Presentacion tesis blanco ver10

“Desarrollo de paneles de SNPs autosómicos y estudio de su

aplicación con fines forenses”

INSTITUTO DE MEDICINA LEGALFacultade de MedicinaManuel Fondevila Álvarez

Introducción

INTRODUCCIÓN

* ADN MITOCONDRIAL MUTACIONES EN LA REGION CONTROL SNPs EN EL RESTO DE LA MOLECULA

* ADN NUCLEAR: STRs AUTOSÓMICOS

* ADN NUCLEAR: STRs y SNPs del cromosoma X

* ADN NUCLEAR: STRs y SPNs del Cromosoma y

Re

sist

enci

a a

deg

rad

ació

n

Informatividad

Situación actual de la genética forenseINTRODUCCIÓN

Los “Short Tandem Repeats” STRs

Unidades de repetición: entre 2-7 bp

Secuencias repetidas en tándem

ATTACTGATCGGTAGCTGAGCCAATGGCAGTGATGGGATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATAATGGTAGCTGAGTGCTGGACAT

ATTACTGATCGGTAGCTGAGCCAATGGCAGTGATGGGATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATAATGGTAGCTGAGTGCTGGACAT

ADN Repetitivo Microsatélite

INTRODUCCIÓN

Los “Short Tandem Repeats” STRs

Probabilidad de coincidencia al azar: ~1 in 3 trillones con 15 STRs

Resultado obtenido en 5 horas con una muestra de sangre del tamaño de la cabeza de un alfiler

INTRODUCCIÓN

SLIPAGE DE LA POLIMERASA

* Tasa de mutación de hasta 1x10-3

* Longitud de amplicón elevada

* En condiciones de ADN degradado el ADN de alto peso molecular es eliminado de la muestra.

DEGRADACIÓN DE LA MUESTRA

Desventajas de los STRsINTRODUCCIÓN

• Metodologías de alto rendimiento para:Bases de datos de ADN (1 millón de perfiles por año)Necesidad de grandes estudios de mt-ADN/ cromosoma Y

Automatización-Miniaturización

• Mayor sensibilidad

• Mayor información (origen geográfico)

• Características físicas

• Análisis de ADN degradado

Necesidad de ampliar la batería de marcadores

INTRODUCCIÓN

SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms

+ Coexistencia de dos o más posibilidades

nucleotídicas en un locus determinado del genoma.

+ Limitado uso en genética forense

- Estrategia de tipado mas compleja que en STRs

- Menor informatividad individual con respecto a los STRs

INTRODUCCIÓN

Para obtener una probabilidad de exclusión del 99.9% se necesitarían 50 SNPs con frecuencias de entre 0.5-0.5 y 0.2-0.8 respectivamente

P. Gill (2005)

INTRODUCCIÓN

SNPs: Single Nucleotide Polimorphism

• Es la variación mas frecuente en el genoma humano

• Presentan una tasa de mutación baja (Mutation rate 10-9)

• Son marcadores facilmente amplificables en multiplex

• Se analizan facilmente con técnicas de alto rendimiento

• Tamaño de amplicón reducible al mínimo

ATTACTGATCGGTAGCTGAG CCAATGGCAGTGATGGATTACTGATCGGTAGCTGAG CCAATGGCAGTGATGGG. T

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS DEL TRABAJO

• SELECCIÓN DE BATERÍAS DE SNPs

• OPTIMIZACIÓN DE LOS MULTIPLEXES

• VALIDACIÓN DE LOS MULTIPLEXES

• VALIDACIÓN DE LA TECNOLOGÍA DE TIPADO

DESARROLLO DE MULTIPLEXES

• APLICACIÓN A MUESTRAS DEGRADADAS

• APLICACIÓN A PREDICCIÓN DE ORIGEN POBLACIONAL

• APLICACIÓN A CASOS DE PARENTESCO COMPLEJOS

VIABILIDAD DE LOS MULTIPLEXES

* ADN severamente degradado

* Predicción de origen poblacional

* Casos de parentesco complejos

UTILIDADES DE LOS SNPs EN GENÉTICA FORENSE

INTRODUCCIÓN

Tras la muerte actúan sobre el ADN una serie de proceso acumulativos que conducen a la degradación de la molécula:

