Polyposis nasi:

Quantitative Analyse der eosinophilen Granulozyten mit der

Laser Scanning Zytometrie

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Dr. med.

an der medizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von Manuela Gutsche

geboren am 10.07.1977 in Cottbus

angefertigt an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig

in der Klinik und Poliklinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde/ Plastische Operationen

Betreuer: Prof. Dr. med. F. Bootz

Klinik und Poliklinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde/ Chirurgie, Bonn

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom 13.12.2010

Bibliographische Beschreibung:

Gutsche, Manuela

Polyposis nasi: Quantitative Analyse der eosinophilen Granulozyten mit der

Laser Scanning Zytometrie

Universität Leipzig, Dissertation

104 S., 147 Lit., 30 Abb., 6 Tab., 6 Anlagen

Referat:

In der vorliegenden Arbeit wurde Gewebe aus den Nasennebenhöhlen von Patienten mit

Nasenpolypen untersucht. Außerdem wurden Zusammenhänge zwischen den

Zellpopulationen und den Angaben zu allergischen Erkrankungen und wiederholtem

Auftreten der Polypen analysiert. Es fand sich eine interindividuell unterschiedlich starke

Infiltration mit eosinophilen Granulozyten. Es konnten keine Unterschiede in der

prozentualen Verteilung von eosinophilen Granulozyten im Polypengewebe bei allergischen/

nichtallergischen Patienten oder Patienten mit/ ohne Rezidiv nachgewiesen werden.

Die Untersuchungen erfolgten mit dem Laser Scanning Zytometer (LSC), das mit der

Standardmethode, der Begutachtung mittels Lichtmikroskop, verglichen wurde. Mit der

beschriebenen Methode erfolgte die Untersuchung von Polypengewebe nach einem speziell

für diese Anwendung entwickelten Protokoll. Die Ergebnisse korrelierten gut mit den

Ergebnissen der Lichtmikroskopie. Aufgrund der Weiterentwicklung des LSC und der ständig

wachsenden Anzahl der Nachweismöglichkeiten der an der Polyposis nasi beteiligten

Zytokine stellt das LSC eine ideale Methode für die Erforschung der Pathogenese von

chronischen Entzündungen der Nasennebenhöhlen dar.

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

I EINFÜHRUNG 1

II EINLEITUNG 3

2.1. Polyposis nasi

2.1.1 Definition, klinische Symptomatik und Diagnostik der Polyposis nasi 3

2.1.2 Epidemiologie der Polyposis nasi 4

2.1.3 Rezidivneigung der Polyposis nasi 5

2.1.4 Ätiologie der Polyposis nasi und assoziierte Krankheitsbilder

2.1.4.1 Allergische Erkrankungen 6

2.1.4.2 Asthma bronchiale 8

2.1.4.3 Analgetika-Intoleranz und Samter-Triade 9

2.1.4.4 Nicht-allergische Rhinitis mit (Blut-) Eosinophilie-Syndrom 11

2.1.4.5 Infektionen 11

2.1.4.6 Gastroösophageale Refluxkrankheit 13

2.1.4.7 Konstituelle Faktoren 13

2.1.4.8 Immundefektsyndrome 15

2.1.4.9 “Yellow Nail”-Syndrom 15

2.1.4.10 Churg-Strauss-Syndrom 16

2.1.4.11 Umweltmedizinische Aspekte 16

2.1.5 Pathogenese der Polyposis nasi 16

2.1.5.1 Makroskopische Aspekte der chronischen Sinusitis und Polyposis nasi 17

2.1.5.2 Mikroskopische Aspekte der chronischen Sinusitis und Polyposis nasi 17

2.1.5.3 Betrachtungen über die beteiligten Zellpopulationen unter besonderer

Berücksichtigung des eosinophilen Granulozyten

19

2.1.5.4 Beteiligte Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle 22

2.1.6 Therapie der Polyposis nasi 24

2.2 Laser Scanning Zytometrie

2.2.1 Aufbau und Funktionsweise des Gerätes 25

2.2.2 Zelldefinition am LSC und Trigger 27

2.2.3 Darstellungsmöglichkeiten 28

III MATERIAL UND METHODEN 31

3.1 Auswahl des Patientenguts, Gewebeentnahme und Datenerfassung 31

3.2 Präparation und Aufbewahrung der Proben 31

3.3 Präparation und Aufbewahrung von Testzellen 33

3.4 Immunzytologische Färbung 33

3.5. Titrationsversuche für FITC, PI und APC 34

3.6 Messungen im LSC 35

3.7 Darstellung der Messdaten in Diagrammen 36

3.8 HE-Färbung 37

3.9 Relokalisation der Zellen 38

3.10 Manuelle Auszählung mit dem Lichtmikroskop 38

3.11 Histopathologische Beurteilung der Gewebsschnitte 39

3.12 Statistische Auswertung 39

IV ERGEBNISSE 41

4.1 Auswahl des Patientenguts, Gewebeentnahme und Datenerfassung

4.1.1 Geschlechts- und Altersverteilung 41

4.1.2 Klinische Diagnose, Lokalisation und anamnestische Angaben 42

4.2. Titrationsversuche 43

4.3 Messungen mit dem LSC 46

4.4 Relokalisation und Bilddokumentation 47

4.5 Manuelle Auszählungen 49

4.6 Histopathologische Beurteilungen 50

4.7 Statistische Auswertungen

4.7.1 Korrelation der LSC-Daten mit den Daten der manuellen Auszählung 52

4.7.2 Zusammenhang zwischen den LSC-Daten und histopathologischem Befund 52

4.7.3 Zusammenhang zwischen manueller Auszählung und histopathologischem

Befund

53

4.7.4 Zusammenhang zwischen eosinophiler Infiltration und Rezidiv 54

4.7.5 Zusammenhang zwischen eosinophiler Infiltration und Allergie 55

V DISKUSSION 57

5.1 Diskussion der Methodik

5.1.1 Präparation und Methodenvergleich 57

5.1.2 Laser Scanning Zytometrie 59

5.1.3 Zytologische Färbemethoden

5.1.3.1 DNA-Färbung und Triggerung mit Propidiumjodid (PI) 61

5.1.3.2 indirekte Immunfluoreszenzfärbung über Zytokeratin-Biotin-

Streptavidin-APC

62

5.1.3.3 unspezifische Anfärbung der eosinophilen Granulozyten mit

Fluorescin-Isothiocyanat (FITC)

62

5.1.4 Betrachtungen zur Eosinophilie 64

5.2 Diskussion der Ergebnisse

5.2.1 Geschlechts- und Altersverteilung sowie Lokalisation der Polypen 66

5.2.2 Allergierate im Patientengut 67

5.2.3 Rezidivrate im Patientengut 68

5.2.4 Die eosinophile Infiltration und deren Einfluss auf Allergie und Rezidiv 69

5.3 Ausblick 71

VI ZUSAMMENFASSUNG 73

VII LITERATUR 76

VIII ANHANG 92

Abkürzungsverzeichnis 92

Lösungen und Hilfsmittel (verwendete Geräte) 94

Beispiel: Darstellung der Messung in Diagrammen, statistische Auswertung und

Bilddokumentation

98

Danksagung 101

Lebenslauf 102

Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 104

__________________________________________________________________Einleitung

1

I Einführung

Die Polyposis nasi ist eine seit dem Altertum bekannte chronische Erkrankung der Nase und

Nasennebenhöhlen. Mit einer Prävalenz von 1-2% der Bevölkerung gehört sie zu den

häufigsten chronischen Erkrankungen; trotzdem sind Ätiologie und Pathogenese bisher nicht

geklärt. Die Bildung von entzündlich bedingten Wucherungen der Nasenschleimhaut scheint

eine einheitliche Reaktion der Nasenschleimhaut auf unterschiedliche Noxen zu sein.

Mehrfach wissenschaftlich belegt wurde eine Assoziation zwischen der Polyposis nasi und

dem Asthma bronchiale, der Analgetika-Intoleranz, der zystischen Fibrose und primären

Ziliendyskinesiesyndromen (z.B. Kartagener-Syndrom). Ob eine inhalative Allergie die

Entwicklung von Nasenpolypen induziert oder die Unterhaltung der zugrunde liegenden

chronischen Entzündung fördert, wird seit Jahren kontrovers diskutiert. In den Vordergrund

rücken derzeit zwei weitere Theorien: zum einen, ob Pilzinfektionen der Nase und die

dadurch bedingte Entzündungsreaktion oder eine allergische Reaktion auf Pilzallergene eine

pathogenetische Rolle spielen. Zum anderen, ob intrazellulär lebende Staphylokokken an der

Pathogenese beteiligt sind.

Von der Polyposis nasi betroffene Patienten leiden meist über Jahre unter nasaler Obstruktion,

Kopfschmerzen, Rhinorrhoe und Anosmie. Pathomorphologisch gestützte

Behandlungskonzepte werden in den letzten Jahren evidenzbasiert entwickelt.

Medikamentöse Behandlungsmöglichkeiten bieten topische oder seltener systemische

Glukokortikoide sowie hypertone Salzspülungen. Sind diese nicht erfolgreich, folgt eine

minimal invasive Operation mit dem Ziel, die natürlichen Ventilations- und Drainagewege

der Nasennebenhöhlen wieder herzustellen. Trotz dieser intensiven medikamentösen und

operativen Behandlungskonzepte erleiden viele Patienten ein Rezidiv. Prognosen über die

Rezidivwahrscheinlichkeit können allerdings nur vage mithilfe der Theorien zur Ätiologie der

Polyposis nasi erstellt werden.

Durch zytologische und histologische Untersuchungen des Polypengewebes konnte der

entzündliche Charakter der Polyposis nasi bewiesen werden. Die zeitaufwendige, manuelle

Begutachtung der Zellen in Gewebeschnitten mittels Lichtmikroskopie zeigt in 90% der Fälle

eine starke Infiltration durch eosinophile Granulozyten (Jankowski 1996). Der Grad der

Entzündung variiert interindividuell und in Abhängigkeit einer eventuell vorhandenen

Grunderkrankung stark. Die Untersuchung der Gewebsschnitte ist abhängig von der

Erfahrung des Gutachters und von der ödematösen Komponente im Polypengewebe.

Die Laser Scanning Zytometrie (LSC) ermöglicht die schnelle, zuverlässige und quantitative

Untersuchung einer großen Anzahl unterschiedlicher Zellen eines Gewebes. Das Laser

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2

Scanning Zytometer vereint die Möglichkeiten der lasergestützten Untersuchung von

Zelleigenschaften und der optischen Begutachtung der gleichen Zellen mithilfe eines

Durchlichtmikroskops. Dazu werden die Zellen auf einem Objektträger immobilisiert und

immunzytologisch mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt. Durch Speicherung der X-Y-

Koordinaten bei der Messung sind das Wiederauffinden der Zellen und die visuelle Kontrolle

der gemessenen Ereignisse nach Umfärben möglich. Im Gegensatz zur qualitativen

Untersuchung von Zellen und Geweben durch geübte Begutachter, bietet die LSC ein

automatisiertes, objektives Verfahren, das auch Anwendern mit wenig Erfahrung in der

histologischen Untersuchungstechnik zur Verfügung steht.

In dieser Arbeit wurde das LSC zur zytologischen Analyse von Polypengewebe verwendet.

Die Polypenentnahme erfolgte während minimal invasiven Nebenhöhlenoperationen. Ein Teil

wurde zur histopathologischen Begutachtung gesendet, der andere Teil zu

Einzelzellpräparationen aufbereitet und auf Objektträgern immobilisiert. DNA,

Zytokeratinfilamente und eosinophile Granula wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt

und mit dem LSC analysiert. Danach erfolgten die Umfärbung der gleichen Objektträger mit

Hämatoxylin und Eosin und die visuelle Kontrolle der Messergebnisse von der ersten

Messung ebenfalls mit dem LSC. Einige Objektträger wurden noch einmal manuell

ausgezählt. Die Ergebnisse vom LSC, aus der histopathologischen Begutachtung und aus der

manuellen Auszählung wurden korreliert. Außerdem wurden die klinischen Angaben der

operierten Patienten zu inhalativen Allergien und Rezidiven erhoben und geprüft, ob ein

statistischer Zusammenhang zwischen der Anzahl der eosinophilen Granulozyten und einer

Allergie bzw. einem Rezidiv besteht.

Zusammenfassend waren die Ziele dieser Studie:

1. die objektive Quantifizierung von eosinophilen Granulozyten in polypösem Gewebe

mithilfe der LSC,

2. der Vergleich der LSC mit standardisierten Verfahren wie der histopathologischen

Untersuchung und der manuellen Auszählung von Sichtfeldern (Lichtmikroskopie),

3. die Prüfung eines Zusammenhangs zwischen der Anzahl eosinophiler Granulozyten in

den Polypen und der Exposition gegenüber inhalativen Allergien,

4. die Prüfung eines Zusammenhangs zwischen der Anzahl eosinophiler Granulozyten in

den Polypen und dem rezidivierenden Auftreten der Polyposis nasi.

Eine systematische Untersuchung dieser Fragen liegt bisher nicht vor. Die folgende Arbeit

wird sich hiermit beschäftigen.

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3

II Einleitung

2.1. Polyposis nasi

2.1.1 Definition, klinische Symptomatik und Diagnostik der Polyposis nasi

Nasenpolypen sind entzündliche, ödematöse, hyperplastische, gutartige Wucherungen der

Schleimhaut von Nase und Nasennebenhöhlen. Makroskopisch erscheinen sie gelblich bis

blassgrau oder glasig transparent und gestielt. Die Blässe ist auf eine verminderte

Blutversorgung zurück zu führen. Je nach Alter der Polypen können sie aber auch durch

Plattenepithelmetaplasie und Vermehrung von Bindegewebe rötlich aussehen (Lund 1995).

Nasenpolypen treten solitär oder multipel, meist traubenförmig auf und entwickeln sich

beidseits ausgehend von den Engstellen im ostiomeatalen Komplex, seltener von der Kiefer-,

Keilbein- oder Stirnhöhle und den Nasenmuscheln (Stammberger 1999). Entsprechend der

Schwerkraft prolabieren sie in die Nasenhaupthöhle, können diese vollständig verlegen oder

sogar aus der Nase heraus wachsen (Ganz 1985). Sonderformen der Polyposis nasi sind

antrochoanale und sphenochoanale Polypen. Diese wachsen einseitig und gestielt in Kiefer-

bzw. Keilbeinhöhle und prolabieren in die Nasenhaupthöhle und den Nasenrachen, wo sie

beträchtliche Größen erreichen können (Lund 1995). Trotz vermutlich unterschiedlicher

Ätiologien zeigen Nasenpolypen ähnliche histologische und klinische Charakteristika. Tritt

eine polypös erscheinende Veränderung der Nasenschleimhaut nur einseitig auf, sollte immer

eine Biopsie mit anschließender histologischer Untersuchung zum Ausschluss bösartiger

Erkrankungen erfolgen (Jankowski 1996). Bachert et al. (2003) teilen Nasenpolypen in vier

Gruppen ein: unilaterale, antrochoanale, bilaterale (eosinophile) und bilaterale Polypen in

Assoziation zu bestimmten Grundkrankheiten wie der zystischen Fibrose, Mykose oder

Ziliendyskinesie.

Typische Symptome der Polyposis nasi sind anteriore und posteriore Rhinorrhoe, ständige

nasale Obstruktion mit Nasenatmungsbehinderung und Rhinophonia clausa, Störung des

Geruch- und Geschmacksinns sowie Gesichts- und Kopfschmerzen. Gelegentlich treten auch

Nies- und Juckreiz in Nase und Rachen, Mittelohrerkrankungen, Schnarchen und obstruktives

Schlafapnoesyndrom oder morgendliche Lidödeme auf. Bei Beginn der Erkrankung im

Kindesalter kann die ethmoidale Expansion der Polypen zur Auftreibung der Nasenpyramide

und zu Hypertelorismus führen, was als Woakes-Syndrom bezeichnet wird. Durch die

Polyposis nasi ausgelöste Beschwerden sind abhängig vom Ausprägungsgrad der Polypen. Im

Allgemeinen haben sich die Beschwerden über Jahre verschlechtert, sind aber geringer

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4

ausgeprägt als bei einer akuten Sinusitis. Oft berichten Patienten über den Beginn der

dauerhaften Beschwerden nach einer akuten Sinusitis (Ganz 1985, Lund 1995, Bachert et al.

2003, Fokkens et al. 2007).

Die Diagnostik bei Nasen- und Nasennebenhöhlenerkrankungen basiert auf Anamnese und

klinischer Untersuchung, Nasenendoskopie, Computertomografie und postoperativem

histologischen Befund. Einige Autoren empfehlen die routinemäßige Durchführung einer

Riechprüfung, Nasendurchflussmessung und Allergiediagnostik. Zusätzliche Untersuchungen,

wie Abstriche, Lungenfunktionsprüfung, Provokationstestungen mit ASS, Bestimmung der

Serumlevel von ANCA, genetischen Untersuchungen oder elektronenmikroskopischen

Untersuchungen der Zilienstruktur sind bei Verdacht auf Begleiterkrankungen angebracht

(Bachert et al. 2003).

2.1.2 Epidemiologie der Polyposis nasi

Die Polyposis nasi ist keine Erkrankung der Neuzeit. Schon bei den Ägyptern war das

Krankheitsbild bekannt und wurde durch Heilkundige behandelt. Die Entfernung von

Nasenpolypen mit einer Schlinge wurde von Hippokrates beschrieben. Im 18. Jahrhundert litt

der Komponist Joseph Haydn ebenfalls unter Nasenpolypen und unterzog sich mehrfach einer

Schlingenextraktion (Cohen 1998).

Die Polyposis nasi ist eine häufige Erkrankung. Albegger (1977) stellte fest, dass

Nasenpolypen bei sämtlichen Formen der chronischen Rhinosinusitis auftreten können. Ob

die Polyposis nasi als Endstadium einer chronischen Rhinosinusitis angesehen werden kann,

bleibt weiter ungeklärt (Hosemann et al. 1994).

In der Literatur wird die Prävalenz der Polyposis nasi in der erwachsenen Normalbevölkerung

industrialisierter Länder auf 0,2%-2% und die Prävalenz der chronischen Rhinosinusitis auf 1-

4% geschätzt (Settipane & Chafee 1977, Hedman et al. 1999, Johansson et al. 2003, Chen et

al. 2003). Die Polyposis nasi tritt bei allen Ethnien auf (Rugina et al. 2002, Lacroix et al.

2002, Larsen & Tos 2004). Symptomatisch wird die Erkrankung bei weniger als 1% der Fälle

(Lund 1999). Larsen & Tos (2004) konnten bei 32% der untersuchten Fälle polypöse

Veränderungen der Nasenschleimhaut finden. Braun et al. (2003) schätzen die Prävalenz der

chronischen Rhinosinusitis mit polypoiden Veränderungen der nasalen Schleimhaut in den

USA sogar auf über 50% mit steigenden Zahlen für Prävalenz und Inzidenz. Diese

Steigerungen werden zum Teil auf verbesserte Untersuchungsmethoden zurückgeführt (Lund

1995, Mygind 1999).

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5

Es konnten Zusammenhänge zwischen der Polyposis nasi und dem Alter, dem Geschlecht

sowie Begleiterkrankungen festgestellt werden. Die Prävalenz der Polyposis nasi steigt bei

beiden Geschlechtern mit dem Alter. Meist wird die Erkrankung nach dem 30. Lebensjahr

beobachtet, nach dem 60. Lebensjahr finden sich nur noch selten Primärmanifestationen

(Drake-Lee 1994). Polyposis nasi bei Kindern unter zehn Jahren ist äußerst selten (Larsen &

Tos 2004). Männer erkranken häufiger an der Polyposis nasi als Frauen. Angaben über das

Verhältnis von Männern zu Frauen schwanken von 4:1 bis 2:1 (Hedman et al. 1999,

Johansson et al. 2003, Larsen & Tos 2004). Dagegen erkranken Frauen häufiger an einer

chronischen Sinusitis ohne Nasenpolypen (Chen et al. 2003). Eine Geschlechterpräferenz ist

nicht mehr nachzuweisen, wenn die Polyposis nasi mit einem Asthma vergesellschaftet ist

(Larsen 1996, Rugina et al. 2002).

