Práctica (versión Bouchard M.)
Transcript of Práctica (versión Bouchard M.)
![Page 1: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/1.jpg)
ELISAELISA
Dra Morella BouchardInstituto de Inmunología Clínica
Universidad de Los Andes
![Page 2: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/2.jpg)
ELISAELISAEnzymeEnzyme LinkedLinked ImmunoImmuno SorbentSorbent AssayAssay
Dra Morella BouchardInstituto de Inmunología Clínica
Universidad de Los Andes
![Page 3: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/3.jpg)
Interacción Antígeno AnticuerpoInteracción Antígeno Anticuerpo
![Page 4: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/4.jpg)
Fuerzas que Fuerzas que participan participan
en la en la Interacción Interacción Antígeno Antígeno
AnticuerpoAnticuerpo
Puentes de Hidrógeno
Enlaces Iónicos
Interacciones hidrofóbicas
Fuerzas de van der Waals
Enlaces Iónicos
ANTÍGENO ANTICUERPO
![Page 5: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/5.jpg)
Características del Características del AcAc relacionadas con relacionadas con el reconocimiento del el reconocimiento del AgAg
EspecificidadDiversidadAfinidad y Avidez
![Page 6: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/6.jpg)
RESPUESTA HUMORALRESPUESTA HUMORAL
![Page 7: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/7.jpg)
ELISAELISA• Descrita por Engvall y Perlman en 1971
• Uno de los inmunorreactivos se absorbe a una fase sólida y el otro se marca con una enzima.
• La enzima reacciona con un sustrato formando un producto coloreado
![Page 8: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/8.jpg)
Ventajas del ELISAVentajas del ELISAMuy sensibleGran número de muestras procesadas simultáneamente. Resultados rápidosUtilización de reactivos menos tóxicosMenor costoCuantificación de sustancias diversas: hormonas metabolitos toxinasfármacos mediadores de inflamación proteínascitoquinas agentes infecciosos, etc.
![Page 9: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/9.jpg)
Fundamento del ELISAFundamento del ELISA
Ag o Acfijado a
una fase sólida
Ag o Acen la
muestra
Conjugado:Ac unido a
ENZIMASUSTRATO
CAMBIO DE
COLOR
+ + +
![Page 10: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/10.jpg)
Componentes del ELISAComponentes del ELISA
FASE SÓLIDAAntígeno o AnticuerpoConjugado: ENZIMASUSTRATO
![Page 11: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/11.jpg)
SOPORTE SÓLIDOSOPORTE SÓLIDOMaterial del SoporteMaterial del Soporte Formas disponiblesFormas disponibles UniónUnión
Nitrocelulosa Membranas,Láminas
No covalente
Polivinilo Placas, Láminas Covalente
Poliestireno Placas, Láminas, Perlas
Covalente
Látex, nylon, celulosa y sefarosa
Membranas, Láminas, Perlas
Covalente
![Page 12: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/12.jpg)
ANTÍGENOANTÍGENO
CompletoExtracto totalFracción PurificadaPéptido sintético
Proteína recombinante
![Page 13: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/13.jpg)
Anticuerpos Anticuerpos PoliclonalesPoliclonalesHeterogéneosReconocen epítopes diferentes del AgProducidos por numerosos clones de Linfocitos B
Anticuerpos Anticuerpos MonoclonalesMonoclonales
HomogéneosEspecificidad únicaProducidos por un único clon de Linfocitos B
![Page 14: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/14.jpg)
BLOQUEOBLOQUEOBuffer de Buffer de bloqueobloqueo
ComposiciónComposición DesventajasDesventajas
Caseína 5% p/v leche sin grasaDeteriora rápidamente.Enmascara algunos antígenos
Caseína/Tween20 5% p/v leche sin grasa, O,2 %de Tween20
Deteriora rápidamente.Enmascara algunos antígenos
Tween 20 O,2 %de Tween Podría generar algunos residuos
Gelatina Gelatina 0.2% (2mg/ml)
BSA 3% de BSA, Relativamente costoso
![Page 15: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/15.jpg)
MUESTRAMUESTRA
Orina
LCRHecesOtros
Suero
Saliva
![Page 16: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/16.jpg)
ENZIMASENZIMAS
PeroxidasaFosfatasa alcalinaβ-galactosidasaPenicilinasaUreasaGlucosa oxidasa
![Page 17: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/17.jpg)
SUSTRATOSSUSTRATOS
Requerimientos del sustratoSolubles en aguaSolubles en aguaFácil de manipularFácil de manipularNo tóxicos, no mutagénicosNo tóxicos, no mutagénicosBajo costoBajo costo
![Page 18: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/18.jpg)
FosfatasaAlcalina
Peroxidasa
ρ-Nitrofenil Fosfato (ρNPP)
5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato /nitro azul de tetrazolium (BCIP / NBT)
Naftol AS-TR posfato /fast red RC
2,2´-azino-bis (3-etilbenziazoline-6-ácido sulfónico)
ο-fenilendiamino (OPD)
3,3´5,5´-tetrametilbencidina base o Dihidrocloruro (TMB)
3,3´-Diaminobencidina (DAB)
3-amino-9-Etilcarbazole (AEC)
4-cloro-1-Naftol (4C1N)
Púrpura
Amarillo
Verde
Naranja
Azul
Marrón
Rojo
Azul
