Prctica No. 5. Filtracin por membrana para la determinacin de Coliformes totales, coliformes fecales y Estreptococos fecales.MICROBIOLOGA DE LOS ALIMENTOSEQUIPO No.4

INGENIERA BIOQUMICAPRACTICA #5

PROFESOR:M.C. Miguel ngel Daz Alday.

INTEGRANTES: BIVIANO YEVALES BRAYAN GONZALES CASTRO GABRIEL REBOLLEDO ALARCON MIGUEL NGEL SANTIAGO RUEDA CELENE VALENTE RODRIGUEZ JESUS ALBERTO

FECHA DE ENTREGA: 11 DE MARZO DEL 2015

NDICE

PROBLEMA.......3

FUNDAMENTO....3

HIPOTESIS....3

OBJETIVOS...3

INTRODUCCIN..........3

MARCO TERICO........4

MATERIAL Y EQUIPO...12

PROCEDIMIENTO.12

RESULTADOS...13

DISCUSIN DE RESULTADOS.....14

CONCLUSIN...14

GLOSARIO.....15

BIBLIOGRAFA...16

PROBLEMA:La presencia de bacterias patgenas en el agua destinada al consumo humano es un riesgo siempre presente, que se incrementa en las reas de mayor densidad de la poblacin. La tcnica de filtracin por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan membranas que tienen un tamao de poro de 0.45 micras ya que la mayora de los microorganismos tienen un tamao superior (dimetro).La normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable de consumo pblico establece como anlisis microbiolgicos a realizar las determinaciones de: coliformes totales, coliformes fecales, grmenes totales, estreptococos fecales y clostridios sulfito-reductores. El nmero de determinaciones se establece para cada tipo de anlisis, si este es mnimo, normal o completo.FUNDAMENTO En la tcnica de filtracin por membrana, el grupo coliformes se define como todas las bacterias aerbicas y anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas que desarrollan una colonia roja con brillo metlico dentro de 24 horas de incubacin en un medio tipo Endo conteniendo lactosa. El grupo coliformes produce aldehdos por la fermentacin de la lactosa. E. coli bacteria perteneciente al grupo coliformes, que en un medio adecuado y a una temperatura restrictiva de 44,5 C +/- 0,2C, fermenta la lactosa produciendo cido, gas, posee actividad -D-glucoronidasa y actividad triptofanasa. Son negativas a la actividad oxidasa y ureasa. OBJETIVOS: Este mtodo se utiliza para medir la calidad sanitaria del agua potable. Se aplica a agua clorada o agua naturales de muy baja contaminacin y sin turbidez. Al finalizar, el trabajo prctico, el estudiante estar en capacidad, mediante la consulta bibliogrfica y la aplicacin de las tcnicas microbiolgicas, de realizar el control microbiolgico del agua de proceso, utilizando la tcnica de la Membrana Filtrante.

INTRODUCCION

La presencia de bacterias patgenas en el agua destinada al consumo humano es un riesgo siempre presente, que se incrementa en las reas de mayor densidad de la poblacin. La tcnica de filtracin por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan membranas que tienen un tamao de poro de 0.45 micras ya que la mayora de los microorganismos tienen un tamao superior (dimetro).La normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable de consumo pblico establece como anlisis microbiolgicos a realizar las determinaciones de: coliformes totales, coliformes fecales, grmenes totales, estreptococos fecales y clostridios sulfito-reductores. El nmero de determinaciones se establece para cada tipo de anlisis, si este es mnimo, normal o completoMARCO TEORICO

La presencia de bacterias patgenas en el agua destinada al consumo humano es un riesgo siempre presente, que se incrementa en las reas de mayor densidadde la poblacin. La tcnica de filtracin por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan membranas que tienen un tamao de poro de 0.45 micras ya que la mayora de los microorganismos tienen un tamao superior (dimetro).La normativa para abastecimiento y control de calidadde agua potable de consumo pblico establece como anlisis microbiolgicos a realizar las determinaciones de: coliformes totales, coliformes fecales, grmenes totales, estreptococos fecales y clostridios sulfito-reductores. El nmero de determinaciones se establece para cada tipo de anlisis, si este es mnimo, normal o completo.

