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Misura 124 del PSR 2007-2013Cooperazione per lo sviluppo di nuovi prodotti, processi e tecnologie nei settori agricolo e

alimentare e in quello forestaleBando PIF fase 2 - Filiera Olivo-oleicola Progetto Integrato di Filiera “Un Filo d’Olio”

“Gestione razionale delle risorse umane e naturali in moderne tipologie di oliveti e dei sottoprodotti della lavorazione delle olive”

Metodi innovativi di riciclo delle sanse e delle acque di

vegetazione e loro utilizzo come ammendanti su piante

in vaso ed olivete

Dott.ssa Silvia Casini, Dott. Tommaso Campani, Dott.ssa Ilaria Caliani, Dott. Matteo Giannetti, Dott.ssa Milva Pepi

Dipartimento di Scienze Fisiche, della Terra e dell'Ambiente

Dott. Giampiero Cai, Dott.ssa Claudia Angiolini, Dott.ssa Claudia Perini,

Dott. Marco Romi, Dott. Luigi Parrotta, Dott.ssa Alessia Nucci,

Prof. Mauro Cresti

Dipartimento di Scienze della Vita

UNIVERSITA’ DI SIENA

Il settore olivicolo toscano interessa:

- 92.000 ettari di territorio

- 15 milioni di piante

- 50.000 aziende

- 400 frantoi

Produzione media annua di

180.000 quintali di olio di oliva

82.736 tonnellate di sanse e acque di

vegetazione


Dipartimento di scienze della vita

Con la Legge 574/96 e il D.P.G.R.2008 n. 46/R è stato eliminato l’obbligopreventivo dell’abbattimento del carico inquinante prevedendo la possibilitàdi spandere le acque di vegetazione e le sanse umide, direttamente sul suolo ascopo agronomico, ma limitatamente ai quantitativi indicati secondo latipologia dei frantoi di lavorazione (50 m3/ha per frantoi di tipo tradizionale,80 m3/ha per frantoi a ciclo continuo).

Utilizzazione agronomica delle acque di vegetazione e di scarichi dei frantoi oleari


Dipartimento di scienze della vita

- pH acido

- elevata salinità

- alto contenuto in polifenoli

- riduzione permeabilità del suolo - rischio ruscellamento e conseguente infiltrazione nei

corpi idrici- Perdita suolo agricolo

Problematiche ambientali



L'elevata salinità e acidità delle acque di vegetazione, associata all'alto contenuto di

sostanze polifenoliche limitano la loro applicazione nella fertirrigazione (Ciafardini et

al., 1998; De Simone et al., 1998). In quanto questo procedimento può provocare

danni alla flora e alla fauna del suolo. I polifenoli (1,5-8,0 g/l) hanno una spiccata

azione antimicrobica e fitotossica e sono poco biodegradabili. L’elevata

concentrazione di sostanza organica fresca non umificata è di scarsa efficacia o

svantaggiosa per la fertilità del suolo e per la produzione agraria.

Problematiche economiche



Costi di smaltimento



Gli obiettivi della misura 124 (UNISI)

•Impiego di un sistema integrato per la riduzione del potere inquinante di sanse ed acque di vegetazione con trattamento e abbattimento dei polifenoli e del pH : compostaggio e biorisanamento(bioaugmentation) a km 0.

•Impiego della biomassa trattata come ammendante agronomico in colture ortofrutticole e in oliveta.

•Utilizzo di BIOtest per il controllo dell’efficacia di processo e quindi la sicurezza ambientale.

•Trasformare un costo in risorsa attraverso la produzione di un ammendante a km 0 .

