Iontové zdroje

Příprava předmětu byla podpořenaprojektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Elektronová ionizace (Electron ionization, Electron Impact, EI)

• Dempster, Bleakney, Nier

• Látka je v plynném stavu a v tomto stavu je ionizována, velmi vhodné pro spojení s GC

• Kapalné vzorky jsou odpařeny pro získání plynné fáze

• EI se používá pro látky s bodem varu do 500°C a molekulovou hmotností do ~ 1000 Da, tlak v iontové zdroji je kolem 10-3 Pa

• Elektrony jsou emitovány z vyhřívaného wolframového nebo rheniového vlákna - filamentu a urychlovány definovaným potenciálem (~obvykle 70V), který je mezi vláknem a anodou

• Energie elektronů zhruba odpovídá vlnové délce srovnatelné s délkou vazby v organických látkách:

mv

h=λ

20eV kinetické energie elektronu odpovídá 2,7Å a 70eV 1,4Å

a pro magnetický sektor 10 000 V

Závislost počtu vytvořených iontů na energii elektronů,široké maximum v oblasti 70 eV

• Pohyb elektronů je kolmý na směr letu molekul analytu, dochází k předáníkinetické energie elektronů molekulám analytu

• Pro dosažení ionizace ovšem postačuje energie asi 10eV, zbývající energie způsobuje rozsahlou fragmentaci vzniklého iontu

• Primární reakce:

Vzniká tzv. molekulový ion, jedná se přesně řečeno o ion-radikál

-- e2MeM +→+ +•

Energie elektronů vede k fragmentaci molekulového iontu za vzniku fragmentů

• Energie je často tak velká, že molekulární pík ve spektru je velmi malý a jsou měřitelné jen dceřinné ionty

• Izotopové píky

..

..

Chemická ionizace (Chemical ionization, CI)

• Látka je ionizována v plynném stavu, velmi vhodné pro spojení s GC

• Při této technice ionizace vznikající ionty mají jen malou nadbytečnou energii a fragmentace je podstatně omezena, CI je tedy vhodnou komplementární technikou k EI

• Analyty jsou ionizovány pomocí kolizí s ionty reagenčního plynu, tyto ionty jsou generovány stejně jako v případě EI, tzn. elektrony

• Tlak v reakční ionizační oblasti je ~ 60 Pa (volná střední dráha letu ~ 0,1 mm), v analyzátoru 10-3 Pa, poměr analyt/plyn 1/1000-10000

• Analyt je ionizován především interakcí s ionty reagenčního plynu

• Vznikají pozitivně i negativně nabité ionty: dochází k přenosu protonu, abstrakci hydridu, vzniku aduktů a přenosu náboje => vznikají pseudomolekulární ionty

Přenos protonu

� Jednou z nejčastějších reakcí mezi analytem a ionizovaným pomocným plynemve formě GH+ je přenos protonu na analyt

� Důležitá je afinita analytu k protonům ve srovnání k této afinitě pro pomocný plyn

� Jde o reakci typu kyselina-zásada podle Brönstedovy teorie

� Pokud je afinita analytu k protonům podstatně větší než u pomocného plynu,je přenos protonu velmi pravděpodobný

� Různé reagenční plyny se liší protonovou afinitou (PA), methan (PA=5,7eV),isobutan (PA=8,5eV), amoniak (PA=9,0eV)

� Isobutan a amoniak jsou selektivnější a protonace anayltu je méně exotermická,zatím co v případě mathanu ještě může docházet k fragmentaci, pro isobutana amoniak je fragmetace daleko menší

butyl methacrylate

Vznik adukt ů

� V plasmě při chemické ionizaci mohou všechny ionty tvořit asociáty s polárnímimolekulami

� Proces je většinou spojen se vznikem vodíkových vazeb

� Probíhají reakce typu:

MH+ + M ---> (2M + H)+, M je molekula

F+ + M ---> (F + M)+, F je fragment

� Tyto produkty mohou mít velký diagnostický význam pro identifikaci analytu, určení jeho molekulové hmotnosti, je třeba se vždy pokusit logicky vysvětlit jejichpřítomnost ve spektru

