Jobb genom sociala medier, jobb genom Linkedin, jobb genom Facebook
PRESERVASI DNA GENOM MANUSIA ASAL SALIVA DENGAN ...
Transcript of PRESERVASI DNA GENOM MANUSIA ASAL SALIVA DENGAN ...
PRESERVASI DNA GENOM MANUSIA ASAL SALIVA
DENGAN ANTIBIOTIKA DAN ANTIFUNGI
SKRIPSI
OLEH:
CHAIRUNNISA SIREGAR
170100243
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DAN PROFESI DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2021
Universitas Sumatera Utara
PRESERVASI DNA GENOM MANUSIA ASAL SALIVA
DENGAN ANTIBIOTIKA DAN ANTIFUNGI
SKRIPSI
Diajukan sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar
Sarjana Kedokteran
OLEH:
CHAIRUNNISA SIREGAR
170100243
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DAN PROFESI DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2021
Universitas Sumatera Utara
i
Universitas Sumatera Utara
ii
KATA PENGANTAR
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-
Nya yang senantiasa menyertai penulis sehingga penelitian ini dapat diselesaikan
dengan baik. Shalawat dan salam penulis sampaikan kepada utusan-Nya, Nabi
Muhammad SAW. Semoga kelak kita mendapatkan syafa’at Beliau di hari akhir
nanti. Aamiin Aamiin yaa Rabbal’Alamiin.
Karya tulis ilmiah ini berjudul “Preservasi DNA genom manusia Asal
saliva dengan Antibiotika dan Antifungi” merupakan salah satu syarat kelulusan
pendidikan pada Program Studi Pendidikan dan Profesi Dokter, Fakultas
Kedokteran, Universitas Sumatera Utara. Dalam proses penyelesaian penelitian
ini, penulis banyak mendapatkan bantuan dan dukungan baik moriil maupun
materiil dari berbagai pihak. Oleh sebab itu penulis ingin mengucapkan
terimakasih dan penghargaannya kepada:
1. Kepada ibunda dan ayahanda, atas cinta, kasih sayang, do’a, upaya, dan
pengorbanannya sehingga bisa mengantarkan penulis sampai pada titik ini.
Terimakasih juga kepada Abang Marihot Siregar dan Fachrurrozi Farraz Al-
khusein Siregar atas perhatian dan dukungannya selama ini kepada penulis
sehingga penulis tetap semangat untuk menjalani perkuliahan dan
menyelesaikan penelitian ini dengan baik dan tepat waktu.
2. dr. Zulham, M. Biomed, PhD selaku dosen pembimbing yang telah
membiayai penelitian, memberikan banyak arahan, masukan, dan motivasi
dalam membimbing penulis untuk dapat menyelesaikan skripsi ini dengan
baik.
3. dr. Ranti Permatasari, Sp.PK(K) selaku ketua penguji dan Dr. dr. Bintang
Y.M. Sinaga, M.Ked(Paru), SpP selaku dosen penguji yang telah banyak
memberikan masukan dan saran sehingga skripsi ini bisa menjadi lebih baik.
4. Teman- teman sejawat FK USU angkatan 2017 yang telah memotivasi dan
membantu terselesainya skripsi ini khususnya Lisa Yiha, Keni Yolani dan
Wudya yang selalu bersama-sama berjuang dalam belajar, saling
mendukung, memberikan motivasi, serta ilmunya kepada penulis.
Universitas Sumatera Utara
iii
5. Sahabat penulis Nazla Azzahra dan Mowra Shanti Nayla yang selalu
mendengar keluh kesah penulis, memberi semangat dan selalu mendukung
segala impian penulis.
Penulis menyadari bahwa karya tulis ilmiah ini belum sempurna, baik dari
segi materi maupun tata cara penulisan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan
kritik dan saran yang membangun agar lebih baik. Semoga karya ilmiah ini
bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan terutama di bidang
kedokteran.
Medan, 10 Desember 2020
Penulis
Chairunnisa Siregar
NIM. 170100243
Universitas Sumatera Utara
iv
DAFTAR ISI
LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. I
KATA PENGANTAR ........................................................................................ II
DAFTAR ISI ...................................................................................................... IV
DAFTARGAMBAR .......................................................................................... VI
DAFTAR TABEL ............................................................................................ VII
DAFTAR SINGKATAN ............................................................................... VIII
ABSTRAK .......................................................................................................... IX
ABSTRACT .......................................................................................................... X
BAB I
PENDAHULUAN ................................................................................................ 1
1.1. LATAR BELAKANG ............................................................................... 1 1.2. RUMUSAN MASALAH .......................................................................... 2
1.3. TUJUAN PENELITIAN ........................................................................... 3 1.3.1. Tujuan Umum ..................................................................................... 3 1.3.2. Tujuan Khusus .................................................................................... 3
1.4. MANFAAT PENELITIAN ....................................................................... 3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................... 4
2.1. GENOM .................................................................................................... 4
2.2. SALIVA .................................................................................................... 5 2.3. FLORA NORMALSALIVA ..................................................................... 5
2.3.1. Bakteria ............................................................................................... 6 2.3.2. Fungi (Candidaalbicans) .................................................................... 7
2.4. DNASE DAN INHIBITOR DNASE ........................................................ 7 2.4.1. DNase .................................................................................................. 8 2.4.2. Inhibitor DNase ................................................................................... 9
2.5. ISOLASI DNA ........................................................................................ 11
2.6. PCR .......................................................................................................... 12
2.7. KERANGKA TEORI .............................................................................. 14
BAB III
METODE PENELITIAN ................................................................................. 15
3.2. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN ............................................... 15 3.2.1. Tempat Penelitian ............................................................................. 15 3.2.2. Waktu Penelitian ............................................................................... 15
3.3. SUBYEK UJI .......................................................................................... 15
3.4. PENGUMPULAN DAN PERLAKUAN SALIVA ................................ 15 3.5. ISOLASI DNA GENOM MANUSIA ASAL SALIVA .......................... 16 3.6. KUANTITAS DAN KUALITAS DNA GENOM SALIVA ................... 17
Universitas Sumatera Utara
v
3.7. PRIMER PCR .......................................................................................... 17
3.8. KONDISI PCR DAN VISUALISASI .................................................... 17 3.9. DIAGRAM ALUR PENELITIAN .......................................................... 18
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 19
4.1. HASIL PENELITIAN ............................................................................. 19 4.1.1. Ekstraksi DNA Asal Saliva ............................................................... 19 4.1.2. Kualitas DNA Hasil Ekstraksi .......................................................... 20 4.1.3. Pengaruh Gentamicin terhadap Kualitas DNA Genom Manusia Asal
Saliva ................................................................................................ 20 4.2. PEMBAHASAN ...................................................................................... 21
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 23
5.1. KESIMPULAN ....................................................................................... 23
5.2. SARAN .................................................................................................... 23
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 24
LAMPIRAN A ................................................................................................... 30
LAMPIRAN B ................................................................................................... 31
LAMPIRAN C ................................................................................................... 32
LAMPIRAN D ................................................................................................... 33
Universitas Sumatera Utara
vi
DAFTAR GAMBAR
Nomor Judul Halaman
3.1 Ekstraksi DNA Metode Spin-column…………….. 17
4.1 Hasil Elektroforesis Gel…………………………... 22
4.2 Hasil Elektroforesis PCR Gen Human β-actin…… 23
Universitas Sumatera Utara
vii
DAFTAR TABEL
Nomor Judul Halaman
Tabel 3.1 Kondisi PCR untuk ACTB……………………… 19
Tabel 4.1 Absorbansi, Kemurnian, dan Konsentrasi DNA
Asal Saliva………………………………………..
21
Universitas Sumatera Utara
viii
DAFTAR SINGKATAN
CO2 :Karbondioksida
dATP :Deoksiadenosintrifosfat
dCTP :Deoksisitidintrifosfat
dGTP :Deoksiguanosintrifosfat
DNA :Deoxyribonucleicacid
dNTP :Deoksiribonukleotidatrifosfat
dTTP :Deoksitimidintrifosfat
Fe2+ :Besi
Mg2+ :Magnesium
MgCl : Magnesium klorida
mL :Mililiter
mM : Milimolar
PCR : Polymerase chain reaction
TNE : Tris-NaClEDTA
μL : Mikroliter
μM :Mikromolar
Universitas Sumatera Utara
ix
ABSTRAK
Latar belakang: Genom merupakan satu set DNA lengkap dari suatu organisme. Preservasi
DNA genom akan melindungi dan menyimpan DNA agar tahan lama dalam wadah
penyimpanansehingga DNA dapat digunakan sewaktu-waktu. Saliva mengandung sel manusia
dari rongga mulut dan flora normal seperti bakteri, fungi, dan mungkin amoeba. Penggunaan
antibiotika dan antifungi dapat mematikan flora normal sekaligus melindungi DNA genom
manusia dalam saliva. Selain itu, antibiotika seperti gentamisin mampu menghambat aktivitas
DNase dalam saliva. Tujuan: Penelitian ini mengkaji cara mempreservasi DNA saliva untuk
jangka waktu 14 hari. Metode: Penelitian eksperimental ini menggunakan desain pretest and
posttest. Saliva dikumpul dengan meludah kedalam pot saliva. Saliva dipreservasi dengan
konsentrasi akhir 1500 µg/mL gentamisin dan 100 µM ketoconazol dan disimpan pada suhu
ruang dalam variabel waktu 0, 3 , 7, 10, dan 14 hari.Ekstraksi DNA dilakukan dengan metode
spin-column. Kuantitas dan kemurnian DNA diukur dengan spektrofotometri. Keberadaan DNA
genom manusia ditentukan dengan PCR pada gen ACTB. Hasil: Rata-rata konsentrasi DNA
saliva adalah 1,50+3,43 µg/mL (1,46-30,6 µg/mL). Rata-rata kemurnian DNA hasil ekstraksi
adalah 1,67+1,72 (1,58-1,84). Elektroforesis gel hasil PCR menunjukkan band 335 bpgen ACTB
pada lama preservasi 0 dan 3 hari, dan band 300 bp pada lama preservasi 10 dan 14 hari.
