Bioquímica II

Practica # 6

“Enzimas Mitocondriales”

Terán Olvera María Gabriela3º semestre QFBt.

Yesica López

Fecha de entrega: 14-11-2013.

IntroducciónTransporte ElectrónicoLa cadena de transporte electrónico (CTE) mitocondrial, que también se denomina sistema de transporte electrónico, es un conjunto de transportadores electrónicos situados en la membrana interna, en orden creciente de afinidad electrónica, que transfiere los electrones que proceden de las coenzimas reducidas hasta el oxígeno.

Durante esta transferencia se produce una disminución del potencial de oxidación-reducción. Cuando el donador de electrones es el NADH y el oxígeno es el aceptor de electrones. Este proceso, en el que se utiliza oxígeno para generar energía a partir de las moléculas de alimento, suele denominarse respiración aerobia. La energía que se libera durante la transferencia electrónica está acoplada a varios procesos endergónicos, de los que el más importante es la síntesis de ATP. Otros procesos que impulsan el transporte electrónico bombean Ca2+ dentro de la matriz mitocondrial y generan calor en el tejido adiposo. Las coenzimas reducidas, que proceden de la glucólisis, el ciclo del ácido cítrico y la oxidación de los ácidos grasos, son las principales fuentes de electrones.

La citocromo oxidasa, es un complejo proteico que cataliza la reducción de cuatro electrones del O2 para formar H20. El complejo que atraviesa la membrana en los mamíferos puede contener entre seis y trece subunidades, dependiendo de las especies. Puede contener también dos átomos de cobre, además de los átomos de hierro del hemo de los citocromos a y a3. Los átomos de cobre se alternan entre los estados de oxidación + I Y +2, Cu 1+ y Cu2+.

El átomo de hierro del cit a3 está íntimamente asociado con un átomo de cobre denominado CuB. El otro átomo de cobre (CuA) se encuentra a corta distancia del hemo del cit a. El citocromo c, una proteína que está unida débilmente a la membrana interna sobre su superficie externa, transfiere los electrones de uno en uno al Cit a y al CuA. Los electrones se ceden a continuación al cit a3 y al Cub, lo que se produce en el lado de la matriz interna de la membrana.

Durante cada reacción redox secuencial de la CTE (cadena de transporte de electrones), un electrón pierde energía. Durante la oxidación del NADH hay tres pasos en los que la variación del potencial de reducción es suficiente para sintetizar ATP. Las pruebas experimentales más recientes indican que aproximadamente se sintetizan 2.5 moléculas de ATP por cada par de electrones que se transfieren entre el NADH y el O2 en la CTE. En la transferencia de cada par donado por el FADH2 producido por la oxidación del succinato se forman aproximadamente 1.5 moléculas.

Las sustancias que se comportan como inhibidores competitivos, es decir, que reducen la afinidad aparente de una enzima por el sustrato, suelen tener una estructura semejante a la del sustrato. Entre estas moléculas hay productos de reacción o análogos que no se metabolizan o derivados del sustrato. La succinato deshidrogenasa, una enzima del ciclo del ácido cítrico de Krebs, cataliza una reacción redox que convierte el succinato en fumarato. Esta reacción está inhibida por el malonato. El malonato se une al lugar activo de la enzima pero no puede convertirse en producto.

La succinato deshidrogenasa no se encuentra dentro de la matriz mitocondrial, sino que está firmemente unida a la membrana mitocondrial interna. La oxidación de un alqueno requiere un agente oxidante más fuerte que el NAD+. La succinato deshidrogenasa es una flavoproteína que emplea el FAD para impulsar la oxidación del succinato a fumarato. La succinato deshidrogenasa se activa por concentraciones elevadas de succinato, ATP se inhibe por el oxalacetato. La enzima también se inhibe por el malonato, un análogo estructural del succinato.

Bioquímica II

Practica # 6

“Enzimas Mitocondriales”

Terán Olvera María Gabriela3º semestre QFBt.

