Praktisches Arbeiten mit gentechnischen Methoden in der...
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Praktisches Arbeiten mit gentechnischen Methoden in der Schule
Comenius - Projekt "come together - work together"
Arno Hirtler
Kollegium Kalksburg
Klasse 8. A
Schuljahr 2003/04
Prof. Mag. Gabriele Premauer Biologie und Umweltkunde
Wien, 21. Jänner 2004
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Inhaltsverzeichnis:
1. Einleitung 4
2. Einführung 5 2.1 Aufbau der Zelle 5
2.1.1 Eukaryonte Zellen 5
2.1.2 Prokaryonte Zellen 6
2.2 Struktur der DNA 7
2.3 Replikation der DNA 11
3. Gentechnik 14 3.1 Isolieren von DNA aus Gewebe 14
3.1.1 Isolieren von DNA aus pflanzlichen Zellen 14
3.1.2 Isolieren von DNA aus Kalbsthymus-Gewebe 15
3.1.3 Isolieren von DNA aus der Mundschleimhaut 19
3.2 Gelelektrophorese 21
3.3 Restriktionsanalyse 24 3.3.1 Theorie 24
3.3.2 Anwendungen 26
3.3.2.1 Modifizieren von DNA 26
3.3.2.2 Vaterschaftstest 27
3.3.2.3 Gerichtsmedizin 27
3.3.3 Praktisches Beispiel 27
3.4 PCR 28 3.4.1 Theorie 29
3.4.1.1 Das Prinzip der PCR 29
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3.4.1.2 Limitation und Effizienz 32
3.4.1.3 spezielle PCR-Techniken 34
3.4.1.3.1 Nested PCR 34
3.4.1.3.2 Touch down PCR 35
3.4.1.3.3 Inverse PCR 35
3.4.1.3.4 Reverse-Transkriptase-PCR 36
(RT-PCR)
3.4.2 Anwendungen 37
3.4.2.1 Paläontologische Genetik 37
3.4.2.2 Gerichtsmedizin 37
3.4.2.3 Medizinische Diagnostik 37
3.4.3 Praktisches Beispiel 38
4. Zusammenfassung und Ausblick 41
5. Glossar 42
6. Bilderverzeichnis 48
7. Literaturverzeichnis 49
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1. Einleitung:
Im Herbst 2002 wurde ich gefragt, ob ich zusammen mit Schulkameraden, die als
Wahlpflichtfach ebenfalls Biologie gewählt hatten, an einem Vormittag eine
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) machen würde. Damals wusste ich noch nicht, was
PCR war, aber ich sagte zu. An diesem Praktikumstag erfuhr ich auch vom Comenius-
Projekt.
Beim Comenius-Projekt handelt es sich um eine europäische Schulkooperation, an der
Schüler und Lehrer von neun Schulen aus sieben verschiedenen Ländern (Deutschland,
Litauen, Niederlande, Österreich, Slowakei, Tschechien und Ungarn) teilnehmen. Im
Mittelpunkt dieses Projektes stehen Theorie und Praxis zum Thema Gentechnik. Das
Projekt fing im August 2002 an und wird im Juni 2005 enden. Neben den verschiedenen
Techniken sollen auch ethische Probleme der Gentechnik angesprochen werden.
Nach diesem sehr lehrreichen Tag gab es im selben Schuljahr noch einige Exkursionen
in das Vienna Biocenter. In diesem Zeitraum fasste ich den Entschluss, eine
Fachbereichsarbeit über das Thema Gentechnik und besonders über die PCR-Technik
zu schreiben.
Im Frühjahr 2003 wurde gefragt, wer gerne zum nächsten einwöchigen Schüler- und
Lehrertreffen im Rahmen des Comenius-Projekts in Hamburg mitkommen würde. Ich
meldete mich an und konnte schlußendlich mitfahren. In Hamburg lernten wir DNA aus
pflanzlichen und tierischen Zellen zu isolieren und eine Restriktionsanalyse
durchzuführen. Zur Auffrischung machten wir eine PCR.
Ich entschloss mich, alles, was ich dort gelernt hatte, auch in meine Fachbereichsarbeit
einfließen zu lassen. Der Schwerpunkt liegt aber besonders auf der PCR-Technik, weil
ich diese sehr oft durchgeführt habe und mich bei diesem Thema auch am besten
auskenne.
Ich habe die Versuche, die in dieser Fachbereichsarbeit beschrieben werden,
hauptsächlich in Hamburg durchgeführt. Das PCR-Beispiel stammt aus Versuchen im
Vienna Biocenter.
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2. Allgemein: 2.1 Aufbau der Zelle: Die kleinsten Bausteine eines jeden Lebewesens sind die Zellen. Sie sind von einer
Membran umhüllt und mit einer wässrigen Lösung von chemischen Substanzen gefüllt.
Weil sie sich ohne einen Partner vermehren können, sind einzelne Zellen (= Einzeller,
Protozoen) die einfachsten Lebensformen. Höhere Organismen bestehen aus
Zellgemeinschaften, die aus einer Gründerzelle durch Teilung und Wachstum
entstanden sind. In diesen Gemeinschaften führen Gruppen von Zellen verschiedene
Funktionen durch und können auch miteinander kommunizieren.
Es gibt zwei unterschiedliche Arten von Zellen: Eukaryonten mit Zellkern und
Prokaryonten ohne Kern. Zu den Prokaryonten gehören Bakterien und Blaugrün-Algen.
Alle komplexeren vielzelligen Organismen, wie der Mensch, sind aus eukaryonten
Zellen aufgebaut. Eukaryonten haben auch eine Vielzahl von inneren Organen,
Organellen genannt.
2.1.1 Eukaryonte Zellen: (siehe Abb.)
1
Eukaryonten sind Zellen mit einer Doppelmembran, die das Cytoplasma mit all seinen
Proteinen und Organellen plus einem Zellkern (Nucleus) enthalten. Dieser Zellkern
enthält die Desoxyribonucleinsäure, die DNA, die Erbinformation der Zelle, und ist von
einer doppelten Membran mit Poren umschlossen. Diese Poren sind für den Transport
von Stoffen zwischen Cytosol und Nucleus zuständig.
1 Abb. 1-17 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 16
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Im Kerninneren findet die Replikation der DNA und ihre Transkription in RNA
(Ribonucleinsäure) statt. Grundsätzlich wird die RNA in weiterer Folge außerhalb des
Zellkerns als Matrize für die Entstehung von Proteinen verwendet.
Bei der Teilung der Zelle in zwei gleichartige Tochterzellen werden die DNA-Moleküle
kompakter und bilden Chromosomen, wodurch diese leichter erfolgen kann.
Jedes dieser Chomosomen besteht aus einem einzigen, sehr langen DNA-Strang, der mit
Proteinen assoziiert ist, die diesen Strang in eine kompaktere Form bringen. Die
Verbindung von DNA und Protein wird Chromatin genannt.
Die Chromosomen durchlaufen in der Zelle verschiedene Stadien:
In der Interphase befinden sich die Chromosomen in einem ausgebreiteten Zustand, in
dem die Transkription, Translation und Replikation stattfinden.
Wenn sich die Chromosomen auf die Mitose vorbereiten, wird der DNA-Faden immer
mehr aufgerollt und dabei immer kompakter. Das entstandene hochkondensierte
Chromosom nennt man Mitose-Chromosom.
Alle Zellen in Individuen gleichen Geschlechts und gleicher Spezies enthalten immer
einen identischen Chromosomensatz, z.B. der Mensch besitzt 46 Chromosomen.
Natürlich gibt es auch hier Abnormitäten, diese sind aber immer auf Mutationen
zurückzuführen.
2.1.2 Prokaryonte Zellen: (siehe Abb.)
2
Bei den Prokaryonten fehlt der Zellkern, die DNA ist daher nicht im Kern verborgen,
sondern sie treibt als ringförmiges Molekül (Nucleoid) im Plasma herum. Prokaryonte
Zellen haben keine Zellorgane außer Ribosomen.
2 Abb. 3.7 aus der Medizinischen Mikrobiologie, Buch S.159
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2.2 Struktur der DNA: Als zu Beginn der 20iger Jahre erkannt wurde, dass die Gene, die die Zellteilung
kontrollieren, auf Chromosomen liegen, untersuchte man diese genauer und erkannte,
dass sie aus zwei biologischen Verbindungen aufgebaut sind, und zwar aus Proteinen
und einer bestimmten Nucleinsäure, der Desoxyribonucleinsäure (DNA). Einer dieser
beiden Stoffe musste also das genetische Material sein.
Es war bekannt, dass Proteine Makromoleküle sind und aus 20 Aminosäuren bestehen,
die keine Beschränkung in der Reihenfolge ihrer Verknüpfung haben. So kann es fast
eine unendliche Anzahl verschiedener Proteinarten geben.
Bei der DNA nahm man an, dass es ein kleines unveränderliches Molekül sei. Und da
man dachte, dass die DNA nicht über die nötige Variabilität verfüge, um die gesamte
Erbinformation zu beinhalten, meinte man zuerst, dass die Proteine der Chromosomen
das genetische Material seien.
Für diese Annahme gab es aber keine Beweise und nach genaueren Untersuchungen
wurde allmählich klar, dass die DNA in Wirklichkeit ein sehr langes Polymer mit fast
unendlich vielen Formmöglichkeiten ist.
1928 entdeckte schließlich Frederik Griffith die bakterielle Transformation
(= Aufnahme neuer Gene durch eine Zelle in Form isolierter DNA) (siehe Abb.) und
bewies damit, dass die DNA das genetische Material beinhaltet.
Experimenteller Nachweis, dass DNA das genetische Material ist.3
3 Abb. 6-3 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S.199
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Das Wissen über die Struktur der DNA geht auf die beiden Wissenschaftler J. Watson
und F. Crick zurück.
Alle Zellen enthalten DNA, in der in verschlüsselter Form die "Baupläne" sämtlicher
Proteinmoleküle dieser Zelle gespeichert sind.
DNA, wie auch die RNA, ist ein lineares Heteropolymer, d.h. ein Molekül, das
zahlreiche Einzeleinheiten umfasst, die Monomere, die kettenartig miteinander
verbunden sind.
Dieses Polymer besteht aus vier genetischen Bausteinen, den Nucleotiden, die sich
wiederum aus drei Teilen zusammensetzen: einem Zucker, bei der DNA die
Desoxyribose (siehe Abb.), bei der RNA die Ribose (siehe Abb.), einer
stickstoffhaltigen Base und einer Phosphatgruppe.