Kesimpulan: Kuantitas dan kualitas DNA saliva hasil ektraksi adalah cukup bagus. Pemberian
gentamisin dan ketoconazol kepada saliva dapat mengawetkan DNA genom manusia asal saliva.
Kata kunci : DNA,Genom, Preservasi,Saliva.
Universitas Sumatera Utara
x
ABSTRACT
Background: The genome is a complete set of DNA in an organism. DNA preservation will
protect and provide DNA for long term storage in a container so that DNA can be used at any
time. Saliva contains human cells from oral mucosa. Saliva contains epithelial cells and
leucocytes, along with normal flora such as bacteria, fungi, and possibly amoeba. Antibiotics
and anti-fungi can kill normal flora while protecting the human genomic DNA in saliva. In
addition, antibiotics such as gentamicin can inhibit DNase activity in saliva. Objective: This
study examines how to preserve salivary DNA for a period of 14 days. Methods: This
experimental study used a pretest and posttest design. Saliva is collected by spitting into a saliva
pot. Saliva was preserved with a final concentration of 1500 µg/mL gentamicin and 100 µM
ketoconazole and stored at room temperature for time variables of 0, 3, 7, 10, and 14 days. DNA
extraction was carried out using the spin-column method. The quantity and purity of DNA is
measured by spectrophotometry. The presence of human genomic DNA was determined by PCR
on the ACTB gene.Results: The mean salivary DNA concentration was 1.50 + 3.43 µg/mL (1.46-
30.6 µg/mL). The mean purity of the extracted DNA was 1.67 + 1.72 (1.58-1.84). The gel
electrophoresis of PCR ampliconsshowed 335 bp bands of ACTB gene at 0 and 3 days of
preservation, and 300 bp bands at 10 and 14 days of preservation. Conclusion: The quantity and
quality of extracted salivary DNA is quite good. Gentamicin and ketoconazole addition to saliva
can preserve the human genomic DNA from saliva.
Keywords: DNA,Genome, Preservation,Saliva.
Universitas Sumatera Utara
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. LATAR BELAKANG
Genom merupakan satu set deoxyribonucleic acid (DNA) lengkap dari
suatu organisme. Genom mengandung semua informasi yang diperlukan untuk
membentuk dan menjalankan fungsi organisme. Dalam satu sel manusia,
setidaknya ada 3 milyar pasangan DNA, dan semuanya ini terdapat di dalam
nukleus (Marwayana, 2015).
DNA merupakan kode genetik yang membuat keunikan individu. DNA
berbentuk seperti pasangan dari dua pita panjang yang terpuntir (double helix).
Masing-masing pita merupakan susunan dari unit bernama basa. Terdapat empat
jenis basa DNA yaitu adenine (A), cytosine (C), guanine (G), dan thymine (T); A
berikatan dengan T sementara G berikatan dengan C. Ikatan ini membentuk
struktur menyerupai tangga di antara pita DNA. Urutan dari unit basa itulah yang
menjadi kode genetik, yakni instruksi dari semua fungsi tubuh seluruh makhluk
hidup (Siswanto et al., 2016).
Preservasi adalah kegiatan untuk mengumpulkan, melestarikan bahan
penelitian. Tujuan preservasi DNA adalah menyediakan, melindungi,
mengumpulkan, dan menyimpan DNA agar tahan lama pada wadah
penyimpanan sehingga DNA dapat terjaga selamanya dan dapat digunakan
sewaktu-waktu. Faktor jauhnya jarak sumber DNA dengan fasilitas biologi
molekuler atau waktu yang lama dalam pengiriman sampel DNA dapat menjadi
masalah isolasi DNA karena deteriorasi sampel yang dapat terjadi secara cepat
dan munculnya senyawa inhibitor maupun senyawa/organisme yang merusak
DNA sehingga memengaruhi kualitas dan kuantitas DNA (Nejat dan Vadamalai,
2013).
Sampel DNA yang sering digunakan dalam penelitian adalah darah.
Konsentrasi DNA dalam darah dapat mencapai 10-15 µg/mL darah.
Pengambilan sampel DNA dari darah terkadang kurang disukai karena
venipuncture dapat menimbulkan penularan penyakit, membutuhkan tenaga ahli
Universitas Sumatera Utara
2
untuk pengambilan sampel (Quinque et al., 2006), dan invasif (Cascella et al.,
2015). Faktor penting lain yang perlu dipertimbangkan ketika menggunakan
sampel darah adalah adanya ion besi (Fe2+) yang bersaing dengan ion Mg2+, yang
dapat menghambat polymerase chain reaction (PCR) (Aidar dan Line 2007).
Selain itu, mungkin ada hambatan budaya untuk mengekstraksi darah, dan
perawatan luar biasa dilakukan ketika mengirim sampel darah dari lokasi yang
berbeda. Terakhir, menganalisis DNA genom dari penerima transplantasi
sumsum tulang tidak mungkin dilakukan (Hosono et al., 2003).
Saliva mengandung sel manusia dari lapisan mulut (Quinque et. al.,
2006). Pelepasan lapisan superfisial sel epitel pada mukosa mulut manusia yang
terjadi kira-kira setiap 2,7 jam akhirnya mengarah ke saliva. Saliva terdiri dari ~
75% sel epitel (~ 430.000 sel/mL5) dan ~ 25% leukosit (2 hingga 136.000
sel/mL). Selain sel dari individu itu, saliva mengandung berbagai flora normal
seperti bakteri, fungi, dan mungkin amoeba (Thiede et al., 2000). Küchler et al.
(2012) mengevaluasi hasil dan kualitas DNA genom yang diperoleh dari saliva
segar dan saliva yang disimpan selama 4 dan 8 hari pada suhu kamar. Tidak ada
perbedaan signifikan antara periode penyimpanan yang berbeda. Pembekuan
mungkin berpengaruh terhadap penyimpanan DNA jangka panjang, yang
merupakan kepentingan mendasar bagi penciptaan sebuah bank saliva di pusat-
pusat penelitian besar.
Penelitian ini mengkaji cara mempreservasi DNA saliva untuk jangka
waktu 14 hari dengan menghambat senyawa/organisme dalam saliva yang
mungkin merusak DNA genom manusia seperti bakteri, fungi, dan Dnase.
Gentamisin berfungsi untuk menghambat aktivitas DNase (McGuire et al., 2015)
dan juga mampu membunuh bakteria/flora normal dalam saliva (Pereira, 2015).
Pada konsentrasi di atas 35 μg/mL gentamisin menyebabkan penghambatan
aktivitas DNase secara parsial (McGuire et al., 2015).
1.2. RUMUSAN MASALAH
Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Apakah gentamisin sulfat dapat mempreservasi DNA manusia dalam saliva?
Universitas Sumatera Utara
3
2. Bagaimana hasil validasi DNA saliva hasil preservasi dengan PCR?
1.3. TUJUAN PENELITIAN
1.3.1. Tujuan Umum
Mempreservasikan DNA genom manusia yang berasal dari saliva.
1.3.2. Tujuan Khusus
Tujuan penelitian khusus adalah sebagai berikut:
1. Menentukan kuantitas DNA genom manusia asal saliva hasil preservasi
dengan spektrofotometer.
2. Menentukan kemampuan gentamisin sulfat mempreservasi DNA genom
manusia asal saliva.
3. Menentukan kualitas DNA saliva hasil preservasi dengan elektroforesis gel
agarosa dan PCR.
1.4. MANFAAT PENELITIAN
Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk pembuatan kit
koleksi DNA saliva jangka lama dan bank DNA berasal dari saliva.
Universitas Sumatera Utara
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. GENOM
Genom adalah keseluruhan informasi genetik (asam nukleat) yang
dimiliki suatu sel (Alberts et al., 2002). Secara fisik genom dapat terbagi
menjadi molekul- molekul asam nukleat yang berbeda (kromosom atau plasmid)
sementara secara fungsi genom dapat terbagi menjadi gen-gen (Lewin, 2008).