Yesica López

Fecha de entrega: 14-11-2013.

ObjetivoPoder identificar algunas enzimas, como el citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa, mediante el uso de sus aceptores electrónicos coloreados

Hipótesis Con el uso de los aceptores electrónicos coloreados, podré identificar algunas enzimas con citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa.

MaterialMaterial Sustancias

10 Tubos de Ensayo 2 Matraces Erlenmeyer de 150ml 2 Vaso de Precipitado de 500ml 1 Un mortero con mano Pipetas de 5ml 4 Pipetas de 2ml 5 Tubos de centrifuga (falcón) 1 Gradilla Perilla 1 Piseta

Buffer de Fosfatos 0,1M pH 7.4 PBS Cianuro de Potasio p-fenilendiamina Succinato de Sodio Azul de Metileno Aceite Mineral Agua Destilada

Metodología

Cuadro 1- Muestras los componentes supramolecures de la cadena de transporte electrónico.

Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa

Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa

Se prepararó las siguientes soluciones

- Solución salina de Fosfatos PBS (500ml) pH. 7.4- Solución de Cianuro de Potasio 0.05M (50ml)- Solución de p- fenilendiamina al 1% (100ml) - Solución de Succinato de Sodio al 1% (100ml) - Solución de Azul de metileno al 0.01% (100ml) -Aceite Mineral (200mlSe preparon los tubos como indica la tabla No. 1

Extracción y preparación de las enzimas y coenzimas Se tomó una muestra de aproximadamente 5g de tejidos hepático, limpio.

Se colocó en un mortero con arena lavada y se maceró cuidadosamente hasta formara una masa suave adicionando el PBS hasta completar un volumen de 15ml

Se pasó la mezcla a un erlenmeyer de 150ml y se mantuvo en el refrigerador por 15minutos, Se pasó a los tubos y se centrifugo a 1500rpm por 10 minutos. Se tranfirio el sobrenadante a otro erlenmeyer de 150ml.

Nota: Se mezcló bien el contenido de cada tubo y se incubó a 37º C apareciera el complejo coloreado.

Tabla.1- Preparación de los tubos

Reactivo (ml) B 1 2 3

PBS 1.0 1,0 1,0 1,0

Cianuro de Potasio 0.05 M 0.0 0.0 1.0 0.0

Agua Destilada 2.0 1.0 0.0 0.0

Extracto Enzimático 1.0 1.0 1.0 1.0

p-fenilendiamina 0.0 1.0 1.0 1.0

TABLA.1

Reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa

Observaciones

Se preparon los tubos según las indicaciones de la tabla No. 2.Nota: Antes se agregó el extracto enzimático, y se dejo incubando a 37º C durante 10 minutos, y sin retirarlos del baño se agregó el extracto enzimático, inmediatamente se agitó bien y se colocó el aceite mineral .

Se tomó el tiempo en el extracto enzimático hasta que cambie de coloración.

Tabla.2-Modo de preparación de los tubos

Resultados

Reactivo (ml) B 1 2 3 4

PBS 3.0 2,5 2,0 1,5 1.0

Succinato Sodio %0.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Azul de Metileno 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Malonato de Sodio %0.0 0.0 0.0 0.0 1.0

Extracto Enzimático 1.0 0.5 1.0 1.5 1.0

Aceite Mineral 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Reacción catalizada por la citocromo oxidasa Observaciones

Cuando se agregó las diferentes soluciones de PBS, cianuro de potasio, p-fenilendiamina y el extracto enzimático a cada uno de los tubos, hubo ciertos cambios de coloración en algunos tubos:Blanco: Es transparenteTubo 1: Presentó un color rosa claroTubo 2: Es transparenteTubo 3: Presentó un color café claro

Al llevar los cuatro tubos a baño maría algunos tubos experimentaron cambio de coloración:Blanco: Es transparenteTubo 1: Presentó una coloración morado-pastel con un aspecto como de leche cortada.Tubo 2: Presentó una coloración morado-pastel muy tenue, además de ser homogénea.Tubo 3: Se presentaron dos capas con una coloración morada-pastel, la primera tiene una apariencia de leche cortada y la última capa homogénea del mismo color, sin ningún precipitado.

