).
22
Se realizó un estudio en pacientes con SL, en los que se identificó pérdida de
la expresión del complejo proteico MMR en: 7% de los endometrios
normales, 40% de las hiperplasias simples, 100% de las hiperplasias
complejas sin atipia, 92% de las hiperplasias complejas con atipia, y 100%
de los CE (Westin, G., 2009).
23
CAPÍTULO III
MARCO METODOLÓGICO
METODOLOGÍA
Diseño de Investigación
Se realizó un diseño epidemiológico analítico transversal, con la finalidad de
establecer la prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR
asociadas con inestabilidad microsatelital en hiperplasias endometriales,
simples, complejas, benignas y neoplasia intraepitelial endometrial
Matriz de Variables
V. MODERADORA EDAD CONDICION DE MENOPAUSIA
CARACTERISTICAS HISTOMORFOLOGICAS
V. INTERVINIENTE
INESTABILIDAD MICROSATELITAL
V. INDEPENDIENTE CAUSAL
GRADO DE HIPERPLASIA
V. DEPENDIENTE
24
Operacionalización de Variables
VARIABLE DEFINICION DIMENSIÓN INDICADOR ESCALA
EDAD Tiempo transcurrido
entre el nacimiento y la
fecha actual
Tiempo Años Numérica
Condición de
Menopausia
Tiempo transcurrido
entre la fecha de la
última menstruación y el
momento actual igual o
mayo a un año
Tiempo
transcurrido entre
la FUM y el
momento actual
Igual o mayor
de un año
Menor de un
año
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Grado de
Hiperplasia
endometrial
Incremento de glándulas
endometriales por
superficie estromal en
base a clasificación OMS
y EIN
Relación glandulo-
estromal
OMS
Hiperplasia
simple
Hiperplasia
compleja
Hiperplasia
simple con
atipia
Hiperplasia
compleja con
atipia
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
25
EIN
Hiperplasia
benigna
EIN
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Inestabilidad
microsatelital
en Hiperplasia
endometrial
Inexpresión de proteínas
del sistema de
reparación de malos
emparejamientos: MLH1,
MSH2,MLH6, PMS2
Grado de
expresión de
marcadores
Inmunohistoq
uímica:
MLH 1
MSH 2
PMS2
MSH6
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Características
Histomorfológi
cas
Conjunto de cambios
celulares y
arquitecturales del
endometrio
Según OMS y EIN
Cambios
glanduloestromale
s
Proliferación
concordadnte
entre
glandulas y
estroma
Presente
ausente
Presente
26
Glándulas
quísticas
Indice
glandulo
estromal
Estratificación
nuclear
Complejidad
glandular
Yemas
intraluminales
Vasos
sanguíneos
dilatados
Vasos
Ausente
Numérica
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
27
sanguíneos
trombosados
Atipia
Dimensión
lineal de la
lesión (mm)
% de estroma
Citología de
la lesión que
difiere del
endometrio
conservado
adyacente
Presente
Ausente
Numérica
Numérica
Presente
Ausente
VARIABLE DEFINICION DIMENSIÓN INDICADOR ESCALA
Grado de
Hiperplasia
endometrial
Incremento de glándulas
endometriales por
superficie estromal en
base a clasificación OMS
y EIN
Relación glandulo-
estromal
OMS
Hiperplasia
simple
Hiperplasia
compleja
Hiperplasia
simple con
Presente
Ausente
28
atipia
Hiperplasia
compleja con
atipia
EIN
Hiperplasia
benigna
EIN
Inestabilidad
microsatelital
en Hiperplasia
endometrial
Inexpresión de proteínas
del sistema de
reparación de malos
emparejamientos: MLH1,
MSH2,MLH6, PMS2
Grado de
expresión de
marcadores
Inmunohistoq
uímica:
MLH 1
MSH 2
PMS2
MSH6
Presente
Ausente
Características
Histomorfológi
cas
Conjunto de cambios
celulares y
arquitecturales del
endometrio
Según OMS y EIN
Cambios
glanduloestromale
s
Proliferación concordadnte entre glandulas y estroma
Glándulas quísticas
Indice glandulo estromal
Presente
Ausente
29
Forma del núcleo
Estratificación nuclear
Complejidad glandular
Yemas intraluminales
Vasos sanguíneos dilatados
Vasos sanguíneos trombosados
Atipia
Dimensión lineal de la lesión
% de estroma
Citología de la lesión que difiere del endometrio conservado adyacente
Universo, Población y Muestra
El Universo del presente estudio fue constituido por la totalidad de
especímenes obtenidos por legrado endometrial, de pacientes adultas, de
género femenino, durante el período comprendido entre Enero de 2002 y
Diciembre del 2011 con diagnóstico de hiperplasia endometrial clasificada
por la OMS 1994.
