1. PENGERTIAN DNA 2.TES DNA

3.ANALISIS HASIL TES DNA4.CONTOH PRAKTIS

PENERAPAN TEKNIK ISOLASI DAN UJI DNA

1. PENGERTIAN DNA

DNA (deoxyribonucleic acid) adalah asamnukleat yang mengandung materi genetik yangberguna perkembangan dan fungsi biologisseluruh organisme hidup. Fungsi utama darimolekul DNA adalah sebagai tempatpenyimpanan informasi jangka panjang. DNAseringkali dianalogkan dengan blue print, karenaDNA mengandung instruksi yang diperlukandalam pembentukan komponen sel sepertiprotein dan molekul RNA. Segmen DNA yangmembawa informasi genetik disebut gen.(6)

STRUKTUR DAN KARAKTERISTIK DNA

DNA berwujud dua rantai polimer panjang (doublehelix) yang terdiri dari komponen gula pentosa(deoksiribosa) dan gugus fosfat yang distabilisasi olehikatan hidrogen antar molekul basa yang terdapat padakedua untai.

Keempat basa DNA adalah Adenin (A), sitosin (C),guanin (G), dan timin (T), yang kemudiandiklasifikasikan menjadi dua tipe, yaitu Purin (pasanganadenin dan guanin yang memiliki struktur cincinganda)dan Pirimidin (pasangan sitosin dan timin yangmempunyai struktur cincin tungal)

Pada organisme eukariotik, sebagian besarDNA berada pada inti sel (kromosom), coreDNA (c-DNA) dan mitokondria DNA (mt-DNA).

c-DNA merupakan materi genetik yangmembawa sifat individu dan diturunkan dariayah dan ibu menurut hukum Mendel.

Sedangkan mt-DNA merupakan materigenetik yang membawa kode genetik dariberbagai enzim dan protein yang berkaitandengan proses pembentukan dan penuaan.

Gambar 1. Struktur Kimia DNA URL

KROMOSOM

Setiap sel dalam tubuh seseorang memilikirangkaian DNA identik. Rangkaian DNA setiapsel disebut kromosom.

Setiap sel dalam tubuh manusia memiliki23 pasang kromosom yang terdiri atas 22pasang kromosom autosomal dan satu pasangkromosom seks (XX pada wanita, dan XY padalaki-laki)

2. TES DNA 1. Pengertian

Tes DNA adalah salah satu teknik biologimolekuler penanda genetik yang dipakaiuntuk pengujian terhadap materi profil DNA,yaitu sehimpunan data yang menggambarkansusunan DNA yang dianggap khas untukindividu yang menjadi sampelnya.

DNA yang biasa digunakan dalam tesadalah c-DNA dan mt-DNA.

2. Tujuan Tes Dna

Tes DNA pada umumnya digunakan untuk2 tujuan yaitu (1) tujuan pribadi sepertipenentuan perwalian anak atau penentuanorang tua dari anak (Tes Paternitas); dan (2)tujuan hukum, yang meliputi masalahforensik, seperti identifikasi korban yang telahhancur maupun untuk pembuktian kasuskejahatan semisal kasus pemerkosaan ataupembunuhan

3. Sampel Dan Penyiapan SampelUntuk Tes Dna

Hampir semua sampel biologis tubuh seperti darahdan bercak darah, seminal, cairan vaginal, dan bercakkering, rambut (baik rambut lengkap dengan akarnya atauhanya batang rambut), epitel bibir (misal pada puntungrokok), sel buccal, tulang, gigi, saliva dengan nukleus (padaamplop, perangko, cangkir), urine, feces, kerokan kuku,jaringan otot, ketombe, sidik jari, atau pada peralatanpribadi dapat digunakan untuk sampel tes DNA, tetapi yangsering digunakan adalah darah, rambut, usapan mulut padapipi bagian dalam (buccal swab), dan kuku.

Untuk kasus-kasus forensik, sampel sperma, daging,tulang, kulit, air liur atau sampel biologis lain yangditemukan di tempat kejadian perkara (TKP) dapatdijadikan sampel tes DNA

Tahap pengambilan dan penyimpanan bahan atau sampel merupakantahapan yang vital, dan harus dilakukan dengan prinsip-prinsip dibawah ini :

• Hindari tempat yang terkontaminasi DNA dengan tidak menyentuh objeksecara langsung dengan tangan, tidak bersin atau batuk di dekat barang bukti.

