RESPIRACIÓN EN MITOCONDRIA AISLADA

INTRODUCCIÓN

Los procesos fundamentales utilizados por los seres vivos para producir energía son la glucólisis, la fosforilación oxidativa y la fotofosforilación. Estos procesos requieren de sistemas multienzimáticos coordinados eficientemente, las células eucariontes llevan a cabo estos procesos en organelos especializados, en las mitocondrias ocurre la fosforilación oxidativa y en los cloroplastos es donde ocurre la fotofosforilación. Las células procariontes disponen de estos sistemas enzimáticos integrados a la membrana plasmática. La fosforilación oxidativa y la fotofosforilación están conformadas en complejos enzimáticos localizados en la membrana de la mitocondria y cloroplasto.

En las membranas de mitocondrias y cloroplastos así como en la membrana plasmática de los procariontes, se lleva a cabo el proceso de transducción de energía, de manera que se acopla la energía derivada del transporte de electrones desde el

NADH hasta el O2 en la respiración y del H2O hasta el NADP+ en la fotosíntesis, a la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP).

En el metabolismo de carbohidratos, como en el caso de la glucosa, la oxidación se inicia en el citoplasma con la conversión de ésta en dos moléculas de ácido pirúvico, la energía liberada de esta reacción es destinada a la fosforilación de dos moléculas de ADP generando dos de ATP. Los piruvatos contienen aún suficiente energía para producir más moléculas de ATP, por lo cual, el piruvato es convertido en Acetil-CoA en la mitocondria, para ser oxidado posteriormente hasta CO2 y H2O (Alberts et al, 2006).

En la matriz mitocondrial la Acetil-CoA, se condensa con una molécula de cuatro carbonos, el oxalacetato, para producir el ácido cítrico de 6 carbonos, el cual sufre una serie de transformaciones donde se eliminan 2 carbonos en forma de CO2, hasta

regenerar el oxalacetato que reinicia el ciclo llamado ciclo de los ácidos tricarboxílicos o Ciclo de Krebs. Al final se generan 3 moléculas de NADH y una de FADH2, los cuales donan sus electrones a los intermediarios de la cadena transportadora, que se encuentran incluidos en la membrana interna de la mitocondria (Hinkle y McCarty, 1978).

Los transportadores de electrones están organizados a favor de un gradiente de energía, de tal forma que los electrones pasan de un intermediario con más energía a uno con menos energía. En tres pasos de la cadena, se libera suficiente energía para sintetizar una molécula de ATP, de manera que por cada molécula de NADH que dona su par electrónico, se producen tres moléculas de ATP o dos moléculas de ATP por cada FADH2.

El flujo lineal de electrones en la cadena transportadora, produce un transporte de protones desde la matriz mitocondrial hacia fuera de la membrana mitocondrial,

28

generando una diferencia de potencial electroquímico; el cual es utilizado como fuerza motriz para la síntesis de ATP en la ATP sintetasa, según lo propuesto en la teoría quimiosmótica de Mitchell (Voet y Voet, 2006).

El transporte electrónico puede ser evaluado mediante la cuantificación del oxígeno consumido por células o mitocondrias aisladas, utilizando un método polarográfico. La figura 5.1 muestra un trazo experimental obtenido al registrar los datos del electrodo de oxígeno. Como se observa la velocidad de consumo de oxígeno por las mitocondrias es lenta hasta que se añade ADP, entonces el oxígeno se consume rápidamente hasta que todo el ADP ha sido fosforilado, y en este punto, la velocidad del consumo de oxígeno disminuye nuevamente. El consumo rápido de oxígeno en presencia de ADP fue denominado estado 3 por Chance y Williams y la etapa en la cual el ADP ha sido agotado, se ha llamado estado 4. La relación de la velocidad de consumo del estado 3 sobre el estado 4 se denomina relación de control respiratorio (RCR) y proporciona una medida de la integridad de las mitocondrias y su capacidad de acoplamiento. Una relación de 1 ocurre en mitocondrias no acopladas, relaciones de 3 a 6 son habituales con el malato o el glutamato como substrato para mitocondrias de hígado de rata (Pon y Schon, 2007). La figura 5.1 también muestra como la Oligomicina inhibe el consumo de oxígeno, sin embargo, esto puede evitarse por la adición de un desacoplante como el FCCP (Carbonil cianuro tricloro fenil hidrazona), entonces el consumo de oxígeno no es controlado y solo cesa cuando el sistema llega a ser anaeróbico (Leister y Herrmann, 2007).

Figura 5.1. Resultados típicos de la respiración mitocondrial obtenidos con el electrodo de oxígeno.

29

OBJETIVOS

Registrar el consumo de oxígeno en una muestra de mitocondrias aisladas.

Determinar los principales parámetros respiratorios.

Material Reactivos3 pipetas de 5 mL10 tubos de vidrio de 10 mL4 tubos de centrífuga (50 mL)1 espectrofotómetro1 centrífuga refrigerada1 piseta con agua destilada1 oxímetro.

Medio de Reacción * Cianuro de potasio (KCN) 1 mMADP 24 mM Succinato 200 mMReactivo de BradfordAlbúmina Sérica de Bovino (BSA) 100 μg/mLCCCP 500 M en etanol de 96o (carbonilcianuro m-clorofenilhidrazona).

* El medio de reacción para mitocondrias aisladas de células animales es: sacarosa 250 mM, KH2PO4 10 mM, MgCl2 5 mM, KCl 10 mM ajustado con Trizma a pH 7.2.