Al tratarse de un Universo Infinito y al ser el objeto de estudio cualitativo, la
muestra fue calculada a partir de muestreo aleatorio simple para universo
30
infinito, objeto de estudio cualitativo, considerando una probabilidad de un
40% de desarrollo de inestabilidad microsatelital, empleando la siguiente
fórmula:
2
2
e
pxqxzn
Donde:
p=probabilidad de ocurrencia (40%)2 = 0.4
q = probabilidad de no ocurrencia = 0.6
z = nivel de significación (95%) = 1.96
e = error de inferencia (8%) = 0.08
Reemplazando:
14308.0
96.16.04.02
2
xx
n
El tamaño muestral mínimo requerido fue de 143 muestras, sin embargo,
para cubrir la probabilidad de pérdida ésta se incrementó en un 10%,
resultando en una muestra de 157 especímenes.
Procedimiento
Se procedió a revisar los archivos de los reportes de diagnóstico
histopatológico de los especímenes obtenidos por legrado endometrial, de
pacientes adultas, de género femenino, durante el período comprendido
2003 a 2011 en el laboratorio de Patología del Hospital Metropolitano de
Quito.
2 Okuda, T., 2010
31
Se seleccionó todos aquellos casos con diagnóstico de hiperplasia
endometrial clasificada por la OMS 1994, luego se revisó cada una de las
laminillas histológicas para confirmar que cumplan con los parámetros
histológicos impuestos para el diagnóstico. Posteriormente a los casos
revisados, se los reclasificó adicionalmente bajo los criterios de neoplasia
intraepitelial endometrial, de tal manera que cada muestra tenga ambas
clasificaciones.
Se elaboró microarreglos de tejidos (ver Anexo E) mediante técnica manual y
artesanal, utilizando como molde una platina rectangular de acero y plástico
de 3 x 2,5cm, la cual contenía 24 varillas de cobre de 0,2cm de diámetro por
0,5cm de altura, y con una separación de 0,2cm entre varilla, y un margen
periférico de 0.3cm. Posteriormente se bañó con aceite Johnson la
superficie provista de varillas colocándose sobre un molde cubriéndola con
parafina fundida a 60°C, sellándola con una caseta, luego, se llevó la
muestra al congelador hasta que la parafina se solidificó. Una vez
endurecida la parafina, se retiró la platina que contenía las varillas de cobre y
quedó listo el molde de parafina para introducir los cilindros de tejido.
Mientras tanto en los bloques de parafina de los casos seleccionados para el
estudio se obtuvo los cilindros de tejido de 0,2cm de diámetro, utilizando una
cánula para biopsia de médula ósea. Una vez conseguidos los cilindros
tisulares, se procedió a colocarlos en los orificios del molde de parafina,
tomando como referencia el eje de las x y y, de izquierda a derecha, dejando
los orificios de las esquinas libres, donde se colocaron cilindros de tejido
normal que sirvieron de control al momento de evaluar la técnica de
inmunohistoquímica. Una vez elaborado el bloque del microarreglo sobre
una laminilla portaobjetos se introdujo en una estufa a 40° C durante 15
minutos para que se homogenice la parafina del bloque con la de los
cilindros tisulares, se repitió este paso una vez más por 10 minutos y
posteriormente se colocó al bloque en el congelador hasta que la parafina
32
estuvo completamente solidificada. (Parsons, A., 2009, Hoos, E., 2001). (Ver
anexo A)
Se realizó 5 cortes de 4 um utilizando micrótomo de rotación marca
SHANDON FINESSE 325, posteriormente se pescó sobre baño de flotación
SHANDON, uno de ellos se tiñó con hematoxilina y eosina y los 4 restantes
se los reservó para la técnica de inmunohistoquímica, para la cual se
utilizaron los anticuerpos: MLH 1, MSH2, PMS2, MSH6. (Ver anexo B).
De acuerdo a la literatura se tomaron como muestras informativas si más del
50% del disco de microarray tenía lesión. (Hardisson, D., 2003).
Plan de Análisis y Estandarización
La información requerida para el estudio fue recopilada en un formulario
específico diseñado para el efecto (Ver Anexo D), a partir de la cual se creó
una base de datos en Microsoft Excel 2010 para su posterior limpieza y
análisis en SPSS v16-0. Las variables cuantitativas fueron expresadas en
promedios y desviaciones estándar, y las cualitativas en frecuencias simples
y porcentajes. La prevalencia de expresividad fue mostrada en porcentaje
acompañado de su correspondiente intervalo de confianza al 95%.
Para el análisis inferencial, se empleó en el caso de la variables cualitativas
prueba T de diferencia de proporciones para grupos no independientes y
para las cualitativas prueba T de diferencia de promedios, previo aplicación
de prueba F, considerando un nivel de significación del 95% (alfa = 0.05).