ADN severamente degradado

* Fragmentación enzimática aleatoria

* Daño oxidativo

* Acumulación de sustancias inhibidoras

INTRODUCCIÓN

* Cuanto mayor es el fragmento de ADN, menores son las probabilidades de encontrarlo íntegro y útil

ADN severamente degradado

* Las reacciones de PCR de amplicón reducido, aumentan la posibilidad de hallar los fragmentos de interés intactos

SNP 1

SNP 2

SNP 3

SNP 4

SNP 5

SNP 6

SNP 7

INTRODUCCIÓN





INTRODUCCIÓN

Determinación de origen geográfico y poblacional

INTRODUCCIÓN

DIÁSPORA ANCESTRAL DE LA HUMANIDAD

INTRODUCCIÓN

La migración: como un factor homogenizador, introduciendo cambios antes inexistentes, o aumentando su frecuencia.

La deriva génica se debe al emparejamiento al azar en la población. En general actuará aumentando la varianza entre grupos y disminuyendo la varianza intragrupal.

La mutación ocurre con una determinada probabilidad en cada posición, de forma que es muy probable que aparezca un cambio en una población y no en otras.

Fuerzas evolutivas

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

Casos de parentesco complejosLos individuos emparentados tienen una alta probabilidad de que su perfil presente identidad por descendencia

Tendencia a aumentar la resolución con mas marcadores

Mayor número de reacciones

Excesivo gasto de muestra

Riesgo de contaminación

Riesgo de error humano

INTRODUCCIÓN

Distribución de SNPs en el genoma

• Amplia distribución de marcadores en el genoma

• Mayor número de marcadores en una única reacción

• Mayor posibilidad de captar diferente pauta de recombinación

INTRODUCCIÓN

Resultados y Discusión

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Bloque 1: Método, selección y optimización del tipado

Bloque 4: Aplicación a casos de parentesco complejos

Bloque 3: Aplicación a predicción de origen poblacional

Bloque 2: Aplicación a casos de ADN degradado

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se ha desarrollado y optimizado con éxito el tipado multiplex de dos ensayos de SNPs

Método, selección y optimización del tipado

Human Identification 52plex

PCR 52plex o 23plex-Auto1 & 29plex-Auto2

Population Specific 34plex

PCR 34plex

Tipado 23plex & 29plex Tipado 34plex

Auto1-23plex Auto2-29plex Pop.Spec.34plex

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bloque 1:

Selección de SNPs

Selección de marcadores bien espaciados en el genoma

Uso de bases de datos on-line

Ausencia de amplificación inespecífica

Calidad de secuencia flanqueante

African Asian European

0.92 - 0.08 - 0.45 - 0.55

0.90 - 0.10 0.50 - 0.50 0.50 - 0.50

0.91 - 0.09 0.59 - 0.41 0.79 - 0.21

0.92 - 0.08 0.92 - 0.09 0.57 - 0.43

Adecuada distribución de frecuencias


Selección de SNPs para identificación humana Human Identification 52plex

• Frecuencia del alelo mínimo al menos 0.3 en un grupo poblacional

• Frecuencia del alelo 0.2, en máximo 2 de los grandes grupos

• Posibilidad de diseño de amplicón menor de 120bp

• Baja interacción entre primers


Selección de SNPs: Frecuencia alélica mínima

La informatividad esperada no cae significativamente hasta valores de 0.3


Validación de la selección de SNPs del multiplex

• Se ha realizado un tipado masivo de muestras de poblaciones de distribución mundial