Ausführungen zur Häufigkeit der Polyposis nasi bei gleichzeitigem Vorliegen von weiteren

Erkrankungen folgen im Kapitel 2.1.4.

2.1.3 Rezidivneigung der Polyposis nasi

Die hohe Rezidivrate der Polyposis nasi ist klinisch bekannt. Die Angaben schwanken

zwischen 16% und 52% (Drake-Lee et al. 1984, Slavin 1988, Jäntti-Alanko et al. 1989,

Friedman & Katsantonis 1990, Senior et al. 1998, Kaldenbach et al. 1999). Der Zeitraum bis

zum Rezidiv ist u.a. abhängig von der gewählten Therapieform. Das Intervall bis zum

Wiederauftreten von Polypen ist bei einer alleinigen Therapie mit oralen Steroiden sechsmal

kürzer als bei einem operativen Vorgehen (Settipane 1996a). Die Rezidivrate einer

chronischen Rhinosinusitis ohne Polypen unterscheidet sich mit 8,6% deutlich von der einer

chronischen Rhinosinusitis mit Polypen, die in einer Vergleichsstudie von Hilka et al. (1992)

bei 47% lag.

Eine erhöhte Rezidivrate konnte in mehreren Studien mit verschiedenen Begleiterkrankungen

in Zusammenhang gebracht werden. So ist das Risiko einer rezidivierenden Polyposis erhöht

bei gleichzeitigem Vorliegen einer Analgetika-Intoleranz, rezidivierenden Infektionen der

oberen Atemwege und einer inhalativen Allergie (Settipane 1996a). Slavin (1988) beschrieb

einen Zusammenhang zwischen einer Rezidivpolyposis und zunehmenden Alter, Asthma

bronchiale und einem chronischen Hautekzem. Stoop et al. (1993) fanden bei 50% der

Allergiker ein Rezidiv im Gegensatz zu 25% bei Nichtallergikern. Chambers et al. (1997)

gaben als einzigen ungünstigen prognostischen Faktor einen gastroösophagealen Reflux an.

Allergische Erkrankungen der oberen Atemwege und eine Analgetika-Intoleranz verstärken

die Symptome der chronischen Sinusitis und gelten weiterhin als Risikofaktoren für eine

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6

Polyposis nasi sowie deren Rezidiv (Bachert et al. 2003). Ob eine spezifische Immuntherapie

das Rezidivrisiko senkt, kann noch nicht abschließend beurteilt werden (Nishioka et al. 1994).

Viele Studien haben in den letzten Jahren keinen Zusammenhang zwischen allergischen

Erkrankungen und der (rezidivierenden) Polyposis nasi aufdecken können, so dass die

Polyposis nasi nicht als allergische Erkrankung eingeordnet wird (Bachert et al. 2003).

Es ist noch nicht möglich, für den individuellen Patienten eine Rezidivwahrscheinlichkeit

vorauszusagen. Weitere Forschungen zu ätiologischen und pathogenetischen

Zusammenhängen sind notwendig, um die Entstehung der rezidivierenen Polyposis

vermeiden zu können.

2.1.4 Ätiologie der Polyposis nasi und assoziierte Krankheitsbilder

Die Ätiologie der Polyposis nasi bleibt trotz zahlreicher Forschungen und aufgestellter

Theorien weiterhin unklar. Klinisch sind Assoziationen der Polyposis nasi mit bestimmten

Erkrankungen seit langem bekannt. Ein einziger Faktor kann nicht als Ursache der Polyposis

nasi ausgemacht werden. Man spricht deshalb von einem multifaktoriellen Faktorengefüge

und nimmt an, die Polyposis nasi sei keine einheitliche Erkrankung, sondern eine chronisch-

entzündliche, hyperplastische Reaktion der Nasenschleimhaut auf unterschiedliche Reize

(Hosemann et al. 1994, Stammberger 1999).

Im Folgenden wird auf prädisponierende Krankheitsbilder eingegangen.

2.1.4.1 Allergische Erkrankungen

Das menschliche Immunsystem hat die Aufgabe, den Organismus vor gefährlichen

Einwirkungen, insbesondere von Mikroorganismen, zu schützen. Der Begriff Allergie wurde

erstmals 1906 von Pirquet gebraucht. Heute versteht man unter Allergie eine überschießende

spezifische, immunologische Reaktion gegen exogene Substanzen und wird somit von der

Autoimmunität abgegrenzt. Der Begriff Atopie wiederum steht für die vererbbare Neigung,

Allergien zu entwickeln. Die Einteilung der allergischen Reaktionen wurde 1963 von Gell

und Coombs vorgenommen.

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7

Typ I Mastzell- und IgE-vermittelte Immunreaktion

Typ II zytotoxische Immunreaktion

Typ III immunkomplexvermittelte Immunreaktion

Typ IV T-Zell-vermittelte Immunreaktion

Tab. 1 Einteilung der allergischen Reaktionen nach Gell & Coombs (in: Riede & Herbst

1999)

Typische allergische Erkrankungen sind die allergische Konjunktivitis, allergische Rhinitis,

das allergische Asthma bronchiale, Urtikaria und Insektengift- sowie Nahrungsmittelallergien,

die bis zum anaphylaktischen Schock führen können. Allergene können Pollen, Tierhaare,

Pilze, Milben und Nahrungsmittel sein. Nach der ISAAC-Studie erkranken 15-25% aller

Kinder an einer allergischen Erkrankung der oberen Atemwege (Bauchau & Durham 2004).

Das Risiko steigt auf 30-40%, wenn ein Elternteil Atopiker ist, und auf 60-80%, wenn beide

Elternteile betroffen sind.

Eine Sensibilisierung entsteht in zwei Schritten: beim Erstkontakt mit einem Allergen wird

dieses von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und T- sowie B-Zellen

präsentiert. Naive T-Zellen werden aktiviert und können sich in TH1- oder TH2-Zellen

differenzieren. TH1-Zellen produzieren IFN- - -2. TH2-Zellen produzieren IL-

4, IL-5, IL-6 und IL-13. Von beiden Subpopulationen werden IL-3, IL-10, TNF- -

CSF gebildet. Beide Zelltypen inhibieren mit der Produktion ihrer Interleukine und

Wachstumsfaktoren den jeweils anderen Typ. Welcher der beiden Zelltypen sich entwickelt,

hängt wahrscheinlich vom vorherrschenden Zytokinmuster, der Antigenkonzentration und den

antigenpräsentierenden Zellen ab. Die von den TH2-Zellen produzierten Interleukine

beeinflussen die B-Zellen und führen zu einer gesteigerten Synthese von allergenspezifischem

IgE durch Plasmazellen. IgE wird an spezifische Rezeptoren auf Basophilen, Mastzellen und

auch antigenpräsentierenden Zellen gebunden. Damit ist der zweite Schritt der

Sensibilisierung abgeschlossen.

Bei einem Zweitkontakt mit einem Allergen kommt es zu einer Basophilen- und

Mastzelldegranulation, wodurch Histamin, Prostaglandine, Leukotriene, Kinine, PAF,

Zytokine (IL-3, IL-4 und IL-5), Proteasen und Proteoglykane freigesetzt werden. Die

Bereitschaft zur Degranulation wird von Zytokinen und Neurotransmittern wie Substanz P,

VIP und CG- RM moduliert. Die freigesetzten Mediatoren führen zu einer Sofortreaktion mit

lokaler Ödem- und Erythembildung oder systemischen anaphylaktischen Reaktionen.

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8

Weiterhin wird eine Spätphasenreaktion initiiert, die einige Stunden nach der

Allergenexposition auftritt. IL-4 fördert die Bildung von Adhäsionsmolekülen wie VCAM-1

und weiterer Selektine und Integrine am Endothel. Durch chemotaktische Faktoren wie PAF,

C5a, Prostaglandine, Leukotriene und Zytokine wandern basophile und eosinophile

Granulozyten in das Gewebe. Sie setzen proinflammatorische Mediatoren wie MBP, EPO,

ECP, EDN, EPX sowie Kollagenase, Phosphatase, Leukotriene, Prostaglandine, PAF und

Sauerstoffradikale im Gewebe frei und führen so zur Entzündungsreaktion.

Bei allergischen Reaktionen ist die Anzahl der eosinophilen Granulozyten im Blut und in

Geweben erhöht. Aufgrund der hohen Anzahl eosinophiler Granulozyten in Nasenpolypen

wird seit Jahren eine allergische Genese der Polyposis nasi diskutiert. Die Anzahl

eosinophiler Granulozyten in polypösem Gewebe von Atopikern unterscheidet sich nicht von

der in Polypen nichtallergischer Patienten (Park et al. 1998, Jankowski et al. 2002). Der

pathogenetische Zusammenhang zwischen einer allergischen Erkrankung und der Polyposis

nasi bleibt weiterhin unklar und wird ausführlich im Abschnitt 5.2.2 diskutiert.

2.1.4.2 Asthma bronchiale

Asthma bronchiale ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung der Atemwege, die durch

intermittierende und reversible Atemwegsobstruktionen mit Atemnot und einer bronchialen

Hyperreagibilität gekennzeichnet ist. Betroffen sind circa 5% der Erwachsenen und 10% der

Kinder mit steigender Prävalenz. Ätiologisch wird eine extrinsisch (allergische) Form von

einer intrinsischen Form unterschieden. Das extrinsische Asthma bronchiale ist durch eine

Immunreaktion vom Soforttyp nach Gell und Coombs gekennzeichnet und kommt häufiger

bei Kindern vor. Häufig zeigen betroffene Patienten weitere atopische Erkrankungen wie

allergische Rhinitis oder atopisches Ekzem. 10% der erwachsenen Patienten leiden an einem

reinen intrinsischen Asthma bronchiale, 80% an einer Mischform. Ursachen sind Infekte,

chemisch-irritative oder toxische Inhalationsstoffe, gastroösophagealer Reflux oder eine

Analgetikaintoleranz. Die Pathophysiologie der Atemwegsobstruktion ist bei beiden Formen

ähnlich: die Akkumulation von TH2-Lymphozyten und eosinophilen Granulozyten in der

Bronchialschleimhaut und die Sekretion von Zytokinen wie IL-4, IL-13, IL-5 und IL-9 führen

zu einer Bildung von IgE durch aktivierte B-Zellen, zur Degranulation von Mastzellen und

einer Ausschüttung weiterer Zytokine wie Bradykinin und Histamin, die die bronchiale

Konstriktion, ein Schleimhautödem und eine Dyskrinie (Bildung von zähem Schleim) zur

Folge haben (Renauld 2001).

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9

40% der Patienten mit Polyposis nasi haben auch ein intrinsische Asthma bronchiale

(Settipane & Chafee 1977, Klima et al. 1993, Bachert et al. 2003). Umgekehrt entwickeln 5%

der Patienten mit allergischem Asthma bronchiale (Hedman et al. 1999) und 7-20% der

Patienten mit intrinsischem Asthma bronchiale nasale Polypen, wobei die

Erkrankungshäufigkeit mit dem Lebensalter zunimmt (Settipane 1996a, Larsen 1996,

Hosemann et al. 2000). Bei 70% der Asthmatiker können computertomografisch

Verschattungen in den Nasennebenhöhlen nachgewiesen werden. Polypen lassen sich

durchschnittlich 9-13 Jahre nach erstmaliger Feststellung eines Asthma bronchiale finden

(Fokkens et al. 2007).

Der Zusammenhang zwischen chronischen Nasennebenhöhlenentzündungen und dem Asthma

bronchiale wurde schon früh erkannt und der Begriff „sinubronchiales Syndrom“ in den 20er

Jahren geprägt. Allerdings ist dieser Begriff unscharf, da z.B. nicht klar ist, ob Erkrankungen

wie die primäre Ziliendyskinesie einbegriffen sind. Ähnlichkeiten bei chronisch-

entzündlichen Erkrankungen der oberen und unteren Atemwege bestehen bei den beteiligten

Entzündungszellen und Mediatoren und den pharmakologischen Therapieoptionen (Hamilos

et al. 1996, Rowe-Jones et al. 1997). Der Zusammenhang zwischen oberen und unteren

Atemwegen wird mit dem sinubronchialen Reflex, mit der direkten Aspiration von Sekret

oder dem Ausfall der Befeuchtungs- und Erwärmungsfunktion der Nase erklärt. Ein positiver

Effekt auf die Lungenfunktion nach einer operativen Nasennebenhöhlensanierung wird bei bis

zu 70% der Fälle angegeben (Slavin 1988, Hosemann et al. 1990, Hilka et al. 1992).

2.1.4.3. Analgetika-Intoleranz und Samter Triade

Schon sechs Jahre nach Markteinführung von Aspirin 1899 wurde der erste Asthmaanfall

nach Einnahme des Präparats beschrieben. Wenig später beobachtete man das gleichzeitige

Auftreten von Analgetika-Intoleranz, Polyposis nasi und Asthma bronchiale (Widal et al.

1922). Da bei der Reaktion keine Antikörper nachweisbar sind, wird die Analgetikaintoleranz

als pseudoallergische Arzneimittelreaktion auf nichtsteroidale Antirheumatika eingeordnet.

Bei einem Patienten können alle diese Wirkstoffe oder nur ein einziger reaktionsauslösend

sein (Kreuzintoleranz). Die Pathophysiologie ist nicht bekannt; eine Erklärung folgt dem

Modell der Arachidonsäurekaskade. Durch das Enzym Phospholipase A2 werden

Arachidonsäuremoleküle aus der Zellmembran gelöst. Diese Moleküle stehen nun den

Enzymen Cyclooxigenase (COX) oder Lipoxigenase (LOX) zur Verfügung. Der

Cyclooxigenaseweg (alle Gewebe) führt zu verschiedenen Prostaglandinen, Prostacyclinen

und Thromboxanen, die hauptsächlich eine Bronchien- und Gefäßerweiterung und eine

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Hemmung der Leukotrien-Synthese bewirken. Der Lipoxigenaseweg (Leukozyten,

Makrophagen, Mastzellen) führt über die Zwischenstufe 5-HPETE zu den Leukotrienen.

Durch Hemmung der Cyclooxigenase durch z.B. nichtsteroidale Antirheumatika kommt es

insbesondere in Mastzellen, eosinophilen Granulozyten und Makrophagen zur vermehrten

Bildung von Leukotrien C4 (LTC4), das außerhalb der Zellen in LTD4 und LTE4

umgewandelt wird. Diese Botenstoffe bewirken eine Bronchokonstriktion, Erhöhung der

Gefäßpermeabilität und Schleimproduktion sowie eine Chemotaxis für neutrophile und

eosinophile Granulozyten. Die ausgelöste Entzündungsreaktion durch angelockte neutrophile

und eosinophile Granulozyten führt wiederum zur vermehrten Bildung von IL5, MBP und

ECP, die zu einer Aufrechterhaltung der Entzündung beitragen.

Die Hemmung der COX durch NSAR ist bei Gesunden und Kranken gleich, die Reaktion ist

aber dosisabhängig. Untersuchungen von Kowalski et al. (2000) ergaben, dass bei

Intoleranten geringe Mengen von NSAR zu einem starken Anstieg der Leukotriene (LT), aber

zu keinem Abfall der Prostaglandine (PG) führen. Auch ist der basale Lipoxigenase-

Stoffwechsel schon ohne NSAR gesteigert. Mögliche Theorien zu diesem Phänomen

beinhalten eine veränderte Kinetik von COX-Inhibitoren, eine erhöhte Aktivität der LTC4-

Synthase in eosinophilen Granulozyten und Mastzellen oder eine vermehrte Synthese der

Phospholipase A2. Als möglicher Trigger für diese Veränderungen werden latente

Virusinfekte oder ein Autoimmungeschehen in betracht gezogen (Kowalski et al. 2000).

Die Prävalenz der Analgetika-Intoleranz wird in Normalbevölkerung auf 0,5-1% (Hosemann

et al. 2000), bei gleichzeitiger perennialer Rhinitis auf 6%, bei Asthma bronchiale auf 15-

20%, bei Polyposis nasi auf 15-35% (Kalyoncu 2000), bei Polyposis nasi und Asthma

bronchiale auf 40-50% (Kaldenbach et al. 1999), bei diffuser Rezidivpolyposis nach OP auf

60% und bei chronischer Urtikaria auf 20-40% (Kalyoncu 2000) geschätzt.

Bei nachgewiesener Analgetika-Intoleranz neigen 35-76% der Patienten zur Entwicklung von

Nasenpolypen (Klima et al. 1993, Settipane 1996a). May et al. (2000) fand sogar in 93% der

Patienten mit einer Analgetika-Intoleranz nasale Polypen. 36-80% müssen sich mehrfachen

Sanierungen der NNH unterziehen (Klima et al. 1993, Kaldenbach et al. 1999, Schmid et al.

1999, Amar et al. 2000). Bei gleichzeitigem Vorliegen einer Analgetika-Intoleranz und eines

Asthma bronchiale werden Erkrankungshäufigkeiten für die Polyposis nasi zwischen 50-95%

angegeben (Settipane 1996a, Hosemann et al. 2000).

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2.1.4.4 Nicht-allergische Rhinitis mit Eosinophilie-Syndrom (NARES) und Nicht-allergische

Rhinitis mit Bluteosinophilie-Syndrom (BENARES)

Das Krankheitsbild wurde erstmalig 1979 beschrieben und ist durch eine massive nasale

Eosinophilie im Nasensekret oder Nasenabstrichen gekennzeichnet. Patienten leiden unter

Niesattacken, Juckreiz, wässriger Rhinorrhoe, nasaler Obstruktion und unspezifischer

Hyperreagibilität. Allergologische Tests wie Pricktest, RAST oder Provokation zeigen keine

spezifische Sensibilisierung. Die Symptome zeigen ein sehr gutes Ansprechen auf Steroide.

Es wurde vermutet, dass die Erkrankung eine Vorstufe der Polyposis nasi ist.

Zusammenhänge zu anderen prädisponierenden Faktoren wie der Analgetika-Intoleranz oder

der allergischen Pilzsinusitis wurden aufgrund der massiven Eosinophilie ebenfalls vermutet,

sind aber bisher nicht bewiesen (Moneret-Vautrin et al. 1990, Jankowski 1996).

2.1.4.5 Infektionen

Bakterielle und virale Infektionen werden immer wieder als Ursache der Polyposis nasi

diskutiert. Experimentell lassen sich epitheliale Läsionen bei Infektionen der

Nasenschleimhaut mit Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, koagulase-

negative Staphylokokken, Bacteroides fragilis und Pseudomonas aeruginosa nachweisen.

Proliferierendes Granulationsgewebe wächst in diese Epithellücken ein und bildet das erste

Polypensubstrat (Lund 1995). Allerdings sind Besiedlungen mit diesen Bakterien auch bei

gesunden Personen nachzuweisen (Bachert et al. 2003).

Ein direkter Virennachweis in polypösen Schleimhautgewebe ist bisher nicht gelungen,

trotzdem wird eine virale Genese nicht völlig ausgeschlossen (Kozak et al. 1991, Klima et al.

1993). Virale und bakterielle Infektionen führen zu einer Aktivierung der

Entzündungskaskade und könnten so zur Entstehung oder Erhaltung einer chronischen

Entzündung beitragen.

