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7/25/2019 Prsentation clonage.pptx

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Dfnition du clonage Dfnition du Gnie gntique

Dfnition du plasmide

Caractristiques des plasmides du clonage Enzymes de restriction

ADN ligase

Clonage dun gne dans un plasmide

Usage des plasmides recombinants

!rences bibliograp"iques


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#e clonage

$erme issu du grec %l&n ' re(eton) #e termeclonage est l*opration qui + partir de cellulesisoles, permet d*obtenir une ligne

-plusieurs cellules similaires appeles clones.dri/ant d*un seul anc0tre)

#orsque les scientifques parlent de clonagegntique, ils ne pensent pas + la

reproduction d*un organisme mais plut&t +celle d*un gne spcifque) #e clonagegntique est un lment du gnie gntique


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#e gnie gntique

#e gnie gntique -ou ingnierie gntique.est un ensemble de tec"niques, !aisant partiede la biologie molculaire et ayant pour ob(et

lutilisation des connaissances acquises engntique

1l permet ' d*identifer

d*isoler de trans!rer

de modifer de manire contr&ler le matrielgntique


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#e plasmide

Un plasmide dsigne enmicrobiologie ou en bi l i o og e moll i cu a re une mol l cu e d*ADN

distincte distincte de l*ADNc"romosomique c"romosomique,capable capable de rplication

rplication autonome autonome) #eterme plasmide plasmide !utintroduit par le biologiste molculaire

amricain 2os"ua #ederberg en 3456)


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Une cellule bactrienne peut encontenir '

pour les grands plasmides 78 unecopie

pour les plasmides plasmidesartifciels -construits par gniegntique + des fns de clonage degnes. 78des centaines


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9ourquoi les plasmidescomme /ecteurs de clonage : ;nt une petite taille + contr&le de

rplication rel


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#e principe du clonage'

#e principe du clonage est simple) 1l consiste + i ns rer un segmen t d*ADN tranger dans unepetite molcule capable de se rpliquer de !a>onautonome) Ce type de mol l cu e d*ADN est

appel un /ecteur de clonage) Un /ecteur declonage courant est le plasmide bactrien) #*ADNdu plasmide est coup par une enzyme derestriction et li in /itro au !ragment d*ADN tran

ger cou p par la m0me enz yme de restriction ouune enzyme qui donne des e?trmits e?trmitscompatibles compatibles) #orsqu un * trans!ormantstable a t obtenu, la squence est dite clone)


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9armi les caractristiques connuspour 0tre de bons /ecteurs declonage c*est que' @ ils doi/ent porter

des marqueurs gntiques parti li cuers, comme des gnes de rit s sance au? antibiotiques antibiotiques

ou le gne codant la @galactosidase)


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ils doi/ent doi/ent porter un ou plusieursplusieurs sites de restriction uniques dans unergion qui n*est pas essentielle pour la rplicationdes plasmides) @ et si possible possible, ils

doi/ent doi/ent a/oir des sites de restrictionuniques dans des gnes codant des marqueursslecti!s) Ces marqueurs sont inacti/s inacti/slorsqu on * y insre un !ragment !ragment dADN *

tranger) #e c"oi? de ce site est dict par lesconnaissances antrieures concernant la cartog pra "ie du gnome bactrien )


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#es enzymes enzymes derestriction'

#es enzymes de restriction sont desenzymes qui reconnaissent des squencesde B + paires de base appeles sites de

restriction restriction , et y scindentscindent les deu? brins d*ADN, comme ilsincisent dans le corps de la mol l cu e, onles appelle end l onuc ases de restriction

) 1ls sont produites par les b i act r es pourse protger de lADN tranger pro/enantdautres organismes -e? p"ages.)


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#es sites de restriction restrictionsont de courtes courtes squencessquences reptes reptes , c est *

@+ dire identiques identiques surc"aque brin lu de 5* en F*) Etantdonn que l*ADN de c"aque

organisme possde une squencepropre, les enzymes de estriction ,le tron>onnent en un (eu unique et

reproductible de !ragments de


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#*ADN propre de la bactrie estprotge contre l*incision par unautre enzyme l*enzyme

modifcateur , qui le modife modifeen sites prsompti!s prsompti!s decli age cli/age ou en son /oisinage

oisinage, par mt"ylation d*une oude deu? bases gnralementin!rieur au? sites de restriction ) Ce

site une !ois mt"yl, l*endonuclase* *


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eaucoup d*enzymes de restriction produisent des!ragments d*ADN + bouts collants le mcanisme est lesui/ant ' Certains enzymes coupent lADN au ni/eau de lam0me base sur les deu? brins, on obtient alors de