• Los datos de número creciente de nuevas poblaciones, se añaden a una base de datos on-line

www.snpforid.org

SNPforID frequency browser


http://www.snpforid.org/

Validación del Human specific 52plex: Frecuencias observadas

• Las frecuencias observadas coinciden con las esperadas

• Alta informatividad en los tres grandes grupos

• La informatividad decrece ligeramente en población Africana


Tecnología SNaPshot: El método de tipado

Reproducibilidad

Exactitud

Sensibilidad

Adaptación a ensayos multiplex

La tecnología SNaPshot cumple con estos requerimientos necesarios para la adecuación forense del método


Concentración

Original

Dilución 1:8

Dilución 1:32

Dilución 1:132

50pg

20ng


Desventajas del método de SNaPshot

• El desequilibrio entre señales de los heterocigotos (1)

• Y la pérdida alélica (2) presentan mayor dificultad

• La aparición de bandas inespecíficas (3) tiene solución

Derivan de la detección mediante marcaje fluorescente diferente para cada base


El método de Genplex: Estrategia alternativa

Análisis por clusters de datos altamente reproducibles.

Lectura en la misma longitud de onda de ambos alelos.

Mayor constancia de la ratio de señal en los picos de heterocigotos

El método de Genplex añade estas ventajas a las características ya mostradas por el SNaPshot


GENPLEX: Análisis de mezclas• ADN extraído de toma de muestra postcoital

• Diferentes tiempos de toma de muestra tras el coito

• Comparación con los perfiles individuales de los sujetos


Método, selección y optimización del tipado


Aplicación de los SNPs a casos de ADN severamente degradado

* Se ha realizado un estudio comparativo de los métodos de análisis disponibles, mediante el tipado de una colección de restos óseos.

* Centrando parte de la atención en la resolución de casos de ADN extremadamente degradado, en los que solo el genotipado de SNPs autosómicos dio resultado.


PowerPlex16 system AmpFlSTR Identifiler

AmpFlSTR Minifiler NIST’s MiniNC01

Métodos de STRs utilizados

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bloque 2: SNPs versus STRs

Human identification 52plex

* 52plex PCR

* Dos reaciones de extensión en tandem:

Auto1 (23 SNPs)

Auto2 (29 SNPs)

* Posibilidad de usar dos PCR iniciales separadas Auto1&Auto2 – Mejora los resultados

Population Specific 34plex

* 34plex PCR

* 34plex reacción de minisecuenciación


Métodos de SNPs utilizados

* 15 muestras analizadas: 6 juegos de dientes y 9 fémures.

* Se analizaron parientes vivos.

* Todas la muestras eran de origen caucásico, de procedencia del nordeste de la península ibérica.

* Las condiciones climáticas de este área se caracterizan por precipitaciones frecuentes durante todo el año, temperatura suave y suelos ricos en materia orgánica y de pH ácido.

SELECCIÓN DE MUESTRAS


* Método 1:

Extracción por el método de Fenol-Cloroformo

Purificación con Millipore Centricon

* Método 2:

Lalueza-Fox C et al. (2000)

Modificación para ADN antiguo por Nuria Naverán

Método de cuantificación:

Applied Biosystems’ Quantifiler Human DNA quantification kit

Extracción de ADN


* Valores de IPC mayores de 28 indican la presencia de inhibidores.

* Un resultado indeterminado generalmente significa una concentración desconocida pero elevada de inhibidores.

* los inhibidores pueden afectar a la cuantificación.

* En casos de ADN degradado, una alta concetración no implica presencia de ADN de alto peso molecular .