Desoxyribose und Ribose 4
Beim Zucker nummeriert man die Kohlenstoffatome immer in der gleichen Weise,
wobei der Kohlenstoff der Carbonylgruppe (– C = O), die sich bei der Kettenstruktur an
einem Ende befinden, die Zahl 1’ erhält. Diese Nummerierung verrät, an welchen
Positionen die anderen Komponenten des Nucleotids mit dem Zucker verbunden sind.
Die vier verschiedenen Stickstoffbasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin sind die
genetisch informativen Elemente. Adenin und Guanin sind zwei Purine und Cytosin und
Thymin sind Pyrimidine. Die Purine bestehen aus einem Fünferring und einem
Sechserring, die Pyrimidine aber aus nur einem Sechserring (siehe Abb.).
4 Tafel 2-6 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 68
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Die zwei Arten von Basen5
An jeder Base ist der Zucker mit seinem 1’-Kohlenstoff durch eine kovalente Bindung
gebunden, d.h., dass diese Bindung nur durch ein Enzym aufgespalten werden kann. An
dem 5’-Kohlenstoff des Zucker ist auch wiederum kovalent das Phosphat gebunden.
Die Verbindung des Zuckers mit einer Base nennt man Nukleosid. Mit der
Phosphatgruppe wird es zum Nucleotid.
Werden mehrere Nucleotide aneinander gehängt, so nennt man dieses entstandene
Polymer Oligonucleotid oder Polynucleotid. Dabei binden sich die Nucleotide
kettenmäßig und kovalent mit Hilfe einer Phosphatbrücke zwischen dem 3’ C-Atom des
Zuckers und dem 5’ C-Atom des Zuckers mit dem folgenden Nucleotid aneinander.
Diese Bindung nennt man 3’-5’-Phosphodiesterbindung (siehe Abb.).
5 Tafel 2-6 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 68
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Struktur eines kurzen Polynucleotids6
Durch die Aneinanderknüpfung der Nucleotide entsteht aber nur ein Einzelstrang. Bei
der Doppelhelix der DNA werden jeweils zwei Basen durch Wasserstoffverbindungen,
die durch Hitze leicht aufgetrennt werden können, beieinander gehalten. Zwischen 1945
und 1950 bemerkte dabei Erwin Chargaff, dass die Basenverhältnisse in der DNA
konstant sind. Durch diese Entdeckung erkannten später James Watson und Francis
Crick, dass sich immer ein Purin mit einem Pyrimidin paart. Adenin ist komplementär
zu Thymin und Cytosin ist komplementär zu Guanin. Die Form der Doppelhelix wird
durch die Stapelung der Basen bestimmt. Diese stapeln sich wegen ihres Dipolmoments
um 36° versetzt.
Auszug aus Moderne Genetik, Buch S.:
Die Doppelhelix (siehe Abb.) hat sieben wichtige Eigenschaften:
1. Sie besteht aus zwei Polynucleotiden. [...]
2. Die stickstoffhaltigen Basen sind auf der Innenseite der Helix gestapelt. Die
Zucker-Phosphat-Kette bildet das Rückgrat der DNA. [...]
3. Die Basen der beiden Polynucleotide stehen über Wasserstoffbrücken in
Wechselwirkung. [...]
4. Eine Windung der Helix enthält zehn Basenpaare. [...]
5. Die beiden Stränge der Doppelhelix sind antiparallel. Ein Polynucleotid verläuft
in 5' → 3'-Richtung, das andere in 3' → 5'-Richtung. [...]
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6. Die Doppelhelix hat zwei verschiedene Furchen. Man unterscheidet eine große
und eine kleine Furche . Diese Eigenart ist von Bedeutung, wenn die Doppelhelix
mit Proteinen in Wechselwirkung tritt, die an der DNA-Replikation oder der
Expression der genetischen Information beteiligt sind. [...]
7. Die Doppelhelix ist rechtsgewunden. [...]
Die Doppelhelix7
Der Aufbau und die dreidimensionale Struktur sind bei allen Lebewesen gleich, ob sie
Prokaryonten sind oder Eukaryonten. Doch bei den Eukaryonten, zum Beispiel beim
Menschen, ist die DNA noch weiter organisiert zum Supercoil. In dieser Form ist sie in
Chromosomen aufgeteilt, wo sie einen strukturellen Komplex mit Proteinen bildet.
2.3 Replikation der DNA:
Immer wenn sich eine Zelle teilt, muss sich auch die DNA vervielfältigen
(amplifizieren). Dieser Vorgang wird als identische Duplikation oder Replikation der
DNA bezeichnet.
Die Verdopplung der DNA verläuft semikonservativ, d. h. am Ende der Replikation
sind zwei identische DNA-Doppelstränge entstanden, wobei jeder aus einem
Einzelstrang der ursprünglichen DNA und dem neu dazu synthetisierten Strang besteht
(siehe Abb.).
7 Abb. 6-4 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S.200
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Elternstrang Tochterstränge 8
Dabei wird jeder der beiden Einzelstränge der Doppelhelix als Matrize für den Aufbau
einer neuen komplementären Kette verwendet. Das bedeutet, dass sowohl die
Chromosomenstruktur als auch die Doppelstrangstruktur aufgelöst werden muss.
Während ein DNA repliziert wird, sind immer nur in einem begrenzten Abschnitt die
Basen nicht gepaart. Den Punkt, wo die Unterbrechung der Basenpaare beginnt, nennt
man Replikationsursprung. Von diesem Punkt kann die Sythese entweder in beide
Richtungen oder nur in eine Richtung ablaufen. Der Abschnitt, wo die ursprüngliche
DNA aufgetrennt wird und zugleich neu synthetisiert wird, heißt Replikationsgabel.
Verantwortlich für die Auftrennung der elterlichen Doppelhelix ist die Helicase DnaB.
Dieses Enzym wirkt mit den einzelstrangbindenden Proteinen zusammen. Die Proteine
stabilisieren und linearisieren nach der Auftrennung den Einzelstrang. An dem
Startpunkt der Replikation muss eine Starthilfe in Form eines RNA-Stücks, Primer
genannt, vorhanden sein. Diese Starthilfe wird später wieder durch Enzyme entfernt.
Die DNA-Synthese ist gerichtet. Es gibt nur ein Syntheseenzym, das den
Matrizenstrang aber nur in 3'→5'-Richtung liest und synthetisiert. Daher muss die
Synthese des zweiten neuen Stranges, also des 5'→3' gerichteten, stückweise erfolgen.
So entsteht zuerst ein kontinuierlicher Strang und ein diskontinuierlicher Strang. Die
Stücke des diskontinuierlichen Strangs werden Okazaki-Fragmente genannt, die eine
Größe von 1000 Nucleotiden haben.
8 Abb. 11.2 aus Moderne Genetik, Buch S. 190
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Abläufe an der Replikationsgabel bei der Verdoppelung der DNA9
Die fehlenden Phosphordiesterbindungen bei den Okazaki-Fragmente werden später
durch ein besonderes Enzym, die DNA-Ligase, hergestellt.
9 Abb. 3-1 aus Gentechnik, Buch S. 67
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3. Gentechnik Gentechnik ist der Einsatz experimenteller Methoden, um DNA-Moleküle mit neuen
Genen oder neuen Zusammenstellungen von Genen herzustellen.
3.1 Isolieren von DNA aus Gewebe 3.1.1 Isolieren von DNA aus pflanzlichen Zellen:
Es gibt verschiedene Methoden, um (mehr oder weniger reine) DNA zu erhalten, z.B.:
Dichtegradientenzentrifugation, Adsorptionschromatographie, chemisch-enzymatische
Methoden.
Hier wird eine sehr einfache und schnelle Methode zur DNA-Extraktion verwendet. Um
mit dem Molekül dann weiterarbeiten zu können, müsste dieses jedoch noch weitere
Reinigungsschritte durchlaufen.
Benötigtes Material: Benötigte Geräte:
1 ganze Frucht Messer
3 g Salz Schneidbrett
10 ml Spülmittel Filterpapier
100 ml H2O Trichter
100 µl Protease Pipette (100 µl) und gelbe Spitze
20 ml kaltes Ethanol 250 ml Becherglas
Eis 50 ml Becherglas
Wasserbad
Vorgangsweise:
1. Zur Herstellung des Extraktes das
Salz, das Spülmittel und das
Wasser in dem 250 ml Becherglas
mischen. Danach die Frucht klein
(siehe Abb.10) schneiden und in
die Extraktlösung geben.
10 Zerkleinerte Tomate; Foto vom Praktikum in Hamburg
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2. Um alle Membranen zu zerstören, alles zusammen in einem Wasserbad für ca. 10
Minuten bei 65°C erhitzen.
3. Dann alles in einem Eisbad auf Raumtemperatur herunterkühlen, um die DNA zu
schützen.
4. Die Mischung max. 5 Sekunden
pürieren, wodurch die Zellwände
zerstört werden. (siehe Abb.11)
5. 20 ml des Homogenates in das 50 ml Becherglas filtrieren.
6. Damit die Histone von der DNA gelöst werden, die Protease dazugeben.
7. Vorsichtig das Homogenat mit dem
kaltem Ethanol überschichten.
Dadurch wird die DNA dehydriert
und an der Phasengrenze sichtbar!
(siehe Abb.12)
3.1.2 Isolieren von DNA aus Kalbsthymus-Gewebe:
Säugetiere und Menschen haben eine Thymusdrüse. Sie ist am Aufbau des
Immunsystems, besonders im Säuglingsalter, beteiligt. Die Thymusdrüse enthält von
allen Geweben den höchsten Anteil an Nucleinsäuren. In 10 g Kalbsthymus sind etwa
100 mg DNA enthalten.
Benötigtes Material: Benötigte Geräte:
10 g gefrorenes Kalbsthymus-
Gewebe
Schere
11 Pürieren der Tomate; Foto vom Praktikum in Hamburg 12 Homogenat einer Kiwi mit Ethanol überschichtet; Foto vom Praktikum in Hamburg
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20 ml 0,9%iger Natriumchlorid-
Lösung
Petrischale
140 ml gekühlter Zellkernpuffer 250 ml Becherglas
50 ml SSC-Puffer (Standard-
Saline-Citrat-Puffer)
Ultra Turrax (Drehzahl: mind. 11 000
U/min.):
Ein Rotor zerreißt durch seine Druckkräfte
alles in kleinste Teile
0,5 ml 10%ige SDS Lösung
(Sodium-Dodecyl-Sulfat)
Glaswolle
15 ml NaCl-Lösung Saugflasche mit Büchner-Trichter
65 ml kaltes vergälltes 96%iges
Ethanol
Filtertuch
Eis zwei 50 ml Zentrifugenbecher
Zentrifuge
Glasstab
250 ml Becherglas mit hoher Form
Rollrandgläschen zum Aufbewahren der
gewonnenen DNA
Isolieren der Zellkerne:
1. Das Kalbsthymus-Gewebe mit der 20
ml Natriumchlorid-Lösung auftauen,
in große Stücke schneiden (siehe
Abb.13) und waschen. Diese
Waschlösung in den Abguss
dekantieren (Flüssigkeit aus dem
Behälter gießen).
