Presentation Msc LTT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC“Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa

pectinase trong Bacillus subtilis ứng dung trong công nghiệp xư ly vai bông”

Giảng viên hướng dẫn: TS. Lê Văn Trường

Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật

Viện Công nghệ Sinh học

Học viên: Lê Trọng Tài

K17 – Hóa sinh thực nghiệm

Hà Nội, 2015

NỘI DUNG

1

2

3 Phần III: Kết Quả và Thảo LuậnPhần III: Kết Quả và Thảo Luận

Phần II: Vật liệu và Phương Pháp Nghiên Cứu Phần II: Vật liệu và Phương Pháp Nghiên Cứu

4Phần IV: Kết Luận và Kiến nghị Phần IV: Kết Luận và Kiến nghị

Phần I: Mở ĐầuPhần I: Mở Đầu

MỞ ĐẦU

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Tách dòng gen trong E.coli

Phương pháp

• Tạo dòng gen pectinase

Địa điểm nghiên cứu

Phòng Công nghệ Gen động vật – Viện Công nghệ sinh học

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Bộ môn Công nghệ sinh học động vật – Khoa Công Nghệ Sinh Học

Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội

Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội

Thời gian

Khóa luận được tiến hành từ ngày 15/01/2012 đến ngày 30 /07/2012

Mẫu máu do Viện Thú y quốc gia, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam và Đại học Cần Thơ cung cấp

STT Tên mẫu Địa điểm – Năm Năm

1 HG2012.RV1 Hậu Giang 20122 CT2012.HS1 Cần Thơ 20123 DT2012.DT8 Đồng Tháp 20124 BD2010.R1 Bình Dương 20105 HCM2010.CC3 Tp HCM 20106 HCM2010.D06 Tp HCM 20107 DN2010.1 Đồng Nai 20108 DN2010.4 Đồng Nai 20109 DN2010.5.2 Đồng Nai 2010

10 DN2010.11 Đồng Nai 201011 DN2009.42 Đồng Nai 200912 DN2009.44 Đồng Nai 200913 DN2009.59 Đồng Nai 200914 DN2009.88 Đồng Nai 200915 DN2009.292 Đồng Nai 200916 DN2009.1107 Đồng Nai 200917 DN2009.1155 Đồng Nai 200918 DN2008.153 Đồng Nai 200819 DN2008.444 Đồng Nai 200820 DN2008.452 Đồng Nai 200821 DN2008.460 Đồng Nai 200822 DN2008.499 Đồng Nai 200823 DN2008.694 Đồng Nai 200824 JAX1-R

VaccineVắc xin Trung Quốc 2012

Mẫu máu nghiên cứu

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Ký hiệu và địa điểm thu mẫu của các mẫu ORF5 được phân lập

8

2.3.3 RT – PCRSử dụng “First-strand synthesis System” cho RT-PCR của hãng Fermentas cung cấpBước 1: Tổng hợp cDNA

STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl)1 RNA tổng số 52 Mồi xuôi 0.53 Mồi ngược 0.54 H2O 5

Thể tích tổng số 11

1. Thêm các thành phần phản ứng như sau vào các ống eppendorf vô trùng và không chứa RNAse theo như bảng sau

2. Thêm các chất theo thứ tự sau vào ống eppendorf thứ 2 như bảng

STT Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

1 5X reaction buffer 4

2 RibolookTM RNase inhibitor 2

3 dNTP Mix 10 mM 2

4 MuLV 2

Thể tích tổng số 9

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.3 RT – PCRBước 1: Tổng hợp cDNA (tiếp theo)

Bước Giai đoạnNhiệt độ

(oC)Thời gian

1 Ủ 25 5 phút

2 Tiến hành phản ứng 37 60 phút

3 Kết thúc phản ứng 70 5 phút

4 Bảo quản 4 ∞


3. Trộn đều hai hỗn hợp với nhau và tiến hành ly tâm nhanh. Thể tích tổng số của hỗn hợp là 20 µl sau đó cài đặt nhiệt độ như bảng sau:

10

Bước 2: PCR đã cDNA tổng hợp ở bước 1

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR VERITI của hãng Applied Biosystems của Mỹ

Thành phần phản ứng

Máy PCR

2.3.3 RT – PCR (tiếp theo)


11

Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR

2.3.3 RT – PCR (tiếp theo)


Bước 2: PCR đã cDNA tổng hợp ở bước 1

12

2.3.4 Phân tích trình tự gen và axit amin

Trình tự gen được gửi đến công ty Macrogen tại Hàn Quốc để phân tích.

Trình tự DNA được xử lý bằng phần mềm BioEdit 7.0. Thành phần axit amin được suy diễn bằng EditSeq 5.0 sử dụng bộ mã của vi khuẩn.

Cây phả hệ được thiết lập bằng phần mềm MEGA4.1 sử dụng phương pháp so sánh khoảng cách và sử dụng Neighbor – Joinning với giá trị tin cậy 1000x lần lặp lại.


3.1 Kết quả tách tách RNA tổng số

Ảnh điện di sản phẩm sau khi tách DNA

• Hình ảnh điện di cho thấy các bằng gọn, đẹp, phân tách thành hai băng riếng biệt

1: Marker 3: HG2012.RV1

2: BD2010.R1 4: DN2009.88

Phần III: Kết Quả và Thảo Luận

• Điều này chứng tỏ đã tách thành công RNA tổng số.