Setiap organisme memiliki genom yang diperlukan untuk membangun tubuhnya,
mempertahankan hidupnya, dan diwariskan ke generasi berikutnya. Dengan
sejumlah interaksi kompleks, urutan nukleotida komponen penyusun asam
nukleat digunakan untuk membuat semua protein pada suatu organisme pada
waktu dan tempat yang sesuai (Brown, 2002).
Kebanyakan genom manusia dan makhluk hidup bersel, eukaryota dan
prokaryota lainnya, terbuat dari DNA, namun sejumlah virus memiliki genom
RNA (Brown, 2002). Saat ini sekuens (urutan) nukleotida pada genom sejumlah
organisme telah dipetakan seluruhnya dengan teknik sekuensing, dengan urutan
DNA manusia diselesaikan dalam proyek genom manusia pada tahun 2003.
Perbandingan genom organisme dapat memberikan informasi mengenai
karakteristik, evolusi, dan berbagai proses biologi organisme tersebut (Campbell,
2008).
Genom prokariotik (contohnya bakteri) biasanya berupa molekul tunggal
dsDNA sirkuler dengan tambahan DNA ekstra kromosom berupa plasmid
sirkuler. Istilah genom (nuclear genom) nukleus pada eukaryota mengacu pada
informasi genetik berupa kromosom dan kadang juga berupa fragmen DNA
ekstra kromosom didalam nukleus.
Genom ekstranuklear sel eukoriotia mencakup genom mitokondria dan
kloroplas yang berupa molekul dsDNA sirkuler. Kebanyakan prokariota
memiliki satu kromosom saja karena prokariota umumnya mengandung satu
salinan setiap gen dan dengan demikian bersifat haploid. Eukariota umumnya
memiliki dua salinan setiap gen dan secara genetik bersifat diploid
Universitas Sumatera Utara
5
(Madigan et al., 2010). Ada pula organisme pada tumbuhan yang memiliki lebih
dari dua set kromosom dalam nucleus atau disebut bersifat poliploid (Campbell
et al.,2008).
2.2. SALIVA
Saliva adalah cairan oral yang kompleks, terdiri dari campuran sekresi
yang berasal dari kelenjar ludah besar (mayor) dan kecil (minor) yang ada pada
mukosa oral (Kidd dan Bechal, 1992). Saliva tersusun dari 75% sel epitel
(430,000 sel/ mL dan 25% leukosit (2 hingga 136.000 sel/ mL) tergantung pada
kesehatan mulut setiap individu. Terdapat sekitar 58% dari sel epitel dalam
sampel air liur yang dikumpulkan (Kidd dan Bechal, 1992).
Dawes (2003) menunjukkan bahwa air liur memiliki 430.000 sel
epitel/mL, dan rata-rata setiap sel epitel memiliki sekitar 80-100 bakteri yang
menempel. Setiap satu mL saliva mengandung campuran DNA dari sel epitel,
leukosit dan 1,7 x 107 bakteri dan mikroorganisme lain di rongga mulut.
Komponen lain dari saliva adalah enzim, hormon, imunoglobulin, dan
biomolekuler lainnya yang dapat mengganggu kualitas dan kuantitas DNA
genom pada proses ekstraksi DNA (Choo et al., 2006).
2.3. FLORA NORMAL SALIVA
Flora normal adalah sekumpulan mikroorganisme yang hidup pada kulit
dan selaput lendir/mukosa manusia yang sehat maupun sakit. Pertumbuhan flora
normal pada bagian tubuh tertentu dipengaruhi oleh suhu, kelembaban, nutrisi
dan adanya zat penghambat. Keberadaan flora normal pada bagian tubuh tertentu
mempunyai peranan penting dalam pertahanan tubuh karena menghasilkan suatu
zat yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain. Adanya flora normal
pada bagian tubuh tidak selalu menguntungkan. Dalam kondisi tertentu flora
normal dapat menimbulkan penyakit (Brooks et al., 2008).
Interaksi flora normal dapat berupa mutualisme maupun komensalisme.
Flora normal berperan menutupi tempat penempelan potensial untuk invasi
mikroba patogen, resistensi kolonisasi, menempati lingkungan mikro secara
Universitas Sumatera Utara
6
lebih efektif daripada pathogen, memproduksi nutrisi (vitamin K, asam folat,
pyridoxine, biotin, riboflavin), sebagai komensal, dan menghasilkan senyawa
yang beracun untuk mikroorganisme lainnya (Vasanthakumari,2007).
Jenis flora normal dalam saliva berbentuk bakteria, fungi, dan amoeba.
Jenis bakteri dalam saliva diantaranya Streptococcus mutans/Streptococcus
viridans, Staphylococcus sp dan Lactobacillus sp (Jawetz, 2005). Pada keadaan
tertentu bakteri-bakteri tersebut bisa berubah menjadi patogen karena adanya
faktor predisposisi yaitu kebersihan rongga mulut. Sisa-sisa makanan dalam
rongga mulut akan diuraikan oleh bakteri yang menghasilkan asam. Bakteri flora
normal mulut bisa masuk aliran darah melalui gigi yang berlubang atau karies
gigi dan gusi yang berdarah sehingga terjadi bakteremia (Harvey, 2007).
2.3.1. Bakteria
Streptococcus mutans/Streptococcus viridans
Streptococcus viridians memiliki karakteristik coccus, susunan berderet,
tidak berflagel, tidak berspora, tidak berkapsul, gram positif. Morfologi koloni
pada media agar darah memiliki karakterisitik berupa koloni bulat, ukuran 1-2
mm, tidak berwarna (jernih), permukaan cembung, tepi rata, dan membentuk
hemolisa α, Sifat fisiologinya antara lain anaerob fakultatif, tumbuh baik pada
suasana CO2 10% dan suhu 37°C, resisten terhadap optochin, dan tidak larut
dalam empedu. Contoh spesies Streptococcus lainnya adalah Streptococcus β
hemolyticus dan Streptococcus γ hemolyticus (Brooks et al., 2008).
Staphylococcus sp.
Genus Staphylococcus terdiri dari sekurangnya 30 spesies. Tiga spesies
utama yang penting secara klinik adalah S. aureus, Staphylococcus epidermis,
dan Staphylococcus saprophyticus. S. aureus merupakan bentuk koagulasi
positif. Hal ini membedakannya dengan spesies lain (Brooks et al., 2008).
S. aureus adalah bakteri Gram positif yang menghasilkan pigmen kuning,
bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya
tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 µm.
Universitas Sumatera Utara
7
S. aureus tumbuh dengan optimum pada suhu 37C dengan waktu
pembelahan 0,47 jam. (Brooks et al., 2008). Bakteri ini berbentuk sferis, bila
berkumpul dalam susunan yang tidak teratur mungkin sisinya agak rata karena
tertekan. Pada sediaan langsung yang berasal dari nanah, S. aureus dapat terlihat
sendiri, berpasangan, berkumpul dan bahkan tersusun seperti rantai pendek.
Susunan gerombolan yang tidak teratur biasanya ditemukan pada sediaan yang
dibuat dari pembenihan padat, sedangkan dari pembenihan kaldu biasa
ditemukan tersendiri atau tersusun sebagai rantai pendek (Brooks et al., 2008).
Lactobacillus sp.
Morfologi sel dari Lactobacillus berbentuk batang pendek, tidak
berspora, tidak berflagel, tidak berkapsul dan Gram positif. Morfologi koloni
pada media agar darah berbentuk koloni bulat kecil, warna putih susu, cembung,
tepi rata dan permukaan mengkilap. Sifat fisiologi dari Lactobacilus bersifat
anaerob fakultatif, dengan suhu optimal 45oC, mereduksi nitrat menjadi nitrit,
memfermentasi glukosa, laktosa dan sakarosa, dan tidak mempunyai enzim
katalase. Contoh spesiesnya adalah Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus
lactis, dan Lactobacillus casei.
2.3.2. Fungi (Candida albicans)
Candida albicans merupakan jamur terbanyak yang terisolasi dari tubuh
manusia sebagai flora normal dan penyebab infeksi oportunistik (Hakim et.al.,
2015). Candida albicans terdapat sekitar 30-40% pada rongga mulut orang
dewasa sehat, 45% pada neonatus, 45-65% pada anak-anak sehat, 50-65% pada
pasien yang memakai gigi palsu lepasan, 65-88% pada orang yang
mengkonsumsi obat- obatan jangka panjang, 90% pada pasien leukemia akut
yang menjalani kemoterapi, dan 95% pada pasien HIV/AIDS (Williams dan
Lewis, 2011).
Universitas Sumatera Utara
8
2.4. DNASE DAN INHIBITOR DNASE
2.4.1. DNase
Deoxyribonucleases (DNase) merupakan kelas enzim yang memiliki sifat
heterogen yang dapat mengkatalisis hidrolisis DNA. Dua jenis utama DNase
adalah DNase I dan DNase II, keduanya memiliki endonuklease yang
menghasilkan 30 oligonukleotida dan 50 oligonukleotida. Pembelahan
DNase1L1 terjadi pada membran melalui glikosilfosfatinositol. Dnase1L2
bekerja secara intraseluler selama diferensiasi keratinosit. Dnase1L3 pada
intraseluler dan memiliki peran yang lebih lemah dari pada ekstraseluler.
