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¿Cuál de estas 3 posibilidades de replicación es la
que ocurre?
Marcaje del DNA
bacteriano con N15
Experimento de Meselson-Stahl (1958)
1. Bacteria crecida en
N14
2. Bacteria crecida en
N15
3. Incubación en
presencia de N14
4. Centrifugación de
generaciones
sucesivas
CONCLUSIÓN: La Replicación es semi-conservativa
DNA polimerasa
La replicación es catalizada por:
• Las DNA polimerasas añaden dNTPs
complementarios a una cadena molde
• Se necesita un 3’OH libre para que las
DNA polimerasas actúen (cebador)
• Las DNA polimerasas requieren Mg2+
como cofactor
Se produce un ataque nucleofílico del 3’OH al fosfato del dNTP entrante
DNAn + dNTP (DNA)n+1 + PPi
DNA polimerasa
Reacción básica de la replicación de DNA
DNAn
dNTP
molde
(DNA)n+1 PPi
Mg2+
¿Dónde comienza la replicación?
¿En una molécula circular de doble cadena, en qué sentido ocurre la replicación?
¿Además de la polimerasa hay otras moléculas involucradas en replicación?
?
La REPLICACIÓN comienza en una secuencia llamada ORIGEN y es BIDIRECCIONAL
Hay DOS Horquillas de replicación en sentido opuesto
• Cada cadena de DNA original sirve de molde para una
cadena nueva
• Los precursores son desoxiribonucleósidos 5’ TRI-
fosfato (dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
• Las cadenas de DNA originales se separan y se
sintetiza la complementaria de cada una de manera
simultánea
• La replicación comienza en una secuencia llamada
Origen
•La DNA polimerasa requiere de un cebador que
proporcione el 3’OH para la catálisis
•Se requiere la función de otras enzimas además de la
DNA polimerasa durante la replicación
Origen de Replicación bacteriano OriC
1. Activación por metilación de A en GATC
2. Unión de DnaA “abre el DNA”
3. Unión de DnaB y DnaC- actividad helicasa
ATP dependiente
4. Unión de SSB para mantener separadas las
cadenas de DNA
Cajas DnaA (9 pb) Secuencias repetidas en
tandem (13 pb)
En bacteria hay un solo origen de replicación
DNA B (helicasa)
Rompe los puentes
de hidrógeno
entre las bases y
separa las dos
hebras
La HELICASA es un hexámero que utiliza ATP para romper puentes de hidrógeno en el DNA
Proteínas de unión a cadena sencilla (SSB) mantienen las hebras separadas
La unión de SSB es cooperativa y ayuda a la
polimerasa facilitando su actividad
5. Síntesis de Cebador de RNA 6. Polimerización de DNA
1. Primasa
2. Polimerasa
RNA
DNA polimerasas de bacterias
Pulgar
Palma
Exonucleasa
La estructura de las polimerasas asemeja un mano que agarra el DNA y lo sujeta firmemente mientras va tejiendo la nueva hebra
Actividad de exonucleasa 3’ 5’
Actividad de polimerasa 5’ 3’
La fidelidad de la DNA polimerasa III es de 109
El cromosoma bacteriano tiene DOS horquillas de replicación activas Cada horquilla tiene una cadena que crece de manera continua y otra discontinua Ambas cadenas crecen en dirección 5’ 3’
El crecimiento de ambas cadenas es en sentido 5’ 3’
Hebra “guía”
Hebra “retrasada”
Fragmentos de Okazaki
Esquema de la horquilla que va en contra-sentido de las manecillas del reloj
En cada horquilla de replicación, la DNA pol III es la que replica las dos hebras al mismo tiempo.
La replicación de la hebra retrasada se interrumpe cada 1000 nt aproximadamente
Sub # por holoenzima
Mr Función
2 132,000 Actividad polimerasa Núcleo de la polimerasa
2 27,000 Exonucleasa 3’5’
2 10,000 Se requiere para la union de DnaB
2 71,000 Unión estable al molde, dimerización del núcleo
1 52,000
Complejo que carga las subunidades al DNA
1 35,000
’ 1 33,000
1 15,000
1 12,000
4 37,000
Pinzas que forman una rueda (abrazadera) sobre el DNA y aseguran óptima procesividad
Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli
Modelo del
dímero
La DNA pol III es
altamente procesiva
gracias a las
subunidades que
forman una abrazadera
proteínas
(abrazadera)
complejo
El complejo γ monta a la abrazadera sobre el DNA en cada hebra
La DNA polimerasa III es muy procesiva gracias a la abrazadera (subunidades β)
Video
Pol I Pol II pol III
gen pol A polB polC
PM (kDa) 103 90 130
mol/cél. 400 100 10
Vmax 20 nt/s 3 nt/s 750 nt/s
3' exonucl. + + +
5' exonucl + no no
procesiv. 3-200 10000 500000
DNA polimerasas en E. coli
DNA polimerasa I
La DNA pol I rellena los espacios entre fragmentos de Okazaki
Utiliza actividad exonucleasa 5’3’ para eliminar cebador de RNA
DNA ligasa
La DNA ligasa sella un enlace fosfodiester cuando ya no falta ningún nulceótido por añadir
La replicación causa superenrollamiento
Las topoisomerasa Girasa alivia la tensión
Terminación de la replicación
Topoisomerasa IV
participa en la
terminación de la
replicación de
moléculas circulares.
Cómo se asegura la célula que su DNA se
replica solo una vez?
Patrones de metilación del DNA
Las enzimas Dam metilasas regulan el inicio en el origen de replicación
