PRACTICA # 6

COCOS GRAMPOSITIVOS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Aprender a aislar e identificar los cocos grampositivos.

INTRODUCCION

El tracto respiratorio superior es rico en microorganismos de la flora normal, incluyendo Estreptococos, Estafilococos, Neisserias, Difteroides, levaduras y bacilos entéricos Gramnegativos. Los cocos grampositivos patógenos se aíslan en agar enriquecido y suplementado con sangre de carnero. Algunas especies presentan capacidad hemolítica, parcial (alfa hemólisis) o total (beta hemólisis)

El género Staphylococcus se separa de otros cocos grampositivos por sus propiedades microscópicas, morfológicas coloniales y bioquímicas. Staphylococcus. aureus es el único coagulasa positivo y forma grandes colonias cremosas y frecuentemente con pigmentación amarilla si se incuba a temperatura ambiente y es beta hemolítico. Es muy resistente a la acción del calor, luz, desecación, temperaturas extremas, agentes químicos, sobrevive semanas o meses en el polvo, pus o esputo. Es altamente tolerante a altas concentraciones de sales, sobreviviendo en alimentos preservados. En sal-manitol desarrolla colonias amarillas de 3mm y vira el indicador del pH a amarillo. Es resistente a la penicilina.

Sthaphylococcus. epidermidis es coagulasa negativo, no-hemolítico.

El género Streptococcus antigénicamente, presenta 13 grupos (clasificación de Lancefield) en base al carbohidrato C de la pared celular y son denominados de la A a la O.

Los S treptococcus del grupo A, también denominados Streptococcus pyogenes forman colonias de 1-2 mm, sin color, muy transparentes, beta hemolíticas y son los más virulentos. La proteína M es el principal antígeno en las cepas virulentas. Son sensibles a la Bacitracina. Sobreviven semanas en esputo u otras excretas y meses en sangre o pus.

Los Streptococcus del grupo B incluyen a Streptococcus. agalactiae y dan la prueba de CAMP positiva. Una hemólisis marcada en forma de punta de flecha en el punto de unión de su crecimiento con Staphylococcus. aureus.

El Streptococcus faecalis (gpo. D) es el único que crece en EMB.

El Streptococcus pneumoniae (Diplococcus pneumoniae) es conocido como neumococo y desarrolla colonias de 1-3 mm, apigmentadas, alfa hemolíticas en condiciones aerobias y beta hemolíticas en anaerobiosis. Las cepas virulentas dan colonias mucoides debido a que presentan una gran cápsula, lo que constituye su factor de virulencia.

Es difícil de mantener en las resiembras. Es sensible a la Optoquina.

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MATERIALES Y METODOS

1. Tome un exudado faríngeo de un compañero con un hisopo estéril en la forma tradicional y deposite la muestra en el extremo de una placa de agar sangre. Extienda el inóculo con un asa por estría cruzada. Incube a 37 C por 24 hs.

2. El resto de la muestra que quedó en el hisopo deposítelo en un portaobjetos y haga un frotis. Tiña con Gram.

3. Simultáneamente, Haga un Gram de cepas puras de Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae. Observe al microscopio.

4. Siembre las cepas puras en agar sangre. Incube a 37 C por 24 hs.5. Haga una tinción de Gram con las cepas puras. 6. Determine en todas las placas sembradas, cuáles colonias produjeron hemólisis y de qué tipo. 7. Haga un gram de las colonias del exudado. Después de la incubación de 24 hs. 8. Para la cepa pura de Staphylococcus. aureus y las colonias semejantes a Sthaphylococcus. aureus o a

Staphylococcus sp., desarrolladas del exudado faringeo, haga la siguientes pruebas:

- Prueba de la catalasa: Tome una colonia bien aislada con el asa estéril y sumérjala en una gota de agua oxigenada. Observe una efervescencia por desprendimiento del O2).

- Prueba de la coagulasa: Con el asa estéril obtenga una colonia beta hemolítica bien aislada y mézclela con 0.5 ml de plasma. Incube a 37 C por 30 min. y lea el resultado. Si hay coagulación del plasma, es coagulasa positivo.

- Cultivo en medio sal-manitol: Tome con el asa estéril una colonia bien aislada, beta hemolítica y siémbrela en una placa de agar sal-manitol por estría cruzada. Incube a 37 C durante 24 hs. Observe el desarrollo de colonias color dorado y el cambio de color del medio a amarillo. Esto, debido a la fermentación del manitol y acidificación.

9. Para Streptococcus. pyogenes (Estreptococos del grupo A) y en las colonias semejantes del exudado, determine su sensibilidad a la Bacitracina. Para ello siembre una colonia bien aislada en la mitad de una placa de agar-sangre y coloque un círculo de papel filtro impregnado con Bacitracina

10. En el otro sector de la caja coloque un círculo impregnado con Trimetroprim para determinar su resistencia. Incube a 37 C por 24 hs. Determine el diámetro del halo de inhibición alrededor de cada antibiótico para determinar la sensibilidad.

11. Para la identificación del Streptococo beta hemolítico del grupo B (Streptococcus agalactiae), realice la prueba de CAMP:

- Tome una colonia beta hemolítica con el asa y siémbrela en una sola línea perpendicular a otra línea previamente sembrada con Staphylococcus. aureus. Incube a 37 C por 24 hs.

- Determine si hubo hemólisis en forma de punta de flecha, en el lugar donde se unen las dos bacterias.

12. Para identificar Streptococcus pneumoniae y en las colonias semejantes determine su susceptibilidad a la Optoquina, colocando un círculo de papel impregnado con el antibiótico en un medio con agar-sangre donde se sembró la bacteria. Incube a 37 C por 24 hs. Mida el halo de inhibición para determinar la sensibilidad.

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Prueba de CAMP Prueba de Bacitracina, Optoquina y CAMP

Anote detalladamente y analice los resultados.

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