33
Normas Éticas
El estudio respetó las normas éticas de investigación en sujetos humanos
establecidas en el protocolo de Helsinky II. Sin embargo al tratarse de un
estudio que no implica riesgo alguno para pacientes puesto que se trabajó
sobre muestras de archivo, únicamente se aseguró la confidencialidad de
identidad tanto en el manejo de base de datos cuanto en la publicación de
resultados.
Limitaciones
Las principales limitantes de este trabajo se relacionan con la calidad de la
muestra, ya que debido a la presencia de algunos factores como sangre y
procesamiento de los legrados endometriales, estos dificultan la elaboración
de los microarreglos y pueden interferir con la tinción inmunohistoquímica de
los biomarcadores.
34
CAPÍTULO IV
ORGANIZACIÓN ADMINISTRATIVA
RECURSOS
Recursos Humanos
El siguiente estudio se llevó a cabo por las autoras y contó con el soporte de
los investigadores y del Laboratorio de Patología del Hospital Metropolitano.
Recursos Materiales
El presente estudio contó con el soporte del material del Laboratorio del
Hospital Metropolitano de Quito, correspondiente a:
MATERIAL NUMERO
Procesador de tejidos marca SAKURA TISSUE-TEK VIP I 1
Micrótomos de rotación marca SHANDON FINESSE 325 2
Baños de flotación marca SHANDON 2
Planchas calientes 2
Coloreador automático marca MICRON HMS 740 1
Laminillas histológicas de hematoxilina y eosina 145
Bloques de parafina 145
Anticuerpos MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 4
Solución de recuperación antigénica 1
35
Recursos Económicos
Los costos de este estudio fueron cubiertos por sus autoras y se detallan en
la siguiente tabla:
Cronograma de Actividades
RUBRO COSTO $
Laminillas histológicas por 100 15 dólares
Laminillas cubre objetos por 100 10 dólares
Set de Anticuerpos de evaluación de inestabilidad microsatelital (MLH1,
MSH2, PMS2, MSH6)
2148 dólares
Bibliografía 50 dólares
Papelería 50 dólares
Imprevistos 100 dólares
TOTAL 2373 dólares
Actividades Nov
2011
Dic
2011
Ene
2012
Feb
2012
Mar
2012
Abr-Dic
2012
Ene-Oct
2013
Nov 2013-
Mar 2014
Abr-May
2014
Jun-Jul
2014
Realización de protocolo
Aprobación de protocolo
Inicio de recolección de
datos
Análisis de muestra
Análisis de datos
Redacción del informe
final
Informe final
36
CAPÍTULO V
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
RESULTADOS
Se estudiaron un total de 151 muestras correspondientes a legrados
endometriales con diagnóstico histopatológico de hiperplasia endometrial,
correspondientes a mujeres con una edad promedio de 46.5 ± 7.8 años
(Rango: 28 – 63 años). La distribución por edad de la muestra estudiada se
presenta en el gráfico I.
En relación con la condición de menopausia, el 64.9% (n=98) de las muestras estudiadas procedieron de mujeres en esta condición.
37
Las características histológicas para la muestra general y desagregadas por condición de menopausia se muestran en la Tabla I. TABLA II. CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS EN HIPERPLASIA ENDOMETRIAL POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA
PCGE = Proliferación concordante entre glándulas y estroma / GQ = Glándulas quístuicas / ENUC: Estratificación Nuclear / CGLAND = Complejidad glandular / YEMIN =Yemas intraluminales / VDILAT = Vasos sanguíneos dilatados / VTROMB = Vasos sanguíneos trombosados / METAPL = Metaplasia ** p>0.05 – NDES – Chi cuadrado. / * ** p<0.05 –DES – Chi cuadrado
Condición Menopausia
Características Histológicas n(%)
PCGE** GQ** ENUC* CGLAND** YEMIN** VDILAT** VTROMBO** ATIPIA* METAPL*
SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO SI NO
Presente (n=98)
11 (11.2)
87 (88.8)
78 (79.6)
20 (20.4)
11 (11.2)
87 (88.8)
24 (24.5)
74 (75.5)
21 (21.4)
77 (78.6)
95 (96.9)
3 (3.1)
98 (100)
--- 4 (4.1)
94 (95.9)
83 (84.7)
15 (15.3)
Ausente (n=53)
8 (15.1)
45 (84.9)
36 (67.9)
17 (32.1)
13 (24.5)
40 (75.5)
20 (37.7)
33 (62.3)
15 (28.3)
38 (71.7)
51 (96.2)
2 (3.8)
53 (100)
--- 8 (15.1)
45 (84.9)
44 (83)
9 (17)
Total (n=151)
19 (12.6)
132 (87.4)
114 (75.5)
37 (24.5)
24 (15.9)
127 (84.1)
44 (29.1)
107 (70.9)
36 (23.8)
115 (76.2)
146 (96.7)
5 (3.3)
151 (100)
--- 12 (7.9)
139 (92.1)
127 (84.1)
24 (15.9)
38
En cuanto a la citología de la lesión que difiere del endometrio conservado
adyacente, ésta característica estuvo presente en el 31.1% (n=47) de los casos
estudiados; en tanto que el 72.8% de las lesiones estudiadas fueron de patrón
difuso. Tabla II.
