AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS

LEVADURIFORMES DEGRADADORES

DEL BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR

Integrantes: Arboleda MarceloCóndor BelénCueva NathalyGóngora Estefania

INTRODUCCION

El bagazo de caña de azúcar es un material lignocelulósico constituido principalmente por celulosa, hemicelulosa ligadas fuertemente a la lignina. Tradicionalmente en los centrales azucareros este desecho se quema como una forma de limitar la disposición final de este desecho, desperdiciando un elemento de tan valiosa importancia para diversas industrias como la fabricación de papel, producción de alimentos balanceados para animales y elaboración de aglomerados para la construcción, industrias donde se usa actualmente el bagazo de caña, pero no en todo su potencial

El bagazo de caña representa aproximadamente entre el 25 y 40 % del total de la materia procesada, dependiendo del contenido de fibra de la caña y la eficiencia en la extracción del jugo. En el Ecuador existen cultivadas 79.913 Has. de caña de azúcar, y una producción bruta de 5 618 045 TM, con un rendimiento promedio de 70,30 TM/ha. El bagazo uno de los residuos agrícolas más abundantes con una producción anual estimada de 158 000 toneladas, obtenidas de los 6 ingenios azucareros existentes en el Ecuador y de otros productores pequeños. Por lo que este proyecto va orientado al aprovechamiento de los residuos de la extracción del jugo de la caña de azúcar, al degradar la lignina en celulosa y hemicelulosa mediante organismos levaduriformes degradadores de este compuesto.

Los objetivos del proyecto fueron:• Aislar levaduras con capacidad de degradar

lignina a partir del bagazo de caña de azúcar..• Seleccionar las mejores cepas, de acuerdo a las

condiciones de pH, temperatura y otras en las que ellas van a degradar el bagazo de caña.

• Identificar macro y microscópicamente las levaduras seleccionadas, y adaptarlas a un medio estable.

• Evaluar la capacidad de degradación de lignina de las levaduras aisladas del bagazo de caña.

• Preservar las levaduras seleccionadas mediante críocongelación.

MARCO TEORICO

Bagazo de caña de azúcar

La caña de azúcar crece en climas tropicales y

subtropicales. El bagazo es el residuo fibroso que

queda de la caña después de ser exprimida y de

pasar por el proceso de extracción. Por lo general

el bagazo se utiliza en los ingenios azucareros

como combustible, sin embargo para la industria

papelera representa una de las materias primas

más importantes.

El bagazo completo esta integrado por tres componentes principales:• El recubrimiento, en el que se incluye la epidermis, la

corteza y el periciclo.• Los mazos de fibra vascular, entre los que figuran las

células conductoras de pared delgada asociadas con fibras de pared relativamente con estrecho lumen.

• El tejido básico (parénquima) o medula, con mazos de fibra distribuidos irregularmente.

• La composición química de las diferentes fracciones de bagazo, incluyendo el bagazo entero, la fibra separada y la medula se indican en la Tabla 1.

Propiedades físicas y químicas del bagazo

Propiedades químicas de las fracciones del

bagazo

Entero Fibra Medula

Solubilidad en éter (%) 0.25 0.12 2.5

Solubilidad en alcohol-benceno (%) 4.1 1.8 2.8

Solubilidad en agua caliente (%) 2.5 0.9 1.9

Lignina (%) 20.2 20.8 20.2

Pentosas (%) 26.7 27.9 28.4

Hemicelulosa (%) 76.6 77.8 77.7

Alfa celulosa (%) 38.1 42.4 34.8

Ceniza (%) 1.67 0.7 2.29

CARACTERISTICAS DE LOS COMPONENTES PRINCIPALES DEL BAGAZO DE CAÑA

Celulosa:Esta compuesto por un polímero de residuos de D-glucosa unidos por enlaces. Debido a su estructura, las cadenas de celulosa se unen por Puentes de hidrogeno intermoleculares formando agregados (microfibrillas).. La celulosa es una molécula que da estructura y soporte a la planta. Es impermeable al agua. Consecuentemente el polímero celulosa es insoluble y resistente a la hidrólisis.