• Menggunakan sarung tangan bersih untuk pengumpulan barang bukti. Sarungtangan harus diganti untuk setiap penanganan barang bukti yang berbeda

• Setiap barang bukti harus disimpan terpisah.

• Bercak darah, bercak sperma, dan bercak lainnya harus dikeringkan dahulusebelum disimpan.

• Sampel harus disimpan pada amplop atau kertas setelah dikeringkan. Janganmenggunakan bahan plastik karena plastik dapat mempercepat degradasimolekul DNA. Setiap amplop harus ditandai nomor kasus, nomor bukti, waktupengumpulan.

• Bercak pada permukaan meja atau lantai dapat diambil dengan swab kapassteril dan alkohol. Keringkan kapas tersebut sebelum dibawa.

• Di laboratorium, sampel DNA disimpan dalam kulkas bersuhu 4oC atau dalamfreezer bersuhu -20oC. Sampel yang akan digunakan dalam waktu yang lama,dapat disimpan dalam suhu -70oC.

Contoh perlakuan jika kita mengambil sampel Darah dan bercak darah(seperti darah pada pakaian, karpet, tempat tidur, perban

o Darah cair

– Darah cair dari seseorang.

• Ambil dengan menggunakan semprit.

• Masukkan ke dalam tabung yang diberikan pengawet EDTA ± 1 ml darah.

• Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, simpan dalamtermos es, lemari es atau kirim ke laboratorium.

– Darah cair di TKP.

• Ambil dengan menggunakan semprit, pipet atau kain.

• Masukkan ke dalam tabung yang berisikan pengawet EDTA. Bila membeku, ambil dengan menggunakan spaltel.

• Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, simpan di termos es, lemari es, atau kirim ke laboratorium.

– Darah cair dalam air/salju/es.

• Sesegera mungkin, ambil secukupnya, masukkan ke dalam botol.

• Hindari kontaminasi, beri label yang jelas dan tanggal pengambilansampel, simpan atau kirim ke lab.

• Bercak darah basah.– Ditemukan pada pakaian

• Pakaian dengan noda ditempatkan pada permukaan bersih dan keringkan.• Setelah kering, masukkan kantong kertas atau amplop.• Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, kirim ke

laboratorium.– Ditemukan pada benda.

• Bila benda kecil biarkan kering, tetapi pada benda besar, hisap bercaktersebut dengan kain katun dan keringkan.

• Masukkan amplop, beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, dan kirim ke laboratorium.

– Ditemukan pada karpet atau benda yang dapat dipotong.• Potong bagian yang ada nodanya.• Tiap potongan diberi label yang jelas, sertakan potongan yang tidak ada

nodanya sebagai kontrol.• Kirim ke laboratorium.

– Percikan darah kering• Gunakan celotape, tempelkan pada percikan noda.• Masukkan celotape tersebut kedalam kantong plastik.• Beri label yang jelas dan tanggal pengambilan sampel, kirim ke

laboratorium.

4. Teknik Tes Dna

Adapun jenis-jenis teknik analisa DNA adalah sebagai berikut:

1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP).

2. Polymerase Chain Reaction (PCR).

3.Short Tandem Repeats (STRs).

4. Y-Short Tandem Repeats (Y-STRs).

5. Mitochondrial DNA (mt-DNA).

6. CODIS (Combined DNA Index System).

1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP

Teknik pertama yang digunakan analisa DNA dalambidang forensik adalah RFLP. Polimorfisme yangdinamakan Restriction Fragment Leght Polymorphism(RFLP) adalah suatu polimorfisme DNA yang terjadiakibat variasi panjang fragmen DNA setelah dipotongdengan enzim retriksi tertentu menjadi fragmenVariable Number Of Tandem Repeat (VNTR). Teknik inidilakukan dengan memanfaatkan suatu enzim restriksiyang mampu mengenal urutan basa tertentu danmemotong DNA (biasanya 4-6 urutan basa). Urutanbasa tersebut disebut sebagai recognition sequence.

2. Polymerase Chain Reaction (PCR).

Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatumetode untuk memperbanyak DNA template tertentudengan enzim polymerase DNA. Reaksi teknik ini didesainseperti meniru penggandaan atau replikasi DNA yangterjadi dalam makhluk hidup, hanya pada segmen tertentudengan bantuan enzim DNA polymerase sebanyak 20hingga 40 siklus (umumnya 30 siklus), dengan tingkatakurasi yang tinggi. Proses ini berlangsung secara in-vitrodalam tabung reaksi sebesar 200 µl. Walaupun dengansampel DNA yang sedikit atau sudah mulai terdegradasi,PCR mampu menggandakan atau mengkopi DNA templatehingga miliaran kali jumlah semula sehingga dapatdiperoleh informasi.