TABLA III. CITOLOGÍA DE LESIÓN QUE DIFIERE DE ENDOMETRIO CONSERVADO Y DIMENSIÓN LINEAL DE LA LESIÓN POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA
Condición Menopausia
CITOLOGÍA QUE DIFIERE n(%)**
DIMENSIÓN LINEAL** n (%)
SI NO > 1 mm < 1 mm Difuso
Presente (n=98) 29 (29.6) 69 (70.4) 25 (25.5) 1 (1) 72 (73.5)
Ausente (n=53) 18 (34) 35 (66) 15 (28.3) --- 38 (71.7)
Total (n=151) 47 (31.1) 104 (68.9) 40 (26.5) 1 (0.7) 110 (72.8)
** p>0.05– Chi cuadrado.
En cuanto al porcentaje de estroma en las muestras estudiadas, éste fue en
promedio de 22.02 ± 5.3% (Rango: 11.1 – 47.6). El comportamiento de la relación
glándulo estromal en relación con la condición de menopausia, se muestra en la
siguiente tabla.
TABLA IV. PORCENTAJE ESTROMAL PROMEDIO POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA
Condición Menopausia Porcentaje de estroma **
X ± S
Presente (n=98) 22.1 ± 5.6
Ausente (n=53) 21.7 ± 4.6
Total (n=151) 22.02 ± 5.3
** p>0.05 – NDES –Student T te
39
El tipo de hiperplasia endometrial por escala usada (WHO – EIN), desagregada por
condición de menopausia, se muestra en las siguientes tablas.
TABLA V. TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA. CLASIFICACIÓN WHO
Condición Menopausia TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL (WHO) n(%)*
HSSA HCSA HSCA HCCA
Presente (n=98) 74 (75.5) 21 (21.4) 1 (1.0) 2 (2.0)
Ausente (n=53) 32 (60.4) 11 (20.8) 5 (9.4) 5 (9.4)
Total (n=151) 106 (70.2) 32 (21.2) 6 (4.0) 7 (4.6)
HSSA= Hiperplasia simple sin atipia / HCSA = Hiperplasia compleja sin atipia / HSCA =
Hiperplasia simple con atipia / HCCA = Hiperplasia compleja con atipia
* p<0.05 – Chi cuadrado.
TABLA VI. TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL POR CONDICIÓN DE
MENOPAUSIA. CLASIFICACIÓN EIN
Condición de Menopausia
TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL (EIN) n(%)*
Hioperplasia Benigna EIN
Presente (n=98) 73 (74.5) 25 (25.5)
Ausente (n=53) 36 (67.9) 17 (32.1)
Total (n=151) 109 (72.2) 42 (27.8)
EIN= Neoplasia intraepitelial endometrial
* p<0.05 – Chi cuadrado.
La relación entre la clasificación de hiperplasia de EIN frente a OMS, se muestra en
la siguiente tabla.
TABLA VII. TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL POR CONDICIÓN DE MENOPAUSIA. CLASIFICACIÓN WHO Y EIN.
TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL (EIN)
TIPO DE HIPERPLASIA ENDOMETRIAL (WHO) n(%)*
HSSA HCSA HSCA HCCA
Hiperplasia Benigna (n=109) 91 (83.5) 18 (16.5) ---- ----
EIN (n=42) 15 (35.7) 14 (33.3) 6 (14.3) 7 (16.7)
HSSA= Hiperplasia simple sin atipia / HCSA = Hiperplasia compleja sin atipia / HSCA =
Hiperplasia simple con atipia / HCCA = Hiperplasia compleja con atipia / EIN= Neoplasia
intraepitelial endometrial
* p<0.05 – Chi cuadrado.
40
Se estudiaron un total de 4 marcadores de inestabilidad microsatelital por
inmunohistoquímica, a saber: MLH1; PMS2, MSH2 y MSH6.
La prevalencia de no expresividad general en las muestras estudiadas para cada
uno de éstos marcadores, se muestra en la siguiente tabla.
TABLA VIII. PREVALENCIA DE NO EXPRESIVIDAD DE MARCADORES DE INMUNOHISTOQUÍMNICA ESTUDIADOS. MUESTRA GENERAL
Marcadores IHQ Prevalencia % (IC95%)
MLH1 2(Nc)
PMS2 4.6 (1.3 – 7.9)
MSH2 3.3 (0.5 – 6.1)
MSH6 5.3 (2.2 – 8.4)
La prevalencia de expresividad de cada uno de los marcadores, en relación con el
tipo de hiperplasia endometrial para cada una de las clasificaciones aplicadas, se
muestra en la siguiente tabla.