FILTROS DE MEMBRANA

Los filtros de membrana son filtros de superficie, que muestran una estructura microporosa precisa. Durante la filtracin las partculas mayores que los poros de la membrana son retenidas de forma fiable en la superficie de la misma. Las particulas ms pequeas pueden pasar el filtro.Filtracin a travs de membrana

El nmero de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante la filtracin de volmenes especficos de la muestra a travs de filtros de membrana. Por lo general, estn compuestos de steres de celulosa, tpicamente con poros de 0,45 mm de dimetro que retienen los coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra. Despus se incuban las membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. En la prctica, la tcnica de filtracin de membrana ofrece resultados comparables a los que se obtienen con el mtodo de tubos mltiples. Una de las ventajas del mtodo de filtracin a travs de membrana es la prontitud con que pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo rpidamente acciones correctivas y operar en la planta de agua de nuevo en forma normal. Esta tcnica puede aplicarse en el anlisis de casi todos los tipos de agua, tambin se utiliza en el anlisis de leche y otros alimentos lquidos.El anlisis bacteriolgico del agua es vital en la prevencin de epidemias como resultado de la contaminacin del agua. El examen bacteriolgico de abastecimientode agua no implica la bsqueda directa de los grmenes patgenos. El ensayo se basa en el supuesto de que todas las aguas contaminadas con desechos humanos o animales son potencialmente peligrosas. Por consiguiente, el control sanitario del agua se hace con mtodos bacteriolgicos para determinar la presencia de contaminacin fecal. Las pruebas para la determinacin de patgenos no se usan rutinariamente debido a que detectarlos en diluciones altas es muy difcil y adems se encuentran en nmero muy inferior al de las bacterias entricas, las cuales tienen una tasa de mortalidad mucho ms lenta.El examen bacteriolgico del agua usualmente involucra dos ensayos: la estimacin del nmero de bacterias de acuerdo con el conteo total en placa y la determinacin, ms significativa, de la presencia o ausencia de miembros del grupo coliforme.

El grupo coliorme incluye a todas las bacterias en forma de bastoncillos que son aerobias o anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporogneas, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un medio de cultivo prescrito en un perodo de 48 horas, a 35 C.

El nmero de organismos coliformes en el excremento humano es muy grande; la excrecin diaria por habitante vara entre 125x109y 400x109nmeros de unidades formadoras de colonias. Su presencia en el agua es considerada como un indicadorde contaminacin fecal y por lo tanto,de contaminacin con organismos patgenos. En aguas residuales la relacin de organismos coliformes con organismos entricos patgenos es muy grande, del orden de 106/1.

Los coliformes no solamente provienen del excremento humano sinotambin pueden encontrarse en los desechos de animales de sangre caliente, animales de sangre fra y en el suelo. Por lo tanto, la presencia de coliformes en aguas superficiales indica contaminacin proveniente de residuos humanos, animales o erosin del suelo separadamente, o de una combinacin de las tres fuentes. Aunque no es posible distinguir entre coliformes de origen humano o animal, existe un ensayo especial para diferenciar entre coliformes fecales y coliformes del suelo. Para el efecto, se usa unmedio de cultivo EC para incubacin a 44.5 C durante 24 hr. Este ensayo no reemplaza la tcnica usual, pero es aplicable en estudios de contaminacin de ros, fuentes de agua cruda, sistemas de tratamiento de aguas residuales y aguas para recreacin.Para determinar la presencia de bacterias del grupo coliforme se aceptan dos mtodos: el mtodo de los filtros de membrana y el mtodo de los tubos mltiples de fermentacin.

Tcnica del Filtro de Membrana

Todos los organismos que producen una colonia oscura, generalmente verde prpura con brillo metlico, despus de incubacin por 24 horas, en medio de cultivo ENDO son considerados miembros del grupo coliforme. El brillo metlico puede cubrir la colonia entera o aparecer solamente en la parte central o en la periferia. La cantidad ideal de muestra que se ha de filtrar debe ser aquella que produzcauncrecimiento de mximo 30 colonias de coliformes. Cuando se filtran porciones de menos de 20 ml, la muestra debe diluirse y filtrarse un volumen mnimo de 30 ml.Los filtros preparados se colocan directamente sobre el medio nutriente y se incuban, normalmente, durante 24 horas, a 37 C 35 C.

El procedimiento consiste en hacer pasar a travs de un filtro de membrana, aplicando vaco, un volumen medido de muestra de agua. A continuacinse coloca el filtro en un recipiente estril y se incuba en contacto con un medio de cultivo, selectivo y diferencial. En cada punto del filtro en el que durante la filtracinse capta una bacteria coliforme, se desarrollar una colonia de bacterias coliformes. Se enumeran las colonias bacterianas, practicndose un clculo simple para determinar el nmero de colonias de bacterias en 100 ml de muestra.Volumen de agua analizadaEl volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas, en las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en aguas superficiales y en general en aguas naturales sin tratar, el nmero de bacterias en 100 ml puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares. La siguiente tabla proporciona unos datos que pueden servir de orientacin:Tipos de aguaColiformes totales

Potable de consumo pblico100 ml

Envasadas250 ml

Manantiales15; 60; 100 ml

Lagos, depsitos4; 15; 60; 100 ml

Acometidas0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml

De playas0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml

De ros0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml

Residuales cloradas0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml

Residuales sin tratar0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml

Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente aadiendolas al embudo de filtracin. Para muestras entre 1 y 30 ml, se aaden primero al embudo 20-30 ml de solucin tamponada estril y, encima de ella, se vierte la muestraa a filtrar.Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones con solucin tamponada estril.