3.Short Tandem Repeats (STRs).

Metode STRs (Short Tandem Repeats) adalah salahsatu metode analisis yang berdasar pada metodePolymerase Chain Reaction (PCR). STRs (Short TandemRepeat) adalah suatu istilah genetik yang digunakanuntuk menggambarkan urutan DNA pendek (2 – 5pasangan basa) yang diulang. Genome setiap manusiamengandung ratusan STRs. Metode ini paling banyakdikembangkan karena metode ini cepat, otomatis danmemiliki kekuatan diskriminasi yang tinggi. Denganmetode STRs dapat memeriksa sampel DNA yang rusakatau dibawah standar karena ukuran fragmen DNAyang diperbanyak oleh PCR hanya berkisar antara 200 –500 pasangan basa.

4. Y-Short Tandem Repeats (Y-STRs).

Y-STRs adalah STRs yang ditemukan padakromosom Y. Y-STRs dapat diperiksamenggunakan jumlah sampel kecil dan rusakdengan metode dan alat yang sama denganpemeriksaan STRs pada kromosomautosomal. Karena kromosom Y hanyaterdapat pada pria maka Y- STRs dapatberguna untuk menyaring informasi genetikyang spesifik dari pria yang yang menjadisampel

5. Mitochondrial DNA (mt-DNA).

Aplikasi penggunaan mt-DNA dalamidentifikasi forensik dimulai pada tahun 1990.Mitokondria adalah partikel intraselular yangterdapat di luar nukleus dalam sitoplasma sel.Mitokondria mengandung DNA kecil berupamolekul berbentuk sirkular yang terdiri dari16569 pasangan basa yang dapatdiidentifikasi. Setiap sel mengandung 100 –1000 mitokondria

6. CODIS (Combined DNA Index System).

CODIS merupakan analisis DNA yang barudikembangkan FBI. FBI memilih 13 STR yangdigunakan sebagai deretan lokus utama standardan meningkatkan pengembangan kemampuanlaboraturium untuk melakukan pemeriksaan padalokus tersebut. Laboratorium di seluruh duniamenggunakan lokus yang sama. Pengumpulan 13lokus utama meningkatkan kemampuandiskriminasi. Kemungkinan ditemukan kecocokanantara dua orang yang tidak berhubunganberdasarkan random di Caucasian Amerikaadalah satu diantara 575 trilyun

3. ANALISIS HASIL TES DNA

Analisis DNA untuk tes paternitas meliputibeberapa tahap yaitu tahap pengambilan spesimen,tahap proses laboraturium, tahap perhitungan statistikdan pengambilan kesimpulan. Untuk metode tes DNAdi Indonesia, masih memanfaatkan metodeelektroforesis DNA. Intrepretasi hasilnya adalah dengancara menganalisa pola DNA menggunakan marka STR(short tandem repeats). STR adalah lokus DNA yangtersusun atas pengulangan 2-6 basa. Dalam genommanusia dapat ditemukan pengulangan basa yangbervariasi jumlah dan jenisnya. Dengan menganalisaSTR ini, maka DNA tersebut dapat diprofilkan dandibandingkan dengan sampel DNA terduga lainnya

4.CONTOH PRAKTIS PENERAPAN TEKNIK ISOLASI DAN UJI DNA

1. PENYIAPAN SAMPEL DAN ISOLASI DNASeperti yang telah disebutkan sebelumnya, sampel

untuk analisis DNA dapat diperoleh dari berbagai jaringan,seperti bagian daging (otot), tulang, gigi, darah, sperma,saliva, rambut dan sebagainya. Setiap jenis sampel yangberbeda mempunyai teknik penyiapan sampel yangberbeda dan teknik isolasi DNA yang berbeda pula.Jumlah sampel yang umumnya terbatas, tidak menjadikendala, karena jumlah DNA akan digandakan sebelumproses analisis dan kuantifikasinya. Dengan kondisi ini,maka prosedur isolasi DNA dianggap selesai mketika DNAtelah terekstrak dan dimurnikan serta siap untuk prosespenggandaan (melalui PCR).