Superantigene enterotoxinbildender Staphylokokken

Superantigene (SAG) umfassen einen Komplex von bakteriellen oder viralen Toxinen, die

eine massive Dysregulation des Immunsystems bewirken. Sie führen in kleinsten

Konzentrationen zu einer starken T-Zellaktivierung durch Induktion von CD40 und einer

Zytokinausschüttung insbesondere von IL-4. SAG wirken auch in vermindertem Maß als

konventionelle Antigene und führen zu einer IgE- und IgG-Produktion und zur

Histaminfreisetzung. Staphylokokken bilden die Enterotoxine A, B, C, D und das Toxic

Shock Syndrome Toxin 1. In Studien konnte die Kolonisation der Nasennebenhöhlen durch

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enterotoxinbildende Staphylokokken nachgewiesen werden, die bei Polyposis nasi-Patienten

64% und bei Patienten mit chronischer Rhinosinusitis bei 27% liegt. Bei Patienten mit

Nasenpolypen und bekannter Analgetika-Intoleranz lag die Kolonisationsrate sogar bei 80%

(Van Zele et al. 2004). Weiterhin konnten intrazellulär persistierende Staphylokokken

nachgewiesen werden, deren Bedeutung noch unklar erscheint (Sachse et al. 2008). Die

Bildung von Enterotoxinen, die als Superantigene wirken, bewirkt eine lokale, polyklonale

und enterotoxinspezifische IgE-Bildung und führt somit zu der massiven eosinophilen

Entzündungsreaktion in der nasalen Mukosa. Im Vergleich zwischen Patienten mit

enterotoxinspezifischen IgE-positiven Polypen und IgE-negativen Polypen zeigt sich eine

signifikant erhöhte Zahl IgE-positiver Zellen und eosinophiler Granulozyten im

Polypengewebe sowie erhöhte Level von IL-5, ECP und totalem IgE (Van Zele et al. 2004).

Weitere Studien sind nötig, um den Einfluss Staphylokokken-assoziierter Antigene auf die

Entstehung von Nasenpolypen zu spezifizieren.

Pilzinfektionen – allergische Pilzsinusitis

Bei den Pilzbesiedelungen der Nasennebenhöhlen unterscheidet man invasive von

nichtinvasiven Infektionen. Eine Form der nichtinvasiven Infektion ist die sogenannte

allergische Pilzsinusitis (AFS – englisch: „allergic fungal sinusitis“), die die häufigste Form

der Pilzsinusitiden ist (Schubert 2001). Settipane (1996b) gibt eine Häufigkeit der

allergischen Pilzsinusitis von 6-7% aller Patienten mit einer chronischen Rhinosinusitis an. Zu

den häufigsten Erregern gehören Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Alternaria und

Aureobasidium (Buzina et al. 2003). Typische Symptome sind Nasenpolypen und ein

bräunliches, eingedicktes bis krümeliges Sekret. Der Nachweis von Pilzbestandteilen wird

durch histopathologische oder mikrobiologische Untersuchung erbracht (Lund 1995). In der

Histopathologie zeigt sich neben Pilzhyphen, Charcot-Leyden-Kristallen und basophilem

Schleim eine ausgeprägte eosinophile Entzündungsreaktion (Settipane 1996b).

Pilzsporen sind potente Allergene und erreichen mit der Atemluft ständig den

Respirationstrakt, wo sie eine Entzündungsreaktion verursachen können. Die Frage, ob

Pilzbestandteile eine Typ I- oder Typ III-Hypersensitivität nach Gell und Coombs oder andere

Immunreaktionen verursachen, ist noch nicht abschließend geklärt. Der Nachweis von

erhöhten Gesamt- und pilzspezifischen IgE-Werten im Polypengewebe konnte in

verschiedenen Studien erbracht werden (Manning et al. 1993, Kuhn & Javer 2000, Schubert

2001, Bachert et al. 2001). 1999 gelang Ponikau et al. bei 96% der Patienten mit chronischer

Rhinosinusitis der Nachweis von Pilzen im nasalen Sekret durch eine neue,

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fluoresceinbasierte Untersuchungsmethode. Aber auch gesunde Probanden zeigten in hohem

Maße eine Pilzbesiedlung. Die Arbeitsgruppe konnte nur in 33% ein erhöhtes IgE im Serum

nachweisen. In weiteren Studien konnte belegt werden, dass bei Patienten mit chronischer

Rhinosinusitis Lymphozyten durch Pilzantigene zur Bildung von IL-5 und IL-13 angeregt

werden. Diese beiden Interleukine rekrutieren und aktivieren eosinophile Granulozyten, die

sich in so genannten „Clustern“ um die Pilzbestandteile im Nasensekret lagern. Diese

Immunreaktion ist bei gesunden Kontrollpersonen nicht nachweisbar (Braun et al. 2003). Da

bei der Mehrheit der Patienten keine positiven Reaktionen im Skin-Prick-Test oder erhöhte

IgE-Level im Serum nachgewiesen werden konnten, wurden die Ergebnisse als Ausdruck

einer lokalen allergisch-entzündlichen Reaktion auf Pilzantigene gedeutet und eine

Umbenennung des Krankheitsbildes in eosinophile Pilzsinusitis vorgeschlagen.

Auch wenn Pilzinfektionen für die Entstehung der chronischen Rhinosinusitis und Polyposis

nasi verantwortlich gemacht werden, konnte bisher der pathophysiologische Zusammenhang

nicht eindeutig geklärt werden. Auch therapeutisch konnte kein eindeutig positiver Effekt

einer antimykotischen Behandlung oder einer spezifischen Immuntherapie mit Pilzantigenen

nachgewiesen werden (Bachert et al. 2003). Weitere Forschungsergebnisse werden erwartet.

Die Therapie besteht derzeit aus der operativen Sanierung der Nasennebenhöhlen sowie ggf.

einer begleitenden systemischen und topischen Kortikoidgabe.

2.1.4.6 Gastroösophageale Refluxkrankheit

Auch ein Zusammenhang zwischen der gastroösophagealen Refluxkrankheit und der

Polyposis nasi wurde beschrieben (Chambers et al 1997). Delgaudio (2005) konnte eine

erhöhte nasale, laryngeale und ösophageale Refluxrate bei Patienten mit chronischer

Rhinosinusitis nachweisen. DiBaise & Sharma (2006) stellten eine Verbesserung der

Nebenhöhlenbeschwerden nach Einnahme eines Protonenpumpenhemmers fest. Kleemann et

al. (2005) konnten einen positiven Einfluss eines Protonenpumpenhemmers bei prolongierten

Heilungsverläufen nach endoskopischer NNH- Operation zeigen. Der Pathomechanismus für

den Zusammenhang zwischen Reflux und Sinusitis ist unklar, diskutiert werden der direkte

Kontakt zwischen gastraler Säure und Pepsin mit der Schleimhaut oder eine

neuroinflammatorische Reaktion über vagale Reflexbögen.

2.1.4.7 Konstitutionelle Faktoren

Eine genetische Prädisposition für die Polyposis nasi wird von wenigen Autoren

angenommen. In einer Studie zeigten 14% der Patienten mit Polyposis nasi eine familiäre

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14

Häufung (Greisner & Settipane 1996). May et al. (2000) geben bei Betroffenen mit Polyposis

nasi eine Erkrankungsrate der Kinder von 7% an. Rugina et al. (2002) fanden in einer

multizentrischen Studie in Frankreich sogar eine positive Familienanamnese für Polypen von

53%. Der Vererbungsweg konnte bisher nicht geklärt werden.

Zystische Fibrose

Die mit einer Häufigkeit von 1:2000 vorkommende zystische Fibrose ist eine homozygot,

autosomal-rezessive Erbkrankheit mit einem Defekt des CFTR-Gens. Störungen der

exokrinen Sekretion und die Bildung abnorm hochviskösen Schleims werden auf einen

Defekt des Chlorid-Kanals in Schleimhäuten zurückgeführt. Endonasal kommt der

mukoziliäre Transport aufgrund veränderter Sekreteigenschaften und reduzierter

Zilientätigkeit zum Erliegen. Die Folgen sind rezidivierende Sinusitiden und Polyposis nasi

bei 3-48% der Patienten, Bronchitiden, Bronchiektasen und Otitiden mit einer reduzierten

Lebenserwartung (Hadfield et al. 2000). Circa 30-40% der betroffenen Kinder haben nasale

Symptome, so dass bei kindlicher Polyposis nasi ein Pilokarpin-Iontophorese-Schweißtest

oder die Bestimmung des CTFR-Gens gefordert wird (Hadfield et al. 2000, Fokkens et al.

2007).

Primäre ziliäre Dyskinesiesyndrome

Die primäre ziliäre Dyskinesie steht als Überbegriff für eine Reihe angeborener, autosomal-

rezessiver Fehlbildungssyndrome auf der Ebene der Zilien des respiratorischen Epithels. Die

erste Beschreibung erfolgte im Zusammenhang mit dem Kartagener-Syndrom, das mit einer

Häufigkeit von 1:20000 vorkommt. Die Kinozilien des respiratorischen Epithels sind

aufgrund eines genetischen Defekts entweder a- bzw. dysplastisch oder chaotisch angeordnet,

wodurch eine geregelte Zilientätigkeit unmöglich wird. Dies führt zu einer Störung des

mukoziliären Apparates mit Sekretstau und somit zu chronischen Rhinosinutiden, Otitiden,

Bronchiektasen und einer herabgesetzten Lebenserwartung (Schrott-Fischer et al. 2008).

Zu einer vorübergehenden oder dauerhaften Zilienhypoplasie oder Ziliendysplasie mit

sekundärer Ziliendyskinesie und somit einer Einschränkung der mukoziliären Clearance

führen akute virale Entzündungen, chronische Entzündungen mit Pneumokokken oder

Bordetella-Species, Vitamin A-Mangel oder Nikotin (Riede et al. 1999).

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YOUNG-Syndrom

Die 1970 von Young beschriebene, autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung mit nicht

geklärtem Pathomechanismus ist Ursache von 7,4% der männlichen Infertilitäten und durch

Bildung von zähem Sekret gekennzeichnet. Symptome sind eine obstruktive Azoospermie,

chronische Rhinosinusitis, Polyposis nasi und chronische Bronchitis, ggf. mit

Bronchiektasien. Bei der Diagnostik zeigt sich ein normaler Schweißtest, eine normale

Pankreasfunktion und eine normale Zilienstruktur bzw. -schlagfrequenz (Hosemann et al.

1994).

Alpha1-Protease-Inhibitor-Mangel

Diese Erkrankung ist eine angeborene Bildungsstörung des alpha1-Proteaseinhibitors in den

Hepatozyten. Die Erkrankung kommt in einer schweren homozygoten und in einer leichteren,

heterozygoten Form vor. Hauptsymptome sind ein Lungenemphysem und eine Leberzirrhose.

Maune (1995) fand eine bis zu fünfmal erhöhte Rate der heterozygoten Form bei Patienten

mit Polyposis nasi im Vergleich zur Normalbevölkerung.

2.1.4.8 Immundefektsyndrome

Alle Patienten mit einem angeborenen oder erworbenen Immundefektsyndrom haben ein

erhöhtes Risiko, an einer Rhinosinusitis mit oder ohne Nasenpolypen zu erkranken. Oft sind

in diesen Fällen ungewöhnliche Keime und Pilze beteiligt (Manning et al. 1993). In einer

Studie über Patienten mit rezidivierender Sinusitis maxillaris konnten bei 55% ein

pathologischer Lymphozytenfunktionstest sowie reduzierte IgG-, IgM- und IgA-Werte

nachgewiesen werden (Chee et al. 2001). Zu den häufigsten Defekten gehören die sogenannte

„common variable immunodeficiency“, der IgG-Subklassenmangel und der selektive IgA-

Mangel. Es handelt sich um B-Zelldefekte mit Antikörpermangel (Herold 2002a). Bei HIV-

positiven Patienten konnte in Abhängigkeit von der CD4+-Zellzahl eine Prävalenz der

Rhinosinusitis bis 34% nachgewiesen werden (Garcia-Rodriguez et al. 1999).

2.1.4.9 „Yellow Nail“-Syndrom (Skleronychie)

Diese ätiologisch unklare Erkrankung geht mit einer entzündlichen Destruktion von

Lymphgefässen einher. Die typische Symtomtrias besteht aus gelblich verfärbten

Fingernägeln, regionären Lymphödemen der unteren Extremitäten und rezidivierenden

Pleuraergüssen. Circa 30% der Patienten haben eine chronische Rhinosinusitis; als

pathogenetischer Hauptfaktor wird hier der Lymphstau angesehen (Hosemann et al. 1994).

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2.1.4.10 Churg-Strauss-Syndrom

Die Erkrankung wird zu den ANCA-assoziierten, Eosinophilen-dominierten Vaskulitiden der

kleinen Gefäße gezählt. Die Erstmanifestation findet meist in der vierten Lebensdekade statt,

männliche Patienten sind häufiger betroffen. Unbehandelt liegt die 5-Jahres-Überlebensrate

bei 25%, behandelt bei 50%. Die meisten Formen sind idiopathisch, selten ist das Churg-

Strauss-Syndrom medikamentös, z.B. durch Makrolide (Herold 2002b) oder Montelukast

(Dietz et al. 1998) induziert. Neben einer erhöhten Anzahl von eosinophilen Granulozyten im

Differentialblutbild von >10% finden sich ein allergisches Asthma bronchiale und seltener

eine allergische Rhinitis, sowie flüchtige Lungeninfiltrate, Fieber, eine eosinophile,

granulomatöse Myokarditis oder Koronaritis und eine Mono- oder Polyneuropathie. 50% der

Patienten haben nasale Polypen (Settipane 1996a). Die Therapie besteht aus der Gabe

systemischer Kortikoide und Immunsuppressiva (Cyclophosphamid, Azathioprin,

Methotrexat, Ciclosporin A). Interferongabe ist in klinischer Erprobung (Settipane 1996a,

Herold 2002b).

2.1.4.11 Umweltmedizinische Aspekte

Untersuchungen zum Einfluss von Umweltschadstoffen auf die nasale Schleimhaut werden

zunehmend durchgeführt. Neben allergischen Reaktionen kommen toxisch-irritative

Störungen der nasalen Schleimhaut durch Ozon, SO2, NOX, Pentachlorphenol, Dioxin, Blei,

Quecksilber, Benzol, Lindan, Pyrethroide, polychlorierte Biphenyle und Formaldehyd in

Frage. Die Aktivierung von Entzündungsreaktionen der nasalen Schleimhäute durch Ozon

und Kalziumkarbonatstaub konnte experimentell bewiesen werden (Riechelmann 2000). Ein

direkter Zusammenhang zwischen den o.g. Stoffen und der Entstehung von Polypen konnte

bisher nicht nachgewiesen werden.

2.1.5 Pathogenese der Polyposis nasi

Es existieren viele Theorien zur Pathogenese der Polyposis nasi, u.a. betrachtete man

Nasenpolypen als echte Geschwulst, hereditäre Schleimhautreaktion, eine zystisch-

fibrotische Entartung der Schleimhautdrüsen, Schleimretentionszysten, obstruktives

Lymphödem, sekundäres Produkt von eitrigem Sekret oder als Ausdruck einer Vaskulitis oder

vasomotorischen Reaktion.

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2.1.5.1 Makroskopische Aspekte der chronischen Sinusitis und Polyposis nasi

Die Nase und das Nasennebenhöhlensystem bilden eine funktionelle Einheit.

Entwicklungsgeschichtlich sind Stirn- und Kieferhöhle aus dem vorderen Siebbein

entstanden, mit welchem sie über enge Spalten verbunden bleiben. Messerklinger (1979)

bezeichnete Stirn- und Kieferhöhlen als Nebenhöhlen, die dem Siebbein nachgeordnet sind.

Die gemeinsame Mündung von vorderem Siebbein, der Kieferhöhle mit Infundibulum

ethmoidale und der Stirnhöhle mit Recessus frontalis gilt als anatomische Schlüsselstelle für

die Belüftung und den Abtransport von Sekret aus den Nebenhöhlen (Messerklinger 1979,

Stammberger 1999). Um die Wichtigkeit dieser Region zu unterstreichen, wurde der Begriff

der ostiomeatalen Einheit eingeführt.

Seit Einführung der nasalen Endoskopie werden in vielen Schleimhautarealen Ödeme und

polypoide Schwellungen gefunden. Es ist weder bekannt, ob diese Veränderungen den Beginn

einer Polyposis nasi darstellen, noch, welche Faktoren zur Progression führen (Lund 1999).

Anatomische Varianten des ostiomeatalen Komplexes können durch Einengung der

Ventilations- und Drainagewege zu rezidivierenden Entzündungen prädisponieren bzw. das

Krankheitsgeschehen aufrechterhalten (Stammberger 1999). Zu diesen Varianten gehören

Septumdeviationen oder ausgeprägte Formen von Processus uncinatus, mittlerer

Nasenmuschel oder Siebbeinzellen (supra- und infraorbitale Zellen, pneumatisierter Agger

nasi). Allerdings werden solche Varianten auch bei Gesunden in gleicher Häufigkeit gefunden

(Bolger et al. 1991, Jones et al. 1997).

2.1.5.2 Mikroskopische Aspekte der chronischen Sinusitis und Polyposis nasi

Mikroskopisch zeigt die Oberfläche der Nasenpolypen ein hyperplastisch-proliferatives,

mehrschichtiges, respiratorisches Epithel. Gelegentlich sind auch metaplastische

Übergangsformen zum Plattenepithel zu erkennen (Hellquist 1996). Die Zahl der

Becherzellen nimmt im Vergleich zu normaler Schleimhaut ab und ihre Verteilung wird

unregelmäßiger. Kompensatorisch zeigen sich Becherzellhyperplasien (Lund 1995, Mygind

1999). Die Basalmembran zeigt eine Verdickung. Das Epithel wird durch Entzündungszellen

infiltriert und durchwandert, so dass dem Epithel mit Entzündungszellen durchsetzter Schleim

aufliegt (Braun et al. 2003).

Das Stroma der Nasenpolypen ist durch ein massives Bindegewebsödem oder durch

Bindegewebsfibrose und -sklerosierung gekennzeichnet (Fokkens et al. 1990; Lacroix et al.

2002). Außerdem findet sich eine reduzierte Anzahl von Blutgefäßen, Drüsen und

Nervenendigungen im Vergleich zu gesunder Schleimhaut. Die hyperämischen Blutgefäße

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zeigen offene endotheliale Junktionen, die das Ausströmen von Blutplasma ins Gewebe und

so die Ödembildung ermöglichen (Mygind 1999). Das Stroma ist ebenfalls durch

Entzündungszellen infiltriert (Kaldenbach et al. 1999). Gelegentlich sind Lymphfollikel

nachweisbar (Riede 1999). Die vorhandenen immunkompetenten Zellen produzieren eine

Vielzahl von regulatorischen und proinflammatorischen Zyto- und Chemokinen, die

wiederum auf die Zellen einwirken. Im Stroma einiger Polypen kann eine Hyperplasie der

Glandulae nasales nachgewiesen werden. Bei diesen Drüsen ist die Innervation gestört oder

aufgehoben, woraus eine irreguläre Produktion von Schleim (Hyper- und Dyskrinie)

resultiert. Zum Teil sind diese Drüsen zystisch degeneriert (Mygind 1999).

Anhand ihres histologischen Bildes werden polypöse Neubildungen der Nasenschleimhaut in

vier verschiedene Typen unterteilt (Hellquist 1996):

- Ödematös-eosinophiler Typ (85-90%): gekennzeichnet durch ein ödematöses,

drüsenreiches Stroma, viele eosinophile Granulozyten und Mastzellen, aber wenig

Fibroblasten im Stroma, eine verdickte Basalmembran und durch Becherzellhyperplasie

im respiratorischen Epithel.

- Chronisch-entzündlicher Polyp (<10%): gekennzeichnet durch ein fibroblastenreiches,

wenig ödematöses Stroma mit betont lymphozytärer Infiltration, wenigen eosinophilen

Granulozyten und Mangel an Becherzellen im Epithel.

- Seromukös-drüsiger Typ (<5%): gekennzeichnet durch viele seromuköse Drüsen im

Stroma.

- Polypen mit atypischem Stroma (<1%): gekennzeichnet durch Atypien der

Bindegewebszellen. Das Vorliegen einer Neoplasie muss ausgeschlossen werden.

