Presentación de PowerPoint · PTEN pathway genes Densidad Estradiol AMH Foxo3 Phospho-Foxo3 Akt...

¿Ciencia o ficción? Nuevas técnicas de preservación de la fertilidad en

escenarios “difíciles”

Sonia Herraiz PhD

- Criopreservación de ovocitos

- Criopreservación de embriones

Existen distintas estrategias para la preservación de la fertilidad (PF) en pacientes oncológicas:

Requieren un período de estimulación hormonal

No implica un retraso en el inicio del tratamiento

Técnica de elección en pacientes pediátricas

Re-establecimiento función endocrina

Riesgo de re-introducir células malignas con el tejido trasplantado(elevado en el caso de leucemias)

- Criopreservación de corteza ovárica y posterior orto-trasplante (CCO-OT).

TÉCNICAS PARA PF

Reducir riesgo reintroducción células tumorales en pacientes

con leucemia.

Mejora seguridad CCO-OT en cáncer mama.

Pacientes pediátricas sin óvulos maduros para criopreservar.

Alternativas para pacientes que no han accedido a PF.

DESARROLLO DE NUEVAS ALTERNATIVAS CLÍNICAS

• Gran prevalencia en prepúberes.

• LLA trasplante de médula ósea: Agentes alquilantes, irradiación total.

LEUCEMIA

Riesgo de reintroducción de células malignas

Courbiere et al. 2010; Rosendahl et al. 2010; Dolmans et al. 2010; Greve et al. 2012; Abir et al. 2014

RIESGOS DE CCO-OT

AGENTES ANTI-LEUCÉMICOS

Evaluación del efecto anti-leucémico de la dexametasona en corteza ovárica criopreservada de

pacientes con leucemia.

ALTERNATIVAS

Cesar Diaz-Garcia, Sonia Herraiz, Esperanza Such, Mara Andrés, Eva Villamón,Empar Mayordomo-Aranda, José V. Cervera, Miguel A. Sanz and Antonio Pellicer

OBJETIVOS

DESCONGELACIÓN

CRIOPRESERVACIÓN

INCUBACIÓNM199+DXM 0,4mM

INCUBACIÓNM199

XENOTRASPLANTE (n=22)

6 mesesHISTOLOGÍA

PCR

OOFORECTOMÍA

HISTOLOGÍAPCR

n= 6 pacientes LLA

DISEÑO EXPERIMENTAL

MÉTODO

Paciente Diagnóstico EdadQuimioterapia

previaMarcadores Estado Actualidad

Fragmentos

(C + DXM)

1 ALL Sí IgH RC RC 1+1

2 ALL 5 Sí IgHRC

Fallecida 4+4

3 ALL 3 Sí IgH/EA2-PBX1 EMR+ Fallecida 2+2

4 ALL 3 Sí IgHRC

RC 1+1

5 ALL 7 Sí IgHRC

RC 2+2

6 ALL 15 Sí None RC RC 1+1

EMR: Enfermedad mínima residualRC: Remisión completa de la enfermedad

CARACTERÍSTICAS DE LAS PACIENTES

Paciente Diagnóstico

Previo al xenotrasplanteCorteza ovárica Enfermedad

macroscópica

Post-xenotrasplanteCorteza Hígado Otras

muestrasHistología PCR Histología PCR Histología PCR

1 ALL - - - - - - -

2 ALL - - - - - - - -

3 ALL - + - - + - -

4 ALL - - - - + - -

5 ALL - - - - + - + -

6 ALL - N.A. - - N.A. - N.A.

RESULTADOS POR PACIENTE

Tratamiento Enfermedad clínica Histología PCR PCR hígado PCR corteza

CONTROL (n=11) 0/11 0/11 2/11 1/11 2/11

DXM (n=11) 0/11 0/11 3/11 0/11 3/11

Paciente Tratamiento RATÓN PCR CORTEZA PCR HÍGADO

4 C RATÓN 1 - -

4 DXM RATÓN 2 + -

3 C RATÓN 3 + -

3 C RATÓN 4 - -

3 DXM RATÓN 5 + -

3 DXM RATÓN 6 ND -

3 DXM RATÓN 7 ND -

5 C RATÓN 8 - -

5 C RATÓN 9 + +

5 DXM RATÓN 10 + -

5 DXM RATÓN 11 ND -

RESULTADOS TRAS LA INCUBACIÓN

• No hay enfermedad clínica pero sí presencia de células malignas.