B 1 2 3

B 1 2 3

Cuando se agregó el PBS, succinato de sodio, azul de metileno, extracto y enzimático y aceite, tomó una coloración azul y en todos los tubos se precipito el aceite mineral.

Nota: Se agregó el aceite mineral antes de haberse incubado a 37⁰C.

Después de 45 minutos, se observó cierto cambios de coloración en algunos tubos:Blanco: No hubo cambios de coloración, se conservó el color azul agua y se precipitó el aceite.Tubo 1: Hubo un cambio, su coloración fue azul rey, transparente, se precipitó el aceite.Tubo 2: Hubo un cambio, su coloración fue azul rey muy ligero, transparente, se precipitó el aceite.Tubo 3: Hubo un cambio, su coloración fue azul rey, transparente, se precipitó el aceite.Tubo 4: Hubo un cambio, su coloración fue azul rey, transparente, se precipitó el aceite.

TABLA.2

Discusión

En el cuadro tres, cuando se prepararon los tubos, hubo cambios de coloración muy leves, al tubo que contenía p-fenilendiamina, mostró una coloración rosa claro y el tercer tubo mostro una coloración café claro cuando se agregaron las sustancias de la tabla 1, tomó una coloración café claro, esto pudo ser porque pudo haber reaccionado la p-fenilendiamina con el PBS.

Al llevar los tubos a baño maría, experimentaron cambios es su coloración y en su aspecto. Cuando se compara con la muestra blanco, se observó en el tubo una coloración morada-pastel con un aspecto de leche cortada, por lo que la reacción de p-fenilendiamina con el extracto enzimático (tejido hepático), esto sucede, porque ocurre una reacción de redox, oxidando la fenilendiamina, y así se puede determinar así la presencia del citocromo oxidasa.

En el tubo dos, se presentó una coloración homogénea morado-pastel, el cuál explica (2005, Castro N.G.A. y Moreno S.R.) que el complejo de citocromo oxidasa, son inhibidas por el cianuro de potasio y el malonato, debido por la translocación de los protones, que hace que nos dé ese aspecto de con un aspecto de leche cortada.

Conforme a los resultados obtenidos del cuadro cuatro, cuando se agregaron las sustancias correspondientes a la tabla dos, únicamente hubo un cambio de coloración al agregar el azul de metileno, dándole una coloración azul agua. Un error cometido, fue que se agregó el aceite mineral antes de incubarse, por lo tanto no ocurrió la reacción. Según lo reportado en otros equipos a los cuarenta y cinco minutos, se pudo apreciar un cambio de coloración a un azul más intenso, por lo que les resulto la prueba catalizada por succínico deshidrogenasa. Algo que cabe mencionar, que el H2 cedido de por el succinato puede ser transferido al FADH2 al azul de

2 1 B B 1 2 3

3 B 1 2 3

4

B 1 2 B 1 2 3

3 B 1 2 3

4

metileno cambia su estado de redox, en donde primeramente se oxida y después se reduce, tomando así una coloración más intensa o en donde puede llegar a veces a ser incolora.

Conclusión

Se pudieron identificar las enzimas citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa, mediante las reacciones de aceptores electrónicos coloreados, usando un método cualitativo, observándose cambios de coloración y se identificar el efecto inhibitorio de algunas sustancias como el cianuro de potasio y p-fenilendiamina, sobre este sistema enzimático.