Přenos náboje

� Vzácné plyny, dusík, oxid uhelnatý poskytují reakce:Xe + e- ---> Xe+. +2e-

Xe+. + M ---> M+. +Xe

� Výsledkem je iont-radiál podobně jako při EI ionizaci, ale má nižší energiia dochází k méně rozsáhlé fragmentaci

� Tyto plyny se ale běžně pro CI nepoužívají

Pomocné/reagen ční plyny

Methan

� Při zavedení mathanu do iontového objemu (ion volume) je primární reakce

s elektrony obvyklá, tedy:

CH4 + e- ---> CH4+. + 2e-

Tento iont fragmentuje především následujícími rekacemi:

CH4+. ---> CH3

+ + H.

CH4+. ---> CH2

+. + H2

ale vedle těchto dějů probíhá především reakce s molekulami methanu:

CH4+. + CH4 ---> CH5

+ + CH3.

a

CH3+ + CH4 ---> C2H5

+ + H2

Iont C3H5+ vzniká reakcemi:

CH2+. + CH4 ---> C2H3

+ + H2 + H.

C2H3+ + CH4 ---> C3H5

+ + H2

� Analyty většinou poskytují reakci:

M + CH5+ ---> MH+ + CH4

ale pokud je analyt nasycený uhlovodík RH, je pozorována abstrakce hydridu:

RH + CH5+ ---> R+ + CH4 + H2

kromě toho dochází v případě polárních látek i ke vzniku aduktů:

M + CH3+ ---> (M + CH3)

+

Vznik všech těchto molekulových specií/pseudomolekulárních iontů má

diagnostický význam a může pomoci při určení molekulové hmotnosti

studované molekuly

Isobutan

Většinou dochází k protonaci analytu, ale polátní látky poskytují také aduktys t-butyl iontem, tj. vzniká (M+57)+, a s C3H3

+, tj. vzniká iont (M+39)+

Isobutan je neefektivní pro ionizaci uhlovodík ů

C3H3+

EI CI - methan CI - isobutan

Amoniak

� Ion-radikál vznikající primárním procesem reaguje s molekulou amoniaku:

NH3+. + NH3---> NH4

+ + NH2.

Následně dochází k reakci za vzniku iontu 35:

NH4+ + NH3 ---> (NH4 + NH3)

+

AmoniakAmoniak

V případě tohoto plynu bazické látky a speciálně amniny poskytují

přenos protonu :

RNH2 + NH4+ ---> RNH3

+ + NH3

Polární látky schopné tvořit vodíkové vazby a nemající bazické vlastnosti

tvoří adukty typu (M+1)+ a (M+18)+

Nepolární látky , jako nasysecné uhlovodíky, nejsou efektivn ě ionizovány ,

také aromatické uhlovodíky, ethery a látky dusíkaté odlišné od aminů jsou

jen málo ionizovány

Porovnání CI a EI spekter - alifatický alkohol

CI

EI

Particle Beam, PB

• Vznikl jako LC-MS obdoba GC-MS

• Klasické rozhraní

• V prvním kroku odstranění solventu

• Následně přenos solutu v plynné fázi do iontového zdroje a ionizace elektrony, ionizace chemická nebo FAB

• Klíčové části rozhraní jsou generátor aerosolu, desolvata ční komora, momentový separátor

• Iontový zdroj je vyhříván na několik set °C pro udržení analytu v plynné fázi

• Možnost tvorby knihoven spekter podobně jako v GC/MS s EI a srovnání s databazí

• Jedině PB produkuje EI spektra, velká reprodukovatelnost a bohatá strukturní informace

• Pro látky do molekulové hmotnosti 1 000 Da univerzální detekce

• Citlivost je často podstatně nižší ve srovnání s ES, APCI a technikou

GC-MS, a je v oblasti jednotek ppm

Poskytovaná informace: * informace o struktuře

(fragmentace, EI)

* informace o molekulové hmotnosti

(molekulový iont, CI)

Použití: * malé iontové, polární i nepolární

látky, <1000 Da

Ionizační mody: * EI, CI, FAB

Termosprej (Thermospray, TS)

