DNA

DeoxyriboNucleic Acid

Acido DesossiriboNucleico

È formato nuceleotidi compostida:

1. Gruppo fosfato;

2. Zucchero (desossiribosio);

3. Base azotata.

Le basi azotate sono 4:

1. due purine: adenina eguanina;

2. due pirimidine: citosina etimina.

L’adenina è sempre legata alla timina(A=T) con due legami idrogeno, mentre lacitosina è sempre legata alla guanina(G≡C) con tre legami idrogeno.

http://www.uvm.edu/~inquiryb/webquest/fa06/mvogenbe/Animal-Cell.jpg

Il genoma (o patrimonio genetico) è l’insieme ditutte le informazioni scritte nella sequenza creatadai nucleotidi nel DNA

Il cromosoma è la strutturacon cui, durante il processoriproduttivo della cellula,ciascuna unità funzionale diDNA, dopo essersi duplicata,si compatta associata aspecifiche proteine e vienetrasmessa alle cellule figlie.

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http://www.dnareplication.info/images/dnareplication.jpg

http://www.personal.psu.edu/staff/d/r/drs18/bisciImages/DNA_Replication.jpg

Prima della divisione cellulare ilDNA viene fedelmente copiato.

Ogni cellula figlia riceve unpatrimonio genetico identico aquello della cellula madre.

La replicazione del DNA avviene nelnucleo.

Questo fenomeno è catalizzato daproteine specializzate.

Il gene è un tratto di DNA che contieneun’informazione genetica ereditata digenerazione in generazione. Molti deinostri geni codificano per le proteine,cioè contengono il messaggio per “fareuna proteina”. Altri codificano per lemolecole di RNA. Altri hanno unafunzione di regolazione. Altri non hannoancora una funzione nota.

Una proteina è una molecola formata da aminoacidi. Le proteine hanno ruoli funzionali estrutturali nelle nostre cellule. Per esempio formano le fibre muscolari (actina e miosina),oppure rendono possibili tutte le reazioni biochimiche (per esempio quelle necessarie permetabolizzare il glucosio o sintetizzare i grassi).

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Il DNA codifica per le proteine.

La sequenza di nucleotidi del DNAcontiene un messaggio che viene primacopiato in mRNA e poi tradotto inproteine.

La trascrizione in mRNA e la traduzione inproteina permettono di passare dalgenotipo al fenotipo.

Un gene è espresso quando è copiato inmRNA e tradotto in proteina.

Il DNA viene copiato in mRNAmediante il processo ditrascrizione.

Si passa dall’alfabeto A, G, C, Ta quello A, G, C e U.

E’ un processo simile allareplicazione ma riguarda solopochi geni. I geni espressivariano nelle diverse cellule enel tempo.

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Il DNA viene copiato in mRNAprima di essere tradotto inproteina.

L’RNA (acido ribonucleico) èformato da un solo filamento, lozucchero è il ribosio e al postodella timina c’è l’uracile (U),mentre le altre tre basi sonoidentiche (A, G, e C).

Esistono diversi tipi di RNA, quelliche dovete ricordare sono: mRNA,tRNA e rRNA.

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mRNA (RNA messaggero): porta l’informazione genetica per sintetizzare unaproteina dal nucleo al citoplasma.

tRNA (RNA di trasferimento): trasporta gli aminoacidi verso il ribosoma doveavviene la sintesi delle proteine.

rRNA (RNA ribosomiale): forma, insieme ad alcune proteine, il ribosoma cheprovvede alla lettura e alla traduzione del messaggio contenuto nell’mRNA.

snRNA (small nuclear RNA) e miRNA (micro RNA): hanno una funzione diregolazione dell’espressione dei geni.

Ma come si passa dal DNA alla proteina?

La sequenza dei nucleotidi ha un significatoben preciso.

Tre nucleotidi (tripletta o codone)individuano uno specifico aminoacido.Cioè tre lettere del DNA corrispondono auna lettera delle proteine.

Questo è il codice genetico.

Nel processo di traduzione le triplettevengono “lette” e “decodificate”.

Ognuna codifica per un aminoacidodiverso.

