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Tecnología del DNA recombinante,clonación y creación de genes
quiméricos
Preguntas esenciales
1. ¿Se pueden crear nuevos genes usando DNArecombinante?
2. ¿Se puede modificar la herencia de un organismousando DNA recombinante?
3. ¿Cuales son los métodos que usan los científicospara crear moléculas de DNA recombinantes?
• ¿Qué significa Clonar?• ¿Qué es una librería o genoteca de DNA?
• ¿Se puede amplificar DNA sin usar un organismovivo?
• ¿Es posible hacer cambios dirigidos en la herenciade un organismo?
Pero primero vamos a recordar un poco…
Un gen típico eucariota!
PROMOTOR
exón 1 exón 2 exón 3
intrón 1 intrón 2
GEN
5’
5’
3’
3’
+ (hebrasentido)
U (sólo RNA)
C T pirimidinas
||| ||G A purinas
PROMOTOR
intron 1 intron 2
GEN
5’3’ RNApol
DNA hace RNA hace PROTEINA
exón 1 exón 2 exón 35’ 3’
+ (hebrasentido)
PROMOTOR
exon 1 exon 2 exon 3
intron 1 intron 2
GEN
5’
5’
3’
3’
+ cadena
RNApol
5’
Pre-mRNA
3’
La complementaria de una cadena negativa se sintetiza paraproducir la copia de un gen: TRANSCRIPCIÓN
2
5’3’ RNApol
5’
Pre-mRNA
3’
5’
Splicing o ayuxtamiento
3’
mRNA
5’3’
mRNA
5’3’
mRNA
TRADUCCIÓN
MS
G
proteínaNH2
RNARibosomal
t RNA
OBJETIVOS
1. CLONAR
¿Qué significa clonar?Clon: una colección de moleculas o células, todos idénticos a una molécula o
célula original
• “Clonar un gen” es hacer copias del mismo, por ejemplo en una poblaciónbacteriana
• Gen puede ser una copia de un gen original o natural
• Gen puede ser una versión alterada del mismo
• Tecnología del DNA recombinante lo hace posible en el laboratorio
CLON = multiples copias de la misma cosa
Por tanto – si clonamos un gen, significa:
•Cortarlo (RESTRICCIÓN) del resto del genoma
•Unirlo covalentemente (LIGARLO) dentro de algo que sepropague (un VECTOR).
•Situar el vector dentro (TRANSFORMARLO) de unacélula (HUESPED) que va a propagar el vector por nosotros
exon 1 exon 2 exon 3
intron 1 intron 2
GEN
5’
3’
restricción
ligar
VECTOR
Por ejemplo plasmid
Vector recombinante
3
Vector recombinante
bacteria
Cromosoma delhuesped
TRANSFORMAR
PROPAGACIÓN DEL VECTOR
•Incremento delnúmero de copiasdel plásmido•Proliferación
celular
Recuerda – DNA procariota no tiene intrones!
Si queremos trabajar con un gen y su producto –necesitamos un versión “sin intrones” del gen:
5’3’
RNApol
5’Pre-mRNA
3’
5’
splicing
3’
mRNA
Esto es:equivalente alRNA
5’
3’
mRNA
Necesitamos hacer una versión en DNA del mRNA
Su nombre es cDNA
Cuando por ejemplo decimos que hemos clonado y expresadoel gen para (por ejemplo hormona de crecimiento humana)queremos decir que hemos clonado el cDNA de la hormona decrecimiento humana
Figure 9.1.1 Figure 9.1.2
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Objetivos
1. Clonación
2. Enzimas empleados en tecnología del DNArecombinante
1. DNA polimerasas
Reacción general:
(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi
Enzimas usadas en tecnología del DNA recombinante
P
P
N
N
N
OH
5’
N
P
P
P
P
P
P
P
N
N
N
OH
P
N5’
+
DNApol
OH
Todas las DNA polimerasas:
Necesitan un cebador con un 3’OH libre
El DNA sintetizado en la nueva hebra SIEMPREva en dirección 5’ 3’
5’ OH3’5’3’
Equivalente a nuestra hebra –para nuestro gen ejemplo
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
DNA polimerasa dependiente de DNA
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
DNA polimerasa dependiente de DNA
5
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
DNA polimerasa dependiente de DNA
Pero también tiene otras actividades asociadas
p.e. 5’ → 3’ exonucleasa (eliminar los cebadores RNAprimers en la replicación del DNA)
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
DNA polimerasa dependiente de DNA
Pero también tiene otras actividades asociadas
p.e. 5’ → 3’ exonucleasa (eliminar los cebadores RNAprimers en la replicación del DNA)
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
DNA polimerasa dependiente de DNA
Pero también tiene otras actividades asociadas
p.e. 5’ → 3’ exonucleasa (eliminar los cebadores RNAprimers en la replicación del DNA)
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
DNA polimerasa dependiente de DNA
Pero también tiene otras actividades asociadas
p.e. 3’ → 5’ exonucleasa (corrige errores cometidos por lapolimerasa)
2. RNA polimerasas
En el lab - del Bacteriofago - RNA polimerasa dependiente de DNA
Alta especificidad para promotores
No requiere un cebador
PROMOTOR GEN
5’
5’
3’
3’
reacción general:
(NMP)n + NTP (NMP)n+1 + PPi
5’3’ RNApol
5’
(Pre)-mRNA
3’
RNA se sintetiza en dirección 5’ 3’
promotor
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3. Transcriptasas reversas
• DNA polimerasa dependiente de RNA – se encuentran en virus(AMW – avian myeloblastosis virus / MMLV – moloney murineleukemia virus.
• Algunas transcriptasas reversas también tienen 3’ y/o 5’ actividadexoRNase (degrada RNA después de la transcripción reversa)
• Requieren un cebador
RNA5’3’
3. Transcriptasas reversas
• DNA polimerasa dependiente de RNA – se encuentran en virus(AMW – avian myeloblastosis virus / MMLV – moloney murineleukemia virus.
• Algunas transcriptasas reversas también tienen 3’ y/o 5’ actividadexoRNase (degrada RNA después de la transcripción reversa)
• Requieren un cebador
RNA5’3’
cebador5’
3. Transcriptasas reversas
• DNA polimerasa dependiente de RNA – se encuentran en virus(AMW – avian myeloblastosis virus / MMLV – moloney murineleukemia virus.
• Algunas transcriptasas reversas también tienen 3’ y/o 5’ actividadexoRNase (degrada RNA después de la transcripción reversa)
• Requieren un cebador
RNA5’3’
cebador5’
DNA (de nuevo) se sintetiza en dirección 5’ 3’
4. Endonucleasas de restricción
Sólo se usan tipo 2 en DNA recombinante
Reconoce secuencias palíndromes
Cortan dentro – endo - DNA
4. Endonucleasas de restricción
Sólo se usan tipo 2 en DNA recombinante
Reconoce secuencias palíndromes
Cortan dentro – endo - DNA
5. Ligasa
Corrige a la endonucleasa de restricción y requiere ATP
Recuerda – se requieren extremos compatibles
Funciona mejor en extremos cohesivos que en romos
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DNA Ligasa
G P-AATTC GAATTC
| + | ||||||CTTAA-P G CTTAAG
ATP /Mg2+
Ligación de extremos romosusando T4 DNA ligasa, quecataliza la unión dependientede ATP de moléculas deDNA
A
P
P
P
OH OH
_
ATP
N
HO
P
5’
DNA o RNA
N
P
5’P
•Fosfatasa (elimina grupos P) p.e. fosfatasa de tracto intestinalP
N
P
5’HO
6. Quinasas / Fosfatasas
DNA
or RNA
Como se hace un cDNA?
•Transcriptasa reversa: encontrada en virus
requiere un cebador
mRNA tiene una cola “poliA”
5’3’
mRNA
AAAAAAAAAA
5’3’
mRNA
AAAAAAAAAA
Oligo dT I.e (TTTTTTTTT)
5’3’AAAAAAAAAA
TTTTTTT 5’
5’3’AAAAAAAAAA
TTTTTTT
Transcriptasa reversa + dNTPs
5’
5’3’AAAAAAAAAA
TTTTTTT5’
3’
8
5’3’AAAAAAAAAA
TTTTTTT5’
3’
1era cadena del cDNA
5’
3’TTTTTTT 5’
3’
1ra cadena del cDNA
AAAAAA
cebador
2nda cadena de cDNA
DNA polimerasa + dNTPs
ligar
VECTOR
Por ejemplo plasmido
5’
3’TTTTTTT
3’AAAAAA
DNA de Doble Cadena,con una cadenaequivalente al mRNA
Endonucleasas de restricción (EN DETALLE)
•Se encuentran en bacterias.
•P.e. BamHI Bacillus amyloliquefaciens cepa H
•En naturaleza – funciona para digerir DNA extraño en la bacteria
•Reconoce (secuencias palíndromes) secuencias inversas repetidas(tiene la misma secuencia 5’-3’ en cada cadena)
•“restringe” la existencia en la bacteria
•Para evitar daño del DNA endógeno, los sitios de restricción estánmetilados
Cromosola propio
Me
Me
Me
= secuencia de reconocimiento de laendonucleasa de restricción
Me
Me
Me
Por ejemplo:bacteriófago_
Tipos de endonucleasas
Tipo I: Dependiente de ATP
Endonucleasa y metilasa
Digiere DNA en sitios al azar
Hasta 1 kb del sitio de reconocimiento
Tipo II: Independiente de ATP
Endonucleasa
Digiere DNA en el sitio de reconocimiento
Type III: dependiente de ATP
Endonucleasa y metilasa
Digiere DNA ~ 25nts de secuencia de reconocimiento
Endonucleasas de restricción hidroliza entre el 3’OH y 5’Ppara dejar un grupo P en el final 5’:
P
P
P
P
P
P
P
P
N
A
G
A
T
T
C
N
G
A
A
T
T
C
Cadena +
Cadena -
EcoR1+H2O
NNNGAATTCNNN
NNNCTTAAGNNN
5’NNNG-OH P-AATTCNNN
NNNCTTAA-P OH-GNNN 5’
EcoRI + H2O
5’
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Hay varios cientos de endonucleasas de restriccióndisponibles que producen varios “finales”:
5’ protuberantes
P.e. EcoRI
3’ protuberantes
P.e. HhaI
Romos
P.e. SmaI
GAATTC G P-AATTC|||||| | |CTTAAG CTTAA-P G
GCGC GCG P-C|||| | |CGCG C-P GCG
CCCGGG CCC P-GGG|||||| ||| |||GGGCCC GGG-P CCC
romoromo
reconoce una secuencia de DNAde doble cadena específica y cortadentrodentro de esa secuencia
Se llama el sitio sitio de de reconocimientoreconocimientonormalmentenormalmente 4-8 4-8 nucle nucleóótidostidos
Corta fragmentos largos de DNA enpiezas
Llamada digestidigestióón den de restricci restriccióónn
Corta de manera reproduciblereproducible Se encuentran en bacteriabacteria
Producen dos tipos de finales cohesivoscohesivos o o romos romos
Enzimas de restricción
Los cortesLos cortes producidos por producidos por las las enzimas enzimas dederestriccirestriccióón tienen simetrn tienen simetrííaa
• hace cortes que se superponenporque reconocen normalmentesecuencias simétricas
• Llamadas PalPalííndromesndromes
Palíndrome: la lectura de basesen una cadena en 5’ → 3’ is lamisma que la secuencia 5’ → 3’de la secuencia complementaria
Inverted Palindrome:
EnzimasEnzimas de de restricci restriccióónn
Extremos cohesivosExtremos cohesivos::• cada fragmento de DNA (independientemente de la fuente del DNA) generado alcortar un DNA con el mismo E.R. tiene la misma secuencia de bases en los dos finalesdigeridos (leídos en dirección 5’ a 3’).
Los dos fragmentos de DNA distintos se pueden unir por complementareidadde bases para formar una molécula de DNA recombinanteMolMolééculacula de DNA de DNA recombinante recombinante: creación de una nueva combinación deDNA no encontrada en la naturaleza
ElEl n núúmeromero de pares de bases de pares de basesen elen el sitio sitio del del enzima enzima de derestriccirestriccióón determinan determina la ladistanciadistancia media media entre sitios entre sitiosdede restricci restriccióónn
Es decir la distancia mediaentre sitios producidos porE.R. = 4n donde n =número de bases en elsitio
GTACGTAC
kb or kilobase = 1000 pares de bases
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Se pueden usar algunos “trucos” para crear sitios de restricciónDe manera práctica – digestión con endonucleasas derestricción del DNA del fago lambda
Lambda – un virus que infecta bacteria
Genoma linear de DNA de doble cadena de ~ 49Kb
Sitio RE
lamda genome
plasmid
RE
lamda genome
plasmid
RE
lambda lambda plasmid plasmid
+RE +RE
Electroforesis en gel de agarosa
Tamaño
del DNA
Con el fin de introducir DNA en un vector necesitamosextremos compatibles
VECTOR
P.e. plasmido
EcoRI
EcoRI EcoRI
EcoRI EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI EcoRI ligar
Problema: Autoligación del vector >> recombinantes
Usar 2 (no-compatibles) enzimas de restricción:
VECTOR
P.e. plasmido
EcoRI
EcoRI BamHI
EcoRI BamHI
EcoRI + BamHI
EcoRI + BamHI
EcoRI BamHI ligar
BamHI
BamHI
EcoRI