13 Zerkleinerung des Kalbsthymus in große Stücke; Foto vom Praktikum in Hamburg
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2. Mit der Schere das aufgetaute
Gewebe in der Petrischale mit dem 20
ml Zellkernpuffer mischen und in
kleine Stücke schneiden (siehe
Abb.14). Die Stücke sollen so groß
sein wie Linsen. Den Zellkernpuffer
wieder in den Abguss dekantieren und
das Gewebe nochmals mit 20 ml
Zellkernpuffer waschen. Auch diese Waschlösung in den Abguss dekantieren. Die
linsengroße Gewebestücke in das 250 ml Becherglas überführen und mit dem
restlichen Zellkernpuffer das Glas füllen.
3. Das Becherglas in einem Eisbad kühlen. Das
Thymus-Gewebe nun mit dem Ultra-Turrax bei
hoher Drehzahl (11 000 U/min) 45 Sekunden
homogenisieren (siehe Abb.15). Das Gewebe
wird vollständig zerkleinert.
4. Die Kalbsthymus-Suspension über Glaswolle in ein 250 ml Becherglas filtrieren.
Die Glaswolle im Abfallbehälter entsorgen
5. Anschließend die vorgereinigte
Kalbsthymus-Suspension über eine
Saugflasche mit Büchner-Trichter und
Filtertuch absaugen. Das Filtertuch
vorher mit Zellkernpuffer anfeuchten.
(siehe Abb.16)
14 Zerkleinerung in Linsen-große Stücke; Foto vom Praktikum in Hamburg 15 Vollständige Zerkleinerung; Foto vom Praktikum in Hamburg 16 Filtrieren des Homogenats; Foto vom Praktikum in Hamburg
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6. Die gereinigte Lösung gleichmäßig auf die zwei Zentrifugenbecher verteilen.
7. Es wird 10 Minuten mit 1500 U/min
zentrifugiert (siehe Abb.17). Die
Zellkerne befinden sich anschließend
als fester weißer Pellet (engl.
„Kügelchen“) am Boden der
Zentrifugenbecher.
8. Den fließenden Überstand vollständig dekantieren. Mit der Öffnung nach unten
noch ca. 2 Minuten auf Saugpapier die Zentrifugenbecher zum Abtropfen stehen
lassen.
9. Die Zentrifugenbecher mit den Zellkernen auf Eis stellen.
Mikroskopie der Zellkerne:
Mit dem Glasstab vorsichtig ganz wenig Zellkernsuspension entnehmen. Auf dem
Objektträger die Zellkernsuspension mit einem Tropfen Methylenblau einfärben.
Jetzt ein Deckgläschen auf die Zellkernsuspension legen und die Zellkerne bei
verschiedenen Vergrößerungen unter dem Mikroskop betrachten.
Isolieren der DNA aus Zellkernen des Kalbsthymus
1. Die Zellkerne der beiden Zentrifugenbecher werden in dem SSC-Puffer
resuspendiert:
Von 50 ml SSC-Puffer zweimal kleine Portionen mit ca. 5 ml SSC-Puffer in den
Zentrifugenbecher gießen. Die Zellkerne mit einem Glasstab vorsichtig mit der
Lösung mischen und in das 250 ml Becherglas hoher Form überführen. Mit dem
restlichen SSC-Puffer die Zentrifugenbecher spülen und alles im Becherglas
vereinigen.
2. Die Lyse (Aufschließen) der Zellkerne:
In dem 250 ml Becherglas zu 50 ml Zellkernsuspension tropfenweise unter
Schwenken die SDS-Lösung hinzugeben und 10 Minuten leicht bewegen. Die SDS-
Lösung bildet mit der DNA einen instabilen Komplex. Es darf nicht geschüttelt
17 Hineingeben der Zentrifugenbecher in die Zentrifuge; Foto vom Praktikum in Hamburg
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werden, da sonst die DNA-Stränge leicht zerbrechen. Die Zeit muss genau
eingehalten werden, da der instabile SDS-DNA-Komplex bei längerer Inkubation
zerfällt.
3. Die hochviskose Lösung mit 15 ml NaCl-Lösung versetzen und 10 Minuten leicht
mit dem Glasstab rühren.
4. Im 250 ml Becherglas die DNA
Lösung vorsichtig am Glasstab mit
dem Ethanol überschichten. Den
Alkohol langsam über einem Glasstab
an der Glaswand entlang in das
Becherglas gießen, so dass sich die
Phasen nicht vermischen. An der
Phasen-Grenzfläche fällt die DNA in
seidigen Fäden aus. (siehe Abb.18)
5. Einen Glasstab durch die Ethanol-Schicht bis
auf den Boden des Becherglases führen und die
DNA durch die Ethanol-Schicht hochziehen.
Die DNA durch Drehen des Glasstabes
aufwickeln, bis die Schichten ganz vermischt
sind.(siehe Abb.19)
6. Die DNA vom Glasstab abstreifen und mit Ethanol in einem Rollrandgläschen
aufbewahren.
18 Ausfallen der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg 19 Aufwickeln der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg
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3.1.3 Isolieren von DNA aus der Mundschleimhaut:
In diesem Fall wird ein physikalisches-chemisches Verfahren verwendet um DNA zu
isolieren. Am Ende des Isolierungsverfahren kann man jedoch kaum die DNA sehen, da
sie nur in sehr geringer Menge vorhanden ist. Dafür liegt sie vollständig gereinigt vor.
Benötigtes Material: Benötigte Geräte:
50 µl NaOH (Natriumhydroxid) rotes Reaktionsgefäß (Eppi genannt)
2,5 µl TRIS-Puffer (pH 7,5) Pipetten und Spitzen
250 µl PB-Lösung (Bindelösung) Eppi mit Chromatographiesäule
700 µl PE-Lösung (Ethanolische
Lösung)
Zentrifuge
50 µl EB (Elutionbuffer)
Eis 250 ml Becherglas
Vorgangsweise:
1. NaOH in das rote Eppi geben.
2. Mundschleimhaut mit einer Pipetten-
spitze abschaben. (siehe Abb.20)
3. Diese Mundschleimhaut zur NaOH in
das Eppi geben und für 10 Minuten
bei 95°C inkubieren (siehe Abb.21),
dadurch wird das Gewebe zerstört
und die DNA durch Chemikalien und
Wärme aufgespalten.
20 Abschaben der Mundschleimhaut; Foto vom Praktikum in Hamburg 21 Zerstörung der Gewebe; Foto vom Praktikum in Hamburg
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4. Um die Aufspaltung der DNA zu unterbrechen, für 3 Minuten in ein Eisbad geben.
Gleich danach den TRIS-Puffer dazugeben, wodurch man DNA-Stücke bestimmter
Größe erhält.
5. Da noch Proteine an der DNA haften, die PB-Lösung zum DNA-Extrakt geben, die
diese denaturiert.
6. Jetzt muss die DNA noch gereinigt werden, was mit Hilfe einer
Adsorptionschromatographie geschehen kann. Dazu das DNA-Extrakt auf die
Chromatographiesäule geben. Die DNA befindet sich dann auf der
Silicagelscheibe.
7. Alles bei 13 000 Umdrehungen für 1
Minute zentrifugieren (siehe Abb.22).
Der Durchlauf wird verworfen.
8. Die PE-Lösung hinzugeben, wodurch die DNA gewaschen und auf der
Silicagelscheibe fixiert wird.
9. Wieder alles bei 13 000 Umdrehungen für 1 Minute zentrifugieren und den
Durchlauf verwerfen.
10. Gleich danach die Zentrifugation wiederholen.
11. Die Säule in ein sauberes Reaktionsgefäß ohne Deckel stecken und den
Elutionbuffer in die Mitte tropfen, wodurch die DNA von der
Chromatographiesäule getrennt wird.
12. Nochmals bei 13 000 Umdrehungen für 1 Minute zentrifugieren, dadurch wird das
Eluat in dem Reaktionsgefäß gesammelt
13. Die eluierte DNA wird auf Eis aufbewahrt
Diese DNA kann man zum Beispiel für eine Restriktionsanalyse oder für eine PCR
(Polymerase-chain-reaktion) verwenden.
22 Zentrifugieren der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg
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3.2 Gelelektrophorese:
Nachdem ein großes DNA-Molekül zum Beispiel mit einer Restriktionsendonuklease in
kleinere Fragmente gespaltet worden ist, müssen diese voneinander getrennt werden.
Dies wird normalerweise mit Hilfe einer Gelelektrophorese durchgeführt, die die DNA-
Fragmente nach ihrer Länge auftrennt. Das Gemisch der DNA-Fragmente wird mit
einem Farbstoff versehen und an einem Ende eines Agarose- oder Polyacrylamid-Gels
aufgetragen, das ein mikroskopisch kleines Netzwerk aus Poren enthält. Der Farbstoff
dient dabei nicht dazu, die DNA anzufärben, sondern mit diesem kontrolliert man, wann
man mit der Elektrophorese aufhören soll, weil der Farbstoff immer kleiner und deshalb
schneller ist als die DNA. Nachdem alle Proben aufgetragen worden sind, wird an das
Gel eine Spannung angelegt. Weil die DNA wegen der Phosphatgruppen negativ
geladen ist, wandern die Fragmente zur positiven Elektrode; die größeren Fragmente
wandern langsamer, da sie von der Agarosematrix stärker behindert werden als die
kleineren. Nach einiger Zeit sind die DNA-Fragmente auf dem ganzen Gel verteilt,
wobei sie eine Leiter aus diskreten „Banden“ bilden, die sich jeweils aus mehreren
DNA-Molekülen von identischer Länge zusammensetzen. Ein bestimmtes DNA-
Fragment kann auf diese Weise auch leicht isoliert werden: Ein schmaler Gelstreifen,
der die gewünschte Bande enthält, wo dieses Fragment ist, wird mit einem Skalpell oder
einer Rasierklinge ausgeschnitten.
DNA-Banden auf Agarose- oder Polyacrylamid-Gelen sind unsichtbar, wenn sie nicht
auf irgendeine Weise markiert oder angefärbt werden. Dabei kann man zum Beispiel
einen Farbstoff an die DNA binden, der unter UV-Licht fluoresziert oder man baut vor
der Elektrophorese ein Radioisotop in die DNA-Moleküle ein.