I frantoi coinvolti

Frantoio cooperativo ValdelsanoAcque di vegetazione

Frantoio CetonaSanse umide denocciolate



Controllo di processo: caratterizzazione chimico fisica e tossicologica dei reflui

Misurazioni chimico fisiche



pH salinità (mS) polifenoli (mg/kg)

sansa umida 4 2,7 388,67

Acque di vegetazione 3 12,75 415,13


Laboratorio Biomarkers

Sansa umida tal quale o

Acque di vegetazione tal quale

Suolo artificiale:50% terriccio biologico50% sabbia di fiumelavata

Eisenia fetidan 25 per ogni gruppo

sperimentale

CTRL 12,5% 25% 50%

Controllo di processo valuzione degli effetti tossicologici nel

lombrico (Eisenia fetida) e nella gambusia (Gambusia affinis)



Controllo0,1%1%

10%

Sansa umida tal quale oAcque di vegetazione tal quale

Gambusia affinisn 25 per ogni gruppo

sperimentale



- Acetilcolinesterasi (AChE): Biomarker di esposizione e di effetto per la valutazione degli effetti

sul sistema nervoso che possono essere attribuiti alla presenza di polifenoli o di insetticidi

organofosforici e carbammati utilizzati per la difesa dell'olivo.

- Perossidazione lipidica (LPO): Biomarker di esposizione per la valutazione dello stress

ossidativo nell’organismo bioindicatore

- Comet assay e ENA assay: Biomarker di esposizione per la valutazione degli effetti sul DNA

nell’organismo bioindicatore

- Metallotioneine: Biomarker di esposizione per la valutazione degli effetti causati da metalli

pesanti.

BIOtest applicati nei lombrichi e nelle gambusie



- I risultati dei BIOtest, su sansa umida, hanno mostrato la presenza di effetti

tossicologici sugli organismi del suolo trattati con le concentrazioni del 12,5% (non

sempre significativi) e 25% (significativi) e la morte di tutti gli organismi esposti alla

dose più elevata di trattamento (50%).

- L'esposizione di organismi acquatici (Gambusia affinis) a concentrazioni crescenti di

sansa umida (0,1%, 1% e 10%) ha evidenziato come la concentrazione più elevata

abbia causato la morte di tutti gli organismi.

BIOtest applicati nei lombrichi e nelle gambusie

Isolamento di batteri e funghi

Campionamento sanse denocciolate ed acque di vegetazione

Isolamento batteri e funghi polifenolo-degradanti

accrescimento



Sansa denocciolata Acque di vegetazione

266 kg di sansa 288 kg di acque

8 kg di paglia 8,4 kg di paglia


Laboratorio Biomarkers

Compostaggio

Durata: 2 mesi da Ottobre a Novembre 2013

Processo di Bioaugmentation /biorisanamento

Durata: 3 mesi da Gennaio a Marzo 2014

Ceppi fungini isolati dallo stesso cumulo di sansa/acqua di vegetazione vengono inoculati nel cumulo compostato ogni 25 giorni



Controllo di processo: riduzione pH e polifenoli

Aumento dei valori di pHdurante il trattamento



0

1

2

3

4

5

6

7

Ottobre Gennaio Marzo

pH Acque

Sansa

Diminuzione polifenoli durante il trattamento

0

100

200

300

400

500

Ottobre Gennaio Marzo

Acqua

Sansa

Controllo di processo



Bioaugmentation Sansa Cetona

Bioaugmentation Acqua Vegetazione

Valdelsa

Limite di legge 1C legge 748/84

nutrienti

Azoto Totale

% s.s. 1,8 2,3 >1

Fosforo Totale

mg/kg s.s. 1341 2667 >5000

Potassio mg/kg s.s. 13524 28788 >4000

metalli

Piombo mg/kg s.s. <0,5 <0,5 < 140

Cadmio mg/kg s.s. <0,1 <0,1 <1,5

Nichel mg/kg s.s. 0,8 1,4 <300

Zinco mg/kg s.s. 21,6 40,6 <500

Rame mg/kg s.s. 15,3 18,7 <500

Mercurio mg/kg s.s. <0,1 <0,1 <1,5

Cromo mg/kg s.s. 0,8 1,9 750

Cromo esavalente

mg/kg s.s. <0,1 <0,1 <0,5

Concentrazioni dei principali nutrienti e metalli pesanti valutati dopo il processo di

compostaggio confrontati con i limiti di legge riportati nell'allegato 1C legge 748/84.