Salah satu contohnya :

Pada TulangIsolasi DNA untuk tulang dilakukan melalui beberapa tahapan:• Pertama, hancurkan tulang sampai berupa bubukan halus dan mesin bor

dengan kecepatan tertentu sehingga diperoleh bubukan tulang berukuran 100 µm. Dekalsifikasi 1 gr bubuk tulang dengan 10 ml EDTA 0,5 M (pH 7,5), selanjutnya divorteks, diinkubasi pada suhu 56 oC dalam alat ultrasonik selama 2 jam. Proses tersebut dipantau dengan menambahkan larutan amonium oksalat pH 3.0 jenuh dan proses dihentikan setelah larutan jernih.

• Kedua, DNA diisolasi dari tulang yang didekalsifikasi menggunakan 4 metode, yaitu metode Maxim (Silika/guanidium tiosianat), peranti DNAZol, piranti Ready AMP, dan ekstraksi menggunakan garam dapur NaCl.

• DNA yang dihasilkan diukur menggunakan piranti DNA DipStick. • Dan ketiga, dilakukan visualisasi DNA pada gel agarosa konvensional

menggunakan metode pengecatan perak dan perancangan primer menggunakan perangkat lunak pangkalan data (database) the Human Genebank dengan sekuen: 5-CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3 (Indrasex1) dan 5-TAAAGAGA-TTCATTAACTTGACTG-3 (Indrasex2) yang dapat menghasilkan produk PCR X-spesifik dan Y-spesifik menggunakan gel agarosa biasa.

• DNA siap digunakan.

Pada Rambut

Umumnya Dipergunakan Dua Metode, Yaitu Isolasi DNA DariRambut Dan Protokol Dr. Glowatzki (Dr. Glowatzki’s Protocol)

a. Isolasi DNA Sampel Rambut.

– Potong 10 – 15 helai akar rambut sepanjang 0,5 cmkedalam 1,5 ml tabung eppendorf

– Tambahkan 50 µl 200mM NaOH solusi.

– Panaskan tabung menggunakan bak air bersuhu 940C selama 10 menit.

– Lalu dinginkan dalam suhu ruangan dan tambahkan50 µl solusi yang terdiri dari 200 mM HCL dan 200mM Tris-HCL pH 8,5.

– DNA siap untuk digunakan

b. Isolasi DNA dengan Dr. Glowatzki’s protocol– Potong 5-10 akar rambut sekitar 0,5 cm ke dalam tabung

eppendorf.– Gunakan 50 µl larutan di bawah ini sebagai buffer lisis :

• 10 mM Tris pH 8,3,• 50 mM KCl,• 0,5% Tween.

– Tambahkan juga 10 µl larutan 20 µg/ml Proteinase K dalam 10mM Tris-HCl (pH 7,5)

– Sentrifus selama 30 detik.– Ultrasentrifus pada 13000 rpm selama 1 detik– Inkubasi selama satu malam dalam air hangat bersuhu 560 – 600

C.– Inkubasi kembali selama 10 menit pada suhu 940 C (bertujuan

untuk mendenaturasi proteinase K).– Dinginkan dalam suhu ruangan.– Ultrasentrifus pada kecepatan 13000 rpm selama 1 detik– DNA siap untuk dilakukan PCR

2. ANALISIS DNA

yang paling umum digunakan dalam analisisDNA adalah metode pemisahan fraksi proteinberdasarkan berta molekulnya, yakni denganmetode Elektroforesis, khususnya Elektroforesisdengan gel Agarose. Teknik ini dilakukanberdasarkan fakta bahwa DNA merupakansenyawa bermuatan negatif pada pH netral, yangdisebabkan oleh rangka fosfatnya. Berdasarkansifat ini, maka jika arus listrik diberikan padalarutan yang mengandung DNA, molekul DNAakan terdorong menuju bagian bidang yangbermuatan posistif.

3. KUANTIFIKASI DAN INTERPRETASI

Berdasarkan pengamatan pada pita DNA hasilelektroforesis, maka konsentrasi sampel DNA dapatdianalisis. Konsentrasi DNA diperoleh denganmembandingkan kekompakan pita dan intensitaskecerahannya yang diamati pada pola elektroforesissampel DNA dibandingkan marker DNA (misal λ Hind III). Hasil pembandingan dituangkan dalam rasio(nisabah)-nya. Berdasarkan rasio pembandingantersebut, maka konsentrasi DNA dapat dikuantifikasimengikuti rumus berikut:

(Ukuran marker x konsentrasi marker x µl marker x rasioperbandingan)

(ukuran total marker x µl sampel)

TERIMA KASIH

Kebanyakan slide yah…