La proteina nasce grazie all’aggiunta di unaminoacido alla volta, secondo ilmessaggio portato dall’mRNA.

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Il ribosoma è “una macchinetta”, formata da rRNA e proteine, che permette lalettura del messaggio dell’mRNA, e grazie ai tRNA, la sintesi della catenaaminoacidica, cioè della proteina.

Non tutti i geni sono espressi in tutte le cellule e in ogni momento: la regolazione genica

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Identificazione dei microrganismi –METODI GENOTIPICI -

Approccio polifasico: combinazione delleinformazioni genetiche con le caratteristichefenotipiche: identificazione affidabile a livellodi specie

Genotipo: è l’informazione genetica, ossia la costituzione genetica di un organismo cheagendo con i fattori ambientali determina il fenotipo.

Fenotipo: modo in cui il genotipo è espresso, ossia l’insieme delle caratteristichebiochimiche e fisiologiche misurabili e visibili.

Esempio:

informazione contenuta (genotipo) in una sequenza nucleotidica (informazionegenetica) che codifica per un enzima (fenotipo).

1. Lisi delle cellule. La dissoluzione della cellula (distruzione della membrana) è unafase delicata in quanto risultato di due eventi contrastanti: l’esigenza di frammentare ilmateriale di partenza e quella di non alterare gli acidi nucleici da analizzare.

2. Separazione e recupero dell’acido nucleico dalla soluzione contenente il lisatocellulare. Un primo metodo per effettuare tale operazione prevede l’uso di solventiorganici (come fenolo o cloroformio), che consentono la separazione degli acidinucleici dai contaminanti (proteine); successivamente, dopo centrifugazione, gli acidinucleici vengono recuperati in soluzione acquosa.

3. Precipitazione: avviene di solito in alcol etilico o isopropanolo e permette il recupero degli acidi nucleici in forma solida. Dopo lavaggio con etanolo, si ha una valutazione quali-quantitativa degli acidi nucleici estratti e quindi la loro conservazione

MATERIALE:• cucchiaio da laboratorio;• provette d 15ml;• spatola;• spruzzetta.• Pipette Pasteur• lievito di liquido;• detersivo liquido;• un kiwi;• alcol etilico (etanolo);• cloruro di sodio.

PROCEDIMENTO• Prelevare un 5ml di lievito riporlo nella provetta• Aggiungere cloruro di sodio (NaCl)• Aggiungere detergente liquido per piatti• Agita lentamente per evitare la formazione di

schiuma.• Aggiungere con una pipetta Pasteur del succo di

kiwi (contiene l’enzima proteolitico)• Lasciare reagire per 30 minuti• Aggiungere alcol etilico freddo molto lentamente

in modo da farlo stratificare sul liquido acquoso(operare con un contagocce e inclinare la beutadurante l’operazione)

• Osservare la presenza di cristalli fioccosi bianchiformati da agglomerati di DNA

Meccanismo molecolare

Il processo di PCR consiste nella ripetizione ciclica di

tre passaggi:

➢ Denaturazione del DNA al calore (95°)

➢ Annealing o appaiamento dei primer al templato

(50-60°C)

➢ Estensione: la polimerasi sintetizza nuovi

filamenti basandosi sulla sequenza del templato.

(72°C)

I due primer sono complementari ai filamenti

opposti e precisamente essi si appaiano alle due

estremità 3’ del segmento di DNA da amplificare. In

questo modo offrono l’innesco per la polimerasi che

sintetizza in direzione 5’ 3’. E’ necessario che i

primer siano aggiunti in eccesso rispetto alla

quantità di DNA da amplificare.

• DNA genomico= stampo

• TAQ POLIMERASI = DNA polimerasi termoresistente

• dNTPs = dATP + dTTP + dGTP + dCTP

• Tampone

•MgCl2

•PRIMER = oligonucleotidi sintetici per l’innesco della reazione di sintesi

Per ottenere una corretta amplificazione del DNA è indispensabile impiegare soluzioni non

contaminate:

➢Utilizzare attrezzature sterilizzate

➢Cambiare sempre puntali e utilizzare i guanti.