Controllo di processo

Controllo tossicologico su organismi bioindicatori (lombrichi e pesci)

La valutazione dei BIOtest negli organismi del suolo e acquatici esposti a

concentrazioni crescenti di sansa compostata e di acque di vegetazione

compostate, ha evidenziato una diminuzione (assenza) degli effetti

tossicologici rispetto ai reflui testati prima del compostaggio e trattamento.



Valutazione della qualità dei prodotti ottenuti attraverso prove di interazione con colture ortofrutticole



Basilico Tabacco Pomodoro Olivo

12,5% (T12,5)

25,0% (T25)

50,0% (T50)

75,0% (T75)

2 irrigazioni (T2)

4 irrigazioni (T4)

6 irrigazioni (T6)

8 irrigazioni (T8)

-Elettroforesi 1-D

-ImmunoblottingHPLC

Parametri morfologici relativi alla struttura e crescita delle radici e delle foglie

Prove di interazione con colture ortofrutticole: Parametri morfologici (reflui tal quali)

Nella prima fase di accrescimento per le specie di piante sottoposte a trattamento con sansa o con acque di vegetazione tal quali , è stato possibile notare i primi segnali di sofferenza rispetto alle piante utilizzate come controllo (solo terriccio). Le nuove foglie che si originavano apparivano più piccole e di un colore meno intenso rispetto alle nuove foglie presenti negli individui di controllo. Aumentando progressivamente le concentrazioni di sansa o acque di vegetazione, tendenzialmente si induceva un minor sviluppo della pianta trattata rispetto al controllo. A concentrazioni elevate (oltre il 50%), il trattamento con la sansa umida è risultato eccessivo, non consentendo la crescita delle piante testate.



Prove di interazione con colture ortofrutticole: Parametri morfologici (reflui dopo biorisanamento)

Subito dopo la messa a dimora delle piante nel substrato di crescita, abbiamo potuto notare una differente velocità di crescita tra le piante di controllo e quelle trattate, infatti all’aumento delle concentrazioni del compostato rispetto alla percentuale di terriccio naturale utilizzato la velocità di crescita diminuiva rispetto a quella del controllo, sia per quanto riguarda il trattamento con sansa che con acque di vegetazione compostate. Tuttavia questa differenza nella velocità di crescita non è stata più riscontrata superato il primo periodo iniziale di trattamento dove le piante (tabacco e pomodoro), a quel punto mostravano la stessa altezza tra

controllo e trattati.



Prove di interazione con colture ortofrutticole: Parametri morfologici (reflui dopo biorisanamento)



Immagine delle piante di olivo con uguale velocità di crescita tra controllo (sinistra dell’immagine) e trattamenti

progressivamente crescenti (destra). Nel particolare è mostrato un esempio di nuovi germogli di una pianta trattata con

reflui compostati.

Per le piante di olivo non vi è stato alcun rallentamento della crescita nella fase iniziale, tutte le piante, anche quelle coltivate a concentrazioni elevate (75%) di compostato,

hanno dimostrato un ottimo e immediato adattamento al substrato.

Prove di interazione con colture ortofrutticole: Studio dei pigmenti fotosintetici e delle proteine



Nelle piante trattate con i reflui dal quali dai dati raccolti sia diimmunoblotting che sulle diverse concentrazioni dei pigmenti fotosinteticiemerge un sostanziale effetto negativo di entrambi i reflui oleari sul sistemafotosintetico e sugli apparati di crescita.

Nelle piante concimate con i compost dopo processo di bioaugmentation iltrattamento iniziale comporta una variazione nella normale attività fisiologicadelle piante e una fase di adattamento legata al primo contatto con l’elevataconcentrazione del compostato, ma successivamente le piante mettono ingioco un meccanismo di adattamento e riescono tranquillamente a svilupparsied accrescere come le piante controllo.

Mais di controllo: germinazione 90%, lunghezza media radice 1,5-2 cm

Mais su acque di veg.: germinazione < 5%, lunghezza radice < 1 cm

Mais su acque compostate: germinazione circa 100%. lunghezza radice > 2cm



Prove di germinazione mais

Trattamento: 1 ora in acqua (controllo), acqua di vegetazione ed acqua di vegetazione compostata. 5 giorni di germinazione in piastre contenenti la stessa miscela.