Nach der „epithelial rupture theory“ ist das Wachstum der Polypen wahrscheinlich

stadienhaft: aufgrund der Schleimhautentzündung kommt es zu einer Epitheldysfunktion, die

eine Ruptur oder Nekrose der Epithelschicht inklusive der Basalmembran begünstigt. Bei

Persistenz der Läsion folgt eine interstitielle Ödembildung und Hervorquellen der Lamina

propria im rupturierten Bereich. Diese ödematöse Lamina propria bildet das Stroma des

künftigen Polypen, der durch seitliches Überwachsen des Epithels vervollständigt wird.

Gleichzeitig wächst das Epithel in den basalen Defekt ein. Es entstehen kleine Epithelzysten

an der Polypenbasis, die später konfluieren und den Polypenstiel bilden. Es kommt zur

Bildung von Drüsen im Polypen und im Endstadium zur zystischen Degeneration. Aufgrund

der anhaltenden Entzündung mit Gefäßdenervierung, der Gravitation und der

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Atemstromeffekte kommt es zum Ausdünnen des Polypenstiels, zu einer lokalen Fibrose und

zum Fehlen einer autonomen Innervation (Stierna 1996).

2.1.5.3 Betrachtungen über die beteiligten Zellpopulationen unter besonderer

Berücksichtigung des eosinophilen Granulozyten

Untersuchungen zu den Interaktionen der verschiedenen Zellen der Nasenschleimhaut sowie

der beteiligten Entzündungszellen sind in den letzten Jahren in den Vordergrund gerückt.

Epithelzellen der Nasenschleimhaut synthetisieren Zytokine wie IL-3, GM-CSF oder IL-5

und den Wachstumsfaktor IGF-1. Die Rolle von Fibroblasten und Fibrozyten bei der

Entstehung von chronischen Infektionen der oberen Atemwege ist noch nicht geklärt. Sie sind

hyperplastisch und produzieren im Vergleich zu gesunder Schleimhaut vermehrt GM-CSF

sowie M- und G-CSF. Sie zeigen außerdem einen veränderten Stoffwechsel mit einer

vermehrten Proteoglykanproduktion. Der Albumingehalt der extrazellulären Matrix von

Nasenpolypen ist erhöht im Gegensatz zur chronischen Rhinosinusitis oder normaler Mukosa.

Die Einlagerung von Fibronectin in der Nähe der eosinophilen Granulozyten insbesondere

subepithelial konnte nachgewiesen werden, obwohl die Fibronectinproduktion insgesamt

vermindert ist. Der Gehalt an Kollagen, Glycosaminoglykanen und Hyaloronsäure ist dagegen

gleich (Larsen et al. 1992, Bachert et al. 2000). Der veränderte Zellstoffwechsel ist

wahrscheinlich auf die Entzündungsreaktion zurück zu führen und kann als Erklärungsmodell

für den Zusammenhang von eosinophiler Entzündung und Polypenwachstum heran gezogen

werden (Nakagawa et al. 1998, Rudack et al. 2003).

Auf den vaskulären Endothelzellen werden Adhäsionsmoleküle wie ICAM-1 und VCAM-1

exprimiert und somit selektiv Immunzellen angelockt und die Akkumulation im Gewebe

verstärkt (Rudack & Bachert 1999).

Die amöboid beweglichen Mastzellen sind wichtige Effektorzellen bei der allergischen

Reaktion vom Sofort-Typ. Der Mastzellengehalt in Nasenpolypen ist eher niedrig, aber bei

chronischen Entzündungen oder allergischen Reaktionen können sie im oder unterhalb des

Epithels in hoher Konzentration nachgewiesen werden. Auf ihrer Oberfläche besitzen sie IgG-

und IgE- sowie C5a-Rezeptoren. Nach Aktivierung degranulieren Mastzellen und sezernieren

Histamin, Heparin, Leukotriene, Prostaglandine, Interleukine und die Enzyme Tryptase,

Chymase, Carboxypeptidase und Cathepsin G. Durch die Interleukine IL-3, IL-4, IL-5 und

GM-CSF sowie PAF haben sie Einfluss auf die Regulation der Immunantwort im Gewebe

(Bradding 1996)

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Die zum spezifischen Immunsystem zählenden Lymphozyten werden in B- und T-

Lymphozyten unterteilt. B-Lymphozyten dienen der humoralen Immunantwort und sind nach

Ausreifung zu Plasmazellen für die Synthese von Immunglobulinen verantwortlich.

Plasmazellen sind in Polypen verstärkt vorhanden und werden für die lokale Produktion von

IgE in Nasenpolypen verantwortlich gemacht (Bachert et al. 2001).

T-Lymphozyten dienen der zellulären Immunantwort und werden nach CD-

Oberflächenmarkern weiter in CD4-positive T-Helferzellen und CD8-positive zytotoxische T-

Zellen unterschieden. Die T-Lymphozyten in Nasenpolypen liegen subepithelial,

periglandulär oder verstreut im Stroma. T-Helferzellen produzieren eine Vielzahl von Zyto-

und Chemokinen. Aufgrund zwei unterschiedlicher Zytokinmuster werden sie nochmals in

Subpopulationen unterteilt: TH1-Zellen produzieren insbesondere IL-2, TNF- -

wodurch Makrophagen aktiviert werden. TH2-Zellen produzieren vorrangig IL-4, IL-5, IL-6,

IL-10 und IL-13, wodurch insbesondere eosinophile Granulozyten und B-Lymphozyten

aktiviert werden.

T-Lymphozyten der Nasenschleimhaut finden sich in der Nähe von Mastzellen, so dass man

einen Zusammenhang zwischen diesen beiden Zellpopulationen vermutet. Die vermutete

Dysfunktion der T-Lymphozyten könnte aufgrund der nachfolgenden Aktivierung von

eosinophilen Granulozyten und Mastzellen für die nasale Entzündungsreaktion

pathogenetisch bedeutender sein (Bachert et al. 2003).

Granulozyten sind der Infektabwehr dienende Leukozyten, deren zytoplasmatische Granula

unterschiedlich angefärbt werden können. Danach werden sie in neutrophile, eosinophile und

basophile Granulozyten unterteilt. Sie sind zu Migration und Phagozytose befähigt,

sezernieren zahlreiche Zellbotenstoffe und bekämpfen Erreger durch Bildung von freien

Radikalen.

Neutrophile Granulozyten sind die Haupteffektoren bei einer akuten Entzündung. Neben der

Sezernierung von lysosomalen Enzymen und Sauerstoffradikalen setzen sie zahlreiche

Zellbotenstoffe wie TNF- -1 und GM-CSF frei. Bei zystischer Fibrose, Kartagener-

Syndrom und Young-Syndrom findet sich in der Nasenschleimhaut hauptsächlich eine

Infiltration mit neutrophilen Granulozyten (Rowe-Jones et al. 1997, Bachert et al. 2003)

Die in der Nasenschleimhaut selten zu findenden basophilen Granulozyten haben

mastzellähnliche Funktionen. Ihre Granula beinhalten saure Mediatoren wie Histamin. Sie

sezernieren die Interleukine IL-4 und IL-13. An ihrer Zellmembran ist IgE gebunden,

wodurch sie an der allergischen Reaktion vom Sofort-Typ beteiligt sind. Außerdem dienen sie

der Abwehr von Parasiten (Dahinden et al. 1997).

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Eosinophile Granulozyten

Die 1879 von Paul Ehrlich als eosinophile Granulozyten bezeichneten Zellen zeichnen sich

durch die Anfärbbarkeit ihrer Granula mit dem Farbstoff Eosin, einem bromierten

Fluoreszeinderivat, aus. Die ovalrundlichen, eosinophilen Granulozyten sind durchschnittlich

12-15µm groß, haben einen gelappten Zellkern und azidophile Granula in ihrem Zytoplasma

(Kroegel 1992). Die Granula enthalten basisch-toxische Proteine wie ECP, EPO, MBP und

EDN, mit deren Hilfe parasitäre Zellmembranen lysiert werden. So wirken eosinophile

Granulozyten helminthotoxisch und bakterizid. Außerdem bewirken sie durch Bildung von

O2- Radikalen (s.g. „respiratory burst“) eine Epitheldesquamation und führen durch

Aufrechterhaltung der Entzündungsreaktion zur Hyperreagibilität von Schleimhäuten

(Bruijnzeel et al. 1992, Stoop et al. 1993). Eosinophile Granulozyten sezernieren eine Reihe

von Zellbotenstoffen wie Leukotriene, Prostaglandine, Interleukine, GM-CSF, TGF- -

- PAF (Kroegel 1992). Durch Produktion von IL-5, Eotaxin und RANTES sind

sie in der Lage, sich selbst zu stimulieren und eine Entzündungsreaktion aufrecht zu halten

(Ying et al. 1996, Nakajima et al. 1998). Sie exprimieren Oberflächenrezeptoren für

Immunglobuline, Komplementfaktoren, Zyto- und Chemokine sowie

Histokompatibilitätsmoleküle für die Antigenpräsentation (Bruijnzeel et al. 1992, Elsner &

Kapp 2001)

Normalerweise haben eosinophile Granulozyten einen Anteil von 2-4% im

Differentialblutbild. Erhöht sind sie bei parasitären oder allergischen Erkrankungen. Sie

befinden sich für 24-26 Stunden im peripheren Blut und wandern dann in Gewebe ein, wo sie

normalerweise bis zu 14 Tage überleben (Kroegel 1992). In gesunder nasaler Schleimhaut

konnte eine geringe Anzahl eosinophiler Granulozyten sowie deren Produkt ECP

nachgewiesen werden (Rasp 1994). Bei einer chronischen Sinusitis mit oder ohne Polypen

sind eosinophile Granulozyten regelmäßig vorhanden (Jankowski 2002). Allerdings sind wie

bei einer akuten Sinusitis auch bei der chronischen Sinusitis ohne Polypen die eosinophilen

Granulozyten nicht massiv erhöht. Es dominieren eher neutrophile Granulozyten (Jankowski

1996, Rudack & Bachert 1999, Bachert et al. 2000). Die eosinophile Entzündung ist bei der

Polyposis nasi deutlich ausgeprägter (Jankowski 2002). Bei 65-90% der Fälle sind sie die

vorherrschenden Entzündungszellen (Hellquist 1996, Kaldenbach et al. 1999).

Die Bestimmung der Gewebseosinophilie wird routinemäßig nach HE-Färbung durch

qualitative Begutachtung durchgeführt. Semiquantitativ werden Zellsuspensionen nach

Kimura-Färbung in einer Neubauer-Zellzählkammer untersucht. Gewebsschnitte werden nach

___________________________________________________________________Einleitung

22

Paraffineinbettung und HE-Färbung des polypösen Gewebes bei 400facher Vergrößerung in

konventioneller Durchlichtmikroskopie begutachtet.

Die eosinophilen Granulozyten stellen sich in der Lichtmikroskopie normo- und hypodens

dar. 20% aller Zellen in Nasenpolypen sind eosinophile Granulozyten, wovon sich 75%

hypodens darstellen (Stierna 1996, Mygind 1999). Der Anteil hypodenser eosinophiler

Granulozyten steigt bei Inkubation mit Chemo- und Zytokinen, so dass man hypodense

eosinophile Granulozyten als aktivierte Eosinophile ansieht. Hypodense eosinophile

Granulozyten lassen sich mit dem monoklonalen Antikörper EG-2 anfärben, der lange Zeit als

Marker für den Aktivierungszustand eosinophiler Granulozyten galt. Da die Färbung aber von

der Fixationsmethode abhängig ist, wird diese Zuordnung mittlerweile angezweifelt (Jahnsen

& Brandtzaeg 1995).

2.1.5.4 Beteiligte Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle

Der mechanische Kontakt von Schleimhaut zueinander führt zur Ausschüttung zahlreicher

Zytokine und anderer Entzündungsmediatoren, die verschiedenste Wirkungen auf alle

beteiligten Zellen haben (Mygind 1999).

Zytokine sind Zellbotenstoffe, deren biologischer Effekt auf kurzer Distanz auf

verschiedenste Zellen wirkt. Zu ihnen gehören TNF- -

Wachstumsfaktoren wie GM-CSF und TGF- tete Migration

von Zellen, die Zellselektion und die Zellaktivierung. Sie werden in zwei Gruppen unterteilt;

zum einen die C-X-C-Gruppe für die Chemotaxis der neutrophilen Granulozyten (z.B. IL-8),

zum anderen die C-C-Chemokine für die Chemotaxis der eosinophilen Granulozyten (z.B.

RANTES). Adhäsionsmoleküle werden auf Zellmembranen exprimiert oder kommen in

gelöster Form vor. Sie haben eine Haftungs- und Aktivierungsfunktion und modulieren die

selektive Zellmigration durch die Gefäßwand. Zu ihnen gehören die Selektine (E-Selektin),

die Immunglobulin-Superfamilie (IgSF) wie ICAM, VCAM und deren Liganden, die

Integrine (LFA-1, VLA-4) (Rudack & Bachert 1999).

Während akute Rhinosinusitiden mit einer IL-8-, IL-6-, IL- -getriggerten,

neutrophilen Entzündungsreaktion einhergehen, stehen bei einer chronischen Rhinosinusitis

ohne Nasenpolypen IL-8 und IL-3 im Vordergrund. Da IL-3 einen fibrotischen Umbau der

Schleimhaut fördert, könnte es für die Schleimhautverdickung im ostiomeatalen Komplex

verantwortlich sein (Rudack & Bachert 1999). Weitere beteiligte Botenstoffe bei der

chronischen Rhinosinusitis sind IL-1, IL-6, IL-3, TNF- -CSF, ICAM-1, MPO und ECP.

VCAM-1 und IL-5 sind nicht erhöht (Bachert et al. 2000).

___________________________________________________________________Einleitung

23

Kennzeichen der Polyposis nasi ist die ausgeprägte Gewebseosinophilie. Pathogenetisch wird

sie durch eine gesteigerte transendotheliale Migration und durch Inhibierung des

programmierten Zelltodes der Eosinophilen erklärt (Rudack & Bachert 1999).

Migrationsmechanismen für eosinophile Granulozyten:

Chemotaktische Potenz auf eosinophile Granulozyten sind für IL- -4, IL-5, IL-8,

RANTES und Eotaxin nachgewiesen. Während IL- -

transendotheliale Migration fördern, bewirkt IL-8 eher die Migration neutrophiler als

eosinophiler Granulozyten. RANTES gehört zu den C-C-Chemokinen und bewirkt die

Chemotaxis eosinophiler Granulozyten, die transendotheliale Migration, die Produktion

radikaler O2-Radikale und die Freisetzung von ECP (Kroegel 1992).

Eotaxin wirkt auf den Rezeptor CCR3, der auf eosinophilen Granulozyten und anderen

Leukozyten sowie Epithelzellen exprimiert wird, und stimuliert die selektive Migration

eosinophiler Granulozyten (Bachert et al. 2000, Shin et al. 2000).

Die Adhäsionsmoleküle ICAM, VCAM, E- und P-Selektin werden auf Endothelzellen in

Nasenpolypen exprimiert. Der Ligand des VCAM ist VLA-4, das auf eosinophilen, aber nicht

neutrophilen Granulozyten exprimiert wird. Die Expression könnte durch IL-4 (von T-

Lymphozyten, eosinophilen Granulozyten und Mastzellen) oder durch TNF-

werden (Jahnsen et al. 1995). Weitere Adhäsionsmoleküle auf eosinophilen Granulozyten

sind MAC-1 und LFA-1 (Adams & Shaw 1994). Der Mechanismus der transendothelialen

Migration und Selektion eosinophiler Granulozyten bleiben trotz dieser Erkenntnisse nicht

vollständig geklärt (Rudack & Bachert 1999).

Verlängerte Überlebenszeit eosinophiler Granulozyten

Die verlängerte Überlebenszeit von eosinophilen Granulozyten ist durch eine Reduktion der

Apoptoserate bedingt. Die Apoptose ist ein gezielter, Gen-vermittelter Vorgang, der den

Zelltod ohne begleitende Entzündungsreaktion verursacht. Ein Zusammenhang zu den

unterschiedlichen Verteilungsmustern von Zyto- und Chemokinen sowie

Adhäsionsmolekülen bei gesunder Nasenschleimhaut im Vergleich zu Nasenpolypen wird

vermutet: geringer exprimiert werden IL-1 und IL-1RA, keinen Unterschied fand man bei der

Expression von TNF- -6, IL-10, IL-8, GRO- -

geringer Konzentration in Nasenpolypen, IL-3 und IL-4 gar nicht nachgewiesen werden.

Vermehrt exprimiert wird IL-5, wobei sich kein Unterschied von IL-5 bei nicht-/ allergischen

Patienten zeigte, aber die höchste Konzentration bei Patienten mit Analgetika-Intoleranz und

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24

Asthma bronchiale nachgewiesen werden konnte. In Nasenpolypen exprimieren mehr als 50%

der eosinophilen Granulozyten das IL-5-Gen und ca. 30% das GM-CSF-Gen (Ohno et al.

1991). 70% aller IL-5-positiven Zellen sind eosinophilen Granulozyten. Die Ausschüttung

eosinophiler Granulozyten aus dem Knochenmark wird durch IL-5 und GM-CSF gefördert.

Die Apoptose wird durch IL-3, IL-5, GM-CSF und IFN- inhibiert. Simon et al. (1997)

konnten die verlängerte Überlebenszeit der eosinophilen Granulozyten nachweisen. In vitro

zeigten sich apoptotische Veränderung der eosinophilen Granulozyten in Polypen ab Tag 8-

12, in der gesunden Schleimhaut ab Tag 2-5 und bei Blut- Eosinophilen nach 24 Stunden. Bei

Zugabe eines neutralisierenden Antikörpers gegen IL-5 kam es viel schneller zur Apoptose,

während die Zugabe von IL-3- oder GM-CSF- Antikörper keine Änderung des Beginns der

Apoptose bewirkten.

Wahrscheinlich ist die reduzierte Apoptose der bedeutendere Mechanismus der Anreicherung

eosinophiler Granulozyten im Polypengewebe. Die Reduktion wird wesentlich durch IL-5

reguliert, das wiederum vermehrt von eosinophile Granulozyten produziert und freigesetzt

wird. Ebenso bewirken eosinophile Granulozyten durch vermehrte Produktion von GM-CSF

die Reifung und Ausschüttung weiterer eosinophiler Granulozyten aus dem Knochenmark.

Die Eosinophilie ist somit ein autokriner, sich selbst erhaltender Entzündungsprozess (Simon

et al. 1997, Bachert et al. 2000). Da sich die Zyto-, Chemokin und Zellverteilungsmuster bei

Ersterkrankung und Rezidiven der Polyposis nasi gleichen, werden die gleichen

Pathomechanismen für die Entstehung von Rezidiven verantwortlich gemacht.

2.1.6 Therapie der Polyposis nasi

Durch Erstellen internationaler und nationaler Leitlinien mithilfe der evidenzbasierten

Medizin wurde das therapeutische Vorgehen bei der Polyposis nasi in den letzten Jahren

koordiniert (Fokkens et al. 2007). Die Therapie richtet sich nach der vermuteten Genese,

früheren Behandlungsergebnissen und dem histologischen Ergebnis. Die konservative

Therapie beinhaltet die Anwendung topischer oder systemischer Kortikoide, die stark auf die

Entzündungszellen wirken. In klinischer Erprobung befinden sich wiederholt topisch und

systemisch angewendete, antibiotische und antimykotische Präparate. Für Antimykotika gibt

es keinen eindeutigen Wirkungsnachweis bei der Polyposis nasi. Ein mindestens 12 Wochen

dauernder Einsatz von Makrolid-Antibiotika führte zu einer Verbesserung der Symptomatik

der chronischen Sinusitis (Ragab et al. 2004). Eine unterstützende Medikation mit

Sekretolytika und Antihistaminika wird häufig eingesetzt. Bei Patienten mit einer Analgetika-

Intoleranz sind postoperative Kortikoide oder eine Analgetika-Desaktivierung hilfreich

___________________________________________________________________Einleitung

25

(Jäntti-Alanko et al. 1989, Hosemann et al. 2000). Patienten mit Allergien profitieren von

einer spezifischen Immuntherapie (Bachert et al. 2003). Wichtig ist ein klärendes Gespräch

zwischen Arzt und Patient über gegebene Therapiemöglichkeiten, z.B. die Aufklärung der

Patienten über die Wirkweise von Kortikoiden.