DNAPCR buffer

MgCl2dNTPs

Primer ForwardPrimer ReverseTaq Polimerasi

H20

Buffer 10X (50mM di KCl, 10mM Tris-HCl pH 9, 0.1% Triton 100) Serve per creare unambiente idoneo per il funzionamento e mantenimento della Taq polimerasi

MgCl2 (la concentrazione può variare da 1.25mM-1.5mM) Basse concentrazioni riduconol’efficienza. Alte concentrazioni diminuiscono la specificità provocando l’appaiamento deiprimer con il templato senza che ci sia omologia totale e favoriscono l’incorporazione dinucleotidi errati.

dNTPs Alte concentrazioni di dNTPs portano ad una diminuzione della fedeltà perchél’enzima ha maggiore probabilità di recuperare dNTPs sbagliati in soluzione. Basseconcentrazioni bloccano la reazione dando una resa inferiore.

Primer La concentrazione dei primer non deve essere troppo bassa, altrimenti non procedela reazione, né troppo alta per non favorire l’appaiamento aspecifico tra primer e templato.

Taq polimerasi Tutte le DNA polimerasi aggiungono deossiribonucleotidi al terminale 3’ diuna molecola di primer di DNA a doppia elica. La sintesi avanza esclusivamente in direzione5’-3’ rispetto al filamento sintetizzato. Ogni nucleotide che viene incorporato durante lapolimerizzazione è complementare al suo opposto sul templato. La reazione di sintesirichiede i 4 deossiribonucleotidi trifosfato(dNTPs) e ioni magnesio.

Il numero di nuove molecole aumenta al succedersi di ogni ciclo.

Durante il primo ciclo da una singola molecola di DNA ne ottengo due.

Al secondo ciclo ciascuna delle diventano quattro.

In teoria quindi ad ogni ciclo il numero di copie della sequenza bersaglio aumenta in maniera

esponenziale, di fatto, il numero di copie si duplica ad ogni ciclo fino al raggiungimento di

un plateau.Nelle fasi tardive dell’amplificazione il tasso di accumulo di prodotto diminuisce a causa di numerosi fattori tra cui la degradazione dei

reagenti (dNTPs, DNA polimerasi) e dall’accumulo dei prodotti.

93-95°C 5-10 min Denaturazione inziale

Questo passaggio prevede una denaturazione iniziale, senza compromettere l’attività della polimersi.

93-95°C 30 sec-1 min Denaturazione

Durante questo passaggio si ha la denaturazione del DNA. Temperature più alte provocherebbero la degradazione del Taqpolimerasi, mentre temperature più basse causerebbero una parziale denaturazione dei filamenti e di conseguenza unaminore resa.

45-60°C 30 sec-1 min Appaiamento

È il passaggio più delicato per l’efficacia della PCR. Si verifica un appaiamento dei primer al templato. Determina laspecificità dell’appaiamento. Dipende dalla temperatura di melting dei primer (temperatura alla quale la metà dei primerè dissociata dal templato).

Una temperatura molto elevata diminuisce l’efficienza, in quanto i primer si legano poco al templato. Una temperaturamolto bassa permette ai primer di legarsi in modo aspecifico con conseguente amplificazione di frammenti di interessenullo.

T annealing = T melting - 5°

T melting= (A+T)*2+(G+C)*4

72°C per 30-sec-1 min Estensione.

Durante questa fase si verifica l’allungamento dei filamenti. L’alta temperatura evita la formazione di strutture secondarieforti da parte del templato, che impedirebbero l’azione di alcune delle polimerasi. Il tempo dipende dalla lunghezza delfilamento da amplificare e dalla velocità di polimerizzazione dell’enzima scelto.

RIPETERE gli ultimi 3 passaggi per 30-40 cicli

72°C per 5-10’ min Estensione finale

Per completare i filamenti non terminati.

Buffer 10X

MgCl2 50 mM

dNTPs 2,5 mM

Primer 10 µM

Taq 5 U

H2O

DNA 3 µl

Concentrazionifinali

Concentrazioniiniziali