Preparacin de dilucionesPara realizar una dilucin 1/10 (10-1), se pipetea aspticamente 1 ml de muestra en un tubo con 9 ml de solucin tamponada estril y se agita.Muestra1 ml+Diluyente9 ml=Dilucin 1/10 (10-1)

Para realizar una dilucin 1/100 (10-2), se pipetea 1 ml de la dilucin 1/10 en otro tubo con 9 ml de solucin tamponada estril y se agita.Dilucin1/10 (10-1)+Diluyente9 ml=Dilucin 1/100 (10-2)

As sucesivamente se van haciendo las diluciones que se necesiten, dependiendo del grado de contaminacin esperado de la muestra.

TOMA DE MUESTRALa tcnica de muestreo depende del lugar donde se realiza dicho muestreo, para conocer los detalles sobre la toma de muestras de aguas para anlisis microbiolgicos haga clic sobre esta frase.

AGAR ENDO

Endo describi el desarrollo de un medio de cultivo para diferenciar entre microorganismos fermentantes y no fermentantes de la lactosa. Durante aos el agar Endo ha sido un importante medio para el examen microbiolgico del agua potable y residual, los productos lcteos y los alimentos; no obstante, el compendio actual de mtodos estndar para analizar estos elementos recomienda las formulaciones de otros medios.El medio se utiliza an en microbiologa clnica y en otros sectores para elaislamiento y la diferenciacin de la familia

Enterobacteriaceae.

La selectividad del agar Endo se debe a la combinacin del sulfito de sodio con fucsina bsica, lo cual ocasiona la supresin parcialde los microorganismos gram-positivos. Los coliformes fermentan la lactosa, produciendo colonias color rosa oscuro a rojizo con un brillo metlico verdoso iridiscente y una coloracin similar en el medio. Las colonias de microorganismos que no fermentan la lactosa son incoloras o de color rosa plido en contraste con el fondo rosa claro del medio.

El agar Endo es un medio de cultivo diferencial y ligeramente selectivo utilizado para la deteccin de coliformes y otros microorganismos entricos.

Colonias tpicas

Los coliformes fermentadores de lactosa producen colonias rosadas a rojas, mientras que las colonias de los microorganismos que no pueden fermentar este carbohidrato son incoloras o rosado plido. Las colonias tpicas de E. colien el Agar Endo son rosadas con un brillo verde metlico caracterstico, debido a la elevada produccin de cidos y aldehdos como producto de la fermentacin de la lactosa.

ENTEROCOCCS AGAREs un medio selectivo para el aislamiento y el recuento de estreptococos fecales (grupo D) a partir de muestras clnicas. El medio es una frmula estndar para el aislamiento de enterococos

Dos peptonas proporcionan los nutrientes. Los estreptococos del grupo D (incluidos los enterococos) hidrolizan la esculina para formaresculetina y glucosa. La esculetina reacciona con una sal frrica para formar un complejo marrn oscuro o negro. Se incluye el citrato frrico como indicador, que reacciona con la esculetina para producir un complejo de marrn a negro. Se utiliza bilis de buey para inhibir las bacteriasgram positivas diferentes de los enterococos. La azida sdica inhibe losmicroorganismosgram negativos.

MATERIALES:

cajas de petrimillipord Membranas filtrantes de 0,45 m de tamao de poro Soporte del filtro con embudo Sistema de vaco Pipetas estriles de 10 y 1 ml. Pinzas estriles papel filtro muestra de playa la angostaPROCEDIMIENTOColocar un filtro de membrana estril sobre el soporte de filtracin.

Adaptar el embudo y conectar el matraz a una bomba elctrica de vaco. Filtrar 100 ml de muestra si se trata de agua potable, y 0,1 y 1 ml si se trata de aguas no potables, previamente homogeneizadas.

Lavar con unos 30 ml de agua destilada. Retirar el embudo. Mediante las pinzas esterilizadas, transferir la membrana filtrante sobre losmedio de cultivo contenido en dos cajas millipor, de modo que la superficie de filtracin quede hacia arriba. Cerrar y esperar a que el filtro se adiera bien al medio, despus invertir ambas placas e incuba una a 44C (+/-1C ) durante 24h y la otra a 35 +/- 2C.