3.2 Tách chiết và tinh sạch DNA thu nhận từ cDNA

14

Ảnh điện di sản phẩm DNA để giải trình tự

1: Marker 4: DN2009.882: HG2012.RV1 5: DN2009.2923: BD2010.R1 6: DN2008.4447: DN2008.694

Quy trình điện di:Tiến hành trong gel aga 1.5 %, đưới điện thế 110V trong khoảng thời gian 30 phút

Kết quả cho thấy:Băng gọn, rõ ràng, không bị đứt gãy, tập trung thành một phân đoạn có kích thước khoảng 720 kb đủ độ sạch để giải trình tự


Phân đoạn giản đồ giải trình tự tự động (chromatogram) thành phần nucleotide của đoạn gen ORF5 mẫu HG2012.RV1

3.3 Kết quả giải trình tự gen ORF5 của các mẫu phân lập


Thu được toàn bộ gen ORF5 có độ dài 603 bp

Trình tự gen ORF5 của các mẫu phân lập được trong nghiên cứu này có chứa 4 vị trí sai khác về thành phần nucleotide tương tự với các chủng phân lập tại Việt Nam và các chủng phân lập tại Trung Quốc trong những năm 2006 – 2007 đã được nhận xét là chỉ có ở các chủng động lực cao tại ở các vị trí: 25 (G T), 73 (TC), 104 (GA), 172 (A C)

3.4 Kết quả so sánh trình tự gen ORF5

của các mẫu phân lập


Các mẫu phân lập tại Việt Nam trong nghiên cứu này trừ mẫu HG2012.RV1 có mức độ thay đổi rất cao so với chủng VR2332

So với chủng VR2332:

•Chúng HG2012.RV1 không có bất kỳ vị trí sai khác nào về trình tự nucleotide

•23 mẫu còn lại có 102 vị trí sai khác về nucleotide

•Phần trăm tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng phân lập so với chủng gốc VR2332 là từ 87,5% đến 100%




So sánh với chủng vaccine JXA1:

•Có tất cả 98 vị trí sai khác về nucleotide giữa 23 chủng phân lập khi so sánh với chủng vaccine JXA1

•Phần trăm tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng phân lập so với chủng vaccine JXA1 là từ 89,2% đến 98,6%

So sánh với chủng vaccine MLV

•Có tất cả 100 vị trí sai khác về nucleotide giữa 23 chủng phân lập khi so sánh với chủng vaccine JXA1

•Phần trăm tương đồng đối về trình tự nucleotide so với chủng vaccine MLV là từ 87,2% đến 99,6%



Như vậy, về thành phần nucleotide, gen ORF5 của các mẫu phân lập tại Việt Nam trong nghiên cứu này có sự sai khác không lớn so với gen tương ứng của chủng vaccine JXA1, chủng vaccine MLV và chủng VR2332 (Bắc Mỹ)


DN2010.4

DN2010.5.2

DN2009.1155

DN2009.1107

DN2009.88

DN2009.59

DN2009.44

DN2009.42

DN2008.694

DN2008.499

DN2008.460

DN2008.452

DN2008.444

DN2010.11

CT2012.HS1

HCM2010.CC3

BD2010.R1

JAX1

DN2009.153

DN2009.292

DN2010.1

DT2012.DT8

HCM2010.D06

MLV

VR2332

HG2012.RV1

EU

050100150200

3.5 Kết quả phân tích cây phả hệ các mẫu phân lập

Các mẫu có trình tự nucleotide giống hệt nhau

Các mẫu phân lập tại các tỉnh khác nhau thì không có sự tương đồng 100% về trình tự nucleotide


3.6 Kết quả so sánh với một số chủng trên thế giới


• Tất cả các mẫu phân lập được của nhóm 1 đều thuộc sublinegae 8.7, trong đó hầu hết các chủng động lực cao của Trung Quốc đều thuộc phân nhóm này

• Mẫu HG2012.RV1 thuộc sublineage 5.1 chung phân nhóm với các chủng có độc lực thấp, chủng gốc VR2332 và chủng vaccine MLV.

• Thu được chuỗi polypeptide do gen ORF5 của các mẫu phân lập tại Việt Nam trong nghiên cứu này quy định mã hoá cho 200 amino acid

3.6 Kết quả trình tự acid amino acid suy diễn


• So với chủng VR2332:

Có 38 vị trí sai khác giữa các chủng phân lập

Phần trăm tương đồng về trình tự acid amin suy diễn là từ 87% đến 100%

• So với chủng JXA1:

Có 23 vị trí sai khác giữa các chủng phân lập

Phần trăm tương đồng về trình tự acid amin suy diễn là từ 87,5% đến 98%

• So với chủng MLV:

Có 25 sự sai khác giữa các chủng phân lập

Phần trăm tương đồng về trình tự acid amin suy diễn là từ 85,5% đến 99%

3.6 Kết quả trình tự acid amino acid suy diễn


• Đã tách được mRNA của gen mã hóa protein kháng nguyên ORF5

• Đã tổng hợp cDNA và khuếch đại đoạn gen• Đã giải trình tự thành công các đoạn gen và phân tích

trình tự gen, axit amin tương ứng• Xây dựng được cây phả hệ và phân tích được mối quan

hệ di truyền• Đã công bố trên ngân hàng gen 23 mẫu phân lập được

Phần IV: Kết Luận

24

Hướng nghiên cứu tiếp theo Tiếp tục nghiên cứu giải trình tự, nếu có điều kiện một

số mẫu PRRSV khác gây bệnh tại Việt Nam trên phạm vi tất cả các tỉnh thành.

Presentation Msc LTT

Documents

Transcript of Presentation Msc LTT