Muestra

Internal PCR

control IPC

Cycle threshold

Ct

Concentración(ng/ul)

70-06 Undet 37 0.04

78p03 Undet 36.45 0.533

71p04 28.03 29.1 0.666

126p04 28.43 28.45 1.03

122p04 Undet 25.79 5.88

23p04 27.73 33.63 0.034

72p03 31.69 29.26 0.599

77p04 28.56 28.64 0.902

50p04 27.76 31.75 0.117

12p05 28 31.31 0.156

45p04 28.12 28.99 0.717

24p05 28.3 28.51 0.981

11p05 35.55 26.85 2.93

105-05 35.15 25.21 8.63

5p04 35.49 23.97 19.510

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

sample

cy

cle

IPC

Ct

Qty

RESULTADOS DE CUANTIFICACIÓN


ordered by powerplex/Qty

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

sample

% s

uc

ce

ss

powerplex

identifiler

auto1

auto2

34plex

NC01

minifiler

RESULTADOS DEL TIPADO

uncorrected ordered by Powerplex/Qty

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

sample

% s

ucc

ess

powerplex

identifiler

auto1

auto2

34plex

NC01

Minifiler


uncorrected ordered by Powerplex/Qty

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

sample

% s

ucc

ess

powerplex

identifiler

auto1

auto2

34plex

NC01

Minifiler

* Los sistemas de amplicón largo parecen ser afectados con una mayor agresividad por la inhibición.

* Los SNPs muestran una elevada resistencia a la inhibición.

* Una mayor concentración de ADN diana, polimerización más corta, y secuencias flanqueantes no repetitivas pueden ser las explicaciones mas plausibles para este fenómeno.


Powerplex Identifiler Minifiler Auto1 34plex Auto2 NC01

Inhibición

Sin inhibición

* tasa media de éxito antes y después de aplicar las medidas contra la inhibición.

* Los resultados corregidos muestran una tendencia, cuanto mayor el amplicón, mayores las posibilidades de fallo.


70-06 78p03

78p03

• 35 Años de degradación

• Ambiente de degradación agresivo

• Abundante crecimiento de mohos

• Epífisis ausentes y tejido pulverulento

Se aplicaron ambos métodos de extracción a estas piezas.

70-06

• 10 años enterrado en un bosque

• Descubierto tras un incendio forestal

• Restos calcinados

DEGRADACIÓN EXTREMA


70-06

78P-03

Identifiler Powerplex 16

Identifiler Powerplex 16

Reduced amplicon STRs SNPs

Mini-FilerSuccess 50%

Auto 1Success 100%

Auto 1Success 100%

Auto 2Success 100%

Auto 2Success 100%

Mini-FilerSuccess 30%

NC01:3 STRs success 100%

NC01:3 STRs success 100%

70-06

78P-03

70p06

20p07

STRs +SNPs

9/17 52/5219años

10años

P: 98.28 99.9983

P: - 99.993

0/17 52/52

4/8 MiniFiler

3/3 Mini-NC01

1/6 Mini-SGM

RESOLUCIÓN DE LOS CASOS


PREDICCIÓN DE ORIGEN GEOGRÁFICO Y POBLACIONAL

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bloque 3: Origen Poblacional

Enviado a PloS-One, in press

• SNPs específicos de población• AIMs• SNPs no binarios• SNPs fijados 3

2

14

15

SNPs INCLUIDOS EN EL MULTIPLEX

Frecuencias alélicas

Selección en base a:

•La adecuada distribución de frecuencias interpoblacionales

• Calidad de secuencia flanqueante

34 SNPs

Búsqueda en bases de datos on-line


Multiplex optimizado operativo en ADN degradado

Utilidad matématica on-line para el cálculo estadístico

Pool de SNPs seleccionados


Muestras analizadas.- 34SNP plex

CEPH PANEL

SET INICIAL SET DE CHEQUEO

MozambiqueSomaliaGaliciaDinamarcaChinaTaiwan

120 muestrasde cada grupo

1048 muestras1000X1000

BOOTSTRAPPING

Muestreo sintètico

GENOTIPADO DE MUESTRAS POBLACIONALES: VALIDACIÓN

• El 34plex distingue Europeos/africanos/asiáticos

• Clasifica con un error Cercano a 0

• Se puede asociar con SNPs para identificación

• Alta sensibilidad y robustez

• Conocimiento preciso de un mayor número de poblaciones


Pigmeos (Blaka) – perfil completoIncluso los pigmeos que no forman parte de los grupos conocidos se clasifican sin error como africanos

Utilidad matemática: Resultado de salida


Utilidad matemática: Resultado de salida

Mozambiqueño: 14 SNPs, 18 gapsAún con 18 gaps si tenemos una muestra de un africano la clasificación es correcta (con error 0)


Europeo (Cerdeña) – perfil completo

La población Sarda se clasifica correctamente pero con una LR mas baja.