Erzeugung eines Agarose-Gels:
Benötigtes Material: Benötigte Geräte:
1 g Agarose Flasche (mind. 500 ml)
8 ml TAE-Puffer Erlenmeyerkolben
392 ml reines Wasser (destiliertes
H2O)
Topflappen
Gelelektrophorese-Kammer (enthält 1
Gelbett, 2 Metallkeile)
Gel-Elektrophorese-Kamm (es gibt 2
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Varianten: mit 8 bzw. 15 Zähnen)
Handschuhe
Mikrowelle, Heizplatte oder
Bunsenbrenner
1. Zuerst den 50fach konzentrierten TAE-Puffer verdünnen. Dazu auf 1 Teil Puffer 49
Teile reines Wasser geben.
2. Die Agarose in den Erlenmeyerkolben geben und 100 ml Laufpuffer dazugießen.
(1%iges Gel)
3. Die Agarose und den Puffer mit der
Mikrowelle, einer Heizplatte oder mit
dem Bunsenbrenner erhitzen (siehe
Abb.23). Sobald kein Agarosepulver
und keine kleinen Bläschen mehr
sichtbar sind, ist die Agarose
vollständig gelöst.
4. Das flüssige Gel etwas abkühlen
lassen. Dies kann man beschleunigen,
indem man außen den Kolben mit
kaltem Wasser abspült. (siehe Abb.24)
5. Bevor das Gel ganz abgekühlt ist,
50 ml davon in die Gelkammer
gießen und ca. 10 – 20 Minuten
erstarren lassen. Die Kammzähne
sollen zu ca. 2/3 in die
Gelflüssigkeit eintauchen. (siehe
Abb.25)
23 Erhitzung der Agarose und des Puffers; Foto vom Praktikum in Hamburg 24 Abspülen des Kolben mit kaltem Wasser; Foto vom Praktikum in Hamburg
-
24
6. Nach dem Erstarren den Kamm aus dem Gel ziehen und dann ca. 300 ml
Laufpuffer in die Elektrophoresekammer gießen. Das Gel sollte dabei gerade
bedeckt sein.
7. Dieses Gel kann man dann für die
Elektrophorese verwenden. (siehe
Abb.26)
3.3 Restriktionsanalyse: 3.3.1 Theorie:
DNA-Stränge können mit Hilfe von Enzymen hydrolysiert (gespalten) werden. Diese
Enzyme werden als Nukleasen bezeichnet und können entweder ein DNA-Molekül vom
Ende her abbauen (Exonukleasen) oder es zwischen zwei Nucleotiden innerhalb der
Sequenz zerteilen (Endonukleasen).
Eine sehr wichtige Gruppe von Endonukleasen sind die Restriktionsendonukleasen.
Beim Einsatz dieser Enzyme werden bei der Hydrolyse der DNA charakteristische
Enden erzeugt, die durch die Spezifität der verwendeten Restriktionsendonuklease
bestimmt werden. Es können auch durch Restriktionsendonukleasen bestimmte DNA-
Fragmente reproduzierbar isoliert werden.
Es gibt drei Typen von Restriktionsendonukleasen. Gemeinsam ist, dass sie
ausnahmslos doppelsträngige DNA erkennen. Die Typ-1-Restriktionsendonukleasen
benötigen als Co-Substrate ATP (Adenosintriphosphat), S-Adenosylmethionin (SAM)
und Magnesium-Ionen. Die Hydrolyse der DNA geschieht nicht an der
Erkennungsstelle des Enzyms aus der DNA, sondern in einer Entfernung von einigen
hundert Basenpaaren. Aus diesem Grund werden für Klonierungsstrategien Typ-1-
Restriktionsendonukleasen nicht verwendet. Eine Erkennungssequenz ist in der Regel
25 Einfüllen des Geles; Foto vom Praktikum in Hamburg 26 Fertiges Gel; Foto vom Praktikum in Hamburg
-
25
eine palindromartige Sequenz. Palindrome sind Wörter oder Sätze, die von vorne und
hinten gelesen den gleichen Sinn ergeben, wie zum Beispiel „Otto“ oder „Anna“.
Typ-2-Restriktionsendonukleasen hydrolysieren die DNA innerhalb der
Erkennungssequenz und benötigen meist als Co-Faktor nur Magnesium. Wenn diese
Enzyme doppelsträngige DNA hydrolysieren, können drei unterschiedliche Arten von
Enden erzeugt werden:
- Spalten die Enzyme die Erkennungssequenz symmetrisch, enstehen DNA-Fragmente
mit „glatten Enden“, d.h. die Enden sind gleich lang.
- Spalten die Enzyme die Erkennungssequenz asymmetrisch, entstehen entweder
DNA-Fragmente, bei denen das 5’-Ende über das 3’-Ende hinausragt,
oder
DNA-Fragmente, bei denen das 3’-Ende über das 5’-Ende hinausragt.
Typ-2-Restriktionsendonukleasen27
Die Typ-3-Restriktionsendonukleasen hydrolysieren die DNA in spezifischem Abstand,
normalerweise bis zu 25 Basenpaare von der Erkennungsstelle entfernt. Aus diesem
27 Abb. 2.2.3 aus Gentechnik Biotechnik, Buch S. 27
-
26
Grund sind die überlappenden Sequenzen, die von Typ-3-Restriktionsendonukleasen
erzeugt werden, nicht miteinander kompatibel.
In der Molekularbiologie werden meistens Enzyme verwendet, die zu den Typ-2-
Restriktionsendonukleasen gehören. Manchmal werden aber auch Typ-3-
Restriktionsendonukleasen eingesetzt.
Damit Restriktionsendonukleasen ihre volle Spezifität entfalten können, müssen die
Reaktionsbedingungen zum Teil relativ genau eingestellt werden, wobei die
Salzkonzentration oft der wichtigste Parameter ist. Oft erkennen sie dann nicht mehr
ihre genaue Erkennungssequenz, sondern hydrolysieren auch Stellen, die nur noch Teile
der Erkennungssequenz repräsentieren.
Je komplexer die Erkennungssequenz ist, um so seltener schneidet die entsprechende
Restriktionsendonuklease eine DNA. Statistisch gesehen wird eine DNA von einem
Enzym, das vier Nucleotide erkennt, jeweils nach 256 Nucleotiden (44) hydrolysiert.
Ein Enzym, das sechs Nucleotide erkennt, spaltet die DNA nach jeweils 4098
Basenpaaren (46).
Die vielen unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen können verschieden eingesetzt
werden:
- Die DNA kann mit einem einzelnen Enzym komplett geschnitten werden. Dabei
erhält man DNA-Fragmente, die an beiden Seiten identische Enden besitzen.
- Wird eine Kombination von zwei (oder mehreren) Enzymen verwendet und die
DNA komplett hydrolysiert, so ergeben sich DNA-Fragmente, deren Enden
unterschiedlich sein können.
- Die DNA kann aber auch partiell geschnitten werden. Dazu verwendet man eine
einzelne Restriktionsendonuklease, die relativ häufig schneidet. Für eine partielle
Hydrolyse wird entweder eine sehr geringe Enzymkonzentration eingesetzt oder
die DNA inkubiert nur für eine kurze Zeit mit dem Enzym. Das Ergebnis einer
partiellen Hydrolyse sind relativ große DNA-Fragmente. Grundsätzlich noch
wichtiger ist in diesem Zusammenhang die Tatsache, dass man durch eine
partielle Hydrolyse Fragmente erzeugt, die sich teilweise in ihren Sequenzen
überlappen. Dies ist besonders bedeutsam, wenn man eine genomische Genbank
herstellen will.
-
27
3.3.2 Anwendungen
3.3.2.1 Modifizieren von DNA:
Wenn man mittels Restriktionsenzymen einen DNA-Strang „geschnitten“ hat, kann man
diesen auch wieder mittels Ligasen miteinander verbinden. Auch diese Enzyme
reagieren nur, wie die Restriktionsendonukleasen, nach einer bestimmten
Basenabfolgen. Durch diese Ligasen können deshalb neue DNA-Stränge erzeugt oder
bestimmte Teile ausgewechselt werden.
3.3.2.2 Vaterschaftstest:
Um Verwandschaftsbeziehungen festzustellen, wird die Satelliten-DNA vom Kind
sowie von dessen Eltern durch Restriktionsenzyme abgespalten. Satelliten-DNA ist
entweder eine leichtere (AT-reiche) oder schwerere (GC-reiche) DNA im Vergleich zur
Haupt-DNA. Nach der Gelelektrophorese kann man feststellen, welche Banden
übereinstimmen. Dabei darf nur eine einzige Bande abweichend sein, sonst kann nur
jemand anderer der Vater sein. Bei einem leiblichen Kind kann es nämlich nur eine
Neumutation geben.
3.3.2.3 Gerichtsmedizin:
In der Gerichtsmedizin werden häufig Restriktionsenzyme zur Herstellung eines
genetischen Fingerprints mittels Restriktionsfragmentlängen-polymorphismus (RFLP)
verwendet. Durch diese Methode kann man einem Täter ein Verbrechen, das er
begangen hat, leichter nachweisen.
Dabei wird mit Hilfe eines Restriktionsenzyms ein genetischer Fingerabdruck mehrerer
DNA-Proben der Verdächtigen hergestellt. Durch die Spaltung zerfällt diese in mehrere
DNA-Fragmente. Da in jeder Probe die Schnittstellen an unterschiedlichen Stellen
liegen, entstehen auch verschieden lange DNA-Stücke. Anhand der DNA-
Fragmentmuster (Banden) auf dem Gel können dann die Fingerprints der Verdächtigen
mit der Probe der am Tatort gefundenen DNA des Täters verglichen und zugeordnet
werden. Der Verdächtige, dessen Probe mit der gefundenen DNA-Probe genau
übereinstimmt, ist der Täter.
-
28
3.3.3 Praktisches Beispiel:
Wie bereits im vorigen Kapitel Gerichtsmedizin beschrieben, wird hier praktisch ein
Fingerprint von Verdächtigen gemacht und dann mit der gefundenen DNA verglichen.
Benötigtes Material: Benötigte Geräte:
je 5 µl DNA-Proben Pipetten und Spitzen
je 6 µl H2O Wasserbad
je 3 µl Reaktionspuffer Reaktionsgefäße
je 1 µl Restriktionsenzym Gel-Elektrophoreseapparatur
je 3 µl Farbstoff Gel-Dokumentationssystem
1 Agarose-Gel
Vorgangsweise:
1. Zu den DNA-Proben das Wasser, den Reaktionspuffer und die Restriktionsenzyme
dazugeben.