Valutare l’impatto sulla flora spontanea dell’utilizzo di sansa compostata e acqua di vegetazione compostata sparse nelle olivete monitorare la fioritura

dell’olivo al fine di fornire ammendanti e fertilizzanti a km 0 con conseguente riduzione dei reflui conferiti allo smaltimento (discarica e/o

spandimento controllato)

Due olivete in provincia di Siena, Bagno a Sorra e Cetonaognuna con 25 parcelle di 2m x 2m da rilevare

Rilevamento della vegetazione e dei fiorieffettuato prima (2013) e dopo i trattamenti

4 trattamenti sperimentali (sansa compostata 4 Kg/m2 e8 Kg/m2 e acqua compostata 5 l/m2 e 10l/m2) + 1 controllo (lasciato senza trattamenti),il tutto ripetuto per 5 volte

Valutazione dell’impatto della concimazione con sansa compostatae acqua di vegetazione compostata nelle olivete



Le analisi statistiche evidenziano come non ci siano differenze significative nella flora (ricchezza floristica, composizione specifica, famiglie, forme biologiche e indici ecologici) tra

il controllo e i vari trattamenti, mentre si evidenziano differenze significative tra i 2 anni

Lo spettro biologico ponderatosulle coperture delle speciesottolinea variazioni significativetra il 2013 e il 2014. Le erbaceeperenni (H) mostrano unacopertura totale nettamentemaggiore nel 2014, checorrisponde invece ad undecremento in copertura delleannuali (T). Questo trendpotrebbe essere riconducibileall’effetto concimazione chefavorisce le erbacee perenni, piùcompetitive nei suoli concimati,a detrimento delle annualiadattate a vivere in suoli sottili epoveri di nutrienti.

Bagno a Sorra Cetona



G

TT

H

La vegetazione spontanea delle due olivete esaminate non sembra risentire in modo negativo degli spargimenti

delle miscele sperimentali, ma anzi le variazioni individuate potrebbero essere causate da un effetto

concimazione dei trattamenti effettuati

Le variazioni della flora potrebbero però essere conseguenza di diverse pratiche agronomiche effettuate

nei due anni, fattori climatici o normali fluttuazioni, come indicherebbe il risultato delle analisi statistiche,

dove il tempo risulta significativo, mentre i trattamenti o non lo sono o lo sono solo in modo marginale

Tuttavia, per avere risultati inconfutabili da questo tipo di studi in campo servirebbe protrarre il monitoraggio della

comunità vegetale per almeno 5 anni dopo il trattamento; sarebbe quindi necessario continuare le

indagini anche nei prossimi anni, in modo da avere una conferma dei risultati ottenuti

Utilizzo dei nuovi prodotti su colture estese: studio infiorescenze



Immagini di fiori di olivo provenienti dall’oliveta di Cetona. A sinistra, fiori da piante di controllo

osservati al microscopio ottico stereo (A) ed elettronico a scansione (C). A destra, fiori

provenienti da piante trattate (B e D).



In sintesi le attività di questo progetto hanno consentito di produrre due tipi di

reflui compostati con buone caratteristiche chimico fisiche e tossicologiche. I

processi applicati (compostaggio e biorisanamento) hanno prodotto una notevole

diminuzione del contenuto di polifenoli, un abbassamento dell’acidità e della

salinità, sono di facile riproduzione ed economicamente convenienti. Il

compostaggio è avvenuto utilizzando prodotti di scarto delle attività agricole ed il

biorisanamento tramite l’uso di ceppi fungini autoctoni e quindi senza

introduzione di organismi trapiantati o di sostanze chimiche aggiunte, ed a km 0.

Le prove di interazione con colture ortofrutticole e con colture estese hanno

confermato la validità del prodotto. Il controllo di processo tramite i BIOtest ne

attesta la sicurezza ambientale.

CONCLUSIONI

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