Esto sugiere la influencia de la emigración norte africana a Cerdeña

Africa

Europa

Cerdeña

Asia

Clasificación en poblaciones con mestizaje: Posible fuente de error


Problemas cuando se analizan poblaciones similares

Africanos

Europeos Asiáticos

Europeos Sur Asia

(Bengalíes)

Este Asia (Chinos)Africanos

2 poblaciones similares pueden erosionar la clasificación


•El tipado de muestras de población afro-americana revela que para esta población mestiza, la predicción sigue siendo fiable en un altísimo número de casos

• Solo tres individuos clasifican como europeos

• La historia sociopolítica de estas poblaciones y la auto-designación del origen étnico dificultan la correcta valoración de estos resultados

Población mestiza: Genotipado de población Afro-americana


• 7 perfiles de STRs no se corresponden con los sospechosos

• Pregunta.- Son norte-Africanos o Europeos?

34plex: Aplicación real

- Poblaciones geográficamente próximas

- Historia reciente común

- Cierto grado de mestizaje con población

sub-sahariana


Enviado a PloS-One, in press

El test y su aplicación matemática, ofrecen para el trabajo de rutina forense un sistema de clasificación efectivo

3 muestras clasifican como norte-africanas

1 clasifica como europea

3 no dan una estima con suficiente confianza

RESULTADO DE LA PRUEBA


Bloque 4: Casos de parentesco complejos

Los SNPs autosómicos, ofrecen una serie de ventajas que explican su mayor efectividad en este campo:

• Reducida tasa de mutación

• Posiciones genómicas bien espaciadas en el genoma

• Resistencia a la degradación

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bloque 4: Parentesco Complejo

Debido a los casos resueltos con éxito gracias a la incorporación de SNPs autosómicos, se puede asegurar que su adición constituye una solución adecuada para este tipo de casos.

Un número creciente de casos de aplicación exitosa

39p04

STRs +SNPs

21/21 52/52

P: 99.799 99.994

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bloque 4: Parentesco Complejo

51p08 STRs +SNPs

21/21 52/52

P: 98.3 99.98

Conclusiones

1.-Sobre la adaptación forense del tipado de SNPs

La reproducibilidad, exactitud, robustez, la sensibilidad y la informatividad nos permiten llegar a la conclusión de que la adecuación del tipado de SNPs al trabajo forense queda probada.

1.1.- Sobre la selección de los marcadores.-

* El grado de información suministrada por los dos multiplexes de SNPs permite realizar con la suficiente confianza el cálculo probabilístico aún con los exigentes requerimientos del trabajo forense.

1.2.- Sobre el método de SNaPshot en casuística forense.-

* El estudio demuestra que es posible y operativo el diseño de reacciones multiplex de alto rango (mas de 50 SNPs) para muestras forenses.

* La sensibilidad del método de SNaPshot y su robustez quedan demostradas

* La existencia de una serie de desventajas inherentes a la técnica de SNaPshot nos llevan a concluir que su substitución por otra alternativa, como el Genplex, podría ser beneficiosa.

Conclusiones BLOQUE 1: CONCLUSIONES

1.3. - Sobre la tecnología Genplex como sucesora al SNaPshot.-

* Este método de análisis presenta una enorme reproducibilidad, lo que permite la comparación de múltiples grupos de datos, incluso entre diferentes laboratorios.