• Vyvinut pro LC-MS, Blakney a Vestal, 1983, tedy před ES a APCI

• Srdcem je „thermospray vaporizer“

• Skrz vyhřívanou kapiláru proudí mobilní fáze z kolony

• Jemným a přesným nastavením teploty je možno odpařit veškerou kapalinu na konci kapiláry

• Teplota se upravuje podle potřeby velmi jemně v reálném čase

• Odpařená kapalina se nachází v komoře – sprejovací komoře, kde je snížen tlak ( 10 torr)

• Odpařený ionizovaný solut je vnesen do analyzátoru přes kónickou štěrbinu/otvor

• Omezením TS je fakt, že mobilní fáze musí být vodná a musí obsahovat vhodný pufr pro dosažení ionizace analytů

• K dosažení ionizace širší palety látek byl TS doplněn filamentem nebo jiným příslušenstvím, např. corona discharge

• Kompatibilní s průtoky do 1 ml/min

• Poměrně malá spolehlivost a reprodukovatelnost ionizace

• Aplikačně se překrývá s APCI, ale APCI a ES jsou modernější

Poskytovaná informace: * informace o struktuře, při užití

MS/MS

* informace o molekulové hmotnosti

Použití: * malé ionty a polární molekuly

do <2 000 Da

Ionizační mody: * Therospray Ionization TSI

* Filament “on” a discharge CI

* polarita positivní/negativní

Fast Atom/Ion Bombardment (FAB) a CF-FAB (Continuous flow)

• Vzorek musí být rozpuětěn v netěkavé kapalné matrici: glycerol , m-nitrobenzyl alkohol, thioglycerol

• Jedno z nejpřímějších rozhraní mezi LC a MS

• Efluent je zaváděn přímo do oblasti velmi nízkého tlaku přes sondu

při malém průtoku ~ 10 µl/min

• Kapalina se odpařuje přímo v iontovém zdroji, někdy je sonda zahřívána pro zamezení mrznutí a zlepšení odpařovacího procesu

• FAB je desorpční technika k desorpci dochází nárazem rychlých atomů nebo iontů (5-8 KeV pro Xe, Ar, a 30 KeV pro Cs+) na tenkou vrstvu kapaliny na výstupu ze sondy

• Kinetická energie atomů/iontů se přenese na solut a ten je desorbován z povrchu a přenesen do analyzátoru

Probíhá reakce:

Ar(rychlý)+. + Ar(pomalý) ---> Ar(pomalý)

+. + Ar(rychlý)

•Volba matrice je velmi podstatná, ovlivňuje ionizaci

• FAB umožňuje ionizaci polárních látek s poměrně vysokou molekulovou hmotností,

asi do 10 kDa, je tak možno získat spektra poměrně velkých peptidů a nukleotidů

• Spektra lze měřit po relativně dlouhou dobu ve stop-flow režimu a lze provést více

MS experimentů postupně

• FAB spektra obsahují interference na všech m/z, efekt matrice

Ionizace za atmosférického tlaku(Atmospheric pressure ionization, API)

1) Elektrosprej(Electrospray ionization, ESI; Electrospray, ES)

2) Chemická ionizace za atmosférického tlaku(Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI)

3) Fotoionizace za atmosférického tlaku(Atmospheric Pressure Photoionization, APPI)

Elektrosprej (Electrospray, ES) • Tvorba iontů za atmosferického tlaku, vhodné rozhraní pro LC-MS

• Přenos iontů do analyzátoru do oblasti sníženého tlaku přes systém štěrbin

• Kapilárou protéká mobilní fáze, na kapiláře je vložen vysoký elektrický potenciál – několik tisíc voltů (2-6 kV)

• Tvoří se kónický meniskus na konci kapiláry a formuje se sprej nabitých kapiček solventu a analytu

• Probíhá odpařování solventu a tvorba iontů analytu

• Ionty mají často velký náboj, to umožňuje měřit vysokomolekulární látky až MDa

• Velký vliv mobilní fáze na vznik iontů, nutná optimalizace podmínek ES

• Průtoky mobilní fáze 1-10 µl/min, ale běžná modifikace pro vysoké průtoky do 1 ml/min

• ESI není univerzální iontový zdroj, nepolární látky nepodléhají ionizaci

• Vznikají p ředevším ionty typu [M+H] +, [M+Na]+, [M+K] + v pozitivním modu a ionty typu [M-H] - negativním modu