Cuestionario

1.- Qué es una enzima y cuáles son sus características? Es catalizador de origen biológico y naturaleza proteica, de alto peso molecular y conformación tridimensional característica, acelera la reacción al disminuir la energía de activación.Características

Las enzimas catalizan la formación o rotura de enlaces covalentes Su elevada especificidad es su mayor característica. Actúan en baja concentración; No se necesita gran cantidad de ellas para realizar la

acción de manera eficiente, ya que  son activas a concentraciones pequeñas. No sufren modificaciones durante la reacción; su composición y forma no son

transformadas en ninguna parte de la reacción, se recuperan intactas. No afectan el equilibrio de la reacción, pero si su velocidad, debido a que su trabajo es

catalizar la reacción. Son sumamente específicas; tienen un trabajo específico y solo son usadas para ello,

su actividad está regulada y actúan en el mismo lugar donde se segregan. Son moléculas estrictamente proteicas; Son Proteínas Globulares que regulan la mayor

parte de las reacciones metabólicas de los seres vivos, debido a esto  las enzimas sufren desnaturalización, no dializan y sufren saturación.

Lo sintetizan tanto los seres Autótrofos como Heterótrofos. Pueden actuar a nivel intracelular o extracelular, dependiendo de la reacción.

2.- Qué características tienen las enzimas mitocondriales?

Son responsables de la oxidación de ácidos grasos, transportes de electrones y síntesis de ATP.

3.- Describa algunas enzimas presentes en el ciclo de Krebs.

Citrato sintetasa: Condensa el acetil CoA con oxalacetato para dar lugar a citrato.

Acotinasa: Cataliza la transformación intermedia del ácido tricarboxilico cis-aconitato, que normalmente no se disocia del centro activo. Isocitrato deshidrogenasa: Cataliza la descarboxilación oxidativa del isocitrato dando lugar a la formación de, ∝-acetoglutarato.

∝-Acetoglutarato deshidrogenasa: Esta enzima hace una descarboxilación oxidativa por la que el, ∝-acetoglutarato se convierte en succinil-CoA.

Succinil-CoA sintetasa: Es la enzima que cataliza esta reacción reversible, en donde indican la participación de un nucleósido trifosfato en la reacción.

Succinato deshidrogenasa: Es una flavoproteína que oxida el fumarato a partir de succinil CoA.

Fumarasa: Cataliza la hidratación reversible del fumarato a l-malato.

L-malato deshidrogenasa: La enzima L-malato deshidrogenasa ligada NAD, cataliza la oxidación del L-malato deshidrogenasa.

4.- Describa estructuralmente el ciclo de Krebs

5.- ¿Qué función tiene el citocromo Oxidasa y Succinato Deshidrogenasa?Citocromo Oxidasa: Cataliza la transferencia de electrones al oxígeno para dar agua constituye lo que se conoce como complejo 4 de la cadena de transporte electrónico y está presente en todos los organismos aerobios.

Succinato Deshidrogenasa: Ocurre en tres pasos: primeramente oxidación, hidratación y segunda oxidación. Estos tres pasos cumple la función de regenerar oxalacetato, permiten la extracción de energía mediante la formación de FADH2 y NADH. Formando fumarato.

6.- ¿Cuál es la función de observar la cinética enzimática.La cinética enzimática permite:

Distinguir unas enzimas de otra. Distinguir entre isoenzimas Conocer las diferencias entre la actividad en un tejido o en otro. Permitir conocer su afinidad con el sustrato.

Bibliografía Mckee T, Mckee James. (2003).Bioquímica la base molecular de la vida, 3ª Edición, Mc

Graw Hill, pg. 304-307, 311-320. Nelson D.L. y Cox M.M. (2005). Lehninger Principios de Bioquímica. 4ª edición.

Omega.pg. 608-613. Álvarez S. al. (1994). La mitocondria: estructura, función y especies reactivas del

óxigeno, Antioxidantes y Calidad de Vida 1994;1:26. Recuperado 11 de noviembre del 2013: http://computo.sid.unam.mx/Bioquimica/PDF/2005/03/j_104-105_ProblemaBioq.pdf Recuperado 11 de noviembre del 2013: http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/enzimas/#inhibición enzimática Recuperado 11 de noviembre del 2013: http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-v/pb-v-3-catalasa_oxidasa.htm