Se filtran 100 ml del agua a analizar previamente homogeneizada.

Se coloca el filtro de membrana sobre el medio KF se cierra la placa y se espera a que el filtro membrana ase adiera bien al medio. Se invierte la placa y se incuban a 37C durante 24 h.

Se utiliza para la determinacin del nmero de estafhylococcus faecalis mediante filtracin de un volumen determinado del agua a analizar a travs de filtros de membrana e incubacin de los mismos sobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.

Hoja de campoMuestraAgua de playa

Lugar de recoleccinPlaya l a angosta, Acapulco, Gro.

fecha

ReceptorSantiago Rueda Celene.

NotaSe tom la muestra de la playa ,

RESULTADOS:

En la determinacin de estafhylococcus fecalis obtuvimos resultados abundantes de colonias que se desarrollaron en el tipo de agar KF por lo cual fue considerada incontables para nosotros debido a que esta bacteria se encontraba en abundancia en la muestra.

Para la determinacin de coliformes totales y fecales donde se utilizo el medio agar EMB los resultados fueron negativos debido a que no se desarrollo ninguna colonia tanto para coliformes totales y fecales.

DISCUSIN DE RESULTADOS:

La muestra analizada fue extrada de la playa la angosta Acapulco, guerrero la cual fue trasladada en frascos estriles para su anlisis. Posteriormente se llevaron a cabo tres filtraciones de 100 ml de muestra, una en la caja con agar KF donde se desarrollaran estafhylococcus fecalis, los resultados fueron colonias masivas con un color amarillo crema y de buen tamao de formacin y en abundancia, debido a esto se consideraron incontables por haber obtenido un crecimiento masivo y esparcido en el filtro membrana, asiendo de esta manera imposible contar las colonias en el estereomicroscipio. En las siguientes filtraciones realizadas donde se utilizo el medio de agar EMB para coliformes totales y fecales, los resultados fueron negativos debido a que no obtuvimos ninguna colonia tanto para coliformes totales como para fecales.

CONCLUSIONESSe determins Streptococcus fecalis en la muestra de agua de playa la angosta Acapulco Gro; lo cual es es indicativo de que existe una contaminacin constante y abundante en esta playa debido a que cualquier microorganismo que es capaz de soportar altas concentraciones de sal como lo es dicha bacteria, solo puede habitar en ella alrededor de 20 minutos para despus pasar a la fase de muerte, es por eso que llegamos a la conclusin de que la fuente de contaminacin que conlleva a esta playa es a menudo constante. En la determinacin de coliformes totales y fecales los resultados fueron negativos para ambos coliformes ,pensando en el tipo de estacin en que nos encontramos (invierno) , las temperaturas podran no ser las adecuadas para el desarrollo de este tipo de bacterias indicadoras de fuentes de contaminacin.

GLOSARIOColiforme:La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua y los alimentos.Clostridios:Bacilos mviles, grampositivos y anaerobios. Crecen en el suelo, las cloacas, sedimentos marinos, vegetacin en descomposicin, productos de animales y vegetales, el tracto gastrointestinal del hombre, otros vertebrados e insectos. La mayora de las especies que viven en el hombre son comensales inofensivos que pueden convertirse en patgenos oportunistas.Esculina:Es un glucsido txico que se encuentra en el fruto del castao de Indias (Aesculushippocastanum) y en el Falso castao de California (Aesculuscalifornica). Los efectos que produce su ingesta son: espasmos, dolor de estmago, diarrea, desorientacin e incluso la muerteEsporognesis, Dentro del ciclo de vida haplo-diplonte, es la parte en la que se producen las microsporas y megasporas. Son producidas por el esporfito, diploide, que por meiosis produce una ttrade de esporas haploides.Fermentacin lctica:Es una ruta metablicaanaerbica que ocurre en el citosol de la clula, en la cual se oxida parcialmente la glucosa para obtener energa y donde el producto de desecho es el cido lctico.Organismos entricosLas bacterias del grupo entrico forman un conjunto de microorganismos muy heterogneo (el contenido de G+C del grupo vara del 40 al 60%) cuya caracterstica comn ms relevante es ser anaerobios facultativos: desarrollan un metabolismo respiratorio en condiciones aerobias y un metabolismo fermentativo en anaerobias. Slo algunos miembros del grupo son capaces de respirar NO3- aunque esta no es una caracterstica general del grupo.

BIBLIOGRAFIALevin, M., yH. W.Schoenlein. 1930Una compilacin demedios de cultivo parael cultivo demicroorganismos.ElWilliams&WilkinsCompany, de Baltimore.

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