Keluarga DNase I pada manusia terdiri dari empat DNase yaitu: DNase I,
DNAse X, DNase g dan DNAS1L2. DNase I, DNase X, dan DNase g adalah
endonuklease netral yang menunjukkan aktivitas maksimumnya pada pH netral
(masing-masing 6,8, 6,8, dan 7,2), sedangkan DNAS1L2 adalah endonuklease
asam yang menunjukkan aktivitas maksimum pada pH rendah (Tsuruta et al.,
2008). DNase I adalah endonuclease yang bergantung pada Ca2+/Mg2+dalam
aktivitasnya. Setelah akuisisi domain terminal, DNase g dan DNase X
dipertahankan secara intraseluler namun DNase I atau DNAS1L2 yang
dikeluarkan ke ekstraseluler (Shiokawa et al., 2001). Berdasarkan struktur
kiminya, semua DNases I adalah golongan glikoprotein.
Berdasarkan distribusi jaringan, terdapat tiga jenis DNase I pada
mamalia. Jenis DNase I yang pertama terdapat pada pankreas manusia dan babi.
Disebut sebagai tipe pankreas karena memiliki aktivitas DNase I tertinggi dalam
pankreas. Jenis ini lebih sensitif terhadap nilai pH rendah dari pada jenis DNase I
lainnya. Jenis DNase I yang kedua terdapat pada kelenjar parotis tikus dan
disebut tipe parotis karena memiliki aktivitas tertinggi di kelenjar parotis. Jenis
DNase I ketiga terdapat pada sapi dan kelinci dan disebut jenis parotis pankreas
(tipe campuran) karena aktivitas DNase I tertinggi terdapat pada kelenjar
pankreas dan parotis (Takeshita et al., 2000).
Keluarga DNaseII terdiri dari DNase yang sangat homolog dengan
distribusi jaringan lisosom dan optimal pada pH rendah tanpa kation divalen.
Enzim DNaseII memiliki fungsi dalam proses degradasi DNA yang diperantarai
Universitas Sumatera Utara
9
oleh engulfment sebagai mekanisme utama penghancuran DNA (Evans et al.,
2003). L-DNase II merupakan enzim yang terlibat dalam apoptosis yang berasal
dari leucocyte elastase inhibitor (LEI) babi, protein dari keluarga super serpin.
LEI dalam bentuk asli, tidak mendegradasi DNA karena aktivitasnya sebagai
anti- protease. Selama apoptosis, penurunan pH intraseluler menginduksi
modifikasi pasca translasi LEI yang melibatkan perubahan berat molekul LEI,
diikuti oleh hilangnya aktivitas anti-protease, dan kemunculan aktivitas L-DNase
II. Hal ini mengarah pada aktivitas degradasi dua jalur yang terlibat dalam
apoptosis: jalur protease dan nuklease (Torriglia et al., 1998).
DNase I dan DNase II diekspresikan dalam jumlah terbatas
dalamjaringan. Hal ini disebabkan karena sifat enzimatik protein, tingkat
ekspresi yang lebih rendah bisa relevan secara biologis. DNase I paling banyak
diekspresikan dalam sel-sel eksokrin saluran pencernaan. DNase I juga
didapatkan di darah dengan terutama disekresikan oleh sel-sel myeloid untuk
membantu membersihkan DNA bebas dari peredaran darah (Sisirak et al., 2016).
Sumber utama DNaseIL3 terdapat pada sel myeloid hati dan limpa (Keyel,2017).
2.4.2. Inhibitor DNase
DNase merupakan enzim yang penting untuk fungsi sel normal dan
apoptosis. Aktivitas optimal DNase dikendalikan oleh inhibitor DNase yang
terdapat dalam sel. Peningkatan atau penurunan aktivitas inhibitor DNase
menyebabkan perubahan dalam proses metabolisme yang mengarah pada
pengembangan berbagai penyakit. Banyak senyawa dapat bertindak sebagai
inhibitor DNase. Mereka berbeda dalam asal organism (manusia, hewan,
tumbuhan, dan mikroorganisme), sintetis, struktur kimia, efisiensi, kekuatan, dan
selektivitas.
Terdapat beberapa jenis dari inhibitor DNase, diantaranya adalah sebagai
berikut (Kolarevic et.al,2014):
1. Natural DNase inhibitors
a. Natural DNase Iinhibitors, telah diisolasi dari berbagai macam sumber:
manusia: somatostatin, kolesterol sulfat bersamaan dengan asam empedu,
Universitas Sumatera Utara
10
inhibitor dalam leukosit, dan protein dari sel KB (Iwamori, 2000); (2)
hewan: aktin, anti sera anti-DNase, protein dari limpa, dan timus (Liu
etal., 1997);(3) mikroorganisme: antibiotik yang diisolasi dari bakteri
genus Streptomyces (aktinomisin D, nogalamisin, daunomisin, neomycin
B, paromomycin, dan gentamicin), dan metabolit dari Micromonospora
echinospora; (4) tanaman: protein dari sel Nicotianatabacum
(Woegerbauer et al., 2000).
b. Natural DNase II inhibitors, protein ini ditemukan pada jaringan hewan
dan beberapa senyawa nukleotida dan metabolit mikroorganisme.
c. Natural DFF40/CAD inhibitors, beberapa senyawa yang terbentuk
secara alami, seperti DFF45/ICAD, DFF35/ICADS, kompleks Akt/Ebp1
dan curcumin, mampu menghambat DFF40/CAD dan dengan demikian
mencegah fragmentasi DNA selama apoptosis. Inhibitor homolog dengan
ICAD telah diidentifikasi dalam ekstrak telur Xenopus laevis dan sel D.
melanogaster (DREP-1/dICAD).
d. Natural DNase inhibitors lainnya. Berbagai senyawa dari
mikroorganisme menunjukkan efek penghambatan terhadap DNase.
Beberapa vitamin juga dapat memengaruhi aktivitas DNase (Taper,
2008).
2. Synthetic DNase inhibitors
a. Synthetic DNase I inhibitors, beberapa turunan dari asam 2-nitro-5-
thiobenzoic, hydroxybiphenyls, nitrogen mustard, crystal violet, dan
beberapa polyelectrolytes anionik ditemukan bertindak sebagai inhibitor
DNase I (Zhou etal., 2012).
b. Synthetic DNase g inhibitors. Berbagai turunan triazine menunjukkan
efek penghambatan terhadap DNaseg (Sunaga et al., 2004).
c. Synthetic DNase II inhibitors, beberapa poli elektrolitanionik (PES,
HEMA dan amoniak etilen maleat anhidrida) dalam jumlah 10 mg
mampu sepenuhnya menghambat aktivitas DNase II pada pH 5.0.
3. Inorganic DNase inhibitors
Inorganic DNase inhibitors dapat bersumber dari ion emas Au (III) yang
menunjukkan efek penghambatan terhadap DNase I pada pH netral. Aktivitas
Universitas Sumatera Utara
11
DNase I dihambat oleh 10 ekuivalen molar ion Au (III) diikuti oleh
perubahan konformasi DNase. Ion Au (III) adalah oksidan kuat, namun
DNase I tidak teroksidasi olehnya, tetapi dikomplekskan dengan ion Au (III)
sehingga kehilangan aktivitasnya (Maruyama et al., 2007).
2.5. ISOLASI DNA
Ekstraksi DNA merupakan upaya mendapatkan DNA dari sel/virus.
Secara umum, ekstraksi DNA meliputi beberapa tahapan proses mulai tahap
persiapan hingga akhirnya diperoleh ekstrak DNA yang dilarutkan dalam larutan
dapar Tris-EDTA (TE). Larutan dapar TE digunakan untuk menyimpan dan
mempertahankan kondisi DNA secara kualitatif dan kuantitatif dalam jangka
waktu yang relatif lama. Secara kualitatif berarti larutan TE harus
mempertahankan kualitas DNA TE terlarut dalam kondisi baik. Secara
kuantitatif berarti larutan TE harus mempertahankan jumlah DNA dalam jumlah
tetap (tidak terdegradasi) dan dapat digunakan dalam proses selanjutnya tanpa
mengalami penurunan kuantitas DNA.
Proses ekstraksi DNA dimulai dari persiapan sampel, pemilihan metode
ekstraksi yang tepat, hingga didapatkan ekstrak DNA. Proses isolasi DNA
genom dilakukan dengan mengambil dari semua bahan biologis yang
mengandung nuklei seperti darah, semen, saliva, otot, rambut, tulang, dan lain-
lain. Bahan yang paling mudah digunakan untuk isolasi DNA adalah saliva
karena saliva relatif mudah diperoleh. Prinsip isolasi DNA adalah mendapatkan
DNA murni yang tidak tercampur dengan komponen sel lainnya seperti protein
dan karbohidrat (Phillips et al.,2012).