TABLA IX. PREVALENCIA DE NO EXPRESIVIDAD DE MARCADORES DE INMUNOHISTOQUÍMNICA ESTUDIADOS POR ESCALAS DE CLASIFICACIÓN WHO Y EIN
ESCALA WHO
Marcadores Prevalencia % (IC95%)
MLH1 PMS2 MSH2 MSH6
HSSA (n=106) 1.9 (Nc)
3.8 (0.1 – 7.4)
3.8 (0.1 – 7.4)
5.7 (1.3 – 10.1)
HCSA (n=32) ---- 6.2 (Nc) 3.1 (Nc) 3.1 (Nc)
HSCA (n=6) --- ---- ---- 16.7 (Nc)
HCCA (n=7) 14.3 (Nc)
14.3 (Nc)
---- ----
ESCALA EIN MLH1 PMS2 MSH2 MSH6
Hiperplasia Benigna (n=109) 0.9 (Nc)
3.7 (0.16 – 7.2)
1.8 (Nc)
3.7 (0.15 – 7.2)
EIN (n=42) 4.8 (Nc)
7.1 (Nc)
7.1 (Nc)
9.5 (0.6 – 18.4)
41
El análisis de la prevalencia de cada uno de los marcadores, en relación con las
características histológicas se muestra en la siguiente tabla.
TABLA X. PREVALENCIA DE NO EXPRESIVIDAD DE MARCADORES DE INMUNOHISTOQUÍMNICA ESTUDIADOS POR CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS
CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS
Marcadores Prevalencia % (IC95%)
MLH1 PMS2 MSH2 MSH6
PCGE*
Si (n=19) ---- --- 5.3 (Nc) ---
No (n=132) 2.3 (Nc) 5.3 (1.5–9.1)
3 (0.09 – 5.9)
6.1 (2 – 10.2)
GQ*
Si (n=114) 1.8 (Nc)
4.4 (0.6 – 8.1)
3.5 (0.1 – 6.9)
6.1 (1.7 – 10.5)
No (n=37) 2.7 (Nc)
5.4 (Nc)
2.7 (Nc)
2.7 (Nc)
ENUC*
Si (n=24) 4.2 (Nc)
8.3 (3.2 – 13.4)
4.2 (0.5 – 7.9)
8.3 (3.2 – 13.4)
No (n=127) 1.6 (Nc)
3.9 (0.5 – 7.2)
3.1 (0.08 – 6.1)
4.7 (1.02 – 8.4)
CGLAND*
Si (n=44) 2.3 (Nc)
6.8 (Nc)
2.3 (Nc)
2.3 (Nc)
No (n=107) 1.9 (Nc)
3.7 (0.1 – 7.2)
3.7 (0.1 – 7.2)
6.5 (1.8 – 11.2)
YEMIN*
Si (n=36) 2.8 (Nc)
5.6 (Nc)
2.8 (Nc)
----
No (n=115) 1.7 (Nc)
4.3 (0.6 – 8)
3.5 (0.14 – 6.9)
7.0 (2.3 – 11.7)
VDILAT*
Si (n=146) 2.1 (Nc)
4.8 (1.3 – 8.2)
3.4 (0.5 – 6.3)
5.5 (1.8 – 9.2)
No (n=5) ---- ---- ---- ----
VTROMBO*
Si (n=151) 2 (Nc)
4.6 (1.3 – 7.9)
3.3 (0.5 – 6.1)
5.3 (1.7 – 8.9)
ATIPIA*
Si (n=12) 8.3 (Nc)
16.7 (Nc)
--- 16.7 (Nc)
No (n=139) 1.4 (Nc) 3.6 (0.5 – 6.7)
3.6 (0.5 – 6.7)
4.3 (0.9 – 7.7)
METAPL*
Si (n=127) 1.6 (Nc)
3.9 (0.5 – 7.3)
3.1 (0.08 – 6.1)
5.5 (1.5 – 9.5)
No (n=24) 4.2 (Nc)
8.3 (Nc)
4.2 (Nc)
4.2 (Nc)
PCGE = Proliferación concordante entre glándulas y estroma / GQ = Glándulas quístuicas / ENUC: Estratificación Nuclear / CGLAND = Complejidad glandular / YEMIN =Yemas intraluminales / VDILAT = Vasos sanguíneos dilatados / VTROMB = Vasos sanguíneos trombosados / METAPL = Metaplasia ** p>0.05 – NDES – Chi cuadrado.