2. Die Reaktionsgefäße bei 37°C im
Wasserbad für ca. 45 Minuten
inkubieren. (siehe Abb.28)
3. Nach dem Ende der Inkubationszeit wird zu den Proben der Farbstoff gegeben.
4. In die Taschen des Gels die Proben hineingeben. Zum Vergleich wird die
gespaltene Probe des „Täters“ mit aufgetragen.
5. Die Elektrophorese starten.
28 Inkubation der Reaktionsgefäße; Foto vom Praktikum in Hamburg
-
29
6. Nach Beendigung der Elektrophorese
das Gel anfärben (in diesem Fall mit
EtBr, siehe Abb.29) und die
Bandenmuster vergleichen.
Ergebnis:
Bei meiner Gruppe ist bei diesem Praktikum kein Ergebnis zu sehen gewesen, weil
beim Auftragen der Proben auf das Gel unvorsichtig pipetiert worden ist.
Ein mögliches Ergebnis:
Diese Probe eines Verdächtigten stimmt mit allen Banden genau mit der gefundenen
Probe überein. Folglich ist er der Täter.
3.4 PCR:
PCR ist eine der wichtigsten Methoden in der modernen Molekularbiologie. Sie wurde
Mitte der 80er Jahre vom Amerikaner Kary Mullis konzipiert und zur Anwendung
gebracht. Er bekam 1993 dafür den Nobelpreis.
Durch Mullis’ Erfindung konnte zum ersten Mal DNA im Reagenzglas vervielfältigt
werden, was die gesamte Gentechnik revolutionierte.
Die Vervielfältigung der DNA geschieht auf der Basis eines einfachen Prinzips: der
DNA-Synthese. Deshalb braucht man auch alle Komponenten, die für eine DNA-
Synthese nötig sind:
- eine DNA-Matrize
- eine DNA-Polymerase, die die DNA-Synthese katalysiert
29 Färben des Geles; Foto vom Praktikum in Hamburg
-
30
- eine Initiationsstelle für die DNA-Polymerase
- die vier Desoxynucleotid-Triphosphate: dATP, dCTP, dGTP und dTTP als Substrate
für die DNA-Polymerase.
3.4.1 Theorie
3.4.1.1 Das Prinzip der PCR:
Man kann bei der In-vitro-DNA-Synthese nur Bereiche zwischen bekannten oder aus
der Übersetzung einer Proteinsequenz abgeleiteten Nucleotidsequenzen amplifizieren.
Für diese bekannten Nucleotidsequenzen werden Primer synthetisiert, die sich optimal
an die DNA-Matrize anlagern können. Bei denen beginnt die neue Synthese. Die
Sequenz des amplifizierten DNA-Bereichs muss dabei nicht bekannt sein.
Für die Amplifikation benötigt man zwei PCR-Primer, wobei der erste sich an den
oberen Strang der Ziel-DNA und der zweite in einigem Abstand an den unteren Strang
bindet. Durch diese Anordnung der Primer hat man zwei Startpunkte für die DNA-
Polymerasereaktion definiert. Die Richtung der DNA-Polymerasen ist aber
entgegengesetzt und sie überlappen sich am Ende.
Außer der DNA-Matrize und den beiden Primern benötigt man noch ein Gemisch der
vier Desoxynucleotid-Triphosphate, Magnesium und eine thermostabile DNA-
Polymerase. Da die DNA-Polymerase hohe Temperaturen ohne Inaktivierung
überstehen muss, verwendet man Polymerasen aus thermophilen Bakterien, z.B. aus
Thermus aquaticus (Taq-Polymerase), Pyrococcus furiosus (Pfu-Polymerase) oder
Thermotoga maritima (Tma-Polymerase). Die Mutationshäufigkeit pro Verdopplung
durch die Taq-Polymerase liegt bei 8x10-6. Die anderen Polymerasen sind genauer.
Nach dem Zusammenmischen der Komponenten wird der Ansatz in einen so genannten
Thermocycler gestellt. Mit der Hilfe dieses Thermocyclers wird ein komplexes
Inkubationsprogramm kontrolliert und wiederholt durchlaufen. Dabei wechselt die
Temperatur andauernd (siehe Abb.).
-
31
Inkubationszeit Inkubations- temperatur
Ergebnis
1 x 5 min. 95 °C Denaturierung der DNA-Matrize 30 sec. ca. 50°C Anlagerung der
Primer ca. 3 min. 72°C Verlängerung der
Primer
ca. 3
0 x
1 min. 95°C Denaturierung der DNA-Matrize
Ein Inkubationsprogramm für eine PCR-Reaktion30
Auszug aus Gentechnik Biotechnik, Buch S.42:
- Zunächst wird die Temperatur für ca. fünf Minuten auf 95°C eingestellt. Unter den
vorgegebenen Pufferbedingungen werden während dieser Zeit alle
doppelsträngigen DNA-Bereiche zu Einzelsträngen denaturiert, so dass zum Ende
dieser Inkubationsperiode nur noch einzelsträngige DNA-Fragmente vorliegen.
- Danach wird die Temperatur auf einen Bereich gesenkt, in dem die Oligonucleotid-
Primer mit den komplementären Bereichen auf der Ziel-DNA doppelsträngige
Hybride ausbilden können. Die beiden Oligonucleotid-Primer liegen im großen
Überschuss zur DNA-Matrize vor. Deshalb bilden sich bevorzugt
Doppelstrangbereiche zwischen den Primern und dem jeweiligen DNA-
Einzelstrang der Ziel-DNA. Renaturierung der beiden denaturierten Einzelstränge
der Ziel-DNA ist hingegen unter diesen Bedingungen nicht favorisiert. Dieser
Renaturierungsprozess ist in der Regel bereits nach 30 Sekunden abgeschlossen.
- Im nächsten Schritt wird die Inkubationstemperatur auf ca. 72°C angehoben. Bei
dieser Temperatur arbeiten die thermostabilen DNA-Poyimerasen optimal. Je nach
Länge des zu amplifizierenden DNA-Bereiches wird die Temperatur ein bis drei
Minuten auf 72°C gehalten. Danach ist der erste Amplifikationszyklus
abgeschlossen.
- Zur Einleitung des zweiten Amplifikationszyklus wird erneut die Temperatur auf
95°C gehoben, allerdings jetzt nur für eine Minute. Es werden dadurch wiederum
sämtliche Doppelstrangbereiche denaturiert.
- Es folgen Renaturierungs- und Polymerisationsphasen wie im ersten Zyklus.
(siehe Abb.)
30 Abb. 2.3.3 aus Gentechnik Biotechnik, Buch S.41
-
32
Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion 31
31 Abb. 12-1: aus Gentechnik, Buch S.294
-
33
Die Produkte des ersten Amplifikationszyklusses haben keine genau definierte Länge,
weshalb sie „lange Produkte“ genannt werden. Ab der zweiten Amplifikationsrunde
fungieren neben der Originalmatrize auch die „langen Produkte“ als Vorlage. Aus
diesem Grund werden jetzt auch zusätzlich zu den zwei weiteren „langen Produkten“
auch DNA-Fragmente mit einer definierten Länge gebildet. Diese Fragmente sind am
einen Ende durch den Primer und an der anderen Seite durch das Ende der Matrize
begrenzt.
Somit gibt es jetzt zwei komplementäre Stränge der Originalmatrize, vier teilweise
komplementäre Stränge, die „langen Produkte“ und zwei exakt komplementäre
Amplimere (=Bereiche, die durch die beiden PCR-Primer begrenzt werden).
Ausgehend von x Molekülen DNA, die man zur Amplifikation verwendet hat, ist die
Zahl der Ausgangsmatrizen nach n Zyklen konstant geblieben, während die Zahl der
„langen Produkte“ auf x*n gestiegen ist. Die Zahl der Amplimere beträgt x*2n-x-nx.
3.3.1.2 Limitation und Effizienz:
Die Effizienz der PCR kann durch verschiedene Parameter beeinflusst werden. Einer
der Faktoren, der sie verschlechtert, ist die Länge der DNA, die durch die
Oligonucleotide eingeschlossen wird. Im Allgemeinen nimmt die Effizienz mit
steigender Länge des zu amplifizierenden DNA-Bereiches kontinuierlich ab. Die
Effizienz kann aber wieder durch die Inkubationsdauer während eines
Polymerationsschrittes ausgeglichen werden. Durch genauere Einstellung der
Magnesiumkonzentration, die man im Einzelfall experimentell ermitteln muss, kann die
Reaktion für verschiedene DNA-Längen optimiert werden.
Bei der PCR ist weiters zu beachten, dass man keine Primer-Paare verwendet, die
teilweise oder ganz komplementär sind. Diese Primer können, statt sich an die DNA-
Matrizen anzulagern, sehr leicht Primer-Dimere (Primer verbinden sich) bilden.
Dadurch ist es sehr unwahrscheinlich, dass man die gewünschten DNA-Amplimere
bekommt.
Auch nicht jede DNA kann durch PCR vervielfältigt werden. Zum Beispiel wird die
DNA-Amplifikation erheblich gestört, wenn die beiden DNA-Einzelstränge nach der
Denaturierung intramolekulare Sekundärstrukturen ausbilden.
Besonders häufig geschieht dies, wenn die DNA-Einzelstränge hohe Guanin/Cytosin-
Anteile aufweisen, die sich zu stabilen Hypriden anlagern können. Dies kann unter
-
34
Umständen dadurch umgangen werden, dass man einen kleinen Anteil an 7-Aza-dGTP
dem Ansatz beimischt. Durch diese Nucleotid-Analoge wird teilweise die Ausbildung
von Sekundärstrukturen verhindert, wobei die Matrizenfunktion nicht stark gestört wird.
Diese Funktion kann aber auch Glycerin oder Dimethylsylfoxid (DMSO) übernehmen.
Durch diese Zusätze kann aber unter Umständen die Enzymaktivität abnehmen. Diesem
kann aber beispielsweise durch Rinderserumalbumin (BSA) entgegengewirkt werden.
Dieses BSA schützt die DNA-Polymerase in ihrer Aktivität und vermag Inhibitoren
(Hemmer) zu binden.
Normalerweise kann die theoretische Ausbeute an PCR-Produkten nicht erreicht
werden. Nach ungefähr 20 Zyklen nimmt die Effizienz der PCR kontinuierlich ab.
Dafür gibt es drei Gründe:
1. Die Nucleotide und die Primer werden langsam, aber stetig verbraucht.
2. Wegen der starken Temperaturschwankungen wird das Enzym in seiner
Aktivität gestört.
