Universidad Autónoma de Coahuila

Facultad de Ciencias Químicas

Análisis Bromatológicos

Cromatografía de Intercambio Iónico

Equipo Uno

Saltillo, Coahuila Octubre de 2013

Introducción

La Cromatografía de Intercambio Iónico es la adsorción reversible de moléculas cargadas a grupos iónicos inmovilizados en una matriz de una carga opuesta. La separación puede lograrse mediante adsorción selectiva y la liberación de las muestras de la matriz. El intercambio de iones se inicia con la calibración del intercambiador utilizando pH, y fuerza iónica. Durante el equilibrado de los grupos intercambiables se asocian con iones contrarios.

Una vez que se alcanza el equilibrio y la muestra añadido las moléculas se someten a la suma y la adsorción con una carga adecuada desplazan los iones contrarios y se unen reversiblemente a la matriz. Los materiales no consolidados pasarán a través de la columna con el volumen vacío. En la tercera etapa, las sustancias se eliminan de la columna mediante el aumento de la fuerza iónica del tampón de elución1.

- Medios de Intercambio Iónicos

Los Medios de Intercambio iónicos son una matriz insoluble con grupos de carga unidos covalentemente. Intercambiadores de carga negativa se unen iones cargados positivamente (cationes). Intercambiadores unen un tipo de catión, pero, cuando se presenta con un segundo tipo de catión, se puede desplazar, y / o intercambio con, la primera. Estas resinas se denominan resinas de intercambio catiónico. Las resinas de intercambio de aniones tienen carga positiva y se unen y / o canje iones cargados negativamente (aniones).

Varios grupos de la cadena lateral de los residuos de aminoácidos en las proteínas son ionizables (por ejemplo, lisina o ácido glutámico) como son el N-terminal de amino y grupos carboxilo C-terminal de las proteínas y moléculas de modo se pagan. Esta característica se puede utilizar para separar las diferentes proteínas por cromatografía de intercambio iónico1.

- Tipos de Intercambiadores

Dos intercambiadores débiles se pueden utilizar para la separación de proteínas son carboximetilcelulosa (CM-celulosa) y dietilaminoetil-celulosa (DEAE-celulosa). Estos covalentemente entrecruzados agarosa cuentas celulosas de iones se han modificado químicamente.

CM-celulosa tiene un grupo funcional-carboximetil CH2OCH2COOH. A pH neutro el grupo carboximetilo es ionizado como-CH2OCH2COO ¯ modo que CM-celulosa está cargado negativamente, por lo que es un intercambiador de cationes débil. DEAE-celulosa contiene un grupo dietilaminoetilo. Se está cargado positivamente a pH neutro y por lo DEAE-celulosa es un intercambiador aniónico débil.

Los tipos de Sepharose son particularmente útiles para la separación de proteínas de alto peso molecular. En la práctica, ya que estas matrices son muy similares a los utilizados para la filtración en gel algún tamizado molecular puede acompañar el proceso de intercambio iónico.

Esto puede aumentar o reducir la eficacia del fraccionamiento en comparación con el uso de una

celulosa de intercambio iónico1.

Tabla 1. Parámetros reglamentarios para uso del Cromatógrafo.

Tabla 2. Parámetros utilizados en el proceso de cromatografía.

Material y Reactivos

Equipos Material Reactivos

Cromatógrafo Dionex Jeringa 5 ml Solución de Glucosa

PAD Loop 100 µl Eluente CH3COONa/NaOH

Agua MilliQ

Metodología

En la tabla 1 se muestran algunos parámetros reglamentarios en el laboratorio para el uso del

cromatógrafo.

Después se procede a la limpieza de la muestra, eliminando impurezas que puede haber, usando

procesos de filtración y microfiltración.

Se programa el cromatógrafo para que limpie los tubos y loop que se utilizara. Terminado se

procede a inyectar la muestra en el loop de µl con la jeringa.

Colocar la columna y adicionar al sistema el eluente utilizado 150 mM Acetato de Sodio y 100 mM

de Hidróxido de Sodio.

En el aparato se programan algunos parámetros (Tabla 2) para el tratamiento que se le da a la

muestra. Colocamos los tubos de ensaye que recuperarán la muestra ya fraccionada.

Fecha 29 de Octubre de 2013

Analista Gpo. Análisis Bromatológicos

Departamento Alimentos

Cromatografía De intercambio Iónico

Columna CarboPak PA-1

Eluente Acetato de Sodio; Hidróxido de Sodio

Muestra Glucosa

Presión 1400 mPs

Flujo 1 ml/min

Vol. Equilibrio 1 ml

Vol. Inyección 100 µl

Figura 1. Curva de calibrado para Glucosa

Resultados y Discusión

Los resultados obtenidos, fueron únicamente para la obtención de la curva de calibración para

glucosa.

ppm Tiempo de Retención Alturas

10 2.72 267.778

20 2.717 479.598

40 2.717 897.317

80 2.717 1549.747

100 2.724 1648.145

Tabla 3. Valores del muestro en HPLC.

La solución de glucosa era de 1000 ppm, esta fue filtrada para evitar problemas durante el proceso.

Los tiempos de retención fueron muy similares entre las muestras y las alturas obtenidas se

mantuvieron constantes, indicando que efectivamente a mayor ppm mayor altura. Después de su

uso, se le trato al sistema con HCl 1 M para limpiar la columna y el loop.

Estadísticamente la calibración fue exitosa, ya que presenta un R2 de 0.97, considerado como un

valor razonablemente correcto. Lo cual nos permite utilizarla para el análisis de glucosa de alguna

muestra.

y = 15.805x + 178.29R² = 0.9764

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 20 40 60 80 100 120

Alt

ura

s

ppm

Conclusiones

La cromatografía de intercambio iónico resulta ser una técnica muy recomendable para la separación de compuestos, que teniendo un mismo peso molecular, aprovecha otras propiedades de las moléculas a estudiar – en este caso, carbohidratos – como es su carga eléctrica. En este caso la muestra era una azúcar y un compuesto básico y por ende fue fácil separarles.

Los pulsos amperométricos también facilitan la identificación y separan carbohidratos de índole monosacárido y disacárido, aunque este no funcionará si se utiliza en la discriminación de polisacáridos muy ramificados.

Referencias

1. Himmelhoch, SR (1971) Chromatography of proteins on ion-exchange adsorbents. Meth. Enzymol. 22:273-286. Peterson, EA, Sober, HA (1956) Chromatography of proteins. 1. Cellulose ion-exchange adsorbents. J. Am. Chem. Soc. 78:751-758. Scopes, RK (1982) Ion exchangers-principles, properties and uses. In “Protein Purification: Principles and Practice”, pp75-101. Springer-Verlag, New York.