42
CAPÍTULO VI
DISCUSIÓN, CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
DISCUSIÓN
La mayoría de sangrados disfuncionales en mujeres entre 50 y 60 años se deben a
hiperplasia endometrial. (Pérez, L., 2007). Esto se refleja en la distribución etaria
del presente estudio, donde el rango de edad más frecuente está comprendido entre
41 y 57 años. Su elevada incidencia se relaciona con el establecimiento de
menopausia, por lo que 64.9% de pacientes incluidas en este estudio tenían esta
condición. Estos datos epidemiológicos son reproducibles también en otras
investigaciones como Garcia 2010 en donde el 61.32% de pacientes tenían entre 41
y 50 años.
Para la clasificación de HE el sistema más utilizado es el de la OMS, sin embargo
por su baja reproducibilidad se ha propuesto otro sistema denominado NIE. La
importancia de clasificar a las hiperplasias adecuadamente radica en que las que
presentan atipia citológica se han relacionado con alteraciones genéticas y
epigénicas que pueden progresar a carcinoma (Kurmann, N., 1985).
En este estudio se encontró que el 91.4% de casos eran hiperplasias sin atipia
(70.2% tuvieron HSSA, 21.2% HCSA) y el restante 8,6% correspondía a
lesiones atípicas. Al utilizar la clasificación NIE encontramos 27,8% de
lesiones precursoras. Estos datos ponen en evidencia la diferencia entre las
clasificaciones al momento de diagnosticar lesiones precursoras. Al comparar con
otros estudios García 2010 encontró 19.6% de hiperplasias atípicas y Kurhman
43
(referente mundial) 28%, esta variabilidad podría explicarse por la baja
reproducibilidad de la clasificación OMS sobre todo en lesiones atípicas.
Lo antes mencionado se demuestra en el estudio europeo multicéntrico para
análisis de reproducibilidad de la clasificación OMS. Los valores Kappa para
acuerdos diagnósticos intra e interobservador entre patólogos expertos,
mejoraban a medida que se disminuían las categorías diagnósticas (con 7
categorías valores kappa de 0.53 a 0.74, con 3 categorías valores Kappa de
0.70 a 0.83). En otros estudios similares como Zaino 2006 el panel de
expertos coincidió en el diagnóstico de hiperplasia atípica solo en el 38% de
casos referidos y en Allison 2009 el porcentaje de desacuerdo diagnóstico
de atipia citológica fue del 47,3%. Estos datos contrastan con los de
Usubutun 2012 que realizó un estudio de reproducibilidad de la clasificación
EIN con 20 patólogos que obtuvieron entrenamiento vía online sin ser
subespecialistas en patología ginecológica y dos patólogos expertos
obteniendo un valor kappa de 0,72. La baja reproducibilidad de la
clasificación OMS podría deberse a que sus criterios son subjetivos,
existiendo variabilidad de diagnóstico entre patólogos expertos y más aún
entre patólogos generales, mientras que los del EIN son más objetivos
evidenciándose un mejor acuerdo entre patólogos. En este estudio se
diagnosticó EIN en 27.8%, este valor se acerca al porcentaje de hiperplasias
clasificadas como atípicas por Kurhman en 1985. Lo cual indica que los
criterios usados por el sistema EIN son mucho más reproducibles para incluir
a las lesiones atípicas que los usados por la OMS.
En general en este estudio la ausencia de expresión de biomarcadores
(MLH1, MSH2, MSH6 Y PMS2) para detectar IM fue de 15,2%, similar a
William 2000 que encontró en lesiones precursoras 13 a 25%. Los carcinomas
endometriales tipo endometrioide son causados por: silenciamiento del PTEN, IM,
mutaciones del gen Kras y p53 (Okuda, T., 2010). La IM puede observarse en
44
tumores esporádicos, a través de la inactivación por silenciamiento de MLH1,
MSH2, MSH6, PMS2.y en pacientes con Síndrome de Lynch (Mutter, G., 2012) En
el presente estudio se encontró ausencia de expresión de proteínas de MMR
en 31% de los casos diagnosticados como hiperplasias con atipia según la
OMS y en 16.6% de casos diagnosticados como EIN. Datos comparables
fueron encontrados por William 2000 con 13 a 25% de ausencia de expresión
en lesiones precursoras y otras referencias que indican 20 a 40% (Okuda
2010). Este porcentaje es importante ya que se relaciona con la segunda
vía carcinogénica en el endometrio, y la diferencia de expresividad entre
clasificaciones puede deberse a que el número de casos diagnosticados
como EIN fue mayor.
En este estudio no se encontró diferencias estadísticas significativas entre
características histomorfológicas condición de menopausia y ausencia de
proteínas MMR, lo cual no llama la atención porque puede estar relacionado
con el tamaño de la muestra o más probablemente por características
genotípicas más que fenotípicas.