* El método Genplex es robusto y exacto permitiendo el correcto tipado de muestras problemáticas aunque muestren relaciones de intensidad de señal inusuales

* El método de Genplex permite una mejor valoración de perfiles de mezclas biológicas ya que presenta un elevado grado de exactitud, y una relación correcta entre intensidad de señal y cantidad de producto

* Sin embargo este método aún no se encuentra lo suficientemente optimizado para ofrecer una alternativa al SNaPshot en la rutina forense.

CONCLUSIONES Conclusiones BLOQUE 1:

2.- El uso de SNPs en muestras altamente degradadas.

La posibilidad de diseño de reacciones de PCR multiplex de amplicón corto hace suponer que el tipado de SNPs presentará una mayor tasa de éxito, en relación al tipado de STRs, en muestras de ADN altamente degradado

2.1.- Sobre el efecto de las sustancias inhibidoras de la PCR en muestras degradadas.-

* La presencia de inhibidores en el extracto juega un papel crítico en la dificultad del trabajo con muestras degradadas, y debe ser contemplado incluso por encima de la degradación enzimática

* El tipado de SNPs muestra una clara capacidad para soportar los efectos inhibitorios en la PCR. La mayor concentración inicial de ADN blanco sin degradar es la

explicación más probable para esta observación

* La inhibición de la reacción de la PCR puede ser limitada a través de la correcta preparación de la muestras y de la elección adecuada del método de extracción.


2.2.- Sobre el efecto de la fragmentación del ADN en la PCR de muestras degradadas

* Dependiendo del estado de degradación, el volumen del extracto, y los resultados de cuantificación, el método de análisis deberá ser seleccionado entre STRs, SNPs o ADN mitocondrial.

* Se ha comprobado que excepto en los casos de degradación más agresiva, fragmentos de hasta 300bps pueden ser amplificados con éxito con todos los sistemas. Sin embargo los SNPs ofrecen una mayor tasa de éxito si el ADN está severamente degradado.

* La aplicación del tipado de marcadores de amplicón reducido, como los SNPs y los miniSTRs, a muestras degradadas ha demostrado ser una solución adecuada para los problemas que acarrea el trabajo con este tipo de muestras.

* Para la elección de los marcadores se ha de tener en cuenta la informatividad del análisis, por lo que se recomienda el tipado de SNPs sobre el de miniSTRs.


3.- La aplicación del tipado de SNPs a la predicción de origen geográfico

Los individuos pertenecientes a varias poblaciones que fueron tipificados con el multiplex Pop.Spec.34plex, resultaron clasificados correctamente. El grado de clasificación errónea del test es cercano a cero. El test y su aplicación matemática, ofrecen para el trabajo de rutina forense un sistema de clasificación efectivo, por lo que es razonable esperar que pueda encontrar un lugar entre las aproximaciones disponibles para la asignación de ancestralidad poblacional.

3.1- Sobre la capacidad de discriminación entre poblaciones geográficamente próximas

* La comparación enfrentada, por pares de poblaciones, constituye una estrategia válida para la asignación del origen de una muestra entre poblaciones geográficamente próximas.

* Sin embargo cabe destacar que esta comparación depende del que entre las poblaciones a comparar exista una cierta diferencia en las frecuencias génicas de los marcadores implicados, entre las poblaciones.

* La selección de marcadores con la distribución de frecuencias adecuada podría permitir una separación mas fina incluso entre poblaciones con una historia común reciente, sin embargo el hallazgo de tales marcadores se presenta como una difícil empresa


4.- La resolución de casos complejos mediante el uso de SNPs

Habida cuenta de los casos resueltos con éxito gracias a la incorporación de los multiplexes de SNPs al pool de marcadores forenses, se puede asegurar que, constituye una solución adecuada para el trabajo forense, rápida y fiable


AGRADECIMIENTOS

“Generally, I dislike fixedness in both long swords and hands. Fixedness means a dead hand. Pliability is a living hand. You must bear this in mind.”Miyamoto Musashi (1584-1645)

http://www.knowprose.com/node/16030

http://www.knowprose.com/node/16030

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