Isolasi DNA genom dapat dilakukan dengan metode lisis sel secara fisik
dan kimia. Secara fisik sel dipecah dengan kekuatan mekanik yaitu secara freeze
thaw, bead mill homogenization, dan resonansi (misalnya dengan
sonikasi).Secara kimia sel dirusak dengan larutan dapar lisis berisi senyawa
kimia yang dapat merusak integritas membran sel seperti fenol dan
cetyltrimethylammonium bromide (Cheng et al., 2003).
Kualitas DNA genom yang baik merupakan hal penting yang dibutuhkan
dalam aplikasi biologi molekuler. Keberhasilan isolasi DNA dapat diukur
Universitas Sumatera Utara
12
melalui dua proses: 1) pengecekan keberadaan band DNA dengan metode
elektroforesis atau 2) pengukuran konsentrasi DNA terlarut dengan metode
spektrofotometri (Phillips et al., 2012). DNA menyerap cahaya UV pada 260
nm, sedang kontaminan protein dalam larutan fenol menyerap cahaya pada 280
nm. Kemurnian DNA diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi
dengan nilai absorbansi 280 (A260/A280). DNA yang murni memiliki rasio
A260/A280 antara 1,8-2,0 (Fatchiya et al., 2011).
2.6. PCR
Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk
mengamplifikasi secara eksponensial suatu segmen DNA secara in vitro
(Yuwono, 2006). Amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR menyebabkan
analisis DNA pada sampel biologis hanya membutuhkan sedikit sampel.
Kelebihan lain metode PCR adalah bahwa reaksi tersebut dapat dilakukan
dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya
DNA cetakan sekitar 5 ng, primer hanya 1 mM, dan reaksi tersebut biasa
dilakukan dalam volume 25-50 μL (Yuwono,2006).
Lima komponen utama pada PCR adalah: (1) DNA cetakan yaitu
fragmen DNA yang akan diamplifikasi, (2) primer, yaitu suatu sekuen nukleotida
pendek (15-20 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai
DNA, (3) enzim Taq DNA polimerase, yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi
sintesis rantai DNA, dan (4) deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri
atas deoksiadenosin trifosfat (dATP), deoksitimidin trifosfat (dTTP), dCTP
(deoksisitidin trifosfat), dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat), dan (5) MgCl2.
Primer oligonukleotida akan membentuk basa komplemen yang spesifik
dengan DNA cetakan. dATP akan membentuk basa nukleotida adenin, dTTP
akan membentuk basa komplemen timin, dCTP akan membentuk basa
komplemen sitosin, dan dGTP akan membentuk basa komplemen guanin
(Yuwono, 2006).
Siklus PCR rutin terdiri atas tiga tahap utama yaitu denaturasi, annealing
primer, dan ekstensi. Denaturasi merupakan pemisahan DNA untai ganda
Universitas Sumatera Utara
13
menjadi untai tunggal yang dilakukan pada suhu 90-95oC. Annealing merupakan
pelekatan primer pada kedua untai tunggal DNA pada suhu 50-60oC. Beberapa
peristiwa yang terjadi pada tahap annealing yaitu pelekatan primer pada situs
yang tepat, pelekatan DNA polimerase sehingga terjadi pembentukan beberapa
basa, dan terbentuknya ikatan hidrogen yang sangat kuat antara primer dan DNA
cetakan (Russel, 1994). Ekstensi dilakukan pada suhu 72oC dengan Taq
polymerase memanjangkan segmen DNA yang diamplifikasi. Panjang siklus
PCR biasanya 35 siklus. Pasca PCR, suhu dipertahankan pada 4oC.
Universitas Sumatera Utara
14
Pengumpulan
Saliva
Antibiotika dan
Antifungi
Penghambat
Flora Normal
dan DNase
Isolasi
DNA
Kualitas DNA
manusia saliva
hasil
preservasi.
2.7. KERANGKATEORI
2.8.KERANGKAKONSEP
Universitas Sumatera Utara
15
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. RANCANGAN PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik.
Rancangan penelitian yang digunakan adalah pretest and posttest.
3.2. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
3.2.1. Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Terpadu, Fakultas Kedokteran,
Universitas Sumatera Utara.
3.2.2. Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli-September 2020.
3.3. SUBYEK UJI
Subjek dalam penelitian ini adalah mahasiswa. Jumlah subjek ditetapkan
5 orang. Setelah mendapatkan penjelasan, semua calon subjek uji diminta untuk
mengisi dan menyetujui surat persetujuan pasien (informed consent) untuk
menjadi subjek penelitian. Persetujuan etika atas penelitian ini diberikan oleh
Komite Etik Penelitian USU melalui Surat No. 383/KEP/USU/2020 (Lampiran
B).
3.4. PENGUMPULAN DAN PERLAKUAN SALIVA
Pengumpulan saliva dilakukan pada pagi hari. Sebelum pengumpulan
saliva subjek diinstruksikan untuk tidak makan dan minum selama 90 menit.
Subjek diminta untuk duduk dengan nyaman dan berkumur dengan listerine™
untuk membersihkan sisa makanan terlebih dahulu. Selanjutnya, subjek
meludahkan salivanya ke dalam pot saliva. Pengumpulan saliva dilakukan
Universitas Sumatera Utara
16
sebanyak 2 kali untuk masing-masing subjek. Pengumpulan saliva kedua
dilakukan 5 menit dari pengambilan saliva pertama. Saliva yang dikumpulkan
minimal bervolume 40 mL untuk setiap subjek. Saliva yang telah tertampung
dalam pot saliva ditutup dengan penutup pot saliva kemudian dibawa ke
laboratorium untuk dilakukan preservasi dan pengujian DNA genom.
Saliva yang dikumpulkan dibagi menjadi 5 kelompok: segar (H0),
penyimpanan 3 hari (H3), penyimpanan 7 hari (H7), penyimpanan 10 hari (H10),
penyimpanan (H14). Setiap kelompok akan diberi 1500 μg/mL gentamisin sulfat
dan 100 μM ketoconazol H0 akan segera menjalani proses ekstraksi DNA. H3,
H7, H10, H14 disimpan dalam suhu ruang yaitu 25oC.
3.5. ISOLASI DNA GENOM MANUSIA ASAL SALIVA
Sebanyak 2 mL sampel saliva disentifugasi pada kecepatan 3000 g
selama 10 menit pada suhu ruang. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan pelet
diambil untuk digunakan dalam isolasi DNA.
Isolasi DNA dilakukan dengan metode spin column (Gambar 3.1). Pelet
dilarutkan dalam 640μL dapar lisis (mengandung 200 μL larutan resuspensi, 200
μL larutan lisis, 20 μL proteinase K,20 μL RNase, dan 200 μL ethanol). Pelet
dilarutkan dengan 200 μL larutan resuspensi kemudian ditambah 200 μL larutan
lisis dan dicampurkan menggunakan vortex, setelah itu ditambah 20 μL
Proteinase K lalu diinkubasi pada 55°C selama 2 jam, 20 μL RNase ditambahkan
dan ditunggu 2 menit. Tambahkan 200 μL ethanol kemudian vortex untuk
mencampur sebelum larutan dipindahkan , terlebih dahulu tambahkan 500 μL
column prepare solution untuk membersihkan binding column dan di
sentrifugasi >6500 g selama 1 menit setelah itu pindahkan 640 μL ke binding
column dan disentrifugasi pada kecepatan >6500 g, pada suhu ruang selama 1
menit kemudian pindahkan binding column ke tabung pengumpulan yang baru.
Tambahkan 500 μL column wash solution kemudian sentrifugasi >6500 g selama
1 menit. Pindahkan binding column ke tabung yang baru dan ditambahkan 500
μL column wash solution yang kedua dan di sentrifugasi dengan kecepatan
>12.000 g selama 3 menit untuk mengeringkan binding column. Setelah itu
disimpan dalam suhu-20°C.
Universitas Sumatera Utara
17
Gambar 3.1 Ekstraksi DNA Metode Spin-column
3.6. KUANTITAS DAN KUALITAS DNA GENOM SALIVA
Kuantitas dan Kemurnian DNA ditentukan pada kelompok H0, H3, H7,
H10, H14) menggunakan spektrofotometer Multiskan Go (Thermo Scientific).
Kualitas DNA ditentukan dengan cara elektroforesis gel agarosa dan PCR
terhadap hasil ekstraksi DNA saliva semua kelompok. Elektroforesis DNA
dilakukan dengan agarose gel 2% pada 80V, 400 mA selama 60 menit . Pada
masing-masing lane telah diisi 10 µL DNA hasil ekstraksi dari subjek H-7.
Elektroforesis dilakukan dalam agarose gel 2%. PCR dilakukan terhadap gen
beta globin (ACTB).
3.7. PRIMER PCR
Primer beta globin (Gene Bank Acession Number AH001475.2) didesain
menggunakan software Primer-BLAST. Primer dibeli dari perusahaan First base.
Panjang amplicon yang diperkirakan adalah 335 bp.