45
CONCLUSIONES
La prevalencia de expresividad de proteínas del sistema MMR en
hiperplasias endometriales fue del 84.8%, siendo la prevalencia de no
expresividad de MLH1: 2%, PMS2: 4,6% (1.3 – 7.9), MSH2: 3.3% (0,5 - 6,1),
MSH6: 5,3% (2,2 - 8,4)
La no expresividad de proteínas MMR fue del 31% en lesiones precursoras
según la clasificación OMS y 16,6% en EIN
No se encontró relación estadísticamente significativas entre la
inexpresividad de proteínas MMR y características histopatológicas
específicas.
46
RECOMENDACIONES
En el presente estudio la clasificación EIN fue superior a la de la OMS,
detectando mayor número de lesiones precursoras, por lo que se recomienda
su difusión y utilización, particularmente entre patólogos y ginecólogos.
En las hiperplasias endometriales atípicas existen otras vías de
carcinogénesis igual de frecuentes e importantes que la IM, por lo que se
recomienda complementar con estudios que incluyan otros biomarcadores
como PTEN y B-catenina.
47
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57
ANEXOS A
TÉCNICA DE MICROARRAY TISULAR:
Es una técnica útil para estudios experimentales de investigación, puede
traducirse como micromatrices de tejido. En la década de los años 80 con el
desarrollo de la inmunohistoquímica y con la finalidad de abaratar costos,
surge esta nueva técnica. (Redrovan, L., 2010).
Hector Battifora en 1986 propone, bajo el nombre de ¨sausage method¨, el
estudio de múltiples tejidos normales o tumorales en un único bloque de
parafina, este se denominó ¨bloque tisular multitumor¨.
En 1987, Wan y cols, del Centro de Investigación de Denver implementan
una modificación a la técnica, montando cilindros extraídos de varios bloques
de tejido e incorporándolos en uno solo. Esto permitía obtener placas con
hasta 120 casos, y al mismo tiempo solucionaba el problema de la
distribución aleatoria de ellos.
En 1998, Kononen y cols. del Instituto Nacional de Bethesda, describen una
técnica automatizada utilizando un sencillo instrumento, el ¨tissue arrayer¨, a
través del cual se podían insertar hasta mil cilindros de tejido en un mismo
bloque.
Se los utiliza para: estudio de progresión rumoral, cribaje de todo el espectro
de una neoplasia, identificación de nuevas posibilidades terapéuticas,
ensayos clínicos, establecimiento de perfiles moleculares de tumores, testar
y optimizar sondas y anticuerpos, docencia y control de calidad, obtención de
muestra para extraer ADN.
Las ventajas de utilizar los microarreglos tisulares incluyen la reducción
significativa del tiempo y costo, basado en la posibilidad de un análisis
58
simultáneo y estandarizado de múltiples muestras con un tamaño suficiente
para analizar.
Los inconvenientes ocurren al analizar tumores histológicamente
heterogéneos o cuando existe un número mínimo de células tumorales;
casos en los cuales su evaluación requerirá la visualización de todo el corte.
En la construcción del microarreglo tisular tomando en cuenta tejido
endometrial, se deben obtener cilindros de al menos 1mm de diámetro, con
una distancia aproximada entre las muestras de 1mm.
59
ANEXO B
PROTOCOLO PARA LA TÉCNICA DE INMUNOHISTOQUIMICA USANDO
LOS ANTICUERPOS PARA MLH1, MSH2, MSH 6, PMS2.
Preparación:
Cortes de 3 a 4 um, secados a 60ºC toda la noche
Pretratamiento:
Desparafinizar, rehidratar y recuperar el epítope
La recuperación se hace con citrato de sodio a Ph 6
Tinción:
Aplicar el anticuerpo e incubar por 30 minutos en un cuarto a temperatura
ambiente y enjuagar.
Aplicar el vehículo, incubar a temperatura ambiente y enjuagar.
Aplicar cromógeno e incubar por uno a diez minutos a temperatura ambiente,
enjuagar 4 a 5 veces con agua destilada
Realizar montaje y colocar cubreobjetos
Interpretación:
Pérdida de la inmunoreactividad nuclear en el epitelio glandular endometrial
Control interno positivo en linfocitos y células estromales.
60
ANEXO C
Esquema del Patrón Arquitectural Glandular : Valoración de Volumen Porcentual Estromal (VPE)
El siguiente es una serie de gráficos esquemáticos que representan glándulas
(círculos grises claros) con respecto al estroma gris oscuro.
Nota: El VPE en NIE es menor al 55%
61
ANEXO D
HOJA DE RECOLECCION DE DATOS
NÚMERO DE CASO: ……………………….
HCL: …………………….
EDAD: ……………………..
FUM: ……………………….