Formación de colores por la acción Formación de colores por la acción enzimáticaenzimáticasobre diferentes cromógenossobre diferentes cromógenos
Rojo
![Page 19: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/19.jpg)
LavadosLavadosUtilizados para separar los componentes
unidos de los libres
Generalmente:
De 3 a 6 lavados por cada etapa
Duración de 30 seg a 1 min c/u
Se utiliza Buffer fosfato 0.01 a pH 7,2
![Page 20: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/20.jpg)
Revelación de la actividad Revelación de la actividad enzimáticaenzimática
Incorporación de ácidos o bases fuertes para detener la reacción
La cantidad de producto enzimático formado se determina leyendo la densidad óptica (DO) con un espectrofotómetro
![Page 21: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/21.jpg)
FASES DEL ELISAFASES DEL ELISA1. Titulación de la cantidad de Ag o Ac a utilizar para
sensibilizar la placa.2. Sensibilización3. Lavado 4. Bloqueo5. Lavado6. Incubación de las placas con las muestras y controles
positivos y negativos7. Lavado 8. Incubación del conjugado 9. Lavado 10.Incubación del sustrato 11.Detenimiento de la reacción enzimática12.Lectura de las placas
![Page 22: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/22.jpg)
TIPOS DE ELISATIPOS DE ELISA
DIRECTO
INDIRECTO
COMPETITIVO
TIPO SANDWICH
MÉTODO AVIDINA-BIOTINA
![Page 23: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/23.jpg)
E E E E E E
S S S S S S
E E E E E E
E
S
AntígenoAntígenoBuffer de bloqueoBuffer de bloqueoAnticuerpoAnticuerpo
SustratoSustrato
ELISA INDIRECTOELISA INDIRECTO
Conjugado AnticuerpoConjugado Anticuerpo--EnzimaEnzima
![Page 24: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/24.jpg)
S
ELISA SANDWICHELISA SANDWICH
Anticuerpo fijado al
pozo
![Page 25: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/25.jpg)
S
ELISA SANDWICH
lavado
Anticuerpo fijado al
pozo
Adición de la muestra
con Antígeno a ser medido
![Page 26: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/26.jpg)
S
ELISA SANDWICH
lavado lavado
Anticuerpo fijado al
pozo
Adición de la muestra
con Antígeno a ser medido
Adición del conjugado
enzima-Anticuerpo secundario
E EE
![Page 27: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/27.jpg)
S
E EE
S
ELISA SANDWICH
lavado lavadolavado
Anticuerpo fijado al
pozo
Adición de la muestra
con Antígeno a ser medido
Adición del conjugado
enzima-Anticuerpo secundario
Adición del sustrato y medición del color
E EE
![Page 28: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/28.jpg)
S
E EE
S
ELISA SANDWICH
lavado lavadolavado
Anticuerpo fijado al
pozo
Adición de la muestra
con Antígeno a ser medido
Adición del conjugado
enzima-Anticuerpo secundario
Adición del sustrato y medición del color
E EE
![Page 29: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/29.jpg)
INTERPRETACIÓN INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSDE RESULTADOS
![Page 30: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/30.jpg)
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSINTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Incluir controles:Control del PBS (blanco)Control NegativoControl Positivo BajoControl Positivo Alto
![Page 31: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/31.jpg)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 1/64 AB 1/256 BC 1/1024 CD 1/4096 DE 1/64 EF 1/256 FG 1/1024 GH 1/4096 H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Con
trol
ne
gativ
oC
ontr
ol
posi
tivo
B L
A N
C O
S
Paciente 1 2 3 4 5 876 9 10
19 2011 12 13 14 15 16 17 18Paciente
![Page 32: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/32.jpg)
REPORTE DE RESULTADOSREPORTE DE RESULTADOS
REPORTE CUALITATIVOPositivoNegativo
REPORTE CUANTITATIVOng o µg/ mlUnidades internacionales de ELISA (EIU)
![Page 33: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/33.jpg)
REPORTE DE RESULTADOSREPORTE DE RESULTADOS
Pruebas cuantitativas:Empleo de controles negativos, positivos bajos y positivos altos para construir curva de calibración.
![Page 34: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/34.jpg)
REPORTE DE RESULTADOSREPORTE DE RESULTADOS
Valor mínimo positivo
Promedio de los
Controles Negativos
2 ó 3 Desviaciones
estándar= x
Semicuantitativa
![Page 35: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/35.jpg)
PRUEBAS QUE SE REALIZAN CON LA PRUEBAS QUE SE REALIZAN CON LA TÉCNICA DE ELISA EN EL IDICTÉCNICA DE ELISA EN EL IDIC
ANTICUERPOS CONTRA AGENTES INFECCIOSOSToxoplasma Cisticerco AmibasCMV Hepatitis A-B-C Helycobacter pyloriEpstein Barr Rubeola HIV
ANTÍGENOS TUMORALESACE CA125APS AFP
AUTOANTICUERPOSANA FRAnticuerpos antitiroideos Anticardiolipinas
PROTEÍNAS PLASMÁTICASPCR
![Page 36: Práctica (versión Bouchard M.)](https://reader034.fdocuments.net/reader034/viewer/2022051303/58a047611a28ab5c588b97e4/html5/thumbnails/36.jpg)
GRACIASGRACIAS