Forward primer GTATCATGCCTCTTTGCACCATT
Reverse primer TGATAGGTGTGGCTGCACTGG
3.8. KONDISI PCR DAN VISUALISASI
PCR dilakukan dengan menggunakan campuran reaksi PCR yang
mengandung 9,13μL (H0), 5,83μL (H3), 6,64μL (H7), 3,89μL (H10), 7,30μL
(H14) DNA genom saliva sebagai DNA template, 0,5 μM untuk setiap primer,
KAPA2G 25μL, dan ddH20 14,87μL (H0), 18,17 μL (H3), 17,36μL (H7),
Universitas Sumatera Utara
18
• Penyimpanan sampel saliva dengan
tambahan gentamisin sulfat dan
ketoconazole pada suhu ruang
• Ekstraksi DNA saliva dan PCR.
• Penilaian kuantitas dan kualitas DNA
saliva segar dan hasilpenyimpanan.
• Pengumpulan saliva
• Koleksi DNA saliva jangka lama
Bank DNA saliva
3,89μL (H10), 7,30μL (H14). PCR dijalankan dengan langkah denaturasi awal
pada 94oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan 40 siklus PCR terdiri dari 94oC
selama 2 menit, annealing pada 58oC selama 1 menit, ekstensi pada 72oC selama
30 detik, dan dihentikan pada suhu 4oC (Tabel 3.1). Pasca PCR, amplicon gen
beta globin divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa 2% dan etidium
bromida dengan kondisi 80 V, 60 menit, dan 400 mA. Rekaman dari run gel
agarosa dibuat menggunakan geldoc.
Tabel 3.1 Kondisi PCR untuk ACTB
Kondisi Suhu (oC) Waktu
Denaturasi awal 94 5 menit
Denaturasi 94 2 menit
Annealing 58 1 menit
Extension 72 30 detik
Denaturasi akhir 72 2 menit
3.9. ALUR PENELITIAN
Proses
Input
Output
Universitas Sumatera Utara
19
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. HASILPENELITIAN
4.1.1. Ekstraksi DNA Asal Saliva
Seluruh saliva diisolasi berdasarkan lama penyimpanan. DNA untuk
kontrol (H0) segera diekstraksi setelah pemberian gentamicin dan ketoconazol.
Konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh bervariasi dalam lama
penyimpanan dan subjek sumber saliva (Tabel 4.1). Rata-rata konsentrasi DNA
adalah 1,50+3,43 µg/mL dalam rentang 1,46-30,6 µg/mL. Rata-rata kemurnian
DNA hasil ekstraksi adalah 1,84+1,74 µg/mL dengan rentang 1,58-1,84.
Tabel 4.1 Absorbansi, Kemurnian dan Konsentrasi DNA Asal Saliva Lama Hari
Penyimpanan
(Subjek)
A260 A280 A320 A260:A280 Kemurnian
DNA
Konsentrasi
DNA
(µg/mL)
H0(1) 0,0292 0,0186 0,0048 1,57 1,77 1,46
H0(2) 0,0301 0,0205 0,0086 1,47 1,81 1,50
H0(3) 0,6112 0,5953 0,5678 1,03 1,58 30,6
H0(4) 0,0438 0,0291 0,0117 1.51 1,84 2,19
H0(5) 0,0220 0,0176 0,0110 1,25 1,67 1,10
H3(1) 0,0677 0,0437 0,0161 1,55 1,87 3,38
H3(2) 0,0783 0,0554 0,0238 1,41 1,72 3,91
H3(3) 0,0644 0,0472 0,0233 1,36 1,72 3,22
H3(4) 0,0686 0,0500 0,0271 1,37 1,81 3,43
H3(5) 0,0687 0,0472 0,0215 1,46 1,84 3,43
H7(1) 0,0621 0,0464 0,0269 1,34 1,81 3,11
H7(2) 0,0523 0,0374 0,0195 1,40 1,83 2,62
H7(3) 0,0576 0,0458 0,0283 1,26 1,67 2,88
H7(4) 0,0602 0,0497 0,0315 1,21 1,58 3,01
H7(5) 0,0678 0,0555 0,0369 1,22 1,66 3,39
H10(1) 0,0725 0,0547 0,0327 1,33 1,81 3,63
H10(2) 0,0862 0,0642 0,0394 1,25 1,65 4,01
H10(3) 0,0762 0,0571 0,0325 1,33 1,78 3,81
H10(4) 0,1028 0,0877 0,0678 1,17 1,76 5,14
H10(5) 0,1130 0,1020 0,0869 1,11 1,73 5,65
H14(1) 0,0712 0,0581 0,0387 1,23 1,68 3,56
H14(2) 0,0758 0,0609 0,0397 1,24 1,70 3,79
H14(3) 0,0677 0,0514 0,0314 1,32 1,82 3,38
H14(4) 0,0548 0,0442 0,0292 1,24 1,71 2,79
H14(5) 0,0587 0,0489 0,0335 1,20 1,68 2,94 H3(1) adalah DNA dari subjek 1 dengan lama penyimpanan 3 hari dengan perlakuan gentamicin
Universitas Sumatera Utara
20
dan ketoconazol. A(260) adalah 0,0677 A(280) adalah 0,0437 A(320) adalah 0,0161 A260:A280
adalah 1,55 Kemurnian DNA ditentukan dengan menghitung (A260-A320):(A280-A320).
4.1.2. Kualitas DNA Hasil Ekstraksi
Satu elektroforesis gel agarose dilakukan untuk menentukan kualitas
DNA genom pasca ekstraksi. Pada semua sampel, DNA tampak utuh dan tidak
terdapat fragmentasi DNA (Gambar 4.1).
Gambar 4.1 Hasil elektroforesis gel DNA dapat ditemukan pada semua sampel hasil penyimpanan. Dua smear DNA terdapat pada
lane 2 dan 3. Semua DNA tampak utuh dan tidak ada fragmentasi DNA. Lane 1 adalah sampel
dari H0. Lane 2 adalah sampel dari H3. Lane 3 adalah sampel dari H7. Lane 4 tidak
mengandung sampel. Lane 5 adalah sampel dari H10. Lane 6 adalah sampel dariH14.
4.1.3. Pengaruh Gentamicin terhadap Kualitas DNA Genom Manusia Asal
Saliva
Elektroforesis gel agarose hasil PCR menunjukkan multiple bands dan
primer dimer(Gambar 4.2). Expected bands (335 bp) dari gen human ACTB
tampak pada lane 2, 3, 5, dan 6. Kontrol negatif (lane 1) menunjukkan adanya
primer-dimer. Kesamaan pola kontrol negatif (lane 1) dan lane 4 menunjukkan
ketiadaan DNA pada lane 4 sehingga tidak tampak adanya expected band. Lane
2, 3, 5, dan 6 menunjukkan pola bands yang nyaris sama dengan kekuatan sinyal
yang berbeda.
Universitas Sumatera Utara
21
Gambar 4.2 Hasil Elektroforesis PCR gen human ACTB. Expected band dari gen human β-actin (335 bp) berada pada lane 2 dan 3. Lane 5 dan 6
menunjukkan band berukuran 300 bp.Lane 4 tidak menunjukkan expected band.M adalah
marker, 1 adalah kontrol negatif, 2 adalah DNA saliva hasil penyimpanan 0 hari, 3 adalah DNA
saliva hasil penyimpanan 3 hari, 4 adalah DNA saliva hasil penyimpanan 7 hari,5 adalah DNA
saliva hasil penyimpanan 10 hari, 6 adalah DNA saliva hasil penyimpanan 14 hari.
4.2. PEMBAHASAN
DNA saliva yang didapatkan melalui ekstraksi DNA diamati kuantitas
dan kualitasnya. Analisis kuantitas DNA dilakukan untuk mengetahui kemurnian
dan konsentrasi DNA. Kemurnian larutan DNA dapat dihitung melalui
perbandingan A260 nm dengan A280 nm. Hasil isolasi DNA dikatakan murni
apabila rasio perbandingan A260 nm dan A280 nm adalah 1,8-
2,0(Murtiyaningsih, 2017). Kemurnian DNA pada penelitian ini berkisar antara
1,58-1,84. Pada penelitian lain rata-rata kemurnian DNA berkisar sekitar1,8-2,0
(Wahab et al., 2017). Jika sampel yang mempunyai hasil rasio sekitar 1,8 atau
mendekati 1,8 yaitu sampel DNA relative murni (Garbieri et al., 2017). Ha litu
terjadi karena penurunan integritas DNA genom akibat aktivitas DNase yang
menurunkan sampel DNA (Wahab et al., 2017). Rasio kemurnian DNA didalam
penelitian ini menunjukkan relative murni karna berkisar 1,58-1,84. Konsentrasi
DNA pada penelitian ini memiliki rentang 1,46-30,6 µg/mL dengan volume
saliva 2 mL dengan metode spin column. Pada penelitian lain dengan volume 1
mL menggunakan metode kit Oragene ™ memiliki hasil konsentrasi DNA lebih
Universitas Sumatera Utara
22
rendah yaitu 10 ng/µL (Garbieri et al., 2017). Hasil konsentrasi DNA lebih
tinggi tergantung pada volume salivanya, jika semakin banyak volume saliva
maka konsentrasi semakin tinggi. Hasil preservasi DNA di penelitian ini dalam
jangka waktu 14 hari berhasil akan tetapi pada elektroforesis PCR menunjukkan
H7 tidak terdapat band pada gambar 4.2 karena saliva tidak homogen pada H7.