3. Es lagern sich immer häufiger komplementäre Einzelstränge zu Doppelsträngen
aneinander und dadurch wird verhindert, dass sich Primer anlagern.
DNA-Synthesen, die durch die Taq-Polymerase katalysiert werden, sind ungewöhnlich
fehlerhaft, da sie die „proofreading-Aktivität“ nicht besitzen. Dies kann, muss aber nicht
immer Probleme bereiten.
Besonders deutlich wird dieses Problem, wenn Fehler bereits während der ersten PCR-
Zyklen auftreten und wenn sehr wenig Matrizenmaterial eingesetzt wird. Denn dann
dienen die fehlerhaften Kopien als Hauptmatrize für weitere PCR-Zyklen.
Diese Schwierigkeiten lassen sich allerdings heute teilweise umgehen, da beispielsweise
mit der Vent®-Polymerase aus Thermococcus litoralis eine thermostabile DNA-
Polymerase verfügbar ist, die auch die „proofreading-Aktivität“ besitzt.
Eine der großen Stärken der PCR – nämlich ihre Sensibilität – kann auch zu einem
großen Problem werden. Dies muss besonders beachtet werden, wenn die PCR in der
medizinischen Diagnostik verwendet wird. Kontaminationen der Analysenproben mit
fremdem biologischem Material müssen unbedingt vermieden werden. Sonst besteht die
Gefahr, dass ein falsch-positives Ergebnis herauskommt. Dies ist gerade für solche
Krankheiten eine unakzeptable Komplikation, bei denen heute bevorzugt die PCR-
Analytik als Diagnostikmethode eingesetzt wird: Krebs und AIDS.
Um etwaige Kontaminationen zu vermeiden, muss man in einer extrem sauberen
Umgebung arbeiten. Die unterschiedlichen Arbeitsvorgänge wie die Aufbereitung der
-
35
Probe, die Amplifikation der DNA und die Analyse des Amplimers werden räumlich
getrennt voneinander vorgenommen.
Wenn die PCR-Methode an ihrem Limit betrieben wird, zum Beispiel mit sehr wenig
DNA-Matrize, sind weitere Schritte nötig, um die ungewollte Amplifikation möglicher
Kontaminationen zu verhindern. Eine Maßnahme kann eine photochemische oder eine
enzymatische Sterilisation sein:
- Bei der photochemischen Sterilisation werden alle Reaktionsansätze vor Zugabe
der Analysenprobe und nach Beendigung der Reaktion vor dem Öffnen der
Gefäße mit kurzwelligem UV-Licht bestrahlt. Wenn sich eine Kontamination
bereits vor Zugabe der Probe im Ansatz befindet oder ein Teil der abgelaufenen
Reaktion den Arbeitsplatz kontaminiert hat, so ist diese Kontamination als
Konsequenz der Bestrahlung nicht mehr amplifizierbar. Wegen der UV-
Bestrahlung wird in den möglichen DNA-Kontaminationen die Ausbildung von
Pyrimidin-Dimeren induziert. Weil durch Pyrimidin-Dimere vernetzte DNA-
Stränge nicht mehr denaturiert werden können, lassen sich die Kontaminationen
auch nicht mehr amplifizieren.
- Bei der enzymatischen Sterilisation wird vor jeder Amplifikation der
Reaktionsansatz mit dem Enzym Uracil-N-Glycosylase behandelt. Bei diesem
Vorgang wird Desoxyuridin-Triphosphat anstelle von Desoxythymidin-
Triphosphat eingesetzt. Das Enzym degradiert die DNA, die Uridin enthält und
daher aus früheren Reaktionen stammen muss. Natürliche DNA oder RNA lässt
das Enzym hingegen unberührt. Im Laufe der ersten Denaturierungsperiode wird
die Uracil-N-Glycosylase durch Hitze inaktiv und es kann das sich im Laufe des
Amplifikationsverfahrens bildende Uridin-haltige Amplimer nicht zerstört
werden.
Diese Sterilisationsmethoden sind in ihrer Effizienz nicht hundertprozentig und ersetzen
deshalb auch nicht die Einhaltung guter Laboratoriumspraktiken und adäquater
Kontrollen.
-
36
3.4.1.3 Spezielle PCR-Techniken
3.4.1.3.1 Nested PCR:
Es kommt häufig vor, dass die Sequenz eines DNA-Abschnittes, der vervielfältigt
werden soll, nicht bekannt ist. In einem solchen Fall wird die Sequenz der PCR-Primer
von verwandten Genen abgeleitet. Doch oft sind diese nur in einigen Bereichen
identisch. Aus diesem Grund muss damit gerechnet werden, dass sich einer oder sogar
beide Primer nicht nur ausschließlich an die gewünschten Stellen auf der Matrix-DNA
anlagern. In diesen Fällen entstehen oft erhebliche Mengen an Nebenprodukten.
Dieses Problem kann man beseitigen, indem man nach der ersten PCR eine zweiten
PCR mit den Produkten der ersten PCR als DNA-Matrize durchführt (=> „nested
PCR“). Beim zweiten Schritt werden aber andere Primer verwendet, die jeweils 3’ von
der Position der zuerst angewendeten Primer hybridisieren. Die unspezifischen
Nebenprodukte der ersten PCR werden in der Regel dann nicht mehr amplifiziert.
3.4.1.3.2 Touch down PCR:
Im Gegensatz zur „nested PCR“ werden die Amplifikationszyklen bei einer möglichst
hohen Anlagerungstemperatur begonnen. Unter diesen Bedingungen ist es nur perfekten
Primer-DNA-Hybriden möglich, zu initiieren. Wegen der hohen Temperatur ist es sehr
unwahrscheinlich, dass Fehlbildungen stattfinden. Diese Anlagerungstemperatur wird
bei jedem darauf folgenden Zyklus immer weiter gesenkt. Denn bei der ersten
Amplifikationsrunde haben sich so viele zusätzliche Matrizen gebildet, dass eine
eventuelle Fehlpaarung der Primer an falschen DNA-Stellen kaum noch ins Gewicht
fällt.
3.4.1.3.3 Inverse PCR:
Diese Methode ermöglicht die Analyse unbekannter genomischer Sequenzen, die direkt
an schon bekannte Abschnitte grenzen. Dazu wird die gesamte chromosomale DNA mit
einem Restriktionsenzym geschnitten und die entstandenen DNA-Fragmente werden
durch Selbstligation (Verschmelzung) ringförmig geschlossen. In einer daran
anschließenden PCR werden diese ringförmigen DNA-Moleküle als Matrize verwendet,
um die im Ligationsprodukt zwischen den bekannten DNA-Sequenzen liegenden
unbekannten Abschnitte selektiv zu amplifizieren. (siehe Abb.)
-
37
Inverse PCR32
3.4.1.3.4 Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR):
Mit Hilfe der RT-PCR können RNA-Sequenzen spezifisch amplifiziert werden. Dazu
wird die RNA in DNA umgeschrieben und dann wird diese DNA amplifiziert.
Besondere Bedeutung kommt dieser Methode zu, wenn seltene Transkripte
nachgewiesen und analysiert werden sollen. Im Vergleich zu RNA-Nachweisverfahren
ist die Sensitivität der RT-PCR erheblich größer.
32 Abb. 12-4 aus Gentechnik, Buch S. 303
-
38
3.4.2 Anwendungen
3.4.2.1 Paläontologische Genetik:
Fossile DNA ausgestorbener Spezies war bislang für genetische Untersuchungen kaum
zugänglich, da die Mengen an erhaltener DNA sehr gering sind. Nur mit Hilfe der PCR-
Technik konnte fossile DNA amplifiziert und genauer untersucht werden. Die aus
solchen Untersuchungen gewonnenen Daten führten zu einer teilweisen Neuordung von
systematischen Verwandschaftsverhältnissen und ermöglichten darüber hinaus die
phylogenetische Einordnung von unbekannten Spezies. In Zukunft wird es auf diesem
Weg möglich sein, noch weitere offene Fragen zu lösen, die sich mit der Einordnung
fossiler Lebewesen beschäftigen, und einen genaueren Einblick in den zeitlichen
Verlauf evolutionärer Prozesse zu nehmen.
3.4.2.2 Gerichtsmedizin:
In der Gerichtsmedizin wird die PCR-Technik für Fingerprints (siehe 3.3.2.3
Gerichtmedizin, S. 27) besonders dann verwendet, wenn man am Tatort zu wenig DNA
vom Täter gefunden hat, um sie mittels Restriktionsendonukleasen zu spalten. Die
DNA-Proben der Verdächtigen werden mit dem gleichen Primer amplifiziert und
danach werden die Banden der Täter-DNA und den anderen DNA-Proben mittels einer
Gel-Elektophorese verglichen.
3.4.2.3 Medizinische Diagnostik:
Von herausragender Bedeutung ist die medizinische Anwendung der PCR-Technik. Mit
zunehmendem Wissen über spezifische humane Gene und deren Mutationen, die oft die
molekulare Ursache einer genetisch bedingter Krankheiten sind, ist die Analyse von
großer Bedeutung. Auch in der genetischen Beratung und in der Pränataldiagnostik
können Erbkrankheiten einfach und sicher identifiziert werden und man kann
erforderliche Maßnahmen sehr frühzeitig einleiten. Neben der Charakterisierung von
Erbkrankheiten sind mit Hilfe der PCR auch verschiedene Krebserkrankungen auf der
Ebene von Genmutationen untersucht worden.
Eine andere medizinische Anwendung der PCR ist der Nachweis von viralen oder
bakteriellen Infektionen. Durch PCR-Analysen kann der Nachweis einer Infektion
schon vor dem Krankheitsausbruch stattfinden. Bedeutende Anwendungsbeispiele
hierfür sind die klinischen PCR-Diagnosen von Aids- oder Tuberkulose-Infektionen.
-
39
3.4.3 Praktisches Beispiel:
PCR-Test für Toxoplasmose:
Die angeborene Toxoplasmose ist eine Infektion mit einem Protozoon (Toxoplasma
gondii), die besonders für den wachsenden Fötus im Uterus ein Risiko darstellt. Sie
kann zu Blindheit und geistiger Behinderung führen. Die meisten der infizierten
Neugeborenen haben bei der Geburt keine Symptome.
Im Rahmen der Mutter-Kind-Pass Untersuchungen werden in Österreich alle
Schwangeren mittels Antikörpertests auf eine Erstinfektion untersucht. Der Nachweis
der Infektion des Fötus war bei Erstinfektion der Schwangeren früher schwierig.
