Presentado por: Dra. Irene A. Gómez Espinel
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Presentado por:Dra. Irene A. Gómez Espinel
2006
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA CLÍNICA
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El ADN y su duplicaciòn
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Componentes del ADN:
Azúcar
Bases
Grupo fosfato
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Azùcares
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Bases nitrogenadas
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Complementariedad de las bases
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BASE NUCLEÓSIDO Nucleótidos
A
Adenina
desoxiadenosina dAMP dATP desoxiadenosín trifosfato
TTimina
desoxitimidina dTMP dTTP desoxitimidín trifosfato
G Guanina
desoxiguanisina dGMP dGTP desoxiguanosín trifosfato
C Citosina
desoxicitidina dCMP dCTP desoxicitidín trifosfato
UUracilo
Bases nitrogenadas
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DUPLICACIÒN DEL ADN
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APLICACIÓN
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Tipificación En el Laboratorio de Biología Molecular del departamento de patología clínica del HU.
A partir de ADN obtenido de sangre periférica.
La tipificación de los genes HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-DR).
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Obtención de la muestra
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EXTRACCIÓN DE ADN
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ADN
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Comprobación cualitativa de la presencia de ADN
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Comprobación cualitativa de la presencia de ADN
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Comprobación cuantitativa de la presencia y pureza del ADN
FORMULA:
Ng/µl de ADN = (D.O 260 nm)(Factor de dilución)(50)
Factor de dilución = volumen total de la celda (1005)/ volumen de muestra (5 µl) = 201
50 = factor para ADN de doble cadena
35 = factor para ADN de cadena sencilla
40 = factor para ARN
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Reacciòn en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Técnica de laboratorio simple y rápida de amplificación del ADN que hace posible
obtener múltiples copias y la identificación de secuencias específicas de ADN por medio de ciclos repetitivos utilizando el termociclador
1983
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Historia de la PCR•1983 Kary Mullis Inventa la PCR
•1985 Primera publicación científica
•1986 Cetus corparation y Perkin Elmer inician desarrollo de reactivos e instrumentos para PCR
•1988 Se publica el uso de la Taq para PCR (Saiki et al)
•1990-1993 Batalla de las compañías por los derechos de fabricación de reactivos.
•1993 Kary Mullis recibe el premio Nobel en Química.
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Componentes de la PCR
- DNA molde concentración de 25-200 ngconcentración de 25-200 ng//l.l.
-Iniciadores. (oligonucleotidos, primers, Cebadores).
- dNTP´S. (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
- DNA Polimerasa termoestable. (Taq, Tli, Pfu)
- Reguladores (Mg+2)
- Ciclos de temperatura (Termociclador)
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Termocicladores
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PCR: pasos y ciclos
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Pasos de la PCR
1.- Desnaturalización del DNA (95 0C)
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Pasos de la PCR
2.- Hibridación del Iniciador (50-70 0C)- Alineamiento
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Pasos de la PCR3.- Polimerización (72 0C)
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Ciclos de la PCR
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PCR
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Termocicladores MJ Research
PTC-100
OpticonTetrad
Dyad
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Tipos de PCR
- PCR
- PCR-RFLP
- PCR in situ
- RTPCR
- PCR en tiempo real
-PCR POR GRUPOS ALÉLICOS
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IDENTIFICACIÒN DE ALELOS DE IDENTIFICACIÒN DE ALELOS DE LOS GENES HLA-A y HLA-B EN LOS GENES HLA-A y HLA-B EN POBLACIÒN DEL NORESTE DE POBLACIÒN DEL NORESTE DE
MÈXICOMÈXICO
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Sistema HLA
Los Antígenos Leucocitarios Humanos – HLA: • Son moléculas que se encuentran en los
leucocitos y en la superficie de casi todas las células de los tejidos de un individuo.
• Reconocen lo propio y lo ajeno
• Aseguran la inmunidad.
MoléculasComplejoMayor de Histocom (CMH)
Clase I y Clase II
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Sistema HLA• Transmitidas de padres a hijos
• También denominado de Histocompatibilidad
• Existen tres clases de antìgenos HLA I, II, III
• Existen tres "lugares estratégicos": HLA-A, HLA-B y HLA-DR
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MoléculasComplejoMayor de Histocom (CMH)
Clase I y Clase II
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Cromosoma No. 6
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Sistema HLA
• El tipo de antígeno presente en A, B y DR es lo que determina la posibilidad de aceptación del tejido de un donante por el organismo de un receptor.
• Para que dos personas sean compatibles, los antígenos presentes en cada uno de los tres lugares deben ser idénticos.
• Análisis del ADN en sangre.
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Evoluciòn de los alelos
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Clase I A B C E F G H J K L Total
266 511 128 6 1 15 0 0 0 0 927
Clase II DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DMA DMB DOA DOB
3 403 23 53 20 101 4 6 8 8 629
TOTAL 2532
Alelos de HLA identificados al 2006
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Genética
• Los genes del Sistema HLA se heredan siempre en bloque.
• Cada bloque se denomina haplotipo.
• El padre aporta un haplotipo (=mitad del genotipo) y la madre otro, dando origen al genotipo, perfil genético propio o individualidad del nuevo ser.
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GenéticaSistema HLA
Padre Madre
Haplotipo a Haplotipo b Haplotipo c Haplotipo d
Hijos
Combinación 1 Combinación 2 Combinación 3 Combinación 4
Genotipo a-c Genotipo a-d Genotipo b-c Genotipo b-d
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Genética
bcc
d bd
ac
ad
25 % ac, 25% ad, 25% bc, 25% bd
25% de posibilidades de coincidir con un hermano
a b
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Gen de HLA
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PCR
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ELECTROFORÈSIS
Es el movimiento de partículas eléctricamente cargadas, a través de un gas, líquido y en soportes sólidos o semisólidos (geles), como resultado de un campo eléctrico formado entre los electrodos sumergidos en el medio acuoso.
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Corrimiento electroforético
MPMMPM
EXON 2
EXON 3Cátodo
Ánodo
Corrimiento del gel
Carril de ejemplo
Marco de
plástico
Apilado del gel
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Revelado de los geles
• Pasos a seguir:
1.- Solución fijadora 10´
2.- Colorante AgNO3 5´
3.- Lavar de 2 a 3 veces con H2O.
4.- Solución reveladora.
5.- Solución fijadora
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Estos se realizan observando el DNA teñido con bromuro de etidio en un gel de agarosa.
Interpretación de resultados.
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Interpretación de resultados.Con Nitrato de plata
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Enfermedades asociadas a genes HLA
Espondilitis anquilosante HLA-B27
Síndrome de Reiter HLA-B27
Enfermedad celìaca y hepatitis crónica activa HLA-B8
Diabetes tipo 1 HLA-DR3 y DR4.
Artritis reumatoide con HLA-DR4.
Esclerosis múltiple HLA-DR2.
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VENTAJAS ESTUDIO DE ADN 1. Se puede detectar una mayor información que con la serología 2. Los resultados pueden guardarse indefinidamente 3. Se pueden identificar todos los componentes del sistema HLA 4. más fiable en cuanto a la identificación de cada individuo. 5. Más exacto ya que se eliminan reacciones cruzadas6. Rapidez en los resultados.
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Puntos críticos en la técnica de PCR
1. Riesgo de contaminación:
• ADN de la muestra• Moléculas de ADN previamente amplificadas
2. Alto costo de los reactivos y equipo3. Espacio físico específico
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Secuenciación automática
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Secuenciaciòn de ADN
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GRACIAS
Cromosoma 6