Pada gambar 4.2 juga terdapat smear. Smear merupakan sisa dari larutan-larutan
yang masih terbawa selama proses isolasi atau juga dapat berupa DNA yang
terdegradasi pada proses isolasi.
Kemurnian DNA yang memadai tidak menjamin amplifikasi gen yang
berhasil karena faktor-faktor lain seperti konsentrasi DNA juga perlu
dipertimbangkan (Abdel-Latif dan Osman, 2017). Beberapa peneliti menyimpan
air liur pada suhu -20°C. DNA yang layak dapat diekstraksi dari air liur yang
disimpan tanpa batas pada suhu antara -15°C dan -20°C dan disimpan selama
beberapa waktu dalam suhu ruang (Brozoski dan Santos, 2017). Secara khusus,
hasil dari penelitian ini memiliki konsentrasi DNA dalam rentang 1,46-30,6
µg/mL.
Hal yang valid, sebelum penelitian ini, adalah bahwa air liur mungkin
mengandung proporsi DNA yang signifikan dari bakteri mulut dan/atau
makanan. Konsentrasi sebenarnya dari DNA manusia yang ditambahkan ke
setiap pengujian akan berada di bawah konsentrasi yang dihitung dan kecepatan
keseluruhan akan berkurang secara proporsional (Abraham et al.,2012).
Universitas Sumatera Utara
23
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. KESIMPULAN
1. Kuantitas DNA genom manusia asal saliva hasil preservasi dengan
spektrofotometer menunjukkan rata-rata konsentrasi DNA yaitu 1,50+3,43
µg/mL dan rata-rata kemurnian DNA yaitu 1,84+1,74.
2. Kadar 1500 µg/mL gentamisin sulfat dan 100 µM ketoconazol
mempreservasi DNA genom manusia dalam kondisi penyimpanan suhu
ruang selama 14 hari.
3. Kualitas DNA saliva hasil preservasi adalah baik dengan tidak adanya
fragmentasi DNA dan PCR dapat mengamplifikasi gen human β-actin dari
DNA hasil preservasi.
5.2. SARAN
1. Penambahan volume saliva untuk preservasi sehingga konsentrasi DNA yang
diperoleh mencapai rendemen yang lebih tinggi.
2. Upaya homogenisasi sampel saliva perlu dilakukan agar seluruh sampel
berisi DNA.
3. Uji spektrofotometri untuk pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA
dilakukan segera setelah ekstraksi DNA saliva.
4. Optimasi kondisi PCR perlu dilakukan pada konsentrasi primer dan jumlah
DNA untuk menghilangkan primer dimer.
Universitas Sumatera Utara
24
DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Latif, A., & Osman, G. (2017). Comparison of three genomic DNA extraction
methods to obtain high DNA quality from maize. Plant Methods, 13(1), 1–9.
Abraham, J. E., Maranian, M. J., Spiteri, I., Russell, R., Ingle, S., Luccarini, C., Earl, H.
M., Pharoah, P. P. D., Dunning, A. M., & Caldas, C. (2012). Saliva samples are
a viable alternative to blood samples as a source of DNA for high throughput
genotyping. BMC Medical Genomics, 5.
Brozoski, D. T., & Santos, C. F. (2017). Human DNA extraction from whole saliva that
was fresh or stored for 25(2), 147–158.
Garbieri, T. F., Brozoski, D. T., Dionísio, T. J., Santos, C. F., & Neves, L. T. das.
(2017). Human DNA extraction from whole saliva that was fresh or stored for 3,
6 or 12 months using five different protocols. Journal of Applied Oral Science,
25(2), 147–158. https://doi.org/10.1590/1678-77572016-0046
Murtiyaningsih, H. (2017). Isolasi Dna Genom Dan Identifikasi Kekerabatan Genetik
Nanas Menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic.Agritrop, 15(1),
84–93.
Wahab, R. M. A., Nasri, F. A. M., Abidin, I. Z. Z., Ariffin, Z. Z., Yazid, M. D., &
Ariffin, S. H. Z. (2017). Kesan Penyimpanan Sampel Air Liur Terhadap Kualiti
DNA Genom. Sains Malaysiana, 46(6), 909–915.
Aguiar S.I., Serrano I., Pinto F.R., Melo-Cristino J., Ramirez M. 2008. The presence of
the pilus locus is a clonal property among pneumococcal invasive isolates. BMC
Microbiol. 8,41.
Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002. From DNA to RNA.
Garland Science.
Aidar, M., and Line, S. R. 2007. A Simple and Cost-Effective Protocol for DNA
Isolation from Buccal Epithelial Cells. Brazilian Dental Journal, 18, 148- 152.
BG. Katzung. Farmakologi dasar dan klinik. 10th ed. Jakarta. EGC; 2009.p479 489
Brooks., et al. 2008. Mikrobiologi Kedokteran. Ed. 23. Jakarta: EGC.
Brown, T. A. 2002. Pengantar Kloning Gena. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica.
Brozoski, D. T., & Santos, C. F. (2017). Human DNA extraction from whole saliva that
was fresh or stored for 3 , (2), 147–158.
Universitas Sumatera Utara
25
Cascella, R., Foti Cuzzola V., Lepre, T. 2015. Full sequencing of the FLG gene in
Italian patients with atopic eczema: evidence of new mutations, but lack of an
association. J Invest Dermatol, 131: 982-984.
Campbell, N. A., dan J. B. Reece. 2008. Biologi. Edisi ke 8, Jilid 1. (diterjemahkan dari
Biology Eighth Edition, penerjemah: D.T. Wulandari). Jakarta:Erlangga
Cheng YJ, Guo WW, Yi HL, Pang XM & Deng X. 2003. An efficient protocol for
genomic DNA extraction from citrus species. Journal Plant Molecular Biology
Reporter 21: 177a-177g.
Choo, J. H., Rukayadi, Y., and Hwang, J-K. 2006. Inhibition of bacterial quorum
sensing by vanilla extract. Letters in Applied Microbiology, 42(6): 37-41.
Dawes, S. B. 2003. Book Reviews: Seeing the Psalms. The Expository Times, 114(12),
430–430.
Dhanya and S. Hegde, Salivary glucose as a diagnostic tool in Type II diabetes mellitus:
A case-control study, Niger. J. Clin. Pract., 19(4), pp. 486–490, 2016.
Diaz, J., ten Have A., and van Kan JA. 2002. The role of ethylene and wound signaling
in resistance of tomato to Botrytis Cinerea. Plant Physiol, 129(3): 1341-51.
Dodd, C. L., Greenspan D., Katz M.H., Westenhouse J.L., Feigal D.W., and
GreenspanJ.S.1991.Oral Candidiasis in HIV Infection: Pseudomembranous and
Erythematous Candidiasis Show Similar Rates of Progression to AIDS. 5:1339–
1343.
Efendi, F. 2009. Keperawatan Kesehatan Komunitas: Teori dan Praktek dalam
Keperawatan. Jakarta: SalembaMedika.
Evans, Cory J., and Aguilera, R. J. 2003. DNase II: Genes, Enzymes and Function.Gene,
Dec 11; 322:1-15. doi: 10.1016/j.gene.2003.08.022.
Fatchiyah, Arumingtyas, E.L., Widyarti, S., dan Rahayu, S. 2011.Biologi Molekular
Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.
Funakoshi, H. Wakasugi, M. Nakamura, Y. Takagi, H. Ibayashi, Biochemical and
clinical studies on human pancreatic deoxyribonuclease I inhibitor,
Gastroenterol. Jpn. 14 (1980).
Harvey, R. A., Champe, P. C., Fisher, B. D. 2007. Microbiology, 2nd Ed. USA:
Lippincot Williams & Wilkins.
Hosono,A.,Ozawa,A.,Kato,R.,etal.2003.Dietary fructo oligosaccharides induce
Universitas Sumatera Utara
26
immunoregulation of intestinal IgA secretion by murine Peyer’s patch cells.
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 67: 758-764.
Jawetz, E., Melnick, J.L. & Adelberg, E.A., 2005, Mikrobiologi Kedokteran,
diterjemahkan oleh Mudihardi, E., Kuntaman, Wasito, E. B.,Mertaniasih, N. M.,
Harsono, S., Alimsardjono, L., Edisi XXII, 327-335, 362-363, Jakarta: Salemba
Medika.
Kawane, K., Fukuyama, H., Kondoh, G., Takeda, J., Ohsawa, Y., Uchiyama, Y.,
Nagata,S.2001.Requirement of DNase II for definitive erythropoiesis in the
mouse fetal liver. Science. 292:1546-1549.
Keyel, Peter A. 2017. Dnases in Health and Disease. Developmental Biology,
429(2017): 1-11.