INDICACION CLINICA PARA TOMA DE LA MUESTRA:
Presente
Ausente
Menopausia
ADECUABILIDAD DEL ESPECIMEN
Satisfactorio
Evaluación limitada
Poco tejido endometrial
Solo endometrio superficial
Sangre abundante
Necrosis
Otros
No se encuentra endometrio
CARACTERISTICAS HISTOMORFOLOGICAS
Presente Ausente
Proliferación concordante
entre glándulas y estroma
Glándulas quísticas
Estratificación nuclear
Complejidad glandular
Yemas intraluminales
Vasos sanguíneos dilatados
62
Vasos sanguíneos trombosados
Atipia
Citología de la lesión que difiere
del endometrio conservado adyacente
% de estroma: ……………………….
Dimensión lineal de la lesión: …………………….. mm
Índice glándulo-estromal: ……………………….
DIAGNOSTICO HISTOLOGICO
WHO
Hiperplasia simple: Hiperplasia Compleja:
Hiperplasia simple con atipia: Hiperplasia compleja con atipia:
EIN
Hiperplasia Benigna: EIN: Otro:
METAPLASIA: Presente: Ausente:
INMUNOHISTOQUÍMICA (Inestabilidad Microsatelital)
MARCADOR PRESENTE AUSENTE
MLH1:
MSH2:
PMS2:
MSH6:
63
ANEXO E
FOTOGRAFÍAS
BLOQUES CON MICROARREGLOS TISULARES
FOTOS DE LOS CASOS ESTUDIADOS
OMS EIN H &E MLH1 PMS2
HSSA
HIPERPLASIA
BENIGNA
20X
20X
Ausencia de expresión Control interno presente
20X
Ausencia de expresión Control interno presente
64
OMS EIN H&E MLH1 PMS2
HSSA
EIN
10 X
20X
Expresión conservada
20X
Ausencia de expresión. Control interno presente
MSH2 MSH6
40 X
Expresión conservada
20x
Expresión conservada
OMS EIN H&E MLH1 PMS2
HCSA
EIN
20 X
20X
Expresión conservada
40X
Expresión conservada
MSH2 MSH6
40 X
Expresión conservada
40x
Expresión conservada
65
OMS EIN H&E MLH1 PMS2
HCSA
EIN
20 X
10X
Expresión conservada
10X
Expresión conservada
MSH2 MSH6
20 X
Expresión conservada
20x
Expresión conservada
66
CURRICULUM VITAE
INVESTIGADOR 1
DATOS PERSONALES:
APELLIDOS: Borja Herrera
NOMBRES: Tatiana Paola
CÉDULA: 1714194063
EDAD: 32 años
FECHA DE NACIMIENTO: 7 de julio de 1982
ESTADO CIVIL: Soltera
DIRECCIÓN: Pinar bajo OE683 Y Jorge Erazo
TELÉFONOS: 3301654
CORREO ELECTRÓNICO: [email protected]
ESTUDIOS REALIZADOS:
Superior:
Universidad Central del Ecuador. Facultad de Ciencias Médicas Escuela de Medicina
Título obtenido: Médica General
Año de consecución: 2007
Posgrado:
Universidad Central del Ecuador. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto Superior de Posgrado.
Condición Actual: Egresada del Posgrado de Anatomía Patológica
Año de consecución: 2011
EXPERIENCIA:
Médico Residente del Servicio de Patología en el Hospital Vozandes Quito, desde la fecha de egresamiento hasta la fecha actual.
Médico Residente del Servicio de Patología en el Hospital de los Valles Quito, desde la fecha de egresamiento hasta la fecha actual
67
CURRICULUM VITAE
INVESTIGADOR 2
DATOS PERSONALES:
APELLIDOS: Carrión Guzmán
NOMBRES: Cecilia de los Ángeles
CÉDULA: 1103599518
EDAD: 30 años
FECHA DE NACIMIENTO: 17 Septiembre de 1983
ESTADO CIVIL: Casada
DIRECCIÓN: Juan Severino E6-46 y Eloy Alfaro
TELÉFONOS: 26014541-0992998795
CORREO ELECTRÓNICO: [email protected]
ESTUDIOS REALIZADOS:
Superior:
Universidad Nacional de Loja. Área de la Salud Humana. Medicina
Título obtenido: Médica General
Año de consecución: 2007
Posgrado:
Universidad Central del Ecuador. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto Superior de Posgrado.
Condición Actual: Egresada del Posgrado de Anatomía Patológica
Año de consecución: 2011
EXPERIENCIA:
Médico Residente Devengante de Beca del Hospital Oncológico SOLCA Núcleo Quito. 02-Feb-2012 a 02-Feb-2014.
Médico Residente con Funciones en Patología del Hospital Oncológico del SOLCA Núcleo Quito. Desde Febrero 2014 hasta la actualidad.
Docente de la Universidad de las Américas (UDLA) en la materia de Histología. Desde Enero 2012 hasta la actualidad.
Docente de la Universidad Técnica Equinoccial (UTE) en la materia de Histología. Septiembre 2012 a Febrero 2013.