Bei rezidivierenden oder anhaltenden Symptomen trotz intensiver konservativer Therapie ist

eine funktionell endoskopische oder mikroskopische Nasennebenhöhlenoperation die

Methode der Wahl. Der Eingriff ist je nach erwarteter Ausdehnung in Intubationsnarkose oder

in Regionalanästhesie durchführbar. Intraoperative Navigations- sowie Shaver-Systeme

werden zunehmend eingesetzt, insbesondere um bei Revisions-Operationen weitestgehend

schleimhautschonend vorgehen und Verletzungen der Schädelbasis oder Orbita vermeiden zu

können (Metson et al. 1998). Entferntes Gewebe wird in Formalin fixiert und zur

histopathologischen Untersuchung eingeschickt.

Ziele der konservativen und operativen Therapie sind die Wiederherstellung und

Aufrechterhaltung einer uneingeschränkten Epithelfunktion, die Eliminierung der Polypen

oder zumindest die Reduzierung der Polypengröße, eine ausreichende Drainage und

Belüftung der Nasennebenhöhlen, die Verringerung der nasalen Obstruktion und somit die

Ermöglichung von Nasenatmung und Riechen, weiterhin die Verringerung von Symptomen

wie Niesen, Rhinorrhoe und Kopfschmerzen. Operationen, Rezidive und wiederholte

Operationen sollen möglichst vermieden werden.

Zusammenfassend erscheint bei einem vielschichtigen, komplizierten Krankheitsprozess wie

der Polyposis nasi ein kombiniertes, chirurgisch-medikamentöses Vorgehen heute als

Methode der Wahl.

2.2. Die Laser Scanning Zytometrie

Die Laser Scanning Zytometrie ist eine Methode zur Bestimmung von fluoreszenzmarkierten

Zellparametern. Sie kombiniert die Vorteile der Durchflusszytometrie und der Bild-Analyse,

so dass die Möglichkeiten der zytometrischen Analyse von Zelleigenschaften, deren

Auswertung und Dokumentation erweitert werden.

Das Prinzip der Laser Scanning Zytometrie besteht aus dem Anfärben von Zellstrukturen mit

fluoreszierenden Farbstoffen, der Anregung dieser Farbstoffe mit Laserlicht und der Analyse

des von den gefärbten Zellen emittierten Lichts.

___________________________________________________________________Einleitung

26

2.2.1 Aufbau und Funktionsweise des Gerätes

Das Laser Scanning Zytometer (LSC) besteht aus einem herkömmlichen

Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Lasersystem in Verbindung steht. Die Laser dienen

wie bei der Durchflusszytometrie der Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe. Für die

vorliegende Studie standen ein Argon-Laser und ein Helium-Neon-Laser mit einer Emission

von 488nm bzw. 633nm zur Verfügung. Die Strahlen der beiden Laser laufen koaxial, jedoch

zeitversetzt. Sie treffen zunächst auf einen oszillierenden Scanspiegel und werden von dort

über weitere Spiegel durch das Objektiv auf das Objekt gelenkt. Bei Projektion des Lasers

durch das in dieser Studie verwendete 20x Objektiv hat der resultierende Spot eine Größe von

5µm im Durchmesser. Durch das auftreffende Laserlicht werden die fluoreszenzmarkierten

Zellen zur Emission von Licht angeregt (s. Tabelle 2).

Fluorochrome Optimale

Anregung (nm)

Eingesetzte

Anregung (nm)

Emission (nm) Spektralgrenzen

des Filters (nm)

FITC 495 488 519 515-545

PI 535 488 617 611-639

APC 651,633 633,635 660 650 LP

Tab. 2: Die optimale Anregung, eingesetzte Anregungswellenlängen und Emissionsmaxima

der verwendeten Fluorochrome und die Spektralgrenzen des verwendeten Filtersets.

Das emittierte Licht nimmt den Strahlengang der Laser in umgekehrter Richtung bis zu einem

Teilerspiegel. Dieser lenkt das Licht über vier dichroische Spiegel mit nachgeschalteten

Bandpassfiltern zu vier Photomultipliern. Diese detektieren Licht eines spezifischen

Wellenlängenbereichs. Die Signale der Photomultiplier werden verstärkt und automatisch in

Digitalwerte zur Benutzung am PC umgewandelt. Dabei werden auch die X- und Y-

Koordinaten der gemessenen Ereignisse gespeichert, so dass später die Position jeder

erkannten Zelle auf dem Objektträger bestimmt werden kann (s. Abb. 1).

___________________________________________________________________Einleitung

27

Abb. 1: Aufbau des LSC (modifiziert nach dem Original von CompuCyte®). Erklärung im

Text.

Mit dem LSC kann eine Vielzahl von Zellparametern in kurzer Zeit bestimmt werden. Diese

werden in Diagrammen, Histogrammen und Streudiagrammen mit Hilfe der zugehörigen

WinCyte® Software dargestellt. Durch die Speicherung der X- und Y-Koordinaten ermöglicht

das LSC das Relokalisieren und die Visualisierung von Zellen auf dem Objektträger mittels

einer CCD-Kamera. Diese Möglichkeit ist auch noch nach Abschluss der Messung und sogar

nach Entfernen der Objektträger, Umfärbung (z.B. durch HE-Färbung) und erneutem

Auflegen auf den Objekttisch möglich. Das Mikroskop verfügt über eine Lichtquelle,

wodurch eine Durchlichtmikroskopie durchgeführt werden kann. Somit können Zellmerkmale

überprüft und mehrere Färbetechniken kombiniert werden.

2.2.2 Zelldefinition am LSC und Trigger

Vor Beginn jeder Messung werden verschiedene Messparameter des LSC eingestellt. Zu

diesen gehören die zu aktivierenden Laser, die jeweiligen Kanäle und die Einstellungen für

die Photomultiplier (Voltage, Offset und Gain). Außerdem wird festgelegt, welche

Eigenschaften als Definition für eine Zelle dienen. Diese Eigenschaften sind die minimale

___________________________________________________________________Einleitung

28

Fläche und die minimale Pixelhelligkeit (Treshold) eines Messereignisses. Der Trigger liegt

bei dieser Arbeit auf der Fluoreszenz der nukleären DNA, also dem Parameter PI (rote

Fluoreszenz). Nach dem Starten der Messung bewegt das LSC den Objektträger mit 0,5µm

großen Schritten durch den Laserstrahl und erfasst alle festgelegten und messbaren

Ereignisse.

Für jede im LSC gemessene Probe werden folgende Parameter bestimmt: die Zellzahl, die X-

und Y-Koordinaten der gemessenen Ereignisse, die Zellfläche, der Zellumfang, die integrale

Helligkeit und der maximale Fluoreszenzgipfel der PI-, APC- und FITC-Fluoreszenz.

Um die als Zelle definierten Ereignisse werden vom Rechner in Abhängigkeit von der

Fluoreszenz-Intensität vier Konturen gelegt. Der Trigger ist bei allen Messungen dieser Arbeit

der FL3-Kanal (Pl, rote Fluoreszenz). Die innen liegende rote Kontur stellt die Triggerkontur

dar und umfährt das Primärereignis. Die nach außen folgende grüne Kontur ist die eigentliche

Analysekontur. Auf diese folgen eine innere und eine äußere blaue Backgroundkontur (s.

Abb. 2a und 2b).

Abb. 2a Abb. 2b

Abb. 2a und 2b „Scan Data“- Fenster. In allen durchgeführten Messungen wurde auf PI

getriggert. Es handelt sich um eine synoptische Farbdarstellung über Fehlfarbcolorierung

(CompuColor) der beiden Parameter DNA-PI (rot) und FITC (grün). In Abb. 2a sind die PI-

und FITC- Färbungen im „Scan Data“- Fenster während eines Messvorgangs zu sehen, in

Abb. 2b die Ansicht eines Messbereiches derselben Messung und Darstellung der

Triggerkonturen.

___________________________________________________________________Einleitung

29

2.2.3 Darstellungsmöglichkeiten

Die vom LSC gespeicherten Daten können in vielfältiger Weise dargestellt und ausgewertet

werden. Messungen einzelner Parameter werden in Histogrammen dargestellt. Zwei

Parameter werden in Streudiagrammen (Scattergrams, Dot Plots) gegeneinander aufgetragen.

So können verschiedene Zellpopulationen voneinander abgegrenzt werden. Die WinCyte®

Software ermöglicht die Erstellung von Regionen im Diagramm, die einzeln statistisch

ausgewertet werden. Durch späteres Relokalisieren der gemessenen Zellen können die ihnen

zugeordneten Eigenschaften überprüft werden.

In den folgenden Abbildungen sind die in dieser Arbeit verwendeten Darstellungsmethoden

erläutert.

Abb. 3

Abb. 3 Histogramm: Darstellung eines Parameters. Im hier dargestellten DNA-Histogramm

stellen sich zwei Peaks je nach DNA-Gehalt der Zellen dar (rote Fluoreszenz, PI).

Abb. 4a Abb. 4b

___________________________________________________________________Einleitung

30

Abb. 4a und 4b Histogramme: die vergleichende Darstellung der Zytokeratin-Expression

(langwellig-rote Fluoreszenz, APC) in Histogrammen. In Abb. 4a die Messung der Kontrolle,

in Abb. 4b die Messung der Kontrolle (schwarze Fläche) und gleichzeitige Darstellung der

Messung des Verum als „overlay“ (violetter Graph) in einem Diagramm.

Abb. 5a Abb. 5b

Abb. 5a und 5b Streudiagramme: Darstellung von zwei Parametern. Auf der X-Achse ist der

DNA-Gehalt (rote Fluoreszenz, PI), auf der Y-Achse die Zytokeratin-Expression (langwellig-

rote Fluoreszenz, APC) aufgetragen.

In der zugrunde liegenden Messung können die Populationen abgegrenzt werden, indem

ihnen Regionen zugeordnet werden. Abb. 4a zeigt die Messung der Kontrolle. Die Linie

entspricht dem Cut-off-Level (5%) der Negativkontrolle. Darüber stellt sich in Abb. 4b die

spezifische Zytokeratin-Färbung dar. Die neue prozentuale Verteilung wird bei Aufrufen der

spezifischen Messung berechnet.

________________________________________________________Material und Methoden

31

III Material und Methoden

siehe auch Anhang: Lösungen und Hilfsmittel (S. 94)

3.1 Auswahl des Patientenguts, Gewebeentnahme und Datenerfassung

Im Zeitraum von November 2000 bis April 2002 wurde Gewebe von 41 Patienten untersucht.

Alle Patienten unterzogen sich in der Klinik für HNO-Heilkunde der Universität Leipzig einer

endonasalen Nasennebenhöhlen-Operation. Die stationären und ambulanten Patientenakten

wurden zur Auswertung herangezogen. Patienten, die histologisch keine Polyposis nasi,

sondern z. B. ein invertiertes Papillom oder einen malignen Tumor hatten, wurden

ausgeschlossen.

Alle relevanten Daten wurden tabellarisch aufgezeichnet. Gesondert für jeden Patienten

wurden Geburtsjahr und Alter bei Operation, Geschlecht, klinische Diagnose, Voroperation,

Begleiterkrankungen und anamnestische Angaben zu Allergie, Analgetika-Intoleranz,

Asthma, chronischer Bronchitis, zystischer Fibrose, Medikamenteneinnahme und

Rauchverhalten erfasst. Aus dem Operationsbericht wurden Daten zur Lokalisation des

entfernten polypösen Gewebes entnommen. Außerdem wurden Informationen über die

Histologie, insbesondere über das zelluläre Infiltrat im Gewebe, aus dem pathologischen

Gutachten des Instituts für Pathologie der Universität Leipzig entnommen.

Der Studienaufbau wurde von der Ethikkommission der Universität Leipzig genehmigt

(#593).

3.2 Präparation und Aufbewahrung der Proben

Nach operativer Entfernung der Polypen werden 0,5-2 cm³ große Gewebsproben unmittelbar

in 10ml 0,9%iger Natriumchloridlösung bei 4° C gelagert. Die restlichen Polypen werden zur

histologischen Beurteilung an das Institut für Pathologie gesendet.

Nach maximal 24 Stunden beginnt die eigentliche Präparation mit der mechanischen

Zerkleinerung der Proben mithilfe eines Skalpells in Stücke von zirka 3mm³. Die Relation

zwischen epithelialem und stromalem Gewebe bleibt dabei weitestgehend erhalten. Die

weitere mechanische Disaggregation erfolgt mit dem DAKO Medicon, Medimachine und

Filcon System. Dazu wird eine DAKO Medicon Disaggregationskammer mit 50µm-Netz mit

1,5ml PBS gefüllt und mit den Gewebsstücken beladen. Nach Einsetzen des DAKO Medicon

in die DAKO Medimachine bewegt der Automat die Stahlklinge im Inneren des DAKO

Medicons mit einer konstanten Geschwindigkeit von 100 U/min und drückt so das Gewebe

________________________________________________________Material und Methoden

32

durch die 50µm großen Poren des DAKO Medicons. Die Herstellung der

Einzelzellsuspension in der DAKO Medimachine erfolgt für 60 Sekunden. Danach wird die

Suspension mithilfe einer 5ml Einmalspritze über den Spritzenzugang des DAKO Medicon

entnommen. Es folgt eine zweimalige Spülung des DAKO Medicons mit jeweils 2ml PBS

über den Spritzenzugang. Die gewonnene Suspension wird durch einen DAKO Filcon mit

einer Porengröße von 100µm filtriert und in einem 5ml Rundbodenröhrchen aufgefangen. Im

Anschluss daran wird für 5min bei 2000 U/min zentrifugiert. Nach Dekantieren des

Überstandes erfolgt die Resuspension des Pellets bei Raumtemperatur in 3ml Lyse-Puffer, der

frisch aus dem gelieferten Konzentrat hergestellt wird. Nach 15minütiger Inkubation mit dem

Lyse-Puffer wird ein zweites Mal 5min bei 2000 U/min zentrifugiert. Die erneute

Resuspension erfolgt unter optischer Kontrolle mittels eines Mikroskops je nach Zelldichte

mit 100 bis 600µl, 4°C 0,5%iger BSA-PBS-Lösung. Diese Suspension wird auf einen

beschrifteten Objektträger mithilfe einer Schablone aufgetragen, so dass sich auf einem

Objektträger zwei 18x18 mm² große Felder befinden (s. Abbildung 6). Dies ermöglicht die

Standardisierung der Feldgröße. Die Zelldichte pro Feld wird mittels eines Mikroskops

überprüft und gegebenenfalls korrigiert. Ziel hierbei ist es, möglichst viele Zellen vereinzelt,

aber nah nebeneinander auf den Objektträger zu bringen und anschließend zu fixieren, um

später gute Messergebnisse bei kurzer Messdauer zu erhalten.

Abb. 6 Skizze eines 75x25mm großen Objektträgers mit zwei 18x18mm großen Feldern. Das

linke Feld wird für die Positivfärbung, das rechte Feld für die Kontrollfärbung verwendet.

Anschließend werden die Objektträger in einem Abzug staubfrei gelagert und bei

Raumtemperatur luftgetrocknet. Die Fixierung der Zellen erfolgt daraufhin durch Einstellen

der Objektträger in einen Aufbewahrungsbehälter gefüllt mit 10ml 70% Ethanol. Die so

präparierten und fixierten Zellen können bei Raumtemperatur mehrere Monate aufbewahrt

und verwendet werden.

________________________________________________________Material und Methoden

33

3.3 Präparation und Aufbewahrung von Testzellen

Um die optimale Konzentration des Farbstoffs FITC zu ermitteln, werden Titrationsversuche

an peripheren Blutzellen durchgeführt. Von drei freiwilligen Probanden werden Blutproben

entnommen. Jeweils 1ml Blut wird mit 3ml Lyse-Puffer für 15min inkubiert. Im Anschluss

daran wird 5min bei 2000 U/min zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Die weiteren

Präparationsschritte entsprechen denen unter 3.2. beschriebenen.

3.4 Immunzytologische Färbung

Um die Messung von Zellparametern im LSC durchführen zu können, ist eine

immunzytologische Färbung der präparierten und in 70%igen Ethanol bei Raumtemperatur

gelagerten Zellen erforderlich.

Das Gesamtvolumen einer Färbelösung pro Feld ergibt in jedem Färbeschritt 100µl.

Zum Färben wird ein Objektträger aus dem Ethanol entnommen und für 15min in 4°C kaltes

PBS gestellt.

Die erste Färbelösung wird wie folgt vorbereitet: in je ein Eppendorfhütchen werden pro Feld

97µl 0,5% BSA-PBS-Lösung und 3µl Antikörper pipettiert. Für die Positivmessung werden

3µl Mäuse-IgG1-anti-Cytokeratin, Klon MNF116 und für die Negativkontrolle 3µl Mäuse-

IgG1-Negativkontrollantikörper verwendet. Nach dem Herausnehmen aus dem PBS und

Dekantieren überschüssiger Flüssigkeit werden die zwei auf dem Objektträger befindlichen

Felder mit Fettstift umrahmt und der Objektträger mit Angaben zur Färbung beschriftet.

Daraufhin wird die vorbereitete Färbelösung aufgetragen, auf je ein Feld die Lösung für die

Positivmessung und für die Negativkontrolle. Die Inkubation der Zellen mit der Färbelösung

schließt sich für 20min in einer dunklen, feuchten Kammer unter leichtem Schütteln an.

In dieser Zeit wird die zweite Färbelösung vorbereitet, wobei ab diesem Zeitpunkt die

Objektträger vor Lichteinfall geschützt werden müssen. Der zweite Färbeschritt ist für die

Positivmessung und die Negativkontrolle identisch, so dass nur ein Eppendorfhütchen

benötigt wird. Pro Feld werden 92µl 0,5%ige BSA-PBS-Lösung, 3µl Ziege-anti-Maus-IgG1-

Biotin-Färbelösung und 5µl FITC-Färbelösung 1:500 in ein Eppendorfhütchen pipettiert.

Nach der Inkubation mit der ersten Färbelösung werden die Felder zweimal mit jeweils 500µl

PBS aufgefüllt und der Objektträger dekantiert. Der spezifische Färbevorgang wird durch

diesen Waschvorgang gestoppt. Es folgt die Inkubation mit der zweiten Färbelösung,

ebenfalls für 20min in einer dunklen, feuchten Kammer und unter leichtem Schütteln. Danach

schließt sich ein weiterer Waschvorgang wie oben beschrieben an.

________________________________________________________Material und Methoden

34

Der dritte Färbeschritt ist ebenfalls für die Positivmessung und Negativkontrolle identisch und

wird wie folgt vorbereitet: in ein Eppendorfhütchen werden 87µl 0,5% BSA-PBS-Lösung, 3µl

Streptavidin-APC-Färbelösung und 10µl PI-Färbelösung pipettiert. Nach dem zweiten

Waschvorgang wird die dritte Färbelösung aufgetragen und wieder für 20min unter leichtem

Schütteln in einer dunklen, feuchten Kammer inkubiert. Es folgt ein dritter Waschvorgang

wie oben beschrieben.

Danach werden die einzelnen Felder mit 40µl PI-Glycerol-PBS-Lösung und 24x24mm²

großen Deckgläschen eingedeckt. Die gefärbten Objektträger werden bei Zimmertemperatur

im Dunkeln aufbewahrt und innerhalb der nächsten 24 Stunden im LSC gemessen.