• No podemos confiar en la dexametasona para evitar el riesgo de transmisión de células leucémicas.

MANTENER LA CAUTELA Y CONTINUAR INVESTIGANDO EL USO DE POSIBLES AGENTES ANTI-LEUCÉMICOS

CONCLUSIONES


con leucemia.

Mejora de la seguridad en CCO_OT cáncer mama

Pacientes pediátricas sin óvulos maduros para criopreservar

Alternativas para pacientes que no han accedido a PF

Desarrollo de nuevas alternativas clínicas

Resultadospreliminares

Análisis inmunohistoquímico

Ninguna expresó los marcadores seleccionados para la detección de Metástasis

A B

D

FE

C

Metástasis CO CO PF

Análisis molecular

DETECCIÓN PRECOZ DE CÁNCER DE MAMA EN CORTEZA OVÁRICA

Rodriguez-Iglesias et al., F&S 2015


con leucemia.


Pacientes pediátricas sin óvulos maduros para criopreservar

Alternativas para pacientes que no han accedido a PF

Desarrollo de nuevas alternativas clínicas

• El crecimiento y maduración de folículos dentro del fragmento de tejido ovárico, es una técnica experimental en desarrollo.

• Opción para PF en pacientes pre-púberes y con enfermedad hematológica.

• Existen varias líneas de investigación trabajando en:• Cultivos en placa.

• Cultivo en corteza ovárica.• Cultivos en matrices 3D: alginato, fibrina, matriz de colágeno…

MADURACIÓN IN VITRO DE FOLICULOS PRIMORDIALES


En ovocitos, la ruta PTEN controla el desarrollo del folículo inmaduro. Reddy et al,

2008; John et al., 2008.; Castrillon et al., 2003; Li et al., 2010, Hsueh 2014.

Activación masiva de todo el pool de

folículos primordiales durmientes.

PTEN

PI3K

Fox03a

ACTIVACIÓNIVM

IVMbpV(pic):Dipotassium bisperoxo (picolinato) oxovanadate (V).

En humanos, la molécula inhibidora de PTEN bpV(pic), ha sido utilizado a 100mM encorteza ovárica, para inducir un aumento de la activación. Li et al. PNAS; 2010.


En ovario de ratón, el tratamiento especifico con un inhibidor de PTEN y un activador de PI3K, incrementa activacion de ovocitos primordiales-

Los ovocitos activados y madurados in vitro capaces de generar crías sanas tras FIV (Li

et al., 2010).

ALTERNATIVA

Activación in vitro de foliculos primordiales mediante el uso de inhibidores de PTEN en tejido

ovárico de pacientes oncológicas

Sonia Herraiz; César Díaz-García; Anna Buigues Monfort; Ana García Belda; Edurne Novella y Antonio Pellicer.

Comprobar la eficacia de la inhibición de PTEN mediante el uso debpv(pic) para la IVA de foliculos durmientes en corteza ováricapreviamente criopreservadad de pacientes oncológicas, pues estapoblación podria ser una de las prinicpales beneficiarias de laaplicación clínica de los protocolos IVA.

OBJETIVOS

PTEN pathwaygenes

Densidad Estradiol

AMH

Foxo3Phospho-Foxo3

AktPhospho-Akt

CO frescon=18

CO criopreservadan=14

1h 24h

Medio basal+ 100µM bpV(pic)

Medio basal

ACTIVADA (A)

24h

CONTROL (C)

Medio basal +100µM bpV(pic)+ 0.3IU/ml FSH

Medio basal + 100µM bpV(pic)

+ 0.3IU/ml FSH

1h

Medio basal: alpha-MEM+10%HSA

G1. Fresco-IVAG2.Fresco- Ctrl

G3 Criopreservado-IVA

G4.Criopreservado-Ctrl


Fox03 TUNELH&EG

1 A

ctiv

ado

G2

co

ntr

ol

0,34

0,12

0,46

0,26

0,03

0,29

0

0,2

0,4

0,6

0,8

Primordial/Primary Secondary Total

Fo

llic

le

s/m

m2

El tratamiento con inhibidor de PTEN a 100µM triplica el porcentaje de folículos primordiales activados in vitro (p=0.03) sin inducir ningún efecto deletéreo en los folículos o el estroma ovárico.