Hemicelulosa.- forman cadenas cortas y son

polímeros heterogéneos que contienen tanto

hexosas como pentosas. Dependiendo de la

especies de la planta, estos azucares se asocian

con ácidos urónicos formando estructuras

poliméricas diversas, qué pueden est6ar

relacionados cercanamente tanto con celulosa

como lignina. Los tres polímeros principales son

los xilanos, los mananos y los arabinogalactanos

Lignina.- Es un polímero

complejo, tridimensional,

globular, irregular, insoluble

y de alto peso molecular

(>10,000), formado por

unidades de fenilpropano

cuyos enlaces son fáciles

de hidrolizar por vía

química o enzimática.

• En las plantas, la lignina se encuentra químicamente unida a la hemicelulosa y rodeado a las fibras compuestas por celulosa.

• Es responsable de la rigidez de las plantas y des sus mecanismos de resistencia al estrés y a ataques microbianos. Es especialmente abundante (20-30% del peso de la pared) en células conductoras (vasos xilemáticos) y estructuras (fibras) con engrosamiento secundario.

Empleo de substrato orgánico por los microorganismos

Elementos presentes en gran cantidad

Degradación

Substrato Subunidad básica Enlaces C H O N P Con

2O

Sin

2O

Almidón Glucosa )61()41( + + + - - + +

Celulosa Glucosa )41( + + + - - + +

Hemicelulosa Monosacáridos C5 y C6

)41( )31( )41(

+ + + - - + +

Lignina Fenilpropano Enlaces C-C, C-O

+ + + - - + -

Quitina N-acetilglucosamina

)41( + + + + - + +

Proteínas Aminoácidos Enlaces peptídicos

+ + + + - + +

Hidrocarburos Alifático, cíclico, aromático

+ + - - - + +/-+

+Lípidos Glicerol, ácidos grasos

Esteres + + + + + + +

Organismos degradadores de lignina y

mecanismo de biodegradación

• Lignina, una substancia difícil de degradar y que los hongos descomponen debido a que poseen enzimas que rompen dicha molécula y dependiendo de cómo los hongos lo ataquen, se clasifican en: hongos de pudrición blanca y hongos de pudrición parda (o de color café)

• Estos hongos realizan la ligninólisis la función primaria de esta es exponer a la muestra al ataque del hongo con ayuda de diferentes tipos de enzimas.

• La ligninólisis ocurre durante el metabolismo secundario, es decir bajo limitación de nutrientes, lo que permite que el hongo solo sintetice y secrete agentes ligninoliticos que comiencen a fragmentar el polímero.

• Por otra parte se sabe que dos de las mas conocidas peroxidasas (enzimas que atacan a la lignina) son secretadas por diversos hongos entre ellos Pleurotus eryngii. Una de ellas es la enzima de manganeso peroxidasa y la otra es la enzima lignina peroxidada. Este hongo ha sido muy estudiado debido a su capacidad de degradar lignina selectivamente cuando crece en substratos naturales y por lo tanto es un organismo considerado como modelo para estudios de biodegradación de lignina y con aplicaciones biotecnológicas.

• En términos generales la degradación de lignina es catalizada por un complejo enzimático extracelular que poseen algunos hongos. Los mayores componentes de este sistema incluye a la enzima peroxidada (LiP), manganeso peroxidasa (MnP) y al enzima generadora de peroxido glioxal oxidasa (GLOX). Bajo condiciones de limitación de nutrientes en el medio de cultivo, diversos hongos son capaces de secretarlas

Levaduras degradadoras de lignina Recientemente, se ha descritoque algunas especies de levaduras

como Candida ingeniosa, Rhodotorula graminis y Rhodotorula

mucilaginosa son organismos que degradan productos derivados de

lignina. CARACTERISTICAS

Descripción Fenotípica

Características típicas de levadura

Hábitat Bagazo de caña de azúcar.

Grupo trófico Quimiorganotrófico

Fuente de Carbono y energía

Lignina (Heterótrofo)

Grupo aceptor de electrones

Lignina (Organótrofo)

Fórmula maestra del bioproceso

saHemiceluloCélulosaLignina Levadura

MARCO METODOLOGICO

METODOS GENERALES DE ANALISIS

• MuestreoLas muestras se tomaran del residuo de la elaboración de jugo de caña de azúcar, del sector de Tambillo, esta será representativa y recogida a diferentes tiempos, durante un día de producción.• Preparación de la muestraSe molerá perfectamente la muestra y se pesara 10 g de la misma, posteriormente se colocaran en un matraz con 90 ml de agua destilada estéril, se agitará y se hará diluciones que van desde 10-2 hasta 10-7.

METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS

Diseño del medio de cultivo

Medio minimal + agar

Compuesto Cantidad

K2HPO4 1,73 g KH2PO4 0,68 g (NH4)2SO4 0,83 g MgSO4. 7H2O 0,10 g Solución de elementos traza 1 ml Lignina* 0,2 % Agar 15 g Gentamicinaª 1 ml Agua destilada 1000 ml pH=5

Medio minimal líquido

*Se utiliza como fuente de carbono presentes en el

bagazo de caña de azúcar.

ªPara inhibir bacterias.

Compuesto Cantidad K2HPO4 1,73 g KH2PO4 0,68 g (NH4)2SO4 0,83 g MgSO4. 7H2O 0,10 g Solución de elementos traza 1 ml Lignina* 0,2 % Agua destilada 1000 ml pH=5

AISLAMIENTO DE LEVADURAS DEGRADADORAS DE LIGNINA

• Las muestras obtenidas se sembrarán por el método de extensión (asa de digrasky) en el medio minimal, tres cajas petri por dilución, y se dejarán a temperatura ambiente durante cinco días en aerobiosis.

• El pH del medio minimal mas agar debe ser de 5 debido a que las levaduras que se van a aislar crecen mejor a ese pH y los otros microorganismos que no son de nuestro interés no.

• De las cepas levaduriformes que se reproducirán en el medio al cabo de cinco días, las enriquecemos nuevamente en un medio de cultivo líquido (medio base), las llevamos al shaker durante 24 horas a 37º C y 150 rpm.

PURIFICACIÓN

• Para evitar el crecimiento de bacterias y hongos filamentosos se sembrarán las diluciones enriquecidas en medios Saburoud y otras en medio papa dextrosa adicionadas con tetraciclina para inhibir el crecimiento de los organismos mencionados anteriormente.

IDENTIFICACION

• Análisis de la morfología micro y macroscópica

• A cada una de las cepas aisladas se les realizará tinción Gram para observarlas al microscopio. Y se observará como crecen en el medio de cultivo.

SELECCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS LEVADURIFORMES

• Parámetros de selección:

• Se utilizará un pH de 5 y una temperatura de 37ºC, para las levaduras de nuestro interés

Parámetros de selección pH 4,5 a 6,5 Temperatura 24 y 48ºC.

• Concentración de nutrientes• La lignina es el principal compuesto para el

crecimiento de este tipo de levaduras, el bagazo de caña de azúcar tiene alrededor del 20%.

• Para la selección de las cepas con mayor poder degradador elaboraremos medios con las siguientes concentraciones de lignina 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8% respectivamente. Por lo tanto la selección se efectuará en el medio de cultivo con estas concentraciones.

• Los microorganismos seleccionados serán puestos nuevamente en un medio minimal líquido y sólido, con la diferencia de que esta vez el medio base contendrá como fuente de carbono el bagazo de caña de azúcar que van a ser degradados. Después de sembrar los microorganismos seleccionados estos deberán permanecer por lo menos cuatro o cinco días a temperatura ambiente para su crecimiento

Para verificar tanto el crecimiento de los organismos aislados como su capacidad de degradar lignina se emplea en medio minimal adicionado con lignina al 0,2% en forma de medio liquido en matraces de 250 ml, se sembraran las diferentes levaduras bajo las siguientes condiciones de crecimiento: pH = 5 , temperatura ambiente y agitación a 150 rpm.

• Curva de crecimientoPara evaluar el crecimiento de las cepas se tomaran diariamente 1ml de medio de cultivo de cada uno de los matraces donde se sembraron las levaduras, se colocaran en tubos de ensayo que contengan 9 ml de agua estéril, se mezclaran y a partir de estos, se realizaran diluciones hasta 10-7. Posteriormente cada dilución se sembrara en caja petri con medio solido YEPD. Cada caja se incubara a 37°C y una vez obtenido el crecimiento se contaran las levaduras.

• Degradación de ligninaPara analizar la degradación se observaran diariamente los matraces con el fin de verificar el cambio de coloración del medio de cultivo.

• PRESERVACIÓN

Para la preservación de las cepas puras que

son de utilidad biotecnológica se usara la

técnica de criocongelación (crioviales con

glicerol al 20%).