Labeled Streptavidin-Biotin-Methode

Zur Färbung der Zytokeratinfilmente epithelialer Zellen wurde in dieser Studie die „labeled

Streptavidin-Biotin-Methode“ angewendet. Bei dieser indirekten Färbemethode wird in einem

ersten Schritt ein unkonjugierter, spezifischer Antikörper (hier: Mäuse-IgG1-anti-Cytokeratin,

Klon MNF116) verwendet, der an bestimmte Epitope des Zytokeratins bindet. In einem

zweiten Schritt wird ein, mit dem wasserlöslichen Enzym Biotin gekoppelter Antikörper

(hier: Ziege-anti-Maus-IgG1-Biotin) verwendet, der gegen das Fc-Fragment des

Primärantikörpers gerichtet ist. Der dritte Färbeschritt besteht in der Zugabe einer

Streptavidin-APC-Färbelösung. Streptavidin besitzt vier Bindungsstellen für Biotin und

bindet hochaffin an das Enzym. So wird nicht nur eine eindeutige Darstellung der

Primärfärbung, sondern auch eine Intensivierung der Fluoreszenz des APC erreicht (Gerstner

et al. 2002b).

3.5 Titrationsversuche für FITC, PI und APC

Um die optimale Konzentration des Farbstoffs FITC zum Anfärben von eosinophilen

Granulozyten im polypösen Gewebe zu finden, wurden Titrationsversuche durchgeführt.

Diese Versuche wurden zunächst an normalen peripheren Blutzellen durchgeführt und später

auf die in oben beschriebener Weise präparierten Zellen der Nasenpolypen übertragen.

Folgende Konzentrationen pro Feld wurden getestet:

10µg/ml 50µg/ml 100µg/ml 500µg/ml 1mg/ml 5mg/ml 10mg/ml

Der Anteil der eosinophilen Granulozyten an der Gesamtzellzahl wurde mit dem LSC

bestimmt und mit den Daten der Blutbildanalyse des Instituts für Laboratoriumsmedizin,

________________________________________________________Material und Methoden

35

Klinische Chemie und Molekulare Diagnostik der Universität Leipzig verglichen. Die

optimalen Konzentrationen für die Färbung mit Propidiumiodid und APC wurden aus

laborinternen Vorversuchen übernommen (Gerstner et al. 2002b, Gerstner et al. 2002c).

3.6 Messungen im LSC

Mittels LSC werden für jede Probe folgende Eigenschaften bestimmt: die Zellzahl, die x-y-

Koordinaten der gemessenen Ereignisse, das Integral der PI-Fluoreszenz pro Zelle sowie das

Integral der APC- und FITC-Fluoreszenz.

Jeweils ein Objektträger mit immunzytologisch gefärbten Zellen wird auf den motorisierten

und computergesteuerten Objekttisch des Mikroskops platziert, wobei auf genaues Anlegen

an den vorgegebenen Kanten zu achten ist, damit das spätere Relokalisieren der Zellen

ermöglicht wird.

Nach Aufrufen der WinCyte™ Software werden vor Beginn der Messung verschiedene

Messparameter eingestellt: unter dem Menüpunkt „Instruments“ auf der Registrierkarte

„Parameter“ die zu messenden Frequenzbereiche der Fluoreszenz benannt nach Farben

(green, orange, red und long red), außerdem der Forward Scatter jeweils für den Argon- und

den Helium-Neon-Laser, die Verstärkung im Photomultiplier (PMT), die je nach Parameter

zwischen 4 und 20 Prozent liegt, und der Offset, für den 2050 bis 2095 für die PMT der

Spektralbereiche und 1700 für die Photodiode des Forward Scatters gewählt werden. Auf der

Registrierkarte „Computation“ wird festgelegt, welche Messereignisse als Definition für eine

Zelle dienen. Hier wird der Parameter PI (rot) mit einer minimalen Fläche von 20µm² und

einem Threshold von 800 bis 1000 eingestellt. Auf der Registrierkarte „Background“ wird das

dynamische Messverfahren für den Hintergrund eingestellt.

Unter dem Menüpunkt „Scan Area“ wird die zu messende Region auf dem Objektträger

definiert. Dazu wird eine quadratische Fläche erstellt und mithilfe des Mikroskops

kontrolliert, ob in der festgelegten Fläche genügend Zellen liegen. Durch Aufrufen der Option

„Go“ öffnet sich das „Notation“-Menü. Hier werden Details zur aktuellen Messung und das

Färbeprotokoll kurz notiert und danach mit der Messung begonnen. Das LSC bewegt nun den

Objektträger mit 0,5µm großen Schritten durch den Laserstrahl und erfasst alle festgelegten

und messbaren Ereignisse.

Während der Messung besteht die Möglichkeit, die Einstellung der minimalen Pixelhelligkeit

(Threshold) und der minimalen Fläche im Fenster „Scan Data“ und die Einstellungen des

Photomultipliers und des Offsets im Fenster „Sensors“ zu kontrollieren und bei Bedarf zu

________________________________________________________Material und Methoden

36

verändern. So wird vermieden, dass Zellen gar nicht oder als Dubletten erkannt werden. Bei

Änderungen von Parametern wird erneut mit der Messung begonnen.

Die Zahl der gemessenen Zellen wird in der Statusleiste angezeigt. Wenn eine Gesamtzellzahl

von 5000 Zellen erreicht ist, wird die Messung gestoppt. Daraufhin öffnet sich das

„Notation“-Menü erneut und die Messung wird gespeichert.

Pro Objektträger wird ein Feld mit dem spezifischen Antikörper für Cytokeratin, das andere

Feld mit dem entsprechenden Negativkontrollantikörper inkubiert, die Färbung für die DNA

mit PI und für die eosinophilen Granulozyten mit FITC ist auf beiden Feldern gleich. Die

Messung der Positiv- und Negativkontrolle erfolgt im LSC stets mit der gleichen Einstellung

aller oben genannten Eigenschaften.

3.7 Darstellungen der Messdaten in Diagrammen

Die Messdaten des LSC werden mit der WinCyte™ Software ausgewertet und grafisch

dargestellt. Pro Messung werden sechs Diagramme erstellt. Die Messungen der Positiv- und

Negativkontrolle werden mithilfe der Software verglichen und Unterschiede grafisch

dargelegt.

Zur Qualitätskontrolle wird ein Streudiagramm mit der PI-Fluoreszenz (DNA-Gehalt) auf der

X- Achse und den dazugehörigen y- Koordinaten auf der Y- Achse erstellt. Damit werden

Präparations- und Färbefehler sichtbar gemacht, die sich als Punktwolken mit zu geringer

oder zu hoher Dichte im Diagramm abbilden würden. Diese Darstellung dient der Kontrolle

vor dem Erstellen weiterer Diagramme und wird nicht in der Präsentation abgespeichert.

In einem zweiten Diagramm wird ein Histogramm der PI-Fluoreszenz erstellt. Messereignisse

mit weniger als dem 0,5fachen oder mehr als dem 2,5fachen DNA-Gehalt stellen Zelldebris,

Dubletten oder Zellhaufen dar. In diesem Histogramm werden die einzelnen, intakten Zellen

durch Erstellen einer Region von den zerstörten oder in Haufen liegenden Zellen abgegrenzt.

Alle anderen Diagramme werden auf diese Region mithilfe der „Gate“-Funktion der

WinCyte® Software bezogen.

Im dritten und vierten Diagramm werden die Messergebnisse für den Parameter Zytokeratin-

APC dargestellt. Es werden zum einen ein Histogramm und zum anderen ein Streudiagramm

mit der PI-Fluoreszenz auf der X-Achse und der APC-Fluoreszenz auf der Y-Achse erstellt.

Zur Bestimmung des Anteils zytokeratinpositiver Zellen wird die Option „Create Quadrants“

aus dem Kontextmenü gewählt und in der Negativmessung eine Grenze von 5% festgelegt.

Wenn nun im selben Diagramm die Positivmessung aufgerufen wird, stellt die Software die

Messdaten der Positivmessung mit der festgelegten 5%-Grenze aus der Negativmessung dar

________________________________________________________Material und Methoden

37

und berechnet gleichzeitig die neue prozentuale Verteilung (siehe Abbildungen 5a und 5b in

Einleitung, 2.2.3 Darstellungsmöglichkeiten, S. 31).

Um die den Messwerten zugrunde liegenden Ereignisse zu visualisieren, wird die „view cells

in region..- rescan and view cell image“- Funktion verwendet. Dabei fährt das LSC die in der

festgelegten Region befindlichen Ereignisse ab, scannt die Zellen erneut und stellt das

Messergebnis als Pixelmap dar. Die ausgegebenen Farben können unter „Compucolor“

definiert werden. Die Bilder werden in einer Galerie mit einer Größe von 4×4 Bildern in

einem Präsentationsprogramm mit dem zugehörigen Diagramm gespeichert.

Im fünften und sechsten Diagramm werden die Messergebnisse für den Parameter FITC

dargestellt. Es werden wiederum ein Histogramm sowie ein Streudiagramm erstellt. Im

Streudiagrmm erfolgt die Darstellung mit der PI-Fluoreszenz auf der X-Achse und der FITC-

Fluoreszenz auf der Y-Achse. In diesem Diagramm werden mit der „create polygon“-

Funktion alle FITC-positiven Zellen in einem Rechteck zusammengefasst. Diese werden

ebenfalls mit der „view cells in region..“-Funktion neu gescannt, als Pixelmap dargestellt und

in derselben Präsentation als neue Galerie gespeichert.

Mithilfe der „Region statistics“-Funktion wird aus beiden Streudiagrammen (DNA-PI versus

Zytokeratin-APC bzw. FITC) die Gesamtzellzahl, die Anzahl der Zellen in den einzelnen

Regionen und deren prozentualem Anteil an der Gesamtzellzahl berechnet und tabellarisch

dargestellt. Auch diese Darstellung wird in der Präsentation zusammen mit den restlichen

Diagrammen gespeichert. Für jeden Patienten werden so in einer Präsentation insgesamt fünf

Diagramme, zwei Galerien und zwei Tabellen zusammengefasst (s. Anhang S. 98: Beispiel:

Darstellung der Messung in Diagrammen, statische Auswertung und Bilddokumentation).

Nach der Messung und Auswertung wird der betreffende Objektträger vom Tisch des

Mikroskops genommen und kann sofort mit Hämatoxylin und Eosin umgefärbt werden.

3.8 HE-Färbung

Nach der immunzytologischen Färbung und Messung der Zellen im LSC werden die Zellen

mit Hämatoxylin und Eosin (HE) umgefärbt. Dazu werden die Objektträger für 30min

senkrecht in eine Glasküvette mit 4°C kaltem PBS eingestellt, bis sich die Deckgläschen lösen

und die Zellen so wieder für eine Färbelösung zugänglich sind. Im ersten Färbeschritt werden

die Objektträger 9 min in Hämatoxylin gestellt. Darauf folgt eine 10minütige Spülung mit

kaltem, fließendem Leitungswasser. Nach Sicht differenziert wird durch kurzzeitiges

Eintauchen in HCl- Alkohol, worauf sich ein kurzes Bläuen in 1%igem Ammoniak

anschließt. Danach wird erneut 10min mit kaltem, fließendem Wasser gespült. Die folgende

________________________________________________________Material und Methoden

38

Färbung mit Eosin wird für 4-5 min durchgeführt. Nach diesem Färbeschritt wird eine

aufsteigende Alkoholreihe bis zum absoluten Alkohol I (Ethanol 70%, 80%, 96%)

durchlaufen. Im absoluten Alkohol bleiben die Objektträger 5 min, danach werden sie noch

einmal 5 min in eine weitere Glasküvette mit absolutem Alkohol II gestellt. Im Anschluss

daran folgt ein zweimaliges Einstellen der Objektträger in Xylol für jeweils 5 min. Die auf

den Objektträgern befindlichen Zellen werden danach mit Eukitt® 24x24 mm² großen

Deckgläschen eingedeckt. Die Färbung wird mit einem Lichtmikroskop (Carl Zeiss, Jena)

kontrolliert. Nach dem Trocknen können die Zellen erneut im LSC mit Durchlicht

entsprechend der jeweiligen Messung relokalisiert und morphologisch eingeordnet werden.

Die Objektträger werden in dieser Form lichtgeschützt und trocken archiviert.

3.9 Relokalisation der Zellen

Die morphologische Kontrolle der gemessenen Ereignisse erfolgt mittels der

Durchlichteinheit des LSC. Die Nachbetrachtung der Zellen ist möglich, da die gemessenen

Ereignisse zusammen mit ihren x-y-Koordinaten gespeichert werden.

Ein HE-gefärbter Objektträger wird dazu genau wie bei der ersten Messung auf dem

Objektträgertisch positioniert. Nach Aufrufen der WinCyte® Software wird der Parameter

„brightfield“ eingestellt, um die Durchlichteinheit des LSC zu aktivieren. Die dem zu

betrachtenden Objektträger zugehörige immunzytologische Messung wird aufgerufen. Im

Streudiagramm DNA-PI versus Zytokeratin-APC wird der Quadrant der zytokeratinpositiven,

diploiden Zellen gewählt und die Funktion „view cells in region..“ aus dem Kontextmenü

aktiviert. Im folgenden Dialogfenster wird die CCD-Kamera des LSC aufgerufen. Das LSC

fährt den Objektträgertisch zum entsprechenden Feld des Objektträgers und beginnt, für alle

Ereignisse die x-y-Koordinaten abzufahren und die entsprechenden Zellen anzuzeigen.

Mithilfe der „True Color Copy“-Funktion werden die einzelnen Zellen fotografiert und dann

in die schon von der immunzytologischen Messung vorhandene Präsentation eingefügt.

Der Arbeitsschritt wird für die Region der eosinophilen Granulozyten im Streudiagramm

DNA-PI versus FITC wiederholt.

Außerdem können eventuelle unklare Messergebnisse betrachtet werden.

3.10 Manuelle Auszählung mit dem Lichtmikroskop

Parallel zur automatischen Auszählung der Zellen mit dem LSC werden bei 19 Patienten die

Objektträger zusätzlich manuell mit einem Lichtmikroskop ausgewertet. Nach HE-Färbung

werden die einzelnen Felder auf den Objektträgern mäanderförmig durch das Lichtmikroskop

________________________________________________________Material und Methoden

39

bewegt und sowohl die epitheliale Zellen als auch die eosinophilen Granulozyten gezählt.

Wenn rund 3000 epitheliale Zellen ausgezählt sind, wird die Bestimmung beendet und die

Ergebnisse in eine Tabelle eingetragen.

3.11 Histopathologische Beurteilung der Gewebsschnitte

Die histopathologische Begutachtung der Gewebsschnitte erfolgt semiquantitativ durch

Gutachter des Instituts für Pathologie der Universität Leipzig. Um die eosinophile Infiltration

im polypösen Gewebe zu beschreiben, werden vier Grade (0 bis 3) festgelegt. Dabei

entspricht 0° = keine oder nur vereinzelte Infiltration; 1° = gering- bzw. mäßiggradig

vermehrte Infiltration, 2° = deutlich vermehrte Infiltration und 3°= hochgradig vermehrte

Infiltration. Für Berechnungen mit Fishers exaktem Test werden die Grade 0 und 1 als Gruppe

mit eosinophilenarmen Polypen und die Grade 2 und 3 als Gruppe mit eosinophilenreichen

Polypen zusammengefasst.

3.12 Statistische Auswertung

Die Alters- und Geschlechtsverteilung der 41 Patienten wird berechnet und grafisch

dargestellt.

Die im LSC bestimmten Zellzahlen für alle diploiden Zellen (ndip), epitheliale Zellen (nepi),

Stromazellen (nstroma) und eosinophile Granulozyten (neos) werden tabellarisch

zusammengefasst. Es werden mehrere Relationen berechnet:

1. Epi%dip: das prozentuale Verhältnis von epithelialen Zellen bezogen auf die Zahl aller

diploiden Zellen, die sich aus eosinophilen Granulozyten, epithelialen Zellen und

Stromazellen zusammensetzt.

Epi%dip = nepi/ ndip = nepi/ (neos+nepi+nstroma) x 100% bzw.

2. Stroma%dip: das prozentuale Verhältnis von stromalen Zellen bezogen auf die Zahl aller

diploiden Zellen, die sich aus eosinophilen Granulozyten, epithelialen Zellen und

Stromazellen zusammensetzt.

Stroma%dip = nstroma/ ndip = nstroma/ (neos+nepi+nstroma) x 100%

3. Eos%dip: das prozentuale Verhältnis von eosinophilen Granulozyten bezogen auf die Zahl

aller diploiden Zellen, die sich aus eosinophilen Granulozyten, epithelialen Zellen und

Stromazellen zusammensetzt.

Eos%dip = neos/ ndip = neos/ (neos+nepi+nstroma) x 100%

________________________________________________________Material und Methoden

40

Weiterhin wird das prozentuale Verhältnis von eosinophilen Granulozyten zur Summe aus

eosinophilen Granulozyten und epithelialen Zellen berechnet (LSC-Eos%eos+epi). Dieser

Quotient wird auch aus den Daten der manuellen Auszählung (Man-Eos%eos+epi) gebildet:

LSC-Eos%eos+epi = neos/ (neos+nepi) x 100%

Man-Eos%eos+epi = neos/ (neos+nepi) x 100%

Die Übereinstimmung der drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung der eosinophilen

Infiltration im Gewebe sollen verglichen werden. Dazu wird der Pearson Koeffizient zur

Bestimmung der Korrelation zwischen den berechneten Verhältnissen LSC-Eos%eos+epi und

Man-Eos%eos+epi berechnet. Die Regressionskurve wird in einem Diagramm dargestellt.

Der Zusammenhang zwischen den im LSC bestimmten Verhältnissen (Eos%dip) mit den

Ergebnissen der histopathologischen Begutachtung wird in einem Boxplot dargestellt.

Weiterhin werden mit Hilfe des H-Tests nach Kruskal-Wallis p-Werte berechnet, um

statistische Unterschiede der eosinophilen Infiltration bezüglich der histopathologischen

Gradeinteilung zu untersuchen. Die gleichen Methoden werden auf die Daten der manuellen

Auszählung angewendet.

Im Patientenkollektiv soll zwischen Patienten mit einem Rezidiv bzw. einer Allergie und

Patienten mit erstmaligem Auftreten von Nasenpolypen bzw. ohne Allergie unterschieden

werden. Der Zusammenhang zwischen der eosinophilen Infiltration mit dem Auftreten von

rezidivierenden bzw. allergischen Beschwerden wird mit Fishers exaktem Test untersucht.

Zur Berechnung werden Vierfeldertafeln (eosinophilenreich ja/nein und Rezidiv bzw.

Allergie ja/nein) aufgestellt. Für die Entscheidung, ob ein Gewebe eosinophilenreich ist,

werden im LSC mehrere Grenzen für Eos%dip bei 2%, 3% und 5% festgelegt. Bei der

histopathologischen Begutachtung wird ein Gewebe als eosinophilenreich gewertet, wenn es

Grad 2 oder 3 zugeordnet wurde. Somit werden insgesamt acht Vierfeldertafeln aufgestellt

und der jeweilige p-

Außerdem erfolgt die grafische Darstellung der beobachteten Datenpaare in einem Boxplot

einmal für Rezidiv ja/nein gegen Eosinophilie in Prozent und Allergie ja/nein gegen

Eosinophilie in Prozent.

__________________________________________________________________Ergebnisse

41

IV Ergebnisse

Von November 2000 bis April 2002 wurde Gewebe von 41 Patienten untersucht, die sich in

der Klinik für HNO-Heilkunde der Universität Leipzig einer funktionell endonasalen

Nasennebenhöhlen-Operation unterzogen. Der Einsatz des LSC zur zytometrischen

Diagnostik der Polyposis nasi wurde getestet. Protokolle für den Nachweis von

Zellparametern im untersuchten Gewebe wurden entwickelt, um eine einfache und schnelle

Methode zu entwickeln, die Eosinophilie im polypösen Gewebe quantitativ zu bestimmen und

eine mögliche Erweiterung des Einsatzgebietes des LSC zu finden.

Bei der Auswertung wurden verschiedene Patientengruppen verglichen. Der prozentuale

Anteil der eosinophilen Granulozyten im Polypengewebe wurde für Patienten mit und ohne

inhalativer Allergie bzw. für Patienten mit und ohne Rezidiv verglichen.