Kidd EAM, Joyston-Bechal S. 1992. Dasar-dasar karies: Penyakit dan
penanggulangannya. Alih Bahasa Sumawinata N. Jakarta: EGC.
Kolarević, S., Heberger, K., Kracun-Kolarević, M., et al. 2014. Evaluation of single-cell
gel electrophoresis data: Combination of variance analysis with sum of ranking
differences. Mutation Research, Genetic Toxicology and Enviromental
Mutagenesis, 177: 15-22.
Küchler EC, Tannure PN ,Falagan-Lotsch P ,Lopes TS, Granjeiro JM, AmorimLM.
2012. Buccal cells DNA extraction to obtain high quality human genomic DNA
suitable for polymorphism genotyping by PCR-RFLP and Real-Time PCR. J
Appl Oral Sci.20(4):467–471.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V. & Clark, D.P. 2010. Brock Biology of
Microorganisms. 12th ed. San Francisco: Pearson Education.
Maruyama, S. Sonokawa, H. Matsushita, M. Goto, Inhibitiory effects of gold(III) ions
on ribonuclease and deoxyribonuclease, J. Inorg. Biochem. 101 (2007) 180e186.
Marwayana, O N. 2015. Ekstraksi Asam Deoksiribonukleat (DNA) Dari Sampel
Jaringan Otot. Jurnal Oseana, Volume XL, Nomor 2, Tahun 2015: 1-9
McGuire, A. L. et al. (2015) ‘Preclinical assessment of adjunctive tPA and DNase for
peritoneal dialysis associated peritonitis’, PLoS ONE, 10(3).
Nejat N, Vadamalai G. 2013. Diagnostic techniques for detection of phytoplasma
diseases: past and present. J Plant Dis Prot. 120(1):16–25.
Phillips, K.., N. McCallum, and L. Welch. 2012. A comparison of methods for forensic
Universitas Sumatera Utara
27
DNA extraction: Chelex-IOO and the QIAGEN DNA investigator kit (manual
and automated). Journal Forensic Science International: Genetics,6(2), 282-285.
Pereira, A. L. dos S. (2015), Ekp, 13(3), pp. 1576–1580.
Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M. and Nasidze, I. 2006. Evaluation Of
Saliva As A Source Of Human DNA For Population And Association Studies.
Analytical Biochemistry, 353, 272-277.
Radisavljevic, A.V. Nagorni, G. Kocic, G.B. Bjelakovic, A.S. Petrovic, A.R. Veljkovic,
S.R. et al. 2013. The activities of acid DNase and 50 nucleotidase in erosive
reflux esophagitis and Barrett's epithelium,Hepatogastroenterology
601073e1076.
Russel, P.J. 1994. Fundamentals of Genetics. New York; Harper Collins College
Publisher
Scully, C., and Felix, D. H. 2005. Oral Medicine – Update for the Dental Practitioner,
Mouth Ulcers of More Serious Connotation. British DentalJournal, l. 199 (6), :
339-343.
Shetti A., Ishita G., and Shivyogi M.C. 2011. Oral Candidiasis: Aiding in the Diagnosis
of HIV—A Case Report.
Shiokawa, K., Kubota, M., Otsuka, Y., Ejiri, Y., Ogawa, T., Sakanoi, H. Fukunishi, M.
Yamamoto, S. Fukao, and A. Saito, Traveling ionospheric disturbances observed
in the OI 630‐nm nightglow images over Japan by using a multi‐point imager
network during the FRONT campaign, Geophys. Res. Lett., 24, 4037–4040,
2001.
Sisirak, V., Sally, B., D’Agati, V., Martinez-Ortiz, W., Ozcakar, Z.B, David, J., et al.
2016. Digestion of Chromatin in Apoptotic Cell Microparticles Prevents
Autoimmunity. Cell, 166: 88-101.
Siswanto,J.E.,et.al.2016.Isolasi DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada
Bayi Penderita ROP: Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi dan Indeks
Kemurnian. Jurnal Sari Pediatri, Vol. 18, No.4.
Sleat, David E., Zheng, H., Qian, M., and Lobel, P. 2006. Identification of Sites of
Mannose 6-Phosphorylation on Lysosomal Proteins. Molecular & Cellular
Proteomics, 5(4): 686-701.
Sunaga, T. Kobayashi, A. Yoshimori, D. Shiokawa, S. Tanuma, A novel inhibitor that
Universitas Sumatera Utara
28
protects apoptotic DNA fragmentation catalyzed by DNase g, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 325 (2004) 1292e1297.
Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. 2000. Identification and Characterization of the New
Osteoclast Progenitor With Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate
Into Mature Osteoclasts. J Bone Miner Res, 15(8): 1477-88.
Taper. 2008. Altered deoxyribonuclease activity in cancer cells and its role in nontoxic
adjuvant cancer therapy with mixed vitamins C and K3, Anticancer Res. 28
2727e2732.
Thiede C, Prange-Krex G, Freiberg-Richter J, Bornhäuser M, Ehninger G. 2000. Buccal
swabs but not mouth wash samples can be used to obtain pre transplant DNA
finger prints from recipients of allogeneic bone marrow transplants. Bone
Marrow Transplant.25(5):575–577.
Torriglia, A., Lepretre, C., Ivana, A., Shah, G.M. 1998. Regulation of poly (ADP-
ribose) polymerase-1 functions by leukocyte elastase inhibitor/LEI-derived
DNase II during caspase-independent apoptosis. The International Journal of
Biochemistry & CellBiology,41(5):1046-54.
Tsuruta,K.,Kume,T.,Komatsu,H.,et al. 2008. Relationship Between Tree Height and
Transpiration for Individual Japanese Cypress (Chamaecyparis Obtusa). Journal
of Japan Society of Hydrology & Water Resource. 21(6):414-422.
Turner, M.D dan Ship, J.A. 2007. Dry Mouth and Its Effect on The Oral Health of
Elderly People. JADA. 138, (9 suppl.), 155-205.
Vasanthakumari, R. 2007. Textbook of Microbiology. New Delhi: BIPublications.
Wahab, R. M. A., Nasri, F. A. M., Abidin, I. Z. Z., Ariffin, Z. Z., Yazid, M. D.,
&Ariffin,
S. H. Z. (2017). Kesan Penyimpanan Sampel Air Liur Terhadap Kualiti DNA Genom.
Sains Malaysiana, 46(6), 909–915.
Woegerbauer, H. Burgmann, J. Davies, W. 2000. Graninger, DNase I induced
DNAdegradation is inhibited by neomycin, J. Antibiot. 53 276e285.
Yasuda, Y. Kawai, M. Uekia, K. Kishi. (2005). Clinical applications of DNase I, a
genetic marker already used for forensic identification, Leg. Med. 7:274-
277. Yuwono T. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University
Press.
Universitas Sumatera Utara
29
Zhou, C. Zhu, J. Ren, S. Dong, A. 2012. graphene-based real-time fluorescent assay of
deoxyribonuclease I activity and inhibition, Anal. Chim. Acta 740 88e92.
Universitas Sumatera Utara
30
LAMPIRAN A
CURRICULUM VITAE
Nama : ChairunnisaSiregar
NIM : 170100243
Tempat/tanggallahir : Medan, 22 Oktober 1999
Agama : Islam
NamaAyah : Saiful Bahri Siregar
NamaIbu : Intan MenggalawatiHarahap
Alamat : Jalan Pasar V Gg. Mentimun 4 No. 4, Percut Sei Tuan,
Deli Serdang,SUMUT.
Riwayat Pendidikan:
1. TK SWASTA HIKMATUL FADHILLAH (2004-2005)
2. SD SWASTA HIKMATUL FADHILLAH (2005-2009)
3. SD NEGERI NO. 101080 GUNUNG TUA (2009-2011)
4. SMP SWASTA AL-ULUM TUASAN (2011-2014)
5. SMA NEGERI 1 MEDAN (2014-2017)
6. FAKULTAS KEDOKTERAN USU (2017- sekarang)
Riwayat Pelatihan:
1. Peserta PKKMB (Pelaksanaan Pengenalan Kehidupan Kampus Bagi
Mahasiswa Baru) Fakultas Kedokteran USU tahun2017
2. Peserta MMB (Manajemen Mahasiswa Baru) FK USU tahun2017
3. Peserta LKMM (Latihan Kepemimpinan dan Manajemen Mahasiswa)
FK USU 2017
4. Peserta “Seminar Infeksi Saluran Kemih dan Workshop Sirkumsisi
SCORA FK USU2018”
Riwayat Organisasi:
1. Anggota Palang Merah Remaja tahun2015-2017
2. Anggota SCORA FK USU 2018
Riwayat Kepanitiaan:
1. Panitia Seminar “Dampak Dunia Maya Terhadap Kesehatan Reproduksi
dan Workshop Sirkumsisi” SCORA FK USU2019
2. Panitia Pengabdian Masyarakat SCORA FK USU2020
Universitas Sumatera Utara
31
LAMPIRAN B
Universitas Sumatera Utara
32
LAMPIRAN C
Universitas Sumatera Utara
33
LAMPIRAN D
Universitas Sumatera Utara