In den letzten Jahren wurde ein direkter Nachweis der DNA von Toxoplasma gondii aus
Fruchtwasserproben entwickelt. Bei diesem Test wird eine für Toxoplasma gondii
spezifische DNA Sequenz, das B1 Gen, nachgewiesen. Dieses Gen wird mittels PCR
amplifiziert und das Vorhandensein des spezifischen Amplifikationsproduktes mittels
eines Agarose-Gels analysiert.
Nachweis von Toxoplasma gondii im Fruchtwasser mittels PCR-Analyse:
Benötigtes Material: Benötigte Geräte:
100 mM TRIS-HCl pH 8.4, 250 mM
KCl
Pipette (20 µl)
30 mM MgCl2-Lösung Reaktionsgefäße (500 µl) (oft Eppis
genannt)
2 mM dNTPs (dATP, dCTP, dTTP,
dGTP)
Zentrifuge
sense / antisense primer (Jeder 4
pmol/µl)
Thermocycler
DNA-hältige Proben, aus
Amminoflüssigkeit von Patientinnen
präpariert
Gel-Elektrophoreseapparatur
Taq-DNA-Polymerase Gel-Dokumentationssystem
DNA-Größenstandard (10 µl)
H2O
-
40
Ladepuffer für Elektrophorese (enthält
Glyzerin und einen blauen Farbstoff:
Bromphenolblau)
Vorgangsweise:
1. Zuerst die Eppis beschriften und, weil die PCR eine sehr empfindliche
Nachweisreaktion ist, Handschuhe anziehen.
2. Die für die jeweilige PCR Reaktion angegebenen Komponenten in ein
Reaktionsgefäß geben. (Jedesmal neue Pipettenspitzen nehmen!)
Komponente Patient 1 Patient 2 Kontrolle Endkonzentration
100 mM TRIS-HCl pH 8.4,
250 mM KCl
10 µl 10 µl 10 µl 20 mM TRIS-HCl,
50 mM KCl
30 mM MgCl2 10 µl 10 µl 10 µl 6 mM
2 mM dNTPs 10 µl 10 µl 10 µl 400 µM
sense / antisense primer 5 µl 5 µl 5 µl 400 nM
DNA-hältige Probe 10 µl 10 µl 10 µl 1-5 ng
Taq DNA Polymerase 1 µl 1 µl 1 µl 1 U
H2O 4 µl 4 µl 4 µl
3. Die Reaktionsgefäße für 5 Sekunden zentrifugieren.
4. Dann die Reaktionsgefäße in den
Thermocycler stellen und das Programm
starten. (siehe Abb.33)
33 Thermocycler; Foto vom Praktikum im Vienna Biocenter
-
41
Elektrophorese:
1. Nach dem Ende der Reaktion im Thermocycler das Reaktionsgemisch mit dem
Ladepuffer versetzen und durch mehrmaliges Aufziehen der Pipette mischen.
2. 20 µl des Gemisches in die Tasche
des vorbereiteten Agarosegels
pipettieren. (siehe Abb.34)
3. Wenn alle Taschen besetzt sind, startet man die Elektrophorese.
4. Die Elektrophorese soll ungefähr 30 Minuten laufen.
5. Danach das Gel färben und betrachten. Das Ergebnis dokumentieren.
Eigenes Ergebnis:
Auf der Bahn M wurde ein DNA-Größenmarker aufgetrennt, der es erlaubt die Größe
von PCR-Produkten abzuschätzen. In den Bahnen 1 und 2 wurden die PCR-Reaktionen
von zwei Patientenproben aufgetragen. Bahn 3 zeigt eine positive Kontrollreaktion, bei
der Plasmide, die das β-Aktin Gen und das B1 Gen von Toxoplasmen enthalten, der
Reaktion zugesetzt wurden. Ist in der zu analysierenden Probe DNA von Toxoplasmen
vorhanden, so kommt es zur Bildung eines B1-Genfragmentes mit der Größe von 340
bp. Das als Kontrolle amplifizierte β-Aktin Gen liefert ein Produkt mit der Länge von
850 bp. Die beiden Produkte können auf Grund ihrer Größe durch Elektrophorese
getrennt voneinander unterschieden werden. Das Ergebnis dieser Analyse zeigt, dass bei
Patientin 1 Toxoplasma-DNA in der Amminoflüssigkeit vorhanden ist und somit auch
eine Infektion des Fötus vorliegt.
34 Füllen der Geltaschen; Foto vom Praktikum im Vienna Biocenter
-
42
35
35 Ergebnis der PCR-Reaktion; Bild vom Praktikum im Vienna Biocenter
-
43
4. Zusammenfassung und Ausblick:
Im ersten Teil der Arbeit wird zuerst kurz über den Zellaufbau gesprochen und es wird
dann gleich auf die Struktur der DNA übergegangen. In diesem Kapitel wird begründet,
weshalb die DNA das Erbmaterial ist. Danach wird die Zusammensetzung der DNA
und die Struktur der Doppelhelix genauer beschrieben. Um genügend Basiswissen zu
vermitteln, wird die Replikation der DNA in einem weiteren Kapitel erklärt.
Der Haupteil ist in drei Teile gegliedert. Im ersten Kapitel sind drei Möglichkeiten zur
Isolierung von DNA praktisch beschrieben, zuerst die Isolierung von pflanzlicher DNA
mit Hilfe einfachster Mittel, danach die Isolierung von tierischer DNA mit Hilfe
anspruchsvollerer Ausrüstung und schlußendlich die Isolierung von DNA aus der
Mundschleimhaut mittels Adsorptionschromatographie.
Im zweiten Teil ist die Restriktionsanalyse zuerst in der Theorie geschildert.
Anschließend werden einige Beispiele der Anwendungsmöglichkeiten dargestellt und
daraufhin wird eine dieser Möglichkeiten praktisch beschrieben.
Im letzten und auch längsten Kapitel wird die PCR-Analyse nach dem gleichen Schema
wie die Restriktionsanalyse erklärt, wobei die Theorie etwas länger ausgefallen ist, da
die PCR-Technik um einiges schwieriger ist und diese auch häufiger Verwendung
findet.
Schon heute ist die Gentechnik sehr wichtig. Es können Krankheiten schon frühzeitig
erkannt werden, es werden Pflanzen gentechnisch verändert, es gab bereits die ersten
Klonversuche und beim Schaf Dolly ist dies auch gelungen. Doch es stellt sich natürlich
die Frage, ob es auch ethisch vertretbar ist, Tiere oder sogar Menschen zu klonen. Man
wird wahrscheinlich sogar einen Embryo so gentechnisch verändern können, dass es
gegen Krankheiten resistenter ist oder man wird Haar - Haut oder Augenfarbe
bestimmen können.
Die Gentechnik hat sowohl ihre guten als auch ihre schlechten Seiten. So würde es
einen großen Fortschritt bedeuten, damit Krankheiten verhindert werden. Aber ob es gut
ist, einen Embryo nach bestimmten Wünschen zu verändern und dies nicht der Natur zu
überlassen, sei dahingestellt.
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5. Glossar:
A
Amplifikation: (engl.) amplification; Vervielfältigung einer Basensequenz (eines DNA-
Abschnitts)
amplifizieren: = vervielfälltigen
Amplimer:
C
Chromatin: Komplex aus DNA, Histonen (Zellkernproteine) und Nichthiston-Proteinen
im Kern einer Eukaryontenzelle. Das Material, aus dem die Chromosomen bestehen.
Chromatographie: physik.-chem. Verfahren zur Trennung von Stoffgemischen.
Chromatographiesäule: Säule dient zur Trennung von Stoffgemischen (z. B.: Isolieren
von DNA aus Zellen)
Chromosom: Lange fadenartige Struktur bestehend aus DNA und assoziierten
Proteinen, die einen Teil oder die gesamte genetische Information eines Organismus
enthält. In Pflanzen- und Tierzellen besonders auffällig, wenn sich die Zelle der Mitose
oder Meiose unterzieht.
Cytoplasma: Inhalt einer Zelle innerhalb der Plasmamebran, aber, im Fall einer
Eukaryontenzelle, außerhalb des Zellkerns.
Cytosol: Wäßrige Lösung kleiner und großer Moleküle, die das Hauptkompartiment des
Cytoplasmas füllt. Ausgenommen sind membranumschlossene Organellen, wie das
endoplasmatische Retikulum und Mitochondrien.
D
dehydrieren: einer chemischen Verbindung Wasserstoff entziehen.
dekantieren: eine Flüssigkeit vom Bodensatz abgießen.
Denaturierung: Zerstörung der nicht kovalenten Wechselwirkungen, die für die
sekundäre oder höhergradige Struktur von Proteinen und Nucleinsäuren verantwortlich
sind, mit Hilfe chemischer oder physikalischer Mittel.
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Dimer: eine Struktur, die aus zwei gleichen Untereinheiten besteht. Manchmal wird die
Bezeichnung Heterodimer verwendet, wenn die beiden Untereinheiten nicht identisch
sind.
Dipol: System aus zwei in definiertem Abstand voneinander entfernt stehenden
elektrischen Ladungen, die den gleichen Betrag, jedoch ein entgegengesetztes
Vorzeichen aufweisen; das Produkt aus Ladung Q und Abstand l wird als elektrisches
Dipolmoment p bezeichnet.
DNA: = Desoxyribonucleinsäure(acid); doppelsträngiges Polynucleotid, gebildet aus
zwei separaten Ketten von Desoxyribonucleotideinheiten; dient alsTräger der
genetischen Information.
Doppelhelix: natürliche Form der DNA in der Zelle, bestehend aus zwei
Polynucleotiden, die Basenpaare bilden.
Duplikation: Verdopplung eines Chromosomenabschnitts.
E
Effizienz: Wirksamkeit und Wirtschaftlichkeit.
Eluat: durch Elution gewonnene Lösung.
Elution: Auswaschung; Trennung einer adsorbierten Substanz (an einem anderen Stoff
gebunden) vomAdsorptionsmittel mit Hilfe einer Flüssigkeit.
Enzym: Protein,das eine spezifische chemische Reaktion katalysiert.
Eukaryont: lebender Organismus, der aus einer oder mehreren Zellen mit ausgeprägtem
Zellkern und Cytoplasma besteht. Zu denEukaryontonenzählenPflanzen,Tiere, Pilze und
Protozoen, nicht dagegen Bakterien (Prokaryonten).
F
fluoreszieren: bei Bestralung mit Licht- oder Röntgenstrahlen von selbst leuchtend.
G
Genom: die gesamte genetische Information einer Zelle oder eines Organismus (oder
die DNA-Moleküle, die diese Information tragen).
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H
Heteropolymer: künstliches Nucleinsäuremolekül aus einem Gemisch unterschiedlicher
Nucleotide.