4.1 Auswahl des Patientenguts, Gewebeentnahme und Datenerfassung

4.1.1 Geschlechts- und Altersverteilung

Von den 41 Patienten sind 31 (76%) männlichen Geschlechts und 10 (24%) weiblichen

Geschlechts (s. Abb. 7). Dies ergibt eine Verteilung von 3:1 zugunsten der männlichen

Patienten.

Geschlechtsverteilung

31 entspricht 76%

10 entspricht 24%

männlich

weiblich

Abb. 7: Geschlechtsverteilung

__________________________________________________________________Ergebnisse

42

Der Median des Patientenalters liegt geschlechtsübergreifend bei 43 Jahren. Der jüngste

Patient ist 9 Jahre, der älteste 76 Jahre alt. Es ergibt sich ein Altershäufigkeitsgipfel bei den

36- bis 40jährigen. Ein weiterer Gipfel findet sich bei den 66-70jährigen (siehe Abb. 8).

Altersverteilung

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

06-1

0

11-1

5

16-2

0

21-2

5

26-3

0

31-3

5

36-4

0

41-4

5

46-5

0

51-5

5

56-6

0

61-6

5

66-7

0

76-8

0

Alter

An

zah

l de

r P

ati

en

ten

Abb. 8: Altersverteilung

4.1.2 Klinische Diagnose, Lokalisation und anamnestische Angaben

Bei allen Patienten lautet die klinische Diagnose chronische Polyposis nasi. Eine operative

Therapie wurde aufgrund anhaltender Beschwerden, wie Nasenatmungsbehinderung,

Druckgefühl, Kopfschmerzen, Riech- oder Geschmacksstörungen durchgeführt. Intraoperativ

wurde in 29 Fällen (71%) Gewebe vom Sinus ethmoidales, in 9 Fällen (22%) Gewebe von

Sinus ethmoidalis und maxillaris und in weiteren 3 Fällen (7%) Gewebe vom Sinus

ethmoidalis, maxillaris und sphenoidalis oder frontalis entnommen (s. Abb. 9).

Lokalisation

68%

22%

10%

S. ethm. S. ethm.+ S. max. S. ethm.+ S. max.+ S. front.+ S. sph.

Abb. 9: intraoperative Lokalisation der Nasenpolypen

__________________________________________________________________Ergebnisse

43

Die anamnestischen Angaben zu Voroperationen an den Nasennebenhöhlen ergeben eine

Aufteilung von 15 Patienten mit einem Rezidiv und 26 Patienten ohne Rezidiv. Das ergibt

eine Rezidivrate von 36,6% im untersuchten Patientengut.

20 Patienten haben eine inhalative Allergie, 21 Patienten haben keine Allergie. Somit ergibt

sich eine Allergierate von 48,8% im Patientengut. Eine Übersicht zu Häufigkeiten von

Rezidiven und allergischen Erkrankungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (siehe Abb.

10).

Anamnestische Angaben

2621

1520

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Rezidiv Allergie

An

zah

l d

er

Pa

tie

nte

n

ja

nein

.

Abb. 10: Anamnestische Angaben zu Rezidiv und Allergie

4.2. Titrationsversuche

Tests für die optimale Anfärbung der DNA mit dem Farbstoff PI sind bereits vor Beginn der

Studie laborintern durchgeführt worden. Die Konzentration von 50µg/ml PI in der

Färbelösung und die Zugabe von 25µg/ml PI zum Eindeckmedium wird in Vorversuchen

getestet und ist für die Untersuchungen sehr gut geeignet (Gerstner et al. 2002b, 2002c).

Für die Färbung der Zytokeratinfilamente werden zunächst ebenfalls die Konzentrationen aus

Vorversuchen übernommen (Gerstner et al. 2002c). Es erfolgt die Umstellung von einem

FITC-konjugierten Antikörper auf einen unkonjugierten Antikörper, der in einem zweiten und

dritten Färbeschritt über eine Biotin-Streptavidin-Verbindung zur spezifischen Anfärbung von

Zytokeratin mit APC führt. Die Antikörpermengen werden von 5µl/100µl auf 3µl/100µl

verringert und getestet, ob die Ergebnisse übereinstimmen. Da die prozentualen Verteilungen

der Zytokeratin-positven und –negativen Zellen pro Patient keine Unterschiede der

Messergebnisse bei beiden Konzentrationen zeigen, wird die Antikörperkonzentration von

3µl/100µl Färbelösung beibehalten.

__________________________________________________________________Ergebnisse

44

Die optimale Farbstoffmenge für FITC wird bestimmt. Farbstoffmengen von 10mg/ml,

5mg/ml, 1mg/ml und 500µg/ml sind weniger geeignet, da neben den eosinophilen

Granulozyten auch Zelldetritus angefärbt wird. Außerdem erweist sich ein erhöhtes

Hintergrundsignal als störend bei der Messung. Bei einer Konzentration von 10µg/ml werden

die eosinophilen Granulozyten selektiv angefärbt, erscheinen aber bei der optischen Kontrolle

und im „Scan Data“- Fenster eher blass. Die Konzentration von 50µg/ml erweist sich als am

besten geeignet, da die eosinophilen Granulozyten sehr gut selektiv angefärbt werden und

vom LSC gemessen werden können. Die Farbstoffmenge ist gering genug, um die Anhebung

des Hintergrundsignals zu vermeiden (s. Abb. 11, Abb. 12 und Abb. 13).

Abb. 11: Titrationsversuche. In der oberen Reihe sind die gescannten Zellen in

Fehlfarbcolorierung (CompuColor) der beiden Parameter DNA-PI (rot) und FITC (grün)

dargestellt. In der unteren Reihe die entsprechenden Zellen nach Umfärben mit HE und

Relokalisation. Bei jeder Konzentration werden eosinophile Granulozyten spezifisch gefärbt.

Die optische Kontrolle ergibt das beste Ergebnis bei einer Konzentration von 50µg/ml.

__________________________________________________________________Ergebnisse

45

Abb. 12: Darstellung der grünen Fluoreszenz (X- Achse, FITC max pixel) in Histogrammen

einer Messung an peripheren Blut-Leukozyten. Links die Messung ohne Färbung mit FITC

mit blauem „overlay“-Graph. Die Detektion einer geringen Grünfluoreszenz entspricht der

Autofluoreszenz von Leukozyten. Rechts die Positivmessung nach Färbung mit FITC mit

einer sich deutlich abgrenzenden Zellpopulation (grüner Pfeil). Der blaue Graph entspricht

der links dargestellten Negativmessung.

Abb. 13: Färbung von peripheren Blut-Leukozyten mit PI und FITC. Links oben das

entsprechende Streudiagramm. Auf der X-Achse die PI-Fluoreszenz (rot; lineare Einteilung),

auf der Y-Achse die Darstellung der FITC-Fluoreszenz (grün; logarithmische Einteilung). In

Region 1 finden sich diploide Zellen mit hoher Grünfluoreszenz. In Region 3 diploide Zellen

mit deutlich geringerer Grünfluoreszenz. In Region 2 und 4 kommen Zellhaufen und

Dubletten zu liegen. Rechts im Bild sind die gescannten Zellen in Fehlfarbcolorierung

(CompuColor): DNA-PI = rot und FITC = grün, zusammen mit den entsprechenden

relokalisierten Zellen nach HE-Färbung. In der unteren Bildreihe sind Beispiele der aus

__________________________________________________________________Ergebnisse

46

Region 3 relokalisierten FITC-negativen Zellen zu sehen (neutrophile Granulozyten,

Lymphozyten).

4.3 Messungen mit dem LSC

Die Messung mit dem Laser LSC erfolgt innerhalb 24 Stunden nach der Färbung der

Objektträger. Die Färbung der Zellen mit PI, anti-Zytokeratin-Antikörper und FITC erweist

sich als gut praktikabel und sehr stabil.

Der Median der erfassten Gesamtzellzahl (ndip) beträgt 5010 Zellen mit einer

Standartabweichung von 1177 Zellen.

Der Median der Anzahl Zytokeratin-positiver Zellen (nepi) liegt bei 3594 mit einer

Standardabweichung von 1417 Zellen. Der Median des prozentualen Anteils der Zytokeratin-

positiven Zellen an der Gesamtzellzahl (Epi%dip) liegt bei 73,1% mit einer

Standardabweichung von 19,0%. Der kleinste prozentuale Anteil an zytokeratin- positiven

Zellen in einem Polypen beträgt 5,3%, der größte Anteil beträgt 87,8%.

Der Median der Anzahl eosinophiler Granulozyten (neos) beträgt 71 Zellen mit einer

Standardabweichung von 119 Zellen. Der Median des prozentualen Anteils an der

Gesamtzellzahl (Eos%dip) liegt bei 1,5% mit einer Standardabweichung von 2,9%. Hier

ergaben sich ein Minimalwert von 0,1% und ein Maximalwert von 14,4% der Gesamtzellzahl.

Der Median der Anzahl Zytokeratin-negativer, nicht eosinophiler Zellen (nstroma) in einer

Probe liegt bei 1163 Zellen mit einer Standardabweichung von 915 Zellen. Der Median des

prozentualen Anteils dieser Zellen an der Gesamtzellzahl (Stroma%dip) liegt bei 25,0% mit

einer Standardabweichung 18,5%. Es ergeben sich ein Minimalwert von 7,5% und ein

Maximalwert von 86,5%.

LSC-Daten ndip nepi epi%dip neos eos%dip nstroma stroma%dip

Mittelwert 4919 3407 68,4 120 2,6 1392 29,1

Median 5010 3594 73,1 71 1,5 1163 25,0

Standardabw. 1178 1416 19,0 119 2,9 915 18,5

Min- Wert 2173 269 5,3 0 0 377 7,5

Max- Wert 7826 6869 87,8 461 14,4 4616 92,0

Tab. 3: Übersicht über die LSC- Daten und deren statistischer Auswertung.

__________________________________________________________________Ergebnisse

47

Für den Methodenvergleich von LSC und manueller Auszählung wird bei den 19 auch

manuell ausgezählten Gewebsproben ein weiteres Verhältnis aus den LSC-Daten bestimmt:

der Anteil von eosinophilen Granulozyten an der Summe aus epithelialen Zellen und

eosinophilen Granulozyten (LSC-Eos%eos+epi). Hierbei ergibt sich ein Median des prozentualen

Anteils der eosinophilen Granulozyten an der Gesamtzellzahl von 1,5% mit einer

Standardabweichung von 3,4%. Der Minimalwert beträgt 1,0 % und der Maximalwert 20,4 %

(s. Tab. 4 unter Punkt 4.4 Manuelle Auszählung).

4.4 Relokalisation und Bilddokumentation

Nach erfolgter Messung werden die entsprechenden Diagramme und Tabellen erstellt (s. Abb.

14, 15 und 17). Die Messereignisse werden erneut für die Bilddokumentation gescannt.

Nach HE-Färbung der Objektträger wurden die Proben erneut im LSC analysiert und die

Messereignisse bildlich dokumentiert (s. Abb. 16 und 17). Der Zellverlust durch die HE-

Färbung betrug weniger als 5%. Von jedem Zelltyp wurden 50 Zellen relokalisiert und die

Messung so kontrolliert.

Abb. 14: Histogramm des DNA-Gehalts eines Polypen (rote Fluoreszenz, PI). Es stellen sich

ein Peak bei 1 (diploide Zellen) und 2 (tetraploide Zellen) dar, was gesunden Zellen

entspricht. Die Messereignisse mit weniger als dem 0,5fachen oder mehr als dem 2,5fachen

des einfachen DNA- Gehalts stellen Zelldebris, Dubletten oder Zellhaufen dar und wurden

daher in die weiteren Analysen nicht einbezogen.

__________________________________________________________________Ergebnisse

48

Abb. 15: Darstellung der Zytokeratin-Messung in Histogrammen. Links im Bild ist die

Kontrollmessung dargestellt, in der Mitte die Positiv-Messung mit dem „overlay“-Graphen

(violett). Ganz rechts finden sich beide Messungen in einem Diagramm: der violette Graph

kennzeichnet die Positiv-Messung, die schwarze Fläche die Kontrolle.

Abb. 16: Messung der Zytokeratin-Expression. Links die Darstellung des entsprechenden

Streudiagramms. mit der PI-Fluoreszenz (DNA) auf der X-Achse und der APC-Fluoreszenz

(Zytokeratin) auf der Y-Achse. Dargestellt sind rechts oben im Bild die HE-gefärbten,

relokalisierten, Zytokeratin-positiven Zellen und unten die Zytokeratin-negativen Zellen.

Unter diesen finden sich auch eosinophile Granulozyten.

__________________________________________________________________Ergebnisse

49

Abb. 17: Messung der eosinophilen Granulozyten. Links oben das Histogramm einer

Positivmessung der Grün-Fluoreszenz (FITC) in einem Polypen. Der grüne Pfeil

kennzeichnet die Zellpopulation mit einer 100-fach höheren Intensität der Grün-Fluoreszenz.

Rechts daneben das entsprechende Streudiagramm mit der Darstellung von DNA-PI auf der

X-Achse und der FITC-Fluoreszenz auf der Y-Achse. Die FITC-positiven, eosinophilen

Granulozyten im grünen Quadrat (Region 1) sind nach Umfärbung mit HE und Relokalisation

im unteren Bild dargestellt.

4.5 Manuelle Auszählungen

Zum Methodenvergleich wurden bei 19 Patienten die Objektträger nach HE-Färbung

zusätzlich manuell mit einem Lichtmikroskop ausgewertet. Die Summe aus gezählten

epithelialen Zellen und eosinophilen Granulozyten wird bestimmt (neos+nepi). Der Median der

ausgezählten Zellen liegt bei 3113 mit einer Standardabweichung von 95 Zellen. Der Median

der der epithelialen Zellen beträgt 3019 Zellen mit einer Standardabweichung von 34 Zellen.

Der Median der eosinophilen Granulozyten liegt bei 80 Zellen mit einer Standardabweichung

von 85 Zellen. Der Anteil der eosinophilen Granulozyten an der Gesamtzahl der ausgezählten

__________________________________________________________________Ergebnisse

50

Zellen (Man-Eos%eos+epi) wird berechnet. Der Median liegt bei 2,5% mit einer

Standardabweichung von 2,5%, der Minimalwert liegt bei 1,0%, der Maximalwert bei 8,7%

(s. Tab. 4).

LSC-Daten

(19 Patienten)

manuelle Auszählung

(19 Patienten)

LSC-Eos%eos+epi nepi+eos nepi neos Man-Eos%eos+epi

Median 1,5% 3113 3019 80 2,5%

Standardabw. 3,4% 95 34 85 2,5%

Min- Wert 1,0% 3041 3000 30 1,0%

Max- Wert 20,4% 3353 3125 286 8,7%

Tab. 4: Übersicht über die manuelle Auszählung von 19 Objekträgern und Bildung von

Verhältnissen aus der Zahl der eosinophilen Granulozyten zu allen gezählten epithelialen und

eosinophilen Zellen. Gegenüberstellung dieser Daten mit den LSC-Daten zum Vergleich der

beiden Methoden.

4.6 Histopathologische Beurteilungen

Die semiquantitative, histopathologische Begutachtung der Gewebsschnitte aus den restlichen

Polypenmassen hinsichtlich der eosinophilen Infiltration des Gewebes erfolgt unter der

Vorgabe, die Präparate in vier Grade einzuteilen. Jedes der untersuchten Gewebe zeigt eine

eosinophile Infiltration, dementsprechend wird kein Patient Grad 0 zugeordnet. 12 Patienten

werden Grad 1, 17 Patienten werden Grad 2 und 12 Patienten werden Grad 3 zugeordnet

(siehe Abb. 18).

__________________________________________________________________Ergebnisse

51

Histopathologische Beurteilung

0

12

17

12

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Grad 0 Grad 1 Grad 2 Grad 3

Gradeinteilung

An

zah

l d

er P

atie

nte

n

Abb. 18: Histopathologische Gradeinteilung der eosinophilen Infiltration der Polypen.

Dabei entspricht:

0° = keine oder nur vereinzelte Infiltration;

1° = gering- bzw. mäßiggradige Infiltration,

2° = deutliche Infiltration und

3° = hochgradige Infiltration.

Für die statistischen Berechnungen wird eine Patientengruppe von 12 Personen mit geringer

eosinophiler Infiltration im polypösen Gewebe (Grad 0 und Grad 1) von einer

Patientengruppe von 29 Personen mit starker eosinophiler Infiltration (Grad 2 und Grad 3)

abgegrenzt.

__________________________________________________________________Ergebnisse

52

4.7 Statistische Auswertungen

4.6.1 Korrelation der LSC- Daten mit den Daten der manuellen Auszählung

Der Pearsonsche Korrelationskoeffizient r zwischen den Quotienten Man-Eosepi+eos und LSC-

Eosepi+eos wird berechnet und beträgt 0,79 (P=0,01). Die Datenpaare mit Regressionskurve

sind in Abbildung 19 dargestellt. Somit besteht ein linearer Zusammenhang zwischen den mit

der Laser Scanning Zytometrie erhobenen Daten und den Daten der manuellen Auszählung.

Korrelation Manuelle Auszählung vs. LSC

0,0%

5,0%

10,0%

15,0%

0,0% 5,0% 10,0% 15,0%

Manuell

LS

C

Abb. 19: Korrelation der manuell bestimmten Eosinophilie (Manuelle Auszählungs-Daten, X-

Achse) gegen die automatisierte, objektive Bestimmung der Eosinophilie (LSC-Daten, Y-

Achse). Der Pearsonsche Korrelationskoeffizient beträgt 0,79 bei einem Signifikanzniveau

von 0,01.

4.6.2 Zusammenhang zwischen den LSC- Daten und dem histopathologischen Befund

Ein Zusammenhang zwischen der im LSC berechneten eosinophilen Infiltration und der

Zuteilung der Patienten gemäß des histopathologischen Befundes in vier Grade durch das

Institut für Pathologie wird vermutet. Die Ergebnisse werden in einem Boxplot grafisch

dargestellt (s. Abb. 20) und der entsprechende p-Wert mit dem H-Test nach Kruskal-Wallis

berechnet. Die Hypothese muss nach Berechnung des p-Werts verworfen werden, da der p-

Wert über dem Signifika p=0,11). Somit kann kein signifikanter

__________________________________________________________________Ergebnisse

53

Unterschied der eosinophilen Infiltration (LSC) bezüglich der histopathologischen

Gradeinteilung gefunden werden.

Abb. 20: Boxplot der LSC- Daten bezüglich der histopathologischen Gradeinteilung: Das

Verhältnis der eosinophilen Granulozyten zu allen diploiden Zellen (Eos%dip) ist auf der Y-

Achse, die Gradeinteilung Pathograd 1-3 auf der X- Achse dargestellt. Pathograd 0 wurde

nicht berücksichtigt, da immer eine eosinophile Infiltration nachweisbar war.

4.6.3 Zusammenhang zwischen manueller Auszählung und histopathologischem Befund

Ein Zusammenhang zwischen der mithilfe der manuellen Auszählung errechneten

eosinophilen Infiltration und der Zuteilung der Patienten gemäß des histopathologischen

Befundes in vier Grade durch das Institut für Pathologie wird vermutet. Die Ergebnisse

werden in einem Boxplot grafisch dargestellt (s. Abb. 21).

Der entsprechende p-Wert mit dem H-Test nach Kruskal-Wallis berechnet und ergibt einen

Wert von p=0,93. Die Hypothese muss nach Berechnung des p-Werte verworfen werden, da

der p-Wert über dem Signifikanzniveau von t. Somit kann kein signifikanter

Unterschied der eosinophilen Infiltration (manuelle Auszählung) bezüglich der

histopathologischen Gradeinteilung gefunden werden.

__________________________________________________________________Ergebnisse

54

Abb. 21: Boxplot der Daten der manuellen Auszählung bezüglich der histopathologischen

Gradeinteilung: Das Verhältnis der eosinophilen Granulozyten zu epithelialen und

eosinophilen Zellen (Man- Eos%epi+eos) ist auf der Y-Achse, die Gradeinteilung Pathograd 1-3

auf der X-Achse dargestellt. Pathograd 0 wurde nicht berücksichtigt, da immer eine

eosinophile Infiltration nachweisbar war.