* El medio de reacción para mitocondrias aisladas de células vegetales es: manitol 0.3M, Cloruro de Potasio (KCl) 10mM, Fosfato Monobásico de Potasio (KH2PO4) 10 mM, Cloruro de Magnesio (MgCl2) 5 mM, pH 7.2 ajustado con KOH.

MÉTODO

A) Calibración del oxígrafo y registro de la actividad respiratoria.

1. Encienda el interruptor principal del equipo (Oxímetro YSI, INCORPORATED, modelo 5300). Agregue 1 mL de agua a la celda del oxígrafo que deberá estar en agitación. Espere 2 minutos para que la temperatura se estabilice a 30°C.

2. Coloque la perilla (A) en posición AIR. Espere a que marque 100%. Ajuste a 100% con la perilla de calibración (B). Si no puede ajustarse a 100% es posible que la membrana del electrodo esté rota o seca y deberá cambiarla.

3. Revise y ajuste la concentración de oxígeno agregando unos cuantos cristales de ditionita. La ditionita consume el oxígeno disuelto en el agua, lo cual debe coincidir con la lectura en el panel de control del oxímetro.

30

4. Retire de inmediato esta solución, lave varias veces la celda con agua destilada. La ditionita causa corrosión en el electrodo de oxígeno.

5. Encienda el graficador y ajústelo a las siguientes condiciones: Output 1 Volt, Chart Speed 1cm/min, Zero: perilla en posición STBY.

6. Agregue 0.6 mL de medio de reacción en la celda del oxígrafo.

7. Calibre el oxígrafo a 100% con la perilla (A) AIR y al mismo tiempo ajuste la plumilla del graficador en la escala máxima colocando la perilla Zero en posición “REC” y recorriendo la plumilla con la perilla izquierda del mismo panel, de tal manera de que el valor del 100% de oxígeno del aire en el “display” del oxígrafo corresponda a la escala máxima del papel en el graficador (extremo superior izquierdo). Si el graficador tiene escalas de expansión, el valor seleccionado dependerá de la magnitud en la liberación o consumo de O2 de la muestra. De igual manera, la velocidad de movimiento del papel dependerá de la rapidez en la liberación o consumo de O2.

8. Una vez ajustado el oxímetro realice el registro de consumo de oxigeno según lo indicado en la figura 5.2, agregando 0.1 mL de la suspensión de mitocondrias y 0.3 mL de succinato 200 Mm en la cámara. Recuerde que para el cálculo correcto de la P/O y RCR se necesita de dos estados 4, después de la primera adición del ADP. Es importante dejar una extensión buena de estos estados 4, esto con el fin de poder trazar correctamente la pendiente de donde se origina el cálculo de la relación RCR.

31

Figura 5.2. Representación de los registros de consumo de oxigeno durante la respiración mitocondrial.

B) Cuantificación de proteína mitocondrial.

1. Prepare 7 tubos como se indica en lasiguiente tabla.

TUBO Reactivos (mL) 1 2 3 4 5 6 7Bradford 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5BSA(100 μg/mL) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0Agua Destilada 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.5Suspensión de mitocondrias

0 0 0 0 0 0 0.01

32

2. Mezcle perfectamente el contenido de los tubos y mida su absorbancia a 595 nm, utilizando el contenido del tubo 1 como blanco de reactivos.

3. Construya una curva patrón con los datos obtenidos (absorbancia vs concentración), calcule la pendiente más probable y utilice este dato para calcular la concentración de la muestra problema de acuerdo con la absorbancia registrada.

4. Lave los tubos y la cubeta con etanol al 70% al terminar las mediciones y después enjuáguelos perfectamente con agua destilada.

C) Cálculos de parámetros respiratorios.

1. Con el propósito de familiarizarse con los cálculos respiratorios durante la sesión de laboratorio calcule los parámetros respiratorios que se le piden en la sección de resultados en base al trazo experimental de la figura 5.3. Verifique sus cálculos con el profesor.

2. Si se efectúa el registro en un graficador, el cálculo de la pendiente en el consumo de oxígeno será la medida de la velocidad. Las unidades en que debe expresarse el consumo de oxígeno deberán ser nanomoles de Oxígeno/mg proteína mitocondiral x hora. considerando que 1 mL de H2O a 30 oC contienen 230 nanomoles de oxígeno disueltos.

3. En base a sus resultados calcule el "Control Respiratorio" (RCR) expresado en nmoles de O2 consumido/mg de proteína mitocondrial X hora y calcule también la cantidad de ADP fosforilado a ATP en relación a la cantidad de oxígeno consumido, o lo que se conoce como la "Relación P/O", expresado en nmoles de ADP fosforilado / nanoátomos O2 gastado.

33

34

Figura 5.3. Trazo experimental de la actividad respiratoria en mitocondrias de hígado de rata.

35

BIBLIOGRAFÍA

Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts y Walter. 2006. Introducción a la Biología Celular. 2ª Ed. Editorial Médica Panamericana. España.

González Moreno S. y Peñalosa Castro I. 2000. Biomoléculas: Métodos de análisis. Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Estudios Superiores Iztacala. Tlalnepantla, Estado de México.

González Moreno S., Perales Vela, H., Salcedo Alvarez, M. 2010. Biología Celular y Bioquímica. Proyectos experimentales acerca del metabolismo. Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Estudios Profesionales Iztacala. Tlalnepantla, Estado de México.

Hinkle PC y McCarty RE. 1978. How cell make ATP. Scientific American. 238:104-123.

Leister D and Herrmann JM. 2007. Mitochondria, practical protocols. Humana Press Inc. USA.

Pon LA and Schon EA. 2007. Mitochondria. Elsevier. USA

Voet D y Voet JG. 2006. Bioquímica. 3a ed. Editorial Médica Panamericana. Argentina.

36