!ragments + bout !ranc c*est + dire dont les nuclotidesterminau? sont apparis + leur symtrie comme pare?emple e?emple ECo H ou NrU1 ) 9lus sou/ent, sou/ent,ces enzymes enzymes coupent les deu? brins de !a>ondcale, on obtient alors des !ragments !ragments a/ecune e?trmit e?trmit co"si/e co"si/e) Ii on a(outeun autre !ragment a/ec les m0mes e?trmits co"si/es,les bases /ont sapparier) ;n peut re!aire des liaisonsco/alentes en utilisant une ADN ligase)


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D*autres coupent l*ADN au ni/eau des bases enproduisant des !ragments + bouts collants commepar e?emple e?emple 9st 1 ) #es bouts !orms parun enzyme de restriction en un site donn sont

complmentaires complmentaires de ceu? detous les !ragments obtenus a/ec le m0me enzymede restriction ) A temprature tempratureambiante ambiante, ces rgions monocatnaires,

qualifes de bouts coll t an s s* it apparientmoment t an ment + celles des autres !ragmentsd*ADN produits par le m0me enzyme de restrictionquelle que soit la source d*ADN)


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A pr s restri i ct on, le mlange des!ragments dADN est soumis + une lt " lectrop"orse sur gel, qui

spare les diJrents diJrents!ragments !ragments en !onction!onction de leur taille) Aprs a(out d

un colorant colorant qui s intercaleintercale dans la double "lice de lADN , on peut /isualiser /isualiser

les diJrents !ragments sous UH


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;n connaKt en/iron B= enzymes derestriction qui reconnaissent c"acuneune squence diJrente, appele

site de restriction restriction)Hoiciparmi eu? les plus utiliss utiliss' @Alu 1 ,$aq 1 , Lpb 1 ,Lga 1 ,Eco 1 ,Lind

111 , Not 1 , sf 1 ) #a tec"niquetec"nique sui/ante sui/ante montrele dcoupage dcoupage d un *

plasmide plasmide par un enzyme de


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Usage du clonage /ia plasmidebactrien


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Est un /accin + partir de le/uregntiquement modife, et se trans!resou/ent de personne + personne par le sang

contamin et elle pose un problme pour lesutilisateurs des mdicaments, les patientsdialyses et les indi/idus ncessitent destrans!usions rptes) #e /irus de l"patite

ne peut se d/elopper et 0tre produit quedans le sang de primates in!ectsartifciellement-2erome 6==B.)


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Usage du clonage /ia plasmidebactrien

;n utilise cette tec"nique engntique t"rapeutique, pourmettre au point des /accins, des

drogues et des tests gntiques)-/oir c"apitres sur organismestransgniques et t"rapie gnique et

tests gntiques.


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9roduction des /accins

protine /accinante contre la rage etl"patite )


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#e sang dindi/idus c"roniquementcontamins par ce /irus prsenteune particule protique appele

antigne Ls )cette particule nestpas to?ique en elleMm0me mais elleconstitue un inducteur ecace pour

la production danticorps antiM"patite ) Cette protine a tclone c"ez Saccharomyces

cerevisiae

-2erome 6==B..


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#"ormone de croissance"umaine

Utilise pour traiter les dfciencespituitaires entrainant le nanisme,tait prcdemment obtenus en

prle/ant les glandes pituitairesd"umain dcds) ;btenirsusamment d"ormones tant + la

!ois dicile et couteu?, lutilisationde cette "ormone tait de ce !aittrs limite) #"ormone de croissance

e?traite danimau? nest pas


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#e gne pour la synt"se de#"ormone de croissance "umaine at galement introduit c"ez

Escherichia coliqui constitue lasource commerciale de l"ormone)9rs de F= === en!ants prenaient

cette "ormone au? EtatsMUnis en344 -2erome 6==B.)


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2usqu*+ une priode rcentelinsuline utilise dans le traitementdes diabtes "umain tait e?traite du

pancras danimau? sacrifs)#insuline issus du porc et des bo/insprsente 6 incon/nients '


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Ce nest prcisment la m0me quelinsuline "umaine dun point de /uestructural et elle nest de ce !ait pas

aussi ecace #es prparations dinsuline

contiennent des protines animales

susceptibles de pro/oquer desractions allergiques c"ez certainsdiabtiques -2erome 6==B.)


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Depuis 34B, la productionindustrielle dinsuline "umaine estralise par des Escherichia coli

gntiquement modifes -2erome6==B.)

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