4.6.4 Zusammenhang zwischen eosinophiler Infiltration und Rezidiv

Der Zusammenhang zwischen dem Auftreten eines Rezidivs und der Stärke der eosinophilen

Infiltration im Gewebe soll untersucht werden. Dazu werden die prozentualen Anteile der

eosinophilen Granulozyten aus den LSC-Daten in den Patientengruppen mit und ohne

Rezidivanamnese mit Hilfe von Fishers exaktem Test verglichen und der Testentscheid, ob

ein signifikanter Unterschied besteht oder nicht, anhand p gefällt. Nur p-Werte <0,05%

werden als statistisch signifikant angesehen.

Die Frage, welcher prozentuale Anteil der eosinophilen Granulozyten im Gewebe als starke

Infiltration gilt, ist bisher nicht geklärt. Deshalb werden mehrere Grenzen festgelegt und

getestet. Weder bei einem Anteil eosinophiler Granulozyten von 5%, 3% noch bei 2% kann

ein statistisch signifikanter Unterschied aufgezeigt werden (p=1,0 p=0,491 p=0,742). Somit

kann im Rahmen dieser Arbeit kein Zusammenhang zwischen der eosinophilen Infiltration

im Polypengewebe und dem Auftreten von einem Rezidiv festgestellt werden (s. Abb. 22).

__________________________________________________________________Ergebnisse

55

Abb. 22: Boxplot. Dargestellt ist die Aufteilung der LSC-Daten (Eos%dip) gegen das

Vorhandensein eines Rezidivs (ja/ nein).

Weiterhin werden die Patientengruppen mit und ohne Rezidiv wiederum mit Fishers exaktem

Test hinsichtlich ihrer schwachen bzw. starken eosinophilen Infiltration laut der

histopathologischen Beurteilung verglichen. Die Grade 0 und 1 werden als schwache (neg.)

und die Grade 2 und 3 als starke (pos.) Infiltration zusammengefasst. Der Testentscheid, ob

ein signifikanter Unterschied besteht oder nicht wird anhand p gefällt. Nur p-Werte <0,05%

werden als statistisch signifikant angesehen. Da der berechnete p-Wert 0,73 beträgt, kann mit

den vorliegenden Daten kein Zusammenhang zwischen der eosinophilen Infiltration im

Gewebe und der Rezidivanamnese hergestellt werden.

4.6.5 Zusammenhang zwischen eosinophiler Infiltration und Allergie

Der Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer Allergie und der Stärke der eosinophilen

Infiltration im Gewebe wird untersucht. Dazu werden die prozentualen Anteile der

eosinophilen Granulozyten aus den LSC-Daten in den Patientengruppen mit und ohne

Allergieanamnese mit Hilfe von Fishers exaktem Test verglichen und der Testentscheid, ob

ein signifikanter Unterschied besteht oder nicht, anhand p gefällt. Wiederum gelten nur p-

Werte <0,05% als statistisch signifikant.

Ebenso werden mehrere prozentuale Grenzen der eosinophilen Infiltration festgelegt und

getestet. Weder bei 5%, 3% noch bei 2% kann ein statistisch signifikanter Unterschied

aufgezeigt werden (p=0,663 p=1,0 p=0,341). Somit kann im Rahmen dieser Arbeit auch kein

__________________________________________________________________Ergebnisse

56

Zusammenhang zwischen der eosinophilen Infiltration im Polypengewebe und dem Auftreten

einer Allergie festgestellt werden (s. Abb. 23).

Abb. 23: Boxplot. Dargestellt ist die Aufteilung der LSC-Daten (Eos%dip) gegen das

Vorhandensein einer Allergie (ja/ nein).

Weiterhin werden die Patientengruppen mit und ohne Allergie mit Fishers exaktem Test

hinsichtlich ihrer schwachen bzw. starken eosinophilen Infiltration laut der

histopathologischen Beurteilung verglichen. Der Testentscheid, ob ein signifikanter

Unterschied besteht oder nicht wird anhand p gefällt. Die Irrtumswahrscheinlichkeit wird

ebenfalls kleiner als 95% gewählt, das heißt, nur p-Werte <0,05% gelten als statistisch

signifikant. Da der berechnete p-Wert 0,734 beträgt, kann mit den vorliegenden Daten kein

Zusammenhang zwischen der eosinophilen Infiltration im Gewebe und der Allergieanamnese

hergestellt werden.

__________________________________________________________________Diskussion

57

V Diskussion

Die Polyposis nasi ist mit einer Prävalenz von 1-2% eine der häufigsten chronischen

Erkrankungen der Industrieländer. Ätiologie und Pathogenese sind weiterhin nicht geklärt,

obwohl grundlegende Mechanismen der nasalen Entzündungsreaktion wissenschaftlich

erforscht wurden. Dabei spielen die eosinophilen Granulozyten eine entscheidende Rolle. Die

Standardmethode der histopathologischen Untersuchungen von Polypen ist eine manuelle

Begutachtung der Zellen in Gewebeschnitten mittels Lichtmikroskopie und zeigt in 90% der

Fälle eine starke Infiltration durch eosinophile Granulozyten (Jankowski 1996). Der Grad der

Entzündung variiert interindividuell und in Abhängigkeit einer eventuell vorhandenen

Grunderkrankung stark. Die Untersuchung der Gewebsschnitte ist abhängig von der

Erfahrung des Gutachters und von der ödematösen Komponente im Polypengewebe. Es stellte

sich die Frage, ob die objektive Quantifizierung von eosinophilen Granulozyten in polypösem

Gewebe möglich ist. Dazu wurden in dieser Studie Analyseprotokolle für die innovative

Technik der Laser Scanning Zytometrie entwickelt und die erhaltenen Daten mit der

histopathologischen Untersuchung und der manuellen Auszählung von Sichtfeldern

(Lichtmikroskopie) verglichen.

Die Laser Scanning Zytometrie ermöglicht die schnelle, zuverlässige und quantitative

Untersuchung einer großen Anzahl unterschiedlicher Zellen eines Gewebes. Im Gegensatz zur

qualitativen Untersuchung von Zellen und Geweben durch geübte Begutachter, bietet die LSC

ein automatisiertes, objektives Verfahren. Die Prüfungen eines Zusammenhangs der

objektiven Daten der Laser Scanning Zytometrie mit den Angaben einer Allergie oder eines

Rezidivs ergaben keinen statistischen Zusammenhang.

5.1 Diskussion der Methodik

5.1.1 Präparation und Methodenvergleich

Das Material zur Durchführung dieser Studie wurde während Nasennebenhöhlen-

Operationen in Intubationsnarkose gewonnen. Nasenpolypen stellen ein ideales Gewebe für

wissenschaftliche Untersuchungen dar. Werden sie symptomatisch und muss eine Operation

durchgeführt werden, ist meist ausreichend Gewebe vorhanden, um zum einen eine

routinemäßig durchgeführte histologische Untersuchung durchzuführen und zum anderen

noch Gewebe für weitergehende Untersuchungen verfügbar zu haben. Wie auch bei der

Datenerhebung zu den Vor-Operationen wurde in der Studie nicht nach dem Ausmaß der

__________________________________________________________________Diskussion

58

durchgeführten Operation unterschieden. Die untersuchte Schleimhaut stammte in allen

Fällen aus dem Siebbein, teilweise auch aus den Kiefer-, Stirn- und Keilbeinhöhlen.

Die zu untersuchenden Gewebsstücke wurden mechanisch zerkleinert, um eine Veränderung

der Zelloberfläche durch eine enzymatische oder chemische Behandlung zu vermeiden. Die

Verwendung des Medicon-Systems hat sich als gut praktikabel erwiesen. Das standardisierte

Verfahren ist schnell durchzuführen, unabhängig vom Präparateur, hat eine gute

Reproduzierbarkeit und ist durch eine geringe Ansteckungsgefahr beim Umgang mit

Patientenmaterial gekennzeichnet. Bei nekrotischem Gewebe liefert diese Methode allerdings

keine optimalen Ergebnisse.

Die Untersuchung von in Suspension gebrachten und auf Objektträger fixierten Einzelzellen

führt zu einer Homogenisierung des Präparats. Die Zelldichte auf dem Objektträger bestimmt

der Untersucher und ist dementsprechend unabhängig vom Gewebe. So werden in der

Untersuchung Einflüsse durch die unterschiedliche Verteilung der eosinophilen Granulozyten,

ödematöse Areale oder Gewebsschäden infolge der Operation ausgeglichen. Andererseits

können die Zellen nicht mehr zur entsprechenden Gewebsschicht (z.B. epithelial,

subepithelial oder im Stroma gelegene Zellen) zugeordnet werden. Dies war auch nicht ein

Ziel dieser Studie. Zur Erfassung von Verhältnissen der Zellen untereinander erschien die

Analyse von Einzelzellsuspensionen geeigneter. Grundsätzlich entspricht dieser Ansatz am

ehesten der von R. Virchow geprägten Theorie, dass Krankheiten auf Störungen der

Körperzellen und ihrer Funktionen basieren.

Die Analyse von Gewebsschnitten ist aber mit dem LSC ebenfalls möglich (Hendricks et al.

1995). Diese Möglichkeit wird zunehmend in der Forschung eingesetzt, um eine bessere

Vergleichbarkeit zu routinemäßig durchgeführten Analysen zu erreichen. Untersuchungen

werden meist nur semiquantitativ oder qualitativ durch Beobachten oder Auszählen

durchgeführt. Taylor & Levenson (2006) bemerkten, dass man Zellzählungen pro

Gesichtsfeld bei größter Auflösung („high power field“) zu den quantitativen Untersuchungen

zählen kann, die Analysen aber stark abhängig vom Beobachter und zeitaufwendig sind. Die

intra- und interindividuelle Variabilität kann bis zu 60% betragen (NHL Classification Project

1997). Zum Vergleich der Methoden wurden die mit dem LSC untersuchten Objektträger

nach Umfärbung mit HE nach o.g. Methode ausgezählt, was deutlich zeitaufwendiger als die

Analyse mit dem LSC war. Die Studienergebnisse zeigen aber eine gute Korrelation (r=0,79),

so dass die Aussagen von Taylor & Levenson (2006) an diesen Einzelzellpräparaten bestätigt

werden können.

__________________________________________________________________Diskussion

59

Die histopathologischen Untersuchungen wurden durch einen erfahrenen Pathologen der

Universität Leipzig durchgeführt. Die Vorgabe bestand in der Einschätzung der eosinophilen

Infiltration und Einteilung in vier Schweregrade. Diese Einteilung beruht auf der subjektiven

Erfahrung eines Untersuchers. Da die eosinophilen Granulozyten nicht gleichmäßig im

Gewebe verteilt sind oder teilweise das Epithel durchwandert haben und diesem aufliegen,

kann es durch Betrachtungen von Gewebsausschnitten zu Über- oder Unterbewertungen der

eosinophilen Infiltrationen kommen. In dieser Studie ergab der Vergleich zwischen den

qualitativen Gutachten durch den Pathologen und die objektiven Analysen der LSC eine

Diskrepanz der Ergebnisse. Die subjektive Einschätzung der Proben in vier Schweregrade der

eosinophilen Infiltration konnte weder durch objektive Analyse mit dem LSC noch durch

Auszählung bestätigt werden. In aktuellen zytologischen und histologischen Forschungen

konzentriert man sich aber darauf, akkurate und reproduzierbare, quantitative Analysen

durchzuführen (Gerstner et al. 2004, Rubin et al. 2004). Die Laser Scanning Zytometrie hat

sich nach Entwicklung eines geeigneten Färbe- und Messprotokolls in dieser Studie als

zuverlässiges und schnelles Verfahren zur objektiven Analyse von Nasenpolypen erwiesen.

Da international standardisierte Protokolle noch fehlen, bestehen allerdings Probleme bei der

Übertragung von Analyseprotokollen und Ergebnissen von einem Labor auf andere.

5.1.2 Laser Scanning Zytometrie

Die innovative Technologie der Laser Scanning Zytometrie wurde erstmals 1991 beschrieben

(Kamentsky & Kamentsky 1991) und seit 1996 sind Geräte kommerziell erhältlich (Rew et al.

1999). Die Eigenschaften ähneln dem Durchflusszytometer. Ein Gegensatz und großer Vorteil

ist, dass die Untersuchung nicht an Zellsuspensionen, sondern an auf Objektträgern fixierten

Zellen oder Gewebsschnitten vorgenommen wird. Damit werden geringe Zellmengen benötigt

und der Antikörperverbrauch im Vergleich zur Durchflusszytometrie um 80-85% verringert

(Clatch & Walloch 1997, Gerstner et al. 2002a). Die berechneten und gespeicherten

Positionen (x- und y-Koordinaten) aller Zellen auf dem Objektträger bietet die Möglichkeit,

die Messereignisse zu relokalisieren. Diese Eigenschaft bleibt erhalten, wenn der Objektträger

vom Mikroskop entfernt und eine Umfärbung durchgeführt wird. Es können entweder weitere

Fluoreszenzfarbstoffe oder konservative Färbemethoden eingesetzt werden, so dass eine

zytologische Begutachtung und Definition möglich ist (Darzynkiewicz et al. 1999, Tárnok &

Gerstner 2002). Die WinCyte™- Software ermöglicht die wiederholte Messung und die

Zusammenfassung dieser Messungen (Relokalisation und „Merging“), wodurch dynamische

__________________________________________________________________Diskussion

60

Experimente möglich werden. Somit ist das LSC gut geeignet für pathologische

Fragestellungen (Tárnok & Gerstner 2002).

Die Laser Scanning Zytometrie wurde im Rahmen dieser Studie zur objektiven

Quantifizierung der eosinophilen Granulozyten in Nasenpolypen eingesetzt. Das Verfahren

ermöglicht eine akkurate und reproduzierbare Messung von Zellparametern. Die Färbung mit

FITC, anti-Zytokeratin-APC und PI ist sehr gut zur schnellen Analyse vieler Zellen der

Nasenpolypen geeignet. Durch Umfärben mit HE und Relokalisieren der Messereignisse

konnte die richtige Zuordnung zu den untersuchten Zelltypen (epitheliale Zellen, eosinophile

Granulozyten) evaluiert werden. Der Zellverlust durch die HE-Färbung betrug weniger als

5%, was laborinternen Vergleichsstudien entspricht (Gerstner et al. 2002a, 2002b, 2002c).

Für die Laser Scanning Zytometrie steht eine Vielzahl an Fluoreszenz-Farbstoffen zur

Verfügung, die zum Teil an spezifische Antikörper gebunden kommerziell angeboten werden.

Das LSC ist mit zwei Lasertypen ausgestattet (Argon-Ion und Helium-Neon). Durch das

einfallende Licht werden die Fluoreszenzfarbstoffe zur Emission von Licht spezifischer

Wellenlänge angeregt. Der Einsatz beider Laser während einer Messung ist möglich, was die

Kombinationsmöglichkeit der verschiedenen Farbstoffe deutlich erhöht. Allerdings können

sich die Fluoreszenzemissionsspektren teilweise überlagern und somit zu nicht eindeutigen

Ergebnissen führen. Durch die verschiedenen Darstellungsmöglichkeiten der WinCyte™-

Software können aber Zellpopulationen gut voneinander differenziert werden (Bedner et al

1997, Laffers et al. 2006). Die Objektträger können nach Abschluss der Messungen und

Dokumentation in konventioneller Weise gefärbt, fixiert und so zur unbeschränkten

Aufbewahrung gelagert werden.

Da die Durchflusszytometrie (FCM) als anerkannte und vielseitig verwendete Technik in der

Zytologie den Goldstandard darstellt, wurden zahlreiche Vergleichsstudien zur LSC

durchgeführt. Die Korrelation von mit FCM und LSC erhobenen Daten ist sehr hoch und

erreichte in einer Studie sogar 100% (Martin- Reay et al. 1994, Rew et al. 1998). Die FCM

wurde seit den 60er Jahren zur Analyse von Zellzyklen, zur Immunphänotypisierung bei

Leukämien und Immundefizienz sowie Abstoßungsreaktionen in der Transplantationsmedizin

eingesetzt. FCM und LSC eignen sich beide zur Messung der Ploidie, von

Proliferationsantigenen und Onkoproteinen. Die FCM ist für die Hämatologie gut geeignet, da

sich Zellform und –größe wenig unterscheiden. Für die Untersuchung von Geweben ist sie

aber weniger gut geeignet, da die Zellen sehr variabel in der Morphologie sind und die

Herstellung einer Einzellzellsuspension zum Teil mit einem hohen Zellverlust und auch

Schädigung der zu untersuchenden Zellen einher geht (Reeve & Rew 1997). Für die FCM

__________________________________________________________________Diskussion

61

sind größere Proben nötig, was die FCM insbesondere zur Untersuchung von zellarmen

Körperflüssigkeiten, Abstrichen und Feinnadelpunktaten ungeeignet erscheinen lässt.

Außerdem bietet die FCM nur durch Einsatz von teuren und nicht immer vorhandenen

Zellsortiersystemen die Möglichkeit, die Messereignisse auch morphologisch zu kontrollieren

(Tárnok & Gerstner 2002).

Das LSC bietet die eine schnelle, verlässliche und quantitative Methode,

Einzelzellsuspensionen, Gewebebiopsien oder -schnitte zu untersuchen. Es erlaubt die

Analyse und Quantifizierung von Molekülen der Zellmembran, des Zytoplasmas oder des

Zellkerns (Rew et al. 1999). Durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)-

Analysetechnik können bestimmte DNA-Abschnitte selektiv markiert und analysiert

(Karyotypisierung) werden (Tárnok & Gerstner 2002). Weiterhin bietet das LSC die

Möglichkeit, Zellreaktionen nach Zugabe von Wachstumsfaktoren, Enzymen, Zytokinen oder

Zytostatika (Deptala et al. 1998, Bedner et al. 2000) als Funktion der Zeit zu beobachten.

Viele Forschungsgruppen beschäftigen sich mit der Analyse von Zellzyklus- und

Apoptosemechanismen (Darzynkiewicz & Traganos 1998, Rew et al. 1998). Auch die

quantitative Darstellung von HI-Viren kann mit dem LSC durchgeführt werden (Douglas et

al. 2001). Dabei können schon Proben ab 50 000 Zellen analysiert werden (Rew et al. 1999).

Obwohl die objektiven, objektträger-basierten Verfahren ständig weiter entwickelt werden,

wird das LSC bisher nicht in der Routinediagnostik eingesetzt. Für jede neue Fragestellung

müssen erst Protokolle entwickelt werden. Dies bedeutet einen anfangs hohen zeitlichen

Zeitaufwand. Ein weiteres, noch nicht vollständig gelöstes Problem ist das Erreichen einer

ausreichenden Qualitätskontrolle. Zum Teil fehlen noch standardisierte Negativkontrollen,

wie z.B. Zellkulturen (Taylor & Levenson 2006). Auch die Analyse mit beiden Lasern dauert

länger als z.B. die Untersuchung mit der FCM. Automatisierte Prozesse könnten den Umgang

mit dem Gerät erleichtern (Rew et al. 1999). Für die vorliegende Dissertation wurden

Messprotokolle erstellt, die für Untersuchungen an Nasenpolypen geeignet waren. Einzelne

Parameter wurden nicht mehr verändert. Einzelne veränderliche Parameter müssen pro

Messung kontrolliert und ggf. angepasst werden.

5.1.3 Zytologische Färbemethoden

5.1.3.1 DNA- Färbung und Triggerung mit Propidiumjodid (PI)

Propidiumjodid ist ein DNA-Farbstoff. Durch Interkalation zwischen Basenpaaren der DNA

werden Zellkerne anfärbt. PI ist zur Messung der Ploidie von Zellen geeignet. Bei der

Immunphänotypisierung können anhand der Chromatinstruktur aufgrund unterschiedlicher

__________________________________________________________________Diskussion

62

Fluoreszenzintensität bezogen auf die Fläche Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten

voneinander unterschieden werden (Bedner et al. 1997). Häufig wird PI bei zytologischen

Mