Pretreatment and enzymatic saccharification process of ...
Transcript of Pretreatment and enzymatic saccharification process of ...
OPEN ACCESS
Citation: Lee HH, Jeon MK, Yoon MH. 2016. Pretreatment and enzymatic saccharification process of rapeseed straw for production of bioethanol. Korean Journal of Agricultural Science 43:641-649.
DOI: https://doi.org/10.7744/kjoas.20160067
Editor: Eun Hee Soh, Korea Seed & Variety Service, Korea
Received: November 30, 2016
Revised: December 26, 2016
Accepted: December 27, 2016
Copyright: ยฉ2016 Korean Journal of Agricultural Science.
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non- Commercial License which permits unrestricted non- commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Korean Journal of Agricultural Science 43(4) December 2016 641
ISSN (Print) : 2466-2402
ISSN (Online) : 2466-2410
FOOD & CHEMISTRY
Pretreatment and enzymatic saccharification process of rapeseed straw for production of bioethanol
Heon-Hak Lee, Min-Ki Jeon, Min-Ho Yoon*
Department of Bio-Environmental Chemistry, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea
*Corresponding author: [email protected]
AbstractThis study was conducted to evaluate the yield of bio-ethanol produced by separate hydrolysis and fermentation (SHF) with the pretreated rapeseed straw (RS) using crude enzyme of Cellulomonas flavigena and Saccharomyces cereviase. Crude enzyme of C. flavigena showed enzymatic activity of 14.02 U/mL for CMC 133.40 U/mL, for xylan 15.21 U/mL, for locust gum and 15.73 U/mL for rapeseed straw at pH 5.0 and 40โ, respectively. The hemicellulose contents of RS was estimated to compromise 36.62% of glucan, 43.20% of XMG (xylan + mannan + galactan), and 2.73% of arabinan by HPLC analysis. The recovering ratio of rapeseed straw were investigated to remain only glucan 75.2% after 1% H2SO4 pretreatment, glucan 45.44% and XMG 32.13% after NaOH, glucan 44.75% and XMG 5.47% after NH4OH, and glucan 41.29% and XMG 41.04% after hot water. Glucan in the pretreatments of RS was saccharified to glucose of 45.42 - 64.81% by crude enzyme of C. flavigena while XMG was made into to xylose + mannose + galactose of 58.46 - 78.59%. Moreover, about 52.88 - 58.06 % of bio-ethanol were obtained from four kinds of saccharified solutions by SHF using S. cerevisiae. Furthermore, NaOH pretreatment was determined to show the highest mass balance, in which 21.22 g of bio-ethanol was produced from 100 g of RS. Conclusively, the utilization of NaOH pretreatment and crude enzyme of Cellulomonas flavigena was estimated to be the best efficient saccharification process for the production of bio-ethanol with rapeseed straw by SHF.
Keywords: bioethanol, Cellulomonas flavigena, enzymatic hydrolysis, pretreatment, rapeseed straw
Introduction
์ ์ธ๊ณ์ ์ผ๋ก ํ์์ฐ๋ฃ๋ฅผ ๋์ฒดํ ๋ฐ์ด์ค์ฐ๋ฃ(Biofuel)์ ๋ฐ์ด์ค ์ ํ(Bio-based product)์ด
์ฃผ๋ชฉ๋ฐ๊ณ ์๋ค. ์ด์ ๋ฐ๋ผ ๋ชฉ์ง๊ณ ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค๊ฐ ๋ฐ์ด์ค์ํ์ฌ, ๋ฐ์ด์ค ๋ถํ์ฌ ๊ฐ์ ์๋์ง์ ๋ฐ
ํ๋ผ์คํฑ ๋ฑ์ ํํ ์๋ฃ ์์ฐ์ ์ํ ์ฌ๋ฃ๋ก์ ์ฃผ๋ชฉ๋ฐ๊ณ ์๋ค(Kamm et al., 2007). ์ด ์ค ๋ฐ์ด์ค
์ํ์ฌ์ ๋ฏธ๊ตญ, ๋ธ๋ผ์ง์ ์ค์ฌ์ผ๋ก ํ๋ฐ์ ์ ํผํฉ๋์ด ์ด์ฉ๋จ์ผ๋ก์จ ์์ ๋ฅผ ๋์ฒดํ๋ ํจ๊ณผ์ ์ธ
์๋์ง์์ผ๋ก ์ธ์๋๊ณ ์๋ค. ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค ์์์ผ๋ก๋ถํฐ ์์ฐ๋ ๋ฐ์ด์ค์ํ์ฌ์ ์ด์ฐํํ์ ์ค
๋ฆฝ์์์ผ๋ก์ ์นํ๊ฒฝ์ ์ด๊ณ ์ฌ์ ๊ฐ๋ฅํ ๊ฒฝ์ ์ ์ธ ์๋์ง์์ผ๋ก ์ธ์๋๊ณ ์๋ค(Gwak et al.,
2016). ๊ตญ๋ด์๋ 2015๋ ๋ถํฐ ์ ์ฌ์ ์ฐ๋ฃ ํผํฉ์๋ฌดํ ์ ๋(Renewable Fuel Standard, RFS)๊ฐ ์
ํ๋์๊ณ 2017๋ ๋ถํฐ ๋ฐ์ด์ค์ํ์ฌ ํผํฉ์ด ์๋ฌดํ๋๋ฉด์ ๋ฐ์ด์ค์ํ์ฌ ๋ณด๊ธ์ด ํ๋๋ ๊ฒ์ผ๋ก
Pretreatment and enzymatic saccharification process of rapeseed straw for production of bioethanol
Korean Journal of Agricultural Science 43(4) December 2016 642
์์๋์ด์๋ค(Lee and Koo, 2014).
๋ฐ์ด์ค๋งค์ค๋ ์ฅ์์, ์ฝฉ, ์ฌํ์์ ๋ฑ ๋นยท์ ๋ถ์ง๊ณ 1์ธ๋ ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค, ๋ชฉ์ง๊ณ 2์ธ๋ ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค ์ ๋ฏธ์ธ์กฐ๋ฅ์ ๊ฐ
์ 3์ธ๋ ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค๋ก ๋ถ๋ฅ๋๋ค. 1์ธ๋ ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค๋ ๊ณก๋ฌผ์ ์ด์ฉ ํ๋ ์ ์์ ์๋์์ ๋ถ์กฑ ๋ฐ ๊ณก๋ฌผ๊ฐ ์์น ๋ฑ์ผ๋ก
์ธํด ๋ฏธ๊ตญ ๋ฐ ๋ธ๋ผ์ง์ ์ ์ธํ๊ณ ๋ ๊ฒฝ์ ์ฑ ๋ฐ ์คํจ์ฑ์ ๋ฌธ์ ๊ฐ ๋๊ณ ์๋ค. ๋ฐ๋ผ์ ์์ฐ๊ณ์ ๊ฐ์ฅ ํ๋ถํ๊ณ ์๋ฃ์ ์๊ธ
์ฑ์ด ์ข์ 2์ธ๋ ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค์ธ ๋์ ๋ถ์ฐ๋ฌผ๊ณผ ๋ชฉ์ง๊ณ ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค๊ฐ ๋ง์ ์ฃผ๋ชฉ์ ๋ฐ๊ณ ์๋ค(Nigam and Singh, 2011).
์ ์ฑ๋๋ ๋ฐ์ด์ค ๋์ ค์ฉ ์ ์ฑ์จ(rapeseed) ์ฑ์ทจ ํ, ๋จ์ ๋ถ์ฐ๋ฌผ๋ก ์ฌ๋ฃ๋ ํด๋น์์์ผ๋ก ์ฃผ๋ก ์ด์ฉ๋์๋ค. ๊ทธ๋ฌ๋
์ด์ธ์ ์์ฌํ ๋ฐฉ์์ด ๋ฏธ๋นํ๊ณ ์๋์์์๋ ์ํฅ์ ๋ผ์น์ง ์์ ๋ฐ์ด์ค ์ํ์ฌ ๋ฑ ๋ฐ์ด์ค ์๋์ง ์์์ผ๋ก ๊ฐ๊ด๋ฐ
๊ณ ์๋ค(Han et al., 2009).
๋ฏธ์๋ฌผ์ ์ด์ฉํด ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค๋ก๋ถํฐ ๋ฐ์ด์ค ํํ ๋ฌผ์ง ๋ฐ ์์ฌ๋ก ์์ฐํ๊ธฐ ์ํด์๋ ๊ฐ์ธ๊ณ ํจ์จ์ ์ธ ๋ฐํจ๋น
(fermenatable sugar)์ ์์ฐ์ด ํ์ํ๋ค(Shrestha et al., 2013). ์ผ๋ฐ์ ์ผ๋ก ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค๋ก๋ถํฐ ํํ์ ํ ๋ฐ ๋ฐ์ด์ค ์๋
์ง์ ์์ฐ์ ์ํ ๊ณต์ ์ ํจ์์ ๋ฏธ์๋ฌผ ๋ฐ์์ ์ ํด ๋ฌผ์ง ์ฑ๋ถ์ ์ ๊ฑฐํ๊ณ cellulose์ hemicellulose์ ๋ํ ํจ์์
ํจ์จ์ ํฅ์์ํค๊ธฐ ์ํ ์ ์ฒ๋ฆฌ ๊ณต์ (pretreatment), cellulose์ hemicellulose์ ํจ์๊ฐ์๋ถํด๋ฅผ ํตํด ๋ฐํจ ๊ฐ๋ฅํ ๋น
๋ฅ๋ก ๋ณํํ๋ ํจ์ ๋นํ ๊ณต์ (enzymatic saccharification), ๊ทธ๋ฆฌ๊ณ ์์ฑ๋ ๋น์ ํจ๋ชจ ๋๋ ๋ฐํ ๋ฆฌ์ ๋ฑ์ ์ด์ฉํ์ฌ ๋ฐ
์ด์ค์ํ๋๋ก ์ ํ์ํค๋ ๋ฏธ์๋ฌผ ๋ฐํจ๊ณต์ (microbial fermentation)์ผ๋ก ๊ตฌ๋ถํ ์ ์๋ค(Mosier et al., 2005).
๋ชฉ์ง๊ณ ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค๋ก๋ถํฐ ๋ง๋ค ์ ์๋ ์ฌ๋ฌ ๊ฐ์ง ๋ฐ์ด์ค ์ ํ(bio-based product)๋ค์ ์ง๊ธ๊น์ง ๋ฎ์ ํจ์จ๊ณผ ๋์
์์ฐ์๊ฐ์ ๋ฌธ์ ์ ๋๋ฌธ์ ์์ฉํ์ ์ด๋ ค์์ ๊ฒช๊ณ ์๋ค. ๋ฏธ๊ตญ NREL (National Renewable Energy Laboratory)์ ๋ณด
๊ณ ์์ ์ํ๋ฉด ์ฅ์์๋๋ก๋ถํฐ ์ํ์ฌ ์์ฐ์ ํ๋ ๊ณต์ ์ ๋นํ์ ํ์ํ ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋น์ฉ๊ณผ ๋์ ํจ์ ๋น์ฉ์ด ํด๊ฒฐํด
์ผ ํ ๋ ๊ฐ์ง ์ฃผ์ ํญ๋ชฉ์ผ๋ก ๋ถ์๋์๋ค(Humbird et al., 2011).
Cellulomonas ์์ Bergey et al. (1923)์ ์ํด ์ฒ์ ์ ์๋์๋ค. ํ์ฌ๊น์ง 27์ข ์ด ๋ฐ๊ฒฌ๋์์ผ๋ฉฐ, ์ฃผ๋ก cellulose๊ฐ ํ
๋ถํ ํ ์, ๋๋ฌด ๋ฑ์์ ๋ถ๋ฆฌ๋์๋ค. ๋๋ถ๋ถ์ Cellulomonas ์ ๊ท ์ฃผ๋ ๊ทธ๋ ์์ฑ ๊ฐ๊ท ์ด๋ฉฐ, ๋์ GC ํจ๋(69 - 76
mol%)์ ๊ฐ์ง๊ณ , ๋ฌดํฌ์ํ์ฑ๊ท ์ด๋ค(Abt et al., 2010). Cellulomonas ์์ cellulose์ hemicellulose์ ๋ถํด๊ฐ ๊ฐ๋ฅํ๋ฉฐ,
์ด์ ๊ฐ์ ๋ค์ํ cellulosic ํ์์์์ ์์ก์ด ๊ฐ๋ฅํ๋ค(Beg et al., 2001; Pรฉrez-Avalos et al., 1996; Rajoka, 2004).
๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์์๋ ์ ์ฑ๋๋ฅผ ํ์ฉํ ๊ฐ์ฅ ํจ์จ์ ์ธ ์ํ์ฌ ๊ณ ์์จ ๊ณต์ ์ ์์๋ณด๊ธฐ ์ํด ์ฌ์ ์๋ถํด์ธ๊ท
Cellulomonas flavigena ์กฐํจ์์ก์ ์ด์ฉํ์ฌ ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ์ ๋ฐ๋ฅธ ์ ์ฑ๋์ ๊ตฌ์ฑ์ฑ๋ถ ๋ณํ์ ๋นํํจ์จ์ ๋ถ์ํ๊ณ , ๋
ํ C. flavigena ์กฐํจ์์ก๊ณผ ํจ๋ชจ Saccharomyces cereviase์ ์ํ ๋ถ๋ฆฌ๋นํ๋ฐํจ๋ฒ(separate hydrolysis and fermentation,
SHF)์ ์ํด ์์ฑ๋ ์ํ์ฌ ์์จ์ ๋ถ์ํ์๋ค.
Materials and Methods
์คํ์ฌ๋ฃ
๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์ ์ฌ์ฉ๋ ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค ์ ์ฑ๋(์ ํฌํจ; ์ดํ ์ ์ฑ๋๋ก ์ง์นญ)๋ ๋์ ๊ด์ญ์ ์ค์ด๋์์ ์์งํ์์ผ๋ฉฐ, ๊ฑด์กฐ
ํ ๋ฏน์๊ธฐ๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ๋ถ์ํ์๋ค. ๋ถ์ํ ์ ์ฑ๋๋ 10 - 40 mesh ํฌ๊ธฐ์ ์ฒด๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ์ ๋นํ ํฌ๊ธฐ์ ๋ฐ์ด์ค๋งค์ค
๋ฅผ ์ ๋ณํ์๋ค.
์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐ ํจ์ํ์ฑ์ ์ฌ์ฉ๋ ์์ฝ์ Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)์ Junsei chemical (Tokyo, Japan)์ฌ์
์ ํ์ ์ด์ฉํ์๋ค.
์์ก๊ณก์
๋ฐฐ์๊ธฐ๊ฐ์ ๋ฐ๋ฅธ ์๊ท ์์ ํจ์ํ์ฑ์ ํ์ธํ๊ธฐ ์ํ์ฌ Cellulomonas flavigena๋ฅผ Dubos broth์ ๋ฐฐ์ํ์ฌ 12์
๊ฐ ๋ง๋ค ๋ถ๊ด๊ด๋๊ณ๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์ฌ OD (absorbance) 600 nm์์ ๋ฐฐ์์ก์ ํ๋๋ฅผ ์ธก์ ํจ์ผ๋ก์จ ์์ก ์ ๋๋ฅผ ํ์ธํ์
Pretreatment and enzymatic saccharification process of rapeseed straw for production of bioethanol
Korean Journal of Agricultural Science 43(4) December 2016 643
๋ค. Dubos broth๋ ์ฆ๋ฅ์ 1 L์ Dubos salt (1 g NaNO3, 1 g K2HPO4ยท7H2O, 0.5 g MgSO4ยท7H2O, 0.5 g NaCl, 0.01 g
FeSO4ยท7H2O), 0.02 g yeast extract์ 10 g ํ์์์ ์ฒจ๊ฐ ํ acutoclave๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์ฌ ๋ฉธ๊ท ํ์๋ค(Dubos, 1928). ํ์์
์ CMC (carboxylmethyl cellulose), xylan, locust gum (galacto-mannan), ์ ์ฑ๋(โค 40mesh)๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์๋ค. ๋ํ ๊ฐ
์๊ฐ ๋ณ ๋ฐฐ์์ฌ์ก ์ค์ ํจ์ํ์ฑ์ ์ธก์ ํ์๋ค.
๋จ๋ฐฑ์ง ์ ๋
C. flavigena ์กฐํจ์์ก์ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ ๋ํ๊ธฐ ์ํ์ฌ, Bradford๋ฒ(Bradford and Marion, 1976)์ ์ด์ฉํ์๋ค. ์ฆ,
๋ฐฐ์์๋ฑ์ก 0.5 mL์ bradford ์์ฝ 1 mL์ ์ฒจ๊ฐํ ํ, ์์จ์์ 5๋ถ๊ฐ ์ ์นํ์๋ค. ์ด ํ UV spectrometer
(Thermo sci. USA)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ 595 nm์์ ํก๊ด๋๋ฅผ ์ธก์ ํ์ฌ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ ๋ํ์๋ค. ๋จ๋ฐฑ์ง ์ ๋์ ํ์ค๋ฌผ์ง๋ก
๋ BSA (Bovin Serum Albumin)์ ์ด์ฉํ์๋ค.
ํจ์ํ์ฑ
C. flavigena์ ์ฌ์ ์ ๋ถํดํจ์ํ์ฑ์ ์กฐ์ฌํ๊ธฐ ์ํ์ฌ CMC, xylan, locust gum (galacto-mannan), ์ ์ฑ๋๋ฅผ ํ
์์์ผ๋ก ํ๋ Dubos broth๋ฅผ ์ ์กฐํ์ฌ C. flavigena๋ฅผ ๋ฐฐ์ํ์๋ค. ๋ฐฐ์์ก์ 4ยฐC, 10,000 ร g์์ 20 min ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ
ํ ํ ํ์ํ ์๋ฑ์ก์ ์กฐํจ์์ก์ผ๋ก ์ฌ์ฉํ์๋ค. ๋ฐฐ์ 12์๊ฐ ๊ฐ๊ฒฉ์ผ๋ก ์กฐํจ์์ก์ 0.1 % CMC, xylan, locust
gum, ์ ์ฑ๋๋ฅผ ๊ธฐ์ง๋ก ํ๋ ๊ธฐ์ง ์ฉ์ก๊ณผ 40โ์์ 30 min ๋ฐ์์์ผ ๋ฐ์ ํ ์์ฑ๋๋ ํ์๋น์ DNS๋ฒ(Miller,
1959)์ ์ด์ฉํ์ฌ ์ ๋ํ์๋ค. ์ฆ, ๊ธฐ์ง์ฉ์ก 0.5 mL๋ฅผ water bate์์ ๋ฏธ๋ฆฌ ์์ดํ ํ, ์กฐํจ์ ์ก 0.25 mL๋ฅผ ์ฒจ๊ฐํ
์ฌ 30๋ถ๊ฐ ๋ฐ์์์ผฐ๋ค. ๋ฐ์์ํจ ์ฉ์ก์ DNS์์ฝ 3 mL์ ๋ฃ์ ํ 5๋ถ๊ฐ ๋์ฌ์ฃผ์ด ๋ฐ์์ ์ ์ง ์ํค๊ณ , ํ์๋น์
๋ฐ์์์ผฐ๋ค. ์ด ํ UV spectrometer (Thermo, USA)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ 520 nm์์ ํ์๋น์ ์ ๋ํ์๋ค. ์ฌ์ฉํ ๊ธฐ์ง์ฉ
์ก์ pH ๋ณ๋ก glycine-HCl buffer (pH 3.0), sodium acetate buffer (pH 5.0), sodium phosphate buffer (pH 7.0),
glycine-NaOH buffer (pH 9.0)์ ๊ฐ ๊ฐ์ ๊ธฐ์ง์ ์ฒจ๊ฐํ์ฌ ์ฌ์ฉํ์์ผ๋ฉฐ, ๋ฐ์ ์จ๋๋ 40ยฐC๋ก ์ค์ ํ์๋ค.
์ ์ฑ๋์ ์ ์ฒ๋ฆฌ
์ ์ฑ๋์ ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ์ผ๋ก๋ ์ฐ(1% H2SO4), ์ผ๊ธฐ(2% NaOH), 15% ์๋ชจ๋์์ ์นจ์ง, ์ด์(autoclave) ์ฒ๋ฆฌ๋ฅผ ํ์๋ค.
์ฐ ์ ์ฒ๋ฆฌ๋ 1% H2SO4 100 mL์ ์ ์ฑ๋๋ฅผ 10:1 ๋น์จ๋ก ํ์ฌ 1์๊ฐ ์นจ์ง ํ autoclave (Sanyo, Japan)์ ์ด์ฉํ
์ฌ ์ ์ฒ๋ฆฌํ์๋ค. ์ผ๊ธฐ์ฒ๋ฆฌ๋ 2% NaOH์ ์ ์ฑ๋๋ฅผ 6:1 ๋น์จ๋ก ํ์ฌ 85ยฐC์์ 1์๊ฐ ์นจ์งํ์๋ค. ์๋ชจ๋์์ ์นจ
์ง๋ 15% ์๋ชจ๋์์์ ์ ์ฑ๋๋ฅผ 6:1 ๋น์จ๋ก ํ์ฌ 60ยฐC์์ 6์๊ฐ ์นจ์งํ์๋ค. ์ด์์ฒ๋ฆฌ๋ ์ฆ๋ฅ์ 100 mL์ ์
์ฑ๋๋ฅผ 10:1 ๋น์จ๋ก ํ์ฌ autoclave๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ 121ยฐC์์ 15๋ถ๊ฐ ๋ฐ์ํ์๋ค.
์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ์ ์ ์ฑ๋ ๊ณ ํ๋ฌผ์ ์ฑ๋ถ ๋ณํ๋ ๋ฏธ๊ตญ NREL์์ ์ ์๋ ๋ฐฉ๋ฒ์ผ๋ก ๋ถ์ํ์๋ค(Sluiter et al., 2008).
์ํ๊ด์ ๊ณ ์ฒด ์ํ 0.3 g๊ณผ 72% (w/w) H2SO4 3 mL๋ฅผ ํผํฉํ ๋ค 30ยฐC์์ 2์๊ฐ๋์ 1์ฐจ ์ฐ ๊ฐ์๋ถํด๋ฅผ ํ์๋ค.
์ดํ ์ฆ๋ฅ์ 84 mL์ ๋ฃ์ด 4.0% H2SO4 ๋ก ํฌ์ํ ํ autoclave๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ 121ยฐC์์ 1์๊ฐ ๋์ 2์ฐจ ๊ฐ์๋ถํด๋ฅผ
ํ์๋ค. ๊ฐ์ ๋ถํด๋ ์ก์ฒด๋ฅผ 10 mL๋ฅผ CaCO3๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ pH 7๋ก ์คํ์์ผ HPLC๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ๋ถ์ํ์๋ค.
ํจ์๋นํ
๋นํ์คํ์ C. flavigena๋ฅผ ์ ์ฑ๋๋ฅผ ํ์์์ผ๋ก ํ๋ Dubos broth์์ 48์๊ฐ ๋ฐฐ์ ํ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ๊ทธ ์์ฆ์ก
์ ์ด์ฉํ์ฌ ์ํํ์๋ค. ์ ์ฒ๋ฆฌ๋ ์ ์ฑ๋๋ฅผ ๊ธฐ์ง๋๋ 10 %๋ก 0.4 M sodium acetate buffer (pH 5.0)์ ํผํฉํ ํ C.
flavigena์ ์กฐํจ์์ก๋ฅผ 1:1๋ก ์ฒจ๊ฐํ์ฌ 40ยฐC์ shaking incubator์์ 180 rpm์ ์๋๋ก ๊ต๋ฐ์ ์ํค๋ฉฐ ๋นํ๋ฅผ ์ง
ํํ์๋ค. ํจ์๋นํ ์ฒ๋ฆฌํจ์จ(Es, %)์ ์ (1)๋ก ๋ํ๋ผ ์ ์๋ค.
Pretreatment and enzymatic saccharification process of rapeseed straw for production of bioethanol
Korean Journal of Agricultural Science 43(4) December 2016 644
์ฌ๊ธฐ์ ฮSts๋ ํจ์ ๊ฐ์๋ถํด์ ์์ฑ๋๋ ๋น์ ๋๋(g/L)์ด๋ฉฐ, TC๋ ๋นํ ์ ์ ์ฑ๋์ ๋น์ฑ๋ถ ํจ๋์ด๋ค. ๋นํ์ก
์ autoclave๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ๋ฉธ๊ท ํ ์ํ์ฌ ๋ฐํจ์ ์ฌ์ฉํ์๋ค.
๋นํ์ก ์ํ์ฌ ๋ฐํจ
์ํ์ฌ ๋ฐํจ๋ glucose์ xylose ๋ชจ๋ ๋ฐํจ๊ฐ๋ฅํ Saccharomyces cerevisiae๋ฅผ ์ํ์ฌ ๋ฐํจ์ ์ด์ฉํ์๋ค. S.
cerevisiae๋ potato dextrose broth (PDB)์ 24 ์๊ฐ ๋ฐฐ์ํ์ฌ ํ์ฑํ ์ํจ ํ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌํ์ฌ ๋ฐฐ์ง๋ฅผ ์ ๊ฑฐํ์๊ณ ์ด
๋ฅผ ๋ฉธ๊ท ๋ ๋นํ์ก์ ์ ์ข ํ์๋ค. ๋นํ์ก๊ณผ ํผํฉํ ๋ค 30ยฐC, 180 rpm์ ์กฐ๊ฑด์ผ๋ก ๋ฐํจ๋ฅผ ์งํํ์๋ค. ๋ฐํจ๋ 120์
๊ฐ ๋์ ์งํํ์์ผ๋ฉฐ, 12์๊ฐ ๊ฐ๊ฒฉ์ผ๋ก ์๋ฃ๋ฅผ ์ฑ์ทจํ์ฌ HPLC๋ถ์์ ํตํด ์ํ์ฌ๊ณผ ์ ๋ฆฌ๋น์ ์ ๋๋ถ์ ํ์๋ค.
๋ถ๋ฆฌ ๋นํ ๋ฐํจ๋ก ์์ฐ๋ ์ํ์ฌ์ ์์จ (YEtoH, g/g)์ ๋ค์ ์ (2)๋ก ๋ํ๋ผ ์ ์๋ค.
์ฌ๊ธฐ์ [EtOH]max๋ ์ํ์ฌ ๋ฐํจ๋ก ์ธํด ์์ฑ๋๋ ์ต์ข ์ํ์ฌ์ ๋๋ (g/L)์ด๋ฉฐ, [Sugar]ini๋ ์ํ์ฌ ๋ฐํจ ์ด๊ธฐ
์ ๋ฆฌ๋น์ ๋๋(g/L)์ด๋ค.
Fig. 1. Effect of carbon sources on cell growth (A) and protein production (B) of Cellulomonas flavigena.
Fig. 2. Effect of carbon source and pH 3.0 (A), pH 5.0 (B), pH 7.0 (C), pH 9.0 (D) on enzyme activity of Cellulomonas flavigena.
Pretreatment and enzymatic saccharification process of rapeseed straw for production of bioethanol
Korean Journal of Agricultural Science 43(4) December 2016 645
HPLC ๋ถ์
๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์์ ์ํ์ฌ๊ณผ ์ ๋ฆฌ๋น์ ๋ถ์์ ๋ชจ๋ HPLC๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ๋ถ์ํ์๋ค. ๋ชจ๋ ์๋ฃ๋ 0.45 ฮผm syringe filter๋ฅผ ์ด
์ฉํด ์ฌ๊ณผ ํ, HPLC๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ๋ถ์ํ์๋ค. HPLC๋ Shimazhu HPLC system (Shimazu, Japan)์ ์ฌ์ฉํ์์ผ๋ฉฐ, ์ปฌ๋ผ์
Shodex sugar SH1011 (8.0 ร 300 mm, 6 ฮผm) column (Showa Denko, Japan)๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์๋ค. ์ฉ๋งค๋ 0.005N H2SO4๋ฅผ ๋ถ๋น
0.6 mL๋ก ํ๋ ค์ฃผ์์ผ๋ฉฐ, ์ปฌ๋ผ์ ์จ๋๋ 50ยฐC๋ก ์ ์งํ์๋ค. ๊ฒ์ถ์ RI detector (Shimazu, Japan)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ํ์ธํ์๋ค.
Auto sampler (Shimazu, Japan)๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ์๋ฃ 25 ฮผL์ ์ฃผ์ ํ์ฌ ๋ถ์ํ์๋ค.
๋ชจ๋ ํ์ค๋ฌผ์ง์ Sigma์ฌ์ Junsei์ฌ์์ ๊ตฌ์ ํ์ฌ ์ฌ์ฉํ์๋ค. ํ์ค๋ฌผ์ง์ 1.25, 2.5, 5, 10, 20 g/L ์ ๋๋๋ก ์ ์กฐ ํ,
calibration curve๋ฅผ ์์ฑํ์๊ณ , ์ด๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ๊ฐ ๋ฌผ์ง์ ์ ๋ํ์๋ค.
Results and Discussion
์์ก๊ณก์
๋ฐฐ์๊ธฐ๊ฐ์ ๋ฐ๋ฅธ ์๊ท ์๋ฅผ ํ์ธํ๊ธฐ ์ํ์ฌ C. flavigena๋ฅผ ํ์์ 0.1%๊ฐ ํจ์ ๋ Dubos broth์ ๋ฐฐ์ํ์ฌ 12์๊ฐ
๋ง๋ค ๋ฐฐ์์ก์ 600 nm์์ ํก๊ด๋๋ฅผ ์ธก์ ํ์๋ค. CMC, locust gum์ ํ์์์ผ๋ก ๊ฐ์ง๋ ๋ฐฐ์ง์์๋ ๋ฐฐ์ 48 ์๊ฐ ํ
์ ์ ์ฒด๊ธฐ๊ฐ ๋ํ๋ฌ์ผ๋ฉฐ, ๋ ๋ฐฐ์ง ๋ชจ๋ OD600์ 0.4 - 0.5 ์ฌ์ด๋ก ๋ํ๋ฌ๋ค. Xylan์ ํ์์์ผ๋ก ๊ฐ์ง๋ ๋ฐฐ์ง์์๋
CMC, locust gum๊ณผ ๋ง์ฐฌ๊ฐ์ง๋ก ๋ฐฐ์ 48์๊ฐ ํ์ ์ ์ฒด๊ธฐ๊ฐ ๋ํ๋ฌ์ผ๋ฉฐ, ์ด ๋ OD600 ๊ฐ์ 1.2 - 1.4๋ฅผ ๋ํ๋ด์๋ค. ๋จ์ผ
ํ์์์ ๊ฐ์ง๋ ๋ฐฐ์ง์ ๋ฌ๋ฆฌ ์ ์ฑ๋๋ฅผ ํ์์์ผ๋ก ํ๋ ๋ฐฐ์ง์์๋ ๋ฐฐ์ ํ 120์๊ฐ๊น์ง ์ ์ฒด๊ธฐ๊ฐ ๋ํ๋์ง ์์๋ค.
๋ฐฐ์ 48์๊ฐ ํ์๋ OD600 ๊ฐ์ด 0.5๋ก CMC, locust gum์ ํ์์์ผ๋ก ํ๋ ๋ฐฐ์ง๋ณด๋ค ๋๊ฒ ๋ํ๋ฌ์ผ๋ฉฐ, ๋ฐฐ์ 84์๊ฐ ํ
์๋ 1.5๋ก xylan์ ํ์์์ผ๋ก ๊ฐ์ง๋ ๋ฐฐ์ง๋ณด๋ค ๋๊ฒ ๋ํ๋ฌ๋ค(Fig. 1). ์ด๋ ์ ์ฑ๋๊ฐ ๋ถํด๋จ์ ๋ฐ๋ผ ๋ฐฐ์์ก์ ํ๋๋ฅผ
์ฆ๊ฐ๋์๊ฑฐ๋, ์ ์ฑ๋์ C. flavigena์ ์์ฅ์ ๋๋ ์์์ฑ๋ถ์ด ํ๋ถํ์ฌ ์ ์ฒด๊ธฐ๊ฐ ๋ํ๋์ง ์์ ๊ฒ์ผ๋ก ๋ณด์ธ๋ค.
๋จ๋ฐฑ์ง ์ ๋
๋ฐฐ์๊ธฐ๊ฐ์ ๋ฐ๋ฅธ ์กฐํจ์์ก ๋ด์ ๋จ๋ฐฑ์ง ์์ ํ์ธํ๊ธฐ ์ํด bradford์์ฝ์ ์ฌ์ฉํ์ฌ ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์ ๋ํ์๋ค. ๋จ๋ฐฑ์ง
์์ CMC < xylan < locust gum < ์ ์ฑ๋ ์์ผ๋ก ๋ํ๋ฌ๋ค. ๋จ๋ฐฑ์ง๋์ 48์๊ฐ๋์ ์ฆ๊ฐํ๋ค ์ ์ฒด๋ฅผ ๋ณด์๋ค. ๋ฐฐ์ 48
์๊ฐ ํ์ CMC๋ 45.83, xylan์ 102.50, locust gum์ 145.00, ์ ์ฑ๋๋ 429.17 mg/L์ ๋จ๋ฐฑ์ง๋์ ๋ณด์๋ค(Fig. 1).
์ ์ฑ๋๋ ๋ฐฐ์ 96์๊ฐ ์ดํ์ ๋จ๋ฐฑ์ง๋์ด ํฌ๊ฒ ์ฆ๊ฐํ์๋ค. ์ด๋ ์์ก๊ณก์ ์์ ๊ท ์ ์์ฅ์ด ์ง์์ ์ผ๋ก ์ด๋ฃจ์ด์ง๋
์ด์ ์ ๊ฐ์ ๊ฒ์ผ๋ก ์๊ฐ๋๋ค.
C. flavigena์ ์ฌ์ ์๋ถํด ํจ์ํ์ฑ
C. flavigena์ ์ฌ์ ์ ๋ถํดํจ์ํ์ฑ์ ์์๋ณด๊ธฐ ์ํ์ฌ CMC, xylan, locust gum, ์ ์ฑ๋๋ฅผ ๊ธฐ์ง๋ก ํ์ฌ ํจ์ํ์ฑ
์ ์ธก์ ํ์๋ค. pH๋ 3.0, 5.0, 7.0, 9.0์ผ๋ก ๋๋์ด ์งํ๋์์ผ๋ฉฐ ๋ฐ์์จ๋๋ 40โ๋ก ์ค์ ํ์๋ค. ๊ธฐ์ง์ฉ์ก์ผ๋ก๋ 0.1
%์ ๊ธฐ์ง์ ํฌํจํ lycine-HCl buffer (pH 3.0), sodium acetate buffer (pH 5.0), sodium phosphate buffer (pH 7.0),
glycine-NaOH buffer (pH 9.0)๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์๋ค. ๊ฐ ํ์์์ ๋ถํดํ์ฑ์ locust gum < CMC < ์ ์ฑ๋ < xylan ์์ผ๋ก ๋
ํ๋ฌ์ผ๋ฉฐ, ๋ชจ๋ pH 5.0์์ ๊ฐ์ฅ ๋์ ํ์ฑ์ ๋ํ๋ด์๋ค. CMCaseํ์ฑ์ ๋ฐฐ์๊ธฐ๊ฐ๋์ ์ ์ ์ฆ๊ฐํ์ฌ, ๋ฐฐ์ 120์๊ฐ
ํ(pH 5.0)์ 14.02 U/mL๋ก ๊ฐ์ฅ ๋๊ฒ ๋ํ๋ฌ๋ค. Xylanase ํ์ฑ์ ๋ฐฐ์ 48์๊ฐ ํ(pH 5.0)์ 133.40 U/mL๋ก ๊ฐ์ฅ ๋๊ฒ
๋ํ๋ฌ์ผ๋ฉฐ, ์ด ํ ์ ์ฐจ ๊ฐ์ํ์ฌ ๋ฐฐ์ 120์๊ฐ ํ์๋ 127.62 U/mL๋ก ๋ํ๋ฌ๋ค. Xylanase๋ ๋ค๋ฅธ ํจ์๋ณด๋ค ํ์ฑ์ด ๋งค
์ฐ ๋๊ฒ ๋ํ๋ฌ๋ค. Galacto-mannanaseํ์ฑ์ CMCase์ ๋ง์ฐฌ๊ฐ์ง๋ก ๋ฐฐ์๊ธฐ๊ฐ ๋์ ์ ์ ์ฆ๊ฐํ์ฌ ๋ฐฐ์ 120์๊ฐ ํ
(pH 5.0)์ 15.21 U/mL๋ก ๊ฐ์ฅ ๋๊ฒ ๋ํ๋ฌ๋ค(Fig. 2). ์ ์ฑ๋๋ฅผ ๊ธฐ์ง๋ก ํ ๋, C. flavigena์ ์ ์ฑ๋ ๋ถํด ํจ์ํ์ฑ์
๋ฐฐ์ ๊ธฐ๊ฐ ๋์ ์ ์ ์ฆ๊ฐํ์ฌ ๋ฐฐ์ 120์๊ฐ ํ์ 15.731 U/mL๋ก ๊ฐ์ฅ ๋์ ํจ์ํ์ฑ์ ๋ํ๋ด์๋ค.
Pretreatment and enzymatic saccharification process of rapeseed straw for production of bioethanol
Korean Journal of Agricultural Science 43(4) December 2016 646
Fig. 3. Composition change of rapeseed straw according to pretreated methods.
A B
C D
Fig. 4. Comparison of ethanol produced by separate enzyme hydrolysis fermentation according to pretreated methods. (A) Acidic pretreatment, (B) Alkaline pretreatment, (C) Soaking in aqueous ammonia, (D) Hydrothermal pretreatment.
์ ์ฑ๋์ ์ ์ฒ๋ฆฌ ์ ยท ํ ๊ตฌ์ฑ์ฑ๋ถ ๋ณํ
์ ์ฑ๋๋ฅผ ์ฐ(1% H2SO4), ์ผ๊ธฐ(2% NaOH), 15% ์๋ชจ๋์์ ๋ฐ ์ด์๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ์ ์ฒ๋ฆฌํ ํ, ์ ์ฒ๋ฆฌ ์ ยทํ์ ๊ตฌ
์ฑ์ฑ๋ถ์ ๋ณํ๋ฅผ ์กฐ์ฌ ํ์๋ค. ๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์ ์ฌ์ฉ๋ ์ ์ฑ๋๋ glucan 36.62%, XMG (xylan + mannan + galactan)
43.20% , arabinan 2.73%์ผ๋ก ๋์ hemicellulose ํจ๋์ ๋ณด์์ผ๋, ์ ์ฑ๋๋ฅผ 1% H2SO4๋ก ์ ์ฒ๋ฆฌ ํ์๋ ๊ตฌ์ฑ์ฑ
๋ถ์ ์๋์ ์ธ ๋น์จ์ด glucan (75.2%)์ ์ ์ธํ ๋๋ถ๋ถ์ ๊ตฌ์ฑ์ฑ๋ถ์ด ์ ๊ฑฐ๋์๊ณ , ๊ณ ํ์ฑ๋ถ์ ํ์์จ๋ 43.7%๋ก
Pretreatment and enzymatic saccharification process of rapeseed straw for production of bioethanol
Korean Journal of Agricultural Science 43(4) December 2016 647
์ ๋ฐ ์ดํ์ ํ์์จ์ ๋ณด์๋ค. 2% NaOH๋ฅผ ์ฌ์ฉํ ์ ์ฒ๋ฆฌ ํ์๋ glucan 45.44%, XMG 32.13%, arabinan 1.47%๋ก
์๋์ ์ผ๋ก glucan๊ณผ XMG์ ๋น์จ์ด ๋ค์ ๊ฐ์ํ์๊ณ ๊ณ ํ์ฑ๋ถ์ ํ์์จ๋ 70%๋ก ์ฐ์ฒ๋ฆฌ ๋ณด๋ค ๋์ ํ์์จ์ ๋ณด
์๋ค. 15% ์๋ชจ๋์์ ์ฒ๋ฆฌ ํ์๋ glucan 44.75%, XMG 35.47%, arabinan 1.02%๋ก NaOH ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ณด๋ค ์๋์ ์ผ
๋ก glucan๊ณผ arabinan์ ๋น์จ์ ๋ค์ ๊ฐ์ํ์๊ณ , XMG์ ๋น์จ์ ์ฆ๊ฐํ์๋ค. ํ์์จ ๋ํ 68.9%๋ก NaOH ์ ์ฒ๋ฆฌ
๋ณด๋ค ์กฐ๊ธ ๋ ์ ์ค์จ์ด ๋์๋ค. ์ด์์ฒ๋ฆฌํ ์ ์ฑ๋๋ glucan 41.29%, XMG 41.04%, arabinan 2.06%์ผ๋ก ๊ตฌ์ฑ์ฑ๋ถ
์ ๋ณํ๊ฐ ๊ฐ์ฅ ์ ์๊ณ , ํ์์จ๋ 86.7%๋ก ๊ฐ์ฅ ๋์ ๋ถํด๊ฐ ์๋ ๊ฒ์ผ๋ก ํ๋จ๋์๋ค(Fig. 3). Kang et al (2012)์
์ ์ฑ๋๊ฐ cellulose 33.32%, hemicellulose 18.52% ๊ทธ๋ฆฌ๊ณ Talebnia et al. (2015)์ cellulose 38.1%, hemicellulose
20.4% ์ผ๋ก ๊ตฌ์ฑ๋์ด ์๋ค๊ณ ๋ณด๊ณ ํ์๋ค. ๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์ ์ฌ์ฉ๋ ์ ์ฑ๋๋ hemicellulose ์ฑ๋ถ์ธ XMG๊ฐ 43.20%๋ก
Kang et al. (2012)๊ณผ Talebnia et al. (2015)์ด ๋ถ์ํ ์ ์ฑ๋๋ณด๋ค hemicellulose ํจ๋์ด ๋๊ฒ ๋ํ๋ฌ๋ค.
Fig. 5. Comparison of mass balance on the overall SHF process according to pretreated methods.
์ํ์ฌ ๋ถ๋ฆฌ ๋นํ ๋ฐํจ
๊ฐ ์ ์ฒ๋ฆฌ๊ณผ์ ์ ๊ฑฐ์น ๊ธฐ์ง๊ณผ C. flavigena์ ์กฐํจ์์ก์ ์ด์ฉํ์ฌ 120์๊ฐ ํจ์๋นํ๋ฅผ ์งํํ์๊ณ ์ด ํ ๋ฉธ๊ท
๊ณผ์ ์ ๊ฑฐ์ณ S. cerevisiae๋ฅผ ์ ์ข ํ์ฌ ๋ฐ์ด์ค์ํ์ฌ์ ์์ฐํ์๋ค. ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ ๋ณ๋ก ํจ์๋นํ ๋ฐ ์ํ์ฌ ์์ฐ ๊ฒฐ
๊ณผ๋ฅผ Fig. 4์ ๋ํ๋ด์๋ค. ์ฐ ์ ์ฒ๋ฆฌ ํ ์ ์ฑ๋์ ๊ฒฝ์ฐ cellobiose๋ ์์ฐ๊ณผ ๋ถํด๋ฅผ ๋ฐ๋ณตํ์์ผ๋ฉฐ ๋นํ 120์๊ฐ ํ
glucose๋ 24.36 g/L์ ๋๋๋ก ์์ฐ๋์๋ค. ํจ๋ชจ ์ ์ข ํ glucose๋ ๊ฐ์ํ์ฌ ๋ฐํจ 96์๊ฐ ํ 0.53 g/L ์ผ๋ก ๊ฐ์ํ
๊ณ , ๋ฐํจ 48์๊ฐ ํ ์ํ์ฌ์ 14.15 g/L๊ฐ ์์ฐ๋์๋ค. ์ด ๋ ๋น ์ ํ์จ์ 64.81%, ์ํ์ฌ ์์จ์ 58.06% ์๋ค. ์ผ
๊ธฐ ์ ์ฒ๋ฆฌํ ์ ์ฑ๋๋ ๋นํ 120์๊ฐ ํ 14.11 g/L์ glucose๊ฐ ์์ฐ๋์์ผ๋ฉฐ ๋นํ 84์๊ฐ ํ 12.61 g/L์ xylose๊ฐ
์์ฐ๋์๋ค. ๋ฐํจ ์ ์ด ๋น์ 26.73 g/L์๊ณ ๋ฐํจ 84์๊ฐ ํ 0.21 g/L๋ก ๊ฐ์ํ๊ณ ๋ฐํจ 120์๊ฐ ํ์ ์ํ์ฌ์
11.46 g/L ์๋ค. ์ด ๋ glucan ์ ํ์จ์ 62.12% xmg (xylose + mannose + galactose) ์ ํ์จ์ 78.59%, ์ํ์ฌ ์์จ
์ 56.72% ์๋ค. ์๋ชจ๋์ ์นจ์งํ ์ ์ฑ๋๋ ๋นํ 120์๊ฐ ํ 18.64 g/L์ glucose๊ฐ ์์ฐ๋์์ผ๋ฉฐ ๋นํ 84์๊ฐ ํ
14.02 g/L์ xylose๊ฐ ์์ฐ๋์๋ค. ๋ฐํจ ์ ์ด ๋น์ 27.71 g/L์๊ณ ๋ฐํจ 84์๊ฐ ํ 0.90 g/L๋ก ๊ฐ์ํ๊ณ ์ด๋ ์ํ์ฌ
์ 11.92 g/L์๋ค. ์ด ๋ glucan ์ ํ์จ์ 60.98% XMG ์ ํ์จ์ 79.11%, ์ํ์ฌ ์์จ์ 54.66% ์๋ค. ์ด์ ์ ์ฒ๋ฆฌ
ํ ์ ์ฑ๋๋ ๋นํ 120์๊ฐ ํ 9.38 g/L์ glucose๊ฐ ์์ฐ๋์์ผ๋ฉฐ ๋นํ 84์๊ฐ ํ 11.97 g/L์ xylose๊ฐ ์์ฐ๋์
๋ค. ๋ฐํจ์ ์ด ๋น์ 21.57 g/L์๊ณ ๋ฐํจ 72์๊ฐ ํ 0.59 g/L๋ก ๊ฐ์ํ๊ณ ์ด๋ ์ํ์ฌ์ 11.29 g/L์๋ค. ๋ํ glucan
Pretreatment and enzymatic saccharification process of rapeseed straw for production of bioethanol
Korean Journal of Agricultural Science 43(4) December 2016 648
์ ํ์จ์ 45.42% XMG ์ ํ์จ์ 58.46%, ์ํ์ฌ ์์จ์ 52.88% ์๋ค. Glucan ์ ํ์จ๊ณผ ์ํ์ฌ ์์จ์ ์ฐ > ์ผ๊ธฐ
> ์๋ชจ๋์์นจ์ง > ์ด์, XMG ์ ํ์จ์ ์๋ชจ๋์์นจ์ง > ์ผ๊ธฐ > ์ด์ ์์ผ๋ก ๋๊ฒ ๋ํ๋ฌ๋ค.
Mass balance
์ ์ฑ๋๋ฅผ ์ด์ฉํ ๊ฐ๊ฐ์ ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ์ ๋ฐ๋ฅธ ํจ์๋นํ ๋ฐ ์ํ์ฌ๋ฐํจ ํจ์จ์ mass balance๋ฅผ ์กฐ์ฌํ ๊ฒฐ๊ณผ, ์ ์ฑ
๋ 100 g ๋น ์ฐ ์ ์ฒ๋ฆฌ 12.36 g (14.15 g/L), ์ผ๊ธฐ ์ ์ฒ๋ฆฌ 21.22 g (15.16 g/L), ์๋ชจ๋์์นจ์ง 20.84 g (15.12 g/L), ์ด์
์ ์ฒ๋ฆฌ 19.58 g (11.29 g/L)์ ์ํ์ฌ ์์ฐ๋์ผ๋ก ์กฐ์ฌ๋์ด NaOH ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ์ด ๊ฐ์ฅ ๋๊ฒ ๋ํ๋ฌ๋ค(Fig. 5).
Conclusion
๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์์๋ ํํ์ ๋ฐฉ๋ฒ์ ์ํด ์ ์ฒ๋ฆฌ๋ ์ ์ฑ๋(rapeseed straw)๋ฅผ ์ฌ์ ์๋ถํด์ธ๊ท Cellulomonas flavigena
์ ์กฐํจ์์ก๊ณผ Saccharomyces cereviase๋ฅผ ์ด์ฉํ ๋ถ๋ฆฌ๋นํ ๋ฐํจ๋ฒ(separate hydrolysis and fermentation, SHF)์
์ํด ์์ฑ๋ ์ํ์ฌ ์์จ์ ๋ถ์ํ์๋ค. Biomass ๊ธฐ์ง CMC, xylan, locust gum ์ ์ ์ฑ๋์ ๋ํ C. flavigena์ ์กฐ
ํจ์์ก์ ๋ถํดํ์ฑ์ pH5.0, 40ยฐC ์์ ๊ฐ 14.02 (CMC), 137.35 (xylan), 15.21 (locust gum), 15.73 (์ ์ฑ๋) U/mL
์ ํ์ฑ์ ๋ณด์๋ค. ์ ์ฑ๋๋ HPLC ๋ถ์๊ฒฐ๊ณผ, glucan 36.62%, xylan + mannan + galactan (XMG) 43.46%, arabinan
2.6%๋ก ๊ตฌ์ฑ๋์์ผ๋ฉฐ, ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ์ ๋ฐ๋ผ H2SO4 ์ ์ฒ๋ฆฌ ํ glucan 75.2%, NaOH ์ ์ฒ๋ฆฌ ํ glucan 45.44% ์
XMG 32.13%, NH4OH ์ ์ฒ๋ฆฌ ํ glucan 44.75% ์ XMG 5.47%, ์ด์ ์ ์ฒ๋ฆฌ ํ์๋ glucan 41.29% ์ XMG
41.04%๋ก ๊ตฌ์ฑ๋น์จ์ด ๋ณํ๋ ๊ฒ์ผ๋ก ์กฐ์ฌ๋์๋ค. ์ ์ฑ๋ ์ ์ฒ๋ฆฌ๋ฌผ์ C. flavigena ์กฐํจ์์ก์ผ๋ก ๋นํํ ํ ๋นํ์ฐ
๋ฌผ์ HPLC ๋ถ์ํ ๊ฒฐ๊ณผ, glucan์ 45.42 - 64.81%๊ฐ glucose๋ก ๋นํ ๋์๊ณ , XMG๋ 58.46 - 78.59%์ xylose +
mannose + galactose๋ก ๋ถํด๋๋ ๊ฒ์ผ๋ก ์กฐ์ฌ๋์๋ค. ์ด๋ค ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ณ ๋นํ์ก์ S. cerevisiae๋ฅผ ์ ์ข ํ์ฌ ๋ถ๋ฆฌ๋นํ
๋ฐํจ(SHF)ํ์ฌ ์์ฐ๋ ์ํ์ฌ ์์จ์ ์ฝ 52.88 - 58.06 % ์์ค์ธ ๊ฒ์ผ๋ก ๊ณ์ฐ๋์๋ค. ๋ํ Mass balance๋ NaOH
์ ์ฒ๋ฆฌ ์, ์ ์ฑ๋ 100 g๋น ์ํ์ฌ ์์ฐ๋์ด 21.22 g์ผ๋ก ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ ์ค ๊ฐ์ฅ ๋๊ฒ ๋ํ๋ฌ๋ค. ๊ฒฐ๊ณผ์ ์ผ๋ก ์ ์ฑ๋๋ฅผ
์ด์ฉํ ๋นํ ๋ฐ ์ํ์ฌ ๋ฐํจ ๊ณต์ ์, NaOH ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ๊ณผ C. flavigena์ ์กฐํจ์์ก์ ์ด์ฉํ ๋นํ๋ฒ์ด ๊ฐ์ฅ ํจ์จ
์ ์ธ ๋ฐฉ๋ฒ์ด์๋ค.
References
Abt B, Foster B, Lapidus A, Clum A, Sun H, Pukall R, Lucas S, Del Rio TG, Nolan M, Tice H, Cheng JF, Pitluck S, Liolios K, Ivanova
N, Mavromatis K, Ovchinnikova G, Pati A, Goodwin L, Chen A, Palaniappan K, Land M, Hauser L Chang YJ, Jeffries CD, Rohde
M, Goker M, Woyke T, Bristow J, Eisen JA, Markowitz V, Hugenholtz P, Kyrpides NC, Klenk HP. 2010. Complete genome
sequence of Cellulomonas flavigena type strain (134 T). Standards in Genomic Sciences 3:15-25.
Beg Q, Kapoor M, Mahajan L, Hoondal GS. 2001. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. Applied
Microbiology and Biotechnology 56:326-338.
Bergey DH, Harrison FC, Breed RS, Hammer BW, Huntoon FM. 1923. Genus II. Flavobacterium gen. nov. Bergeyโs Manual of
Determinative Bacteriology 97-117.
Bradford, Marion M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72.1-2:248-254.
Dubos RJ. 1928. The decomposition of cellulose by aerobic bacteria. Journal of Bacteriology 15:223.
Gwak IS, Hwang JH, Lee SH. 2016. Techno-economic evaluation of an ethanol production process for biomass waste. Applied
Microbiology and Biotechnology 27:171-178. [in Korean]
Pretreatment and enzymatic saccharification process of rapeseed straw for production of bioethanol
Korean Journal of Agricultural Science 43(4) December 2016 649
Han JG, Oh SH, Jeong MH, Kim SS, Seo HB, Jeong KH, Jang YS, Kim IC, Lee HY. 2009. Two-step high temperature pretreatment
process for bioethanol production from rape stems. KSBB Journal 24:489-494. [in Korean]
Humbird D, Davis R, Tao L, Kinchin C, Hsu D, Aden A, Schoen P, Lukas J, Olthof B, Sexton D, Dudgeon D. 2011. Process design
and economics for biochemical conversion of lignocellulosic biomass to ethanol: Dilute-acid pretreatment and enzymatic
hydrolysis of corn stover (No. NREL/TP-5100-47764). National Renewable Energy Laboratory (NREL), Golden, CO.
Kamm B. 2007. Production of platform chemicals and synthesis gas from biomass. Angewandte Chemie International Edition
46:5056-5058.
Kang K. E, Jeong GT, Sunwoo C, Park DH. 2012. Pretreatment of rapeseed straw by soaking in aqueous ammonia. Bioprocess and
Biosystems Engineering 35:77-84.
Lee AY, Koo JK. 2014. Intermediate indicators and sustainability of renewable fuel standard. Journal of the Korea Organic Resource
Recycling Association 22:20-26. [in Korean]
Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry 31:426-428.
Mosier N, Wyman C, Dale B, Elander R, Lee YY, Holtzapple M, Ladisch M. 2005. Features of promising technologies for
pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology 96:673-686.
Nigam PS, Singh A. 2011. Production of liquid biofuels from renewable resources. Progress in Energy and Combustion Science
37:52-68.
Pรฉrez-Avalos O, Ponce-Noyola T, Magaรฑa-Plaza I, de la Torre M. 1996. Induction of xylanase and ฮฒ-xylosidase in Cellulomonas flavigena growing on different carbon sources. Applied Microbiology and Biotechnology 46:405-409.
Rajoka MI. 2004. Influence of various fermentation variables on exo-glucanase production in Cellulomonas flavigena. Electronic
Journal of Biotechnology 7:07-08.
Shrestha RK, Hur O, Kim TH. 2013. Pretreatment of corn stover for improved enzymatic saccharification using ammonia circulation
reactor (ACR). Korean Chemical Engineering Research 51:335-341. [in Korean]
Sluiter A, Hames B, Ruiz R, Scarlata C, Sluiter J, Templeton D, Crocker D. 2008. Determination of structural carbohydrates and lignin
in biomass. Laboratory Analytical Procedure 1617.
Talebnia F, Mighani M, Rahimnejad M, Angelidaki I. 2015. Ethanol production from steam exploded rapeseed straw and the process
simulation using artificial neural networks. Biotechnology and Bioprocess Engineering 20:139-147.