ES Iontový zdroj fy Waters(instument Q-Tof-micro)

Výpočet molekulové hmotnosti polypeptidu/proteinuz ESI+ spektra

z1m1 = M + z1mp

z1 je náboj iontu ve spektru s hodnotou m/z odpovídající m1,

M je molekulová hmotnost polypeptidu a mp je hmotnost protonu

Sousední iont ve spektru směrem vyšší hodnotě m/z s hodnotou m2,nese z1 – 1 nábojů, takže platí:

m2(z1-1) = M + (z1-1)mp

Takže platí vztahy:

z1 = (m2 - mp)/(m2 – m1)

M = z1(m1 - mp)

Poskytovaná informace: * molekulová hmotnost

* strukturní informace při technice

CID, MS/MS

Použití: * makromolekuly nesoucí náboj

v roztoku

* malé jednou nabité ionty

Ionizační mody: * polarita pozitivní/negativní

Chemická ionizace za atmosferického tlaku (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI)

• Tvorba iontů za atmosferického tlaku

• Rozhraní podobné ES, ale mechanizmus vzniku iontů je jiný

• Mobilní fáze je sprejována do vyhřívané komory (400 °C)

• Mobilní fáze je odpařena a teprve v plynné fázi dojde ke vzniku iontů analytu, zprostředkovaně pomocí elektronů z „discharge needle“

• Dochází k interakci mezi elektrony a zplyněnou mobilní fází a dalšími plyny za vzniku H3O

+(H2O)n iontů

• Následně interagují tyto klastry s analyty a jejich protonaci

• APCI je vhodný pro ionizaci léčiv a řady metabolitů

• Citlivost, robusnost, spolehlivost, menší citlivost vzhledem chemickým interferencím ve srovnání s ES řadí tento proces k velmi používaným v oblasti farmaceutických aplikací

Poskytovaná informace: * molekulová hmotnost < 2000 amu

* strukturní informace při technice

CID, MS/MS

Použití: * ionizovatelné, polární i nepolární

látky

Ionizační mody: * polarita pozitivní/negativní

Fotoionizace za atmosferického tlaku(Atmospheric pressure photoionization, APPI)

• Tvorba iontů za atmosferického tlaku

• Rozhraní podobné APCI

• Mobilní fáze je sprejována do vyhřívané komory (400 °C)

• Mobilní fáze je odpařena a teprve v plynné fázi dojde ke vzniku iontů analytu proudem fotonů s úzce vymezeným ionizačním potenciálem

• Cílem je přednostně ionizovat širokou paletu analytů, ale přitom vyvolat minimální ionizaci rozpouštědla

• APPI je vhodný pro ionizaci podobných látek jako jsou ionizovány APCI, ale APPI je schopna navíc ionizovat i velmi málo polární látky, polyaromáty

aplikací

Rozsah použitelnosti r ůzných ioniza čních technik

Desorpce laserem za spoluú časti matrice(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)

• Měřený vzorek je dispergován v prostředí vhodné matrice, která je primárně ionizována laserem a absorbovaná energie je sekundárně přenesena z matrice na analyt a tím jej ionizuje

• Příprava vzorku většinou spočívá ve smíchání vzorku rozpuštěného v solventu s vhodnou matricí rozpouštěnou také v rozpouštědle, následně je solven odpařen a vzniknou směsné krystaly analytu a matrice

• Mohou se užívat různé lasery, v UV oblasati dusíkový (λ=337nm),

Nd:YAG (λ=266 nebo 355nm), dále v IR oblasti Er:YAG (λ=2.94µm),

CO2 (λ=10.6µm)

• Výběr matrice závisí na použitém laseru a na typu analytu, matrice musí silně absorbovat použitou vlnovou délku, musí snadno sublimovat, nesmí podléhat chemickým reakcím a musí být stabilní za vakua

• Fragmentace nebývá rozsáhlá

• Vznikají především jednou nabité ionty, adukty

• Možnost fragmentace post-source decay (PSD), probíhá v letové trubici analyzátoru

• MALDI obvykle využívá analyzátor typu TOF, MALDI-TOF