59,55

23,69

0

10

20

30

40

50

60

70

Act

ivac

ión

fol.

pri

mo

rdila

es

G1 Fr. Activado G2 Fr. Control

*9,5

12,8

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

% T

UN

EL +

en

est

rom

a

EFECTOS DEL TRATAMIENTO IVA EN TEJIDO FRESCO.

H&E

G3

act

ivat

edG

4 c

on

tro

l

Fox03 TUNEL

0,28

0,1

0,380,34

0,05

0,39

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Primordial/Primary Secondary Total

Folli

cle

s/m

m2

La criopreservación produce el anillamiento del citoplasma a consecuenciade la congelación lenta en < 5% de los folículos primordiales (Oktem et al. Fertil.

Steril 2011)..

63,68 36,8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Act

ivac

ión

fo

l.p

rim

ord

iale

s **16,1

13,1

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

% T

UN

EL+

Stro

mal

are

a

EFECTOS DEL TRATAMIENTO IVA EN TEJIDO CRIOPRESERVADO.

76,32

53,35 54,54

25,68

0

20

40

60

80

100

% F

olli

cle

s A

MH

+

G1 G2 G3 G4

§

§§

98,6

84,9

40,833,6

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

Estr

adio

l (p

g/m

l)

G1 G2 G3 G4

*

**

FUNCIÓN HORMONAL

IVA mediante una única incubación con concentración reducida de bpV(pic) promueve la activación de folículos primordiales durmientes, la secreción hormonal y preserva la viabilidad folicular

La eficiencia de los protocolos de IVG-IVM sigue siendo baja y por tanto seguimos lejos de la aplicación clínica de esta técnica.

CONCLUSIONES.

Novella et al. Plos One, 2014

DISEÑO DE UN OVARIO ARTIFICIAL?


con leucemia.


Pacientes pediátricas sin óvulos maduros para criopreservar.

Alternativas para pacientes que no han accedido a PF.

DESARROLLO DE NUEVAS ALTERNATIVAS CLÍNICAS

IVA + fragmentación ovárica para activación folicular

Kawamura et al. PNAS 2013; Zhai et al., JCEM 2017

Rescate foliculos durmientes en el ovario de pacientes con fallo ovárico (POI) han dado lugar al nacimiento de niños sanos.

Foliculos remanentes en el ovario son capaces de madurar y ser competentes en el nicho ovárico adecuado.

Ovarian fragmentation for follicular activation (OFFA)

César Díaz-García, Loida Pamplona, Sonia Herraiz, Alicia Marzal, Carlos Simón and Antonio Pellicer.

ALTERNATIVA

Drug-free Intervenncion quirurgica única.

OFFA (n=11)

Time to IVF 101 ± 48

Doses of FSH 2340 ± 397

Follicles>17mm 26

Oocytes (total) 20

Oocytes (MII) 14

Fertilization (%) 6/9 (66%)

PR (%) 3/13 (23%)

OPR/LBR (%) 3/13 (23%)

Values are expressed as medians (IQR), means ± standard deviations or percentages

• 8 IVF cycles

• Pregnancies <37 years-old

• 5 Patients >41• No embryos

• Caotic embryos

POI Patients

Veitia et al., Stem Cells 2007

NO GENETIC RELATIONSHIP DAUGHTER-DONOR

Sterility after Chemo-and radiotherapy

Fertility restoration

(6yr after BMT)

Nuclear polymorphisms analysis

Bone marrow transplant

- Hershlag A, and Schuster MW. Return of fertility after autologous stem cell

transplantation. Fertil Steril. 2002.

- Salooja N, et al. Pregnancy outcomes after peripheral blood or bone marrow

transplantation: a retrospective survey. Lancet. 2001.

- Sanders JE, et al. Pregnancies following high-dose cyclophosphamide with or

without high-dose busulfan or total-body irradiation and bone marrow

transplantation. Blood. 1996.

- Salooja N, at al.,. Successful pregnancies in women following single

autotransplant for acute myeloid leukemia with a chemotherapy ablation

protocol. Bone marrow transplantation. 1994.

Recuperación de la fertilidad tras trasplante médula ósea

Rejuvenecimiento ovárico mediante infusión de células madre derivadas de médula ósea en tejido

ovárico dañado por quimioterapia

Sonia Herraiz, Anna Buigues, Mónica Romeu, César Díaz-García, Aaron J Hsueh and Antonio Pellicer.

Herraiz et al, SRI 2016, 2017; ESHRE 2016

ALTERNATIVA

Evaluar el efecto regenerativo del trasplante de células madre derivadas de médula ósea en ovario de ratón previamente dañado por quimioterapia.

Bone Marrow Derived Stem Cells (BMDSC)

OBJETIVOS


1. Aislamiento BMDSC.

2. Marcaje BMDSC.

Isolation of mononuclear cells

MIRB nanoparticles

Cell labeling with Molday Ion Rhodamine B (MIRB)

• BMDSC were mobilized to peripheral blood by a 5-days treatment with G-CSF.

CD34+ circulating cells <1 ≥10.000 cel/ml

• Recovery of BMDSC by apheresis.

Diseño experimental

14

d

Standard Cht treatment (1xChT)Bu 12 mg/kg, Cy 120 mg/kg

Reduced Cht treatment (0.1xChT)Bu 1.2 mg/kg, Cy 12 mg/kg

7 d

D -7

D0

D+14

D+19

10IU PMSG 48h+ 10IU hCG

Mating (n=4/group)16h after hCG

Sacrifice (n=3/group) 72h after hCG

MII and D2 embryos recovered from the oviduct

PBS

1x106

human BMDSC

Experimentalgroups (n=7)

0.1xChT- Control

0.1xChT- BMDSC

1xChT- Control

0.1xChT- BMDSC

NOD/SCID mice

Ciclo estral y secreción estradiol.

1xChT-Control

1xChT-BMDSC

D-7 D-6 D-5 D-4 D-3 D-2 D-1 D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14

0.1xChT-Control

0.1xChT-BMDSC

ChT BMDSC infusion

✓

✓

✓✓

✓

✓

✓✗

✗✗✗✗

✗

✗✗

?

BMDSC recupera ciclo estral regular en el 75% de los animales tratados

P E M D

A

Estrous (E)Proestrous (P) Metestrous (M) Diestrous (D)

100 μm 100 μm 100 μm 100 μm

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Proestrus

Estrus

Diestrus

Metestrus -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13-7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13

-7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13

1xChT-BMDSC

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Proestrus

Estrus

Diestrus

Metestrus -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13 -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13 -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13

0.1xChT-BMDSC

-7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13 -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13-7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Proestrus

Estrus

Diestrus

Metestrus -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13 -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13 -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13

0.1xChT-Control

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Proestrus

Estrus

Diestrus

Metestrus

1xChT-Control

Estrous cycle

Peso ovario

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0,1xChT 1xChT

Ovarian / b

ody w

eig

ht (m

g/g

) Control

BMDSC

*

**

Peso ovario desciende de forma dosis-dependiente con la quimioterapia.

La administración de BMDSC recupera peso ovario tras estimulación con gonadotropinas.

Control BMDSC

1xC

hT

0.1

xCh

T

1xC

hT

0.1

xCh

T

CONTROL BMDSC

Labeled-human-BMDSC llegan al ovario y se detectan en todos los animales de los grupos infundidos mediante tinción Prussian Blue.

BMDSC se localizan en la capa de células de la teca y cerca de los vasos.

BMDSC engraftment en ovario

Molday ION-Rhodamine B labeled-human-BMDSCs

Crecimiento y desarrollo folicular

***

Numero total de foliculos y de preantrales no varia entre tratamientos

* **

% A

ntr

alfo

llicl

es

El trasplante de BMDSC aumenta el numero total de ovocitos MII recuperados y la cantidad de embriones 2-céls obtenidos

Ovulación y desarrollo embrionario

0

2

4

6

8

10

12

0.1xChT 1xChT

2-c

ell

em

bry

os

Control

BMDSC

1xC

hT

0.1

xCh

T

Control BMDSC

*

0

10

20

30

40

0.1X ChT 1xChT

MII

ovu

late

d o

ocy

tes

Control

BMDSC*

**

La infusión de BMDSC reduce la tasa de apoptosis en folículos y estroma incluso en las dosis más elevadas de ChT.

Viabilidad estroma ovárico

*p<0.05

TUNEL assay

1xC

hT

0.1

xCh

T

CONTROL BMDSC

**

Ovarian stroma

Céls Ki67-positivas en estroma y folículos de todos los grupos.

BMDSC aumenta el porcentaje de células en proliferación en estroma.

Proliferación en estroma ovárico

Ki67 immunostaining

BMDSC

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0.1xChT 1xChT

Prolifera

vecells(%)

CONTROL BMDSC

CONTROL

1xC

hT

0.1

xCh

T

*p=0.03

*p=0.04

Ovarian stroma

BMDSC mejora la vascularización en tejido ovárico, especialmente en la dosis elevada de Cht donde el tejido está

más dañado.

Vascularización

Immunofluorescent staining (Isolectin B4Green; anti α-SmaRed)

* p=0.012CONTROL BMDSC

1xC

hT

0.1

xCh

T

Tis

sue

Sam

plin

g

Ovariectomized NOD-SCID

mice

Control group (n=9)

PBS

D-7

CD133 group (n=9)

3x105

CD133

BMDSC group (n=9)

1x106

BMDSC

D0

OC grafts

D+1

D+7

D+14

Xe

no

trag

raft

Ce

llin

jectio

n

Human ovarian

cortex graft

Blood Other organs

7d

Diseño experimental: ovario humano

J L

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

D1 D7 D14

nº

seco

nd

ary

folli

cles

s/m

m3

*

*

**

Ki6

7P

russ

ian

Blu

eH

&E

CD

31

Control CD133BMDSC

A B C

E F G

I K

M N O

D

H

P

J

El trasplante de BMDSC:

Restaura la ciclicidad y la secreción de estradiol en ovarios dañados.

Mejora desarrollo folicular

Recupera capacidad ovulación

Aumenta numero MII recuperados

Mejora desarrollo embrionario temprano

Regenera nicho ovárico: reduce apoptosis y mejora proliferación células del estroma.

Aumenta la vascularización

Conclusiones

Herraiz et al., submitted

1. Mobilization of BM derived stem cells by 5-days G-CSF treatment (10 ug/kg/ day).

2. Recovery of BM derived stem cells by apheresis.

3. CD133+ cells quantification (no cell selection).

4. Infusion of whole aphaeresis containing 50x106 CD133+ cells in ovarian artery.

Clinical Trial Nº: NCT02240342Herraiz et al, ESHRE 2016

SCOT: Pilot study in PR

Pilot study with 20 PR patients based on the ESHRE criteria. Patients are considered as their own control as only one ovary received SCOT.

STUDY GROUP

•Maternal age ≤40 years.•Two episodes of PR after COS (≤3 oocytes obtained).•AFC> 2 follicles with at least 1 follicle in the ovary that will be perfused. •AMH > 0.5 - ≤3pmol/L.•Serum FSH levels ≤20IU/l.•Regular menses.

Herraiz et al, ESHRE 2016

Stem Cell Ovarian auto-Transplantation (SCOT)

Herraiz et al, ESHRE 2016,; Romeu et al., SRI 2017


12 PACIENTES

Herraiz et al, ESHRE 2016,; Romeu et al., SRI 2017


3 embarazos: 2 ET+ 1gestación espontánea 2 recien nacidos sanos

11 PACIENTES

Agradecimientos

Antonio Pellicer

César Díaz-García

Anna Buigues

Mara Andrés

Esperanza Such

Eva Villamón

Mónica Romeu

Susana Martínez

Aaron Hsueh

Vicente Mirabet

Daniela Galliano

Carlos Simón

Beatriz Rodriguez

Edurne Novella

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