Homogenat:
homogenisieren: sich nicht mischendeFlüssigkeiten dorch Zerkleinerungder
Bestandteile mischen.
hybridisierung: experimenteller Vorgang, bei dem zwei komplementären
Nucleinsäuresträngen die Gelegenheit gegeben wird, unter selektivenBedingungen
aneinander zu binden; eine hochwirksame Technik, um spezifische Nucleotidsequenzen
aufzuspüren.
Hydrolyse: Spaltung einer kovalenten Bindung bei gleichzeitiger Adition von Wasser: -
H wird an das eine Spaltprodukt, -OH an das andere angehängt.
I
Inhibitoren: Hemmer.
Inkubationszeit: Zeit zwischender Ansteckung (Eindringen des Krankheitserregers in
den Körper) bis zum Auftreten der ersten Krankheitserscheinungen der
Infektionskrankheit.
Interphase: Phase zwischen zwei Zellteilungen, in der sich die Zelle in der
stoffwechselaktiven Arbeitsform befindet.
K
katalysieren: eine chemische Reaktion durch einen Stoff herbeiführen oder beeinflussen,
der selbst unverändert bleibt.
komplementär: bedeutet präzise Basenpaarung von zwei Nucleinsäuresequenzen.
Kontamination: Verschmutzung,Verunreinigung.
L
Ligase: Enzym, das zwei DNA- oder RNA-Segmente Endean Ende verbindet (ligiert).
Ligation: Verschmelzung.
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Limitation: Beschränkung.
Lyse: Auflösung.
M
Meiose: Sonderform der Zellteilung, durch die Eizellen und Spermien gebildet werden
und bei der eine Reduktion des doppelten Chromosomensatzes auf einen einfachen
Chromosomensatz stattfindet.
Mitose: Teilung des Kerns einer Eukaryontenzelle, einschließlich der Kondensationder
DNA in sichtbare Chromosomen.
Mutation: eine vererbbare Veränderung in der Nucleotidsequenz eines Chromosoms.
N
Nuclease: Enzym, das Nucleinsäuremoleküle abbaut.
Nucleosid: Verbindung eines Zuckers und einer Base.
Nucleotid: Verbindung eines Zuckers, einer Base und einer Phosphatgruppe.
O
Okazaki-Fragment: ein kurzer RNA-gestarteter DNA-Abschnitt, der bei der DNA-
Replikation während der Synthese des Folgstranges entsteht.
oligo-: Präfix für ein Objekt oder ein kurzes Polymer, das aus einer geringen Anzahl
von Untereinheiten besteht. Ein Oligomer kann aus Aminosäuren (Oligopeptid), Zucker
(Oligosaccharid) oder Nucleotiden (Oligonucleotid) bestehen.
Organelle: unabhängige Struktur einer Eukaryontenzelle, die auf eine besondere
Funktion spezialisiert ist.
P
PCR: engl.: Polymerase-chain-reaktion = Polymerase-Kettenreaktion
Pellet: engl.: Kügelchen, Pille
phylogenetisch: betreffend die stammesgeschichtliche Entwicklung der Lebewesen und
die Entstehung der Arten in der Erdgeschichte.
Polymerase: allgemeine Bezeichnung für ein Enzym, das die Addition von
Untereinheiten an ein Polymer katalysiert.
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Polynucleotid: Polymer aus Nucleotideinheiten.
Pränataldiagnostik: Untersuchung des ungeborenen Kindes.
Primer: kurzes Polynucleotid, das sich an ein einzelsträngiges DNA-Molekül anlagert
und so einen Startpunkt für die DNA-Replikation bildet.
Prokaryontenzelle: Typ einer lebenden Zelle charakterisiert durch den fehlenden
Zellkern.
proofreading-Aktivität: (Korrekturlesefunktion) der Vorgang, durch den die DNA-
Polymerase beim „Abschreiten“ der DNA ihre eigenen Fehler korrigiert.
Protease: Enzym das Proteine durch Hydrolyse abbaut.
Protein: vorwiegend aus Aminosäuren aufgebauter Eiweißkörper.
Protozoen: (Protozoon) mikroskopisch kleines, aus einer einzigen Zelle bestehendes
Tierchen.
R
Renaturieren: wieder in einen naturnahen Zustand zurückführen.
Replikation: siehe Duplikaiton
Restriktionsendonuclease: (Restriktionsenzym) Nuclease, die eine spezifische kurze
Nucleotidsequenz auf der DNA erkennt und die DNA spaltet, wo immer diese Sequenz
auftritt.
Ribosom: vor allem aus Ribonukleinsäuren und Protein bestehendes, für den
Eiweißaufbau wichtiches, sehr kleines Körnchen.
S
Satelliten-DNA: ist entweder eine leichtere (AT-reiche) oder schwerere (GC-reiche)
DNA im Vergleich zur Haupt-DNA
semikonservative Replikation: Die Art der DNA-Replikation, bei der jede
Tochterdoppelhelix ein Polynucleotid von der Eltern-DNA und ein neu synthetisiertes
Polynucleotid enthält.
Sequenz: lineare Abfolge von Untereinheiten in einer Polymerkette, beispielsweise von
Aminosäuren in einem Protein oder Nuclioteden in einer DNA.
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Silicagel: Kieselgel
Supercoil: siehe Überspiralisierung
Suspension: feinste Verteilung sehr kleiner Teilchen einesfesten Stoffes in einer
Flüssigkeit, so daß sie darin schweben.
T
Thermocycler: Das Gerät wird für die PCR-Reaktion verwendet. Es ermöglicht einen
schnellen und sehr exakten Temperaturwechsel.
Transformation: Aufnahme neuer Gene durch eine Zelle in Form isolierter DNA.
Transkription: Synthese einer RNA-Kopie eines Genes.
Translation: Synthese eines Proteins, dessen Sequenz nach den Regeln des genetischen
Codes durch die Nucleotidsequenz einer mRNA bestimmt wird.
U
Überspiralisierung: (supercoiling) Konformation, in der eine Doppelhelix stärker oder
schwächer verdrillt ist, do dass eine superhelikale Spiralisierung entsteht.
W
Wasserstoffbrücken: relativ schwache chemische Bindung, die jedoch für die
Stabilisierung der höhergradigen Struktur vieler Biomoleküle von großer Bedeutung ist.
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6. Bilderverzeichnis:
Abb. 1 Abb. 1-17 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 16
Abb. 2 Abb. 3.7 aus der Medizinischen Mikrobiologie, Buch S.159
Abb. 3 Abb. 6-3 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S.199
Abb. 4 Tafel 2-6 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 68
Abb. 5 Tafel 2-6 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 68
Abb. 6 Tafel 2-6 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S. 69
Abb. 7 Abb. 6-4 aus dem Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Buch S.200
Abb. 8 Abb. 11.2 aus Moderne Genetik, Buch S. 190
Abb. 9 Abb. 3-1 aus Gentechnik, Buch S. 67
Abb. 10 Zerkleinerte Tomate; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 11 Pürieren der Tomate; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 12 Homogenat einer Kiwi mit Ethanol überschichtet; Foto vom Praktikum in
Hamburg
Abb. 13 Zerkleinerung des Kalbsthymus in große Stücke; Foto vom Praktikum in
Hamburg
Abb. 14 Zerkleinerung in Linsen-große Stücke; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 15 Vollständige Zerkleinerung; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 16 Filtrieren des Homogenats; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 17 Hineingeben der Zentrifugenbecher in die Zentrifuge; Foto vom
Praktikum in Hamburg
Abb. 18 Ausfallen der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 19 Aufwickeln der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 20 Abschaben der Mundschleimhaut; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 21 Zerstörung der Gewebe; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 22 Zentrifugieren der DNA; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 23 Erhitzung der Agerose und des Puffers; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 24 Abspülen des Kolben mit kaltem Wasser; Foto vom Praktikum in
Hamburg
Abb. 25 Einfüllen des Geles; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 26 Fertiges Gel; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 27 Abb. 2.2.3 aus Gentechnik Biotechnik, Buch S. 27
Abb. 28 Inkubation der Reaktionsgefäße; Foto vom Praktikum in Hamburg
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Abb. 29 Färben des Geles; Foto vom Praktikum in Hamburg
Abb. 30 Abb. 2.3.3 aus Gentechnik Biotechnik, Buch S.41
Abb. 31 Abb. 12-1: aus Gentechnik, Buch S.294
Abb. 32 Abb. 12-4 aus Gentechnik, Buch S. 303
Abb. 33 Thermocycler; Foto vom Praktikum im Vienna Biocenter
Abb. 34 Füllen der Geltaschen; Foto vom Praktikum im Vienna Biocenter
Abb. 34 Ergebnis der PCR-Reaktion; Bild vom Praktikum im Vienna Biocenter
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7. Literaturverzeichnis:
Alberts, Bruce; Bray, Dennis; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts,
Keith; Walter, Peter: Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie (WILEY-VCH Verlag
GmbH
Brown, Terence A.: Moderne Genetik (Spektrum Akademischer Verlag, 1999, 2.
Auflage)
Dingermann, Theodor: Gentechnik Biotechnik (Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft
mbH Stuttgart, 1999)
Gassen, Hans Günter; Minol, Klaus: Gentechnik (Spektrum Akademischer Verlag,
1996, 4. Auflage)
Gelehrter, Thomas D.; Collins, Francis S.; Ginsburg, David: Principles of medical
Genetics (Williams & Wilkins, 1998, 2. Auflage)
Junqueira, Luiz C.; Carneiro, Jose; Kelley, Robert O.: Histologie (Springer-Verlag,
2002, 5. Auflage)
Kayser, Fritz H.; Bienz, Kurt A.; Eckert, Johannes; Zinkernagel, Rolf M.: Medizinische
Mikrobiologie (Georg Thieme Verlag, 2001, 10. Auflage)
Löffler, Georg: Basiswissen Biochemie mit Pathochemie (Springer-Verlag, 2001, 4.
Auflage)
Mandl, Christian; Mandl, Lothar; Reuer, Egon: Organismus und Umwelt 3 (öbv et hpt
VerlagsgmbH & Co. KG, 1998, 3. Auflage)
Passarge, Eberhard: Taschenatlas der Genetik (Georg Thieme Verlag, 1994)
Regenass-Klotz, Mechthild: Grundzüge der Gentechnik (Birkhäuser Verlag, 2000, 2.
Auflage)
Schmid, Rolf D.: Taschenatlas der Biotechnologie und Gentechnik (WILEY-VCH
Verlag GmbH, 2002
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Ich erkläre, dass ich diese Fachbereichsarbeit selbst verfasst habe und dass außer der
angegebenen Literatur keine weitere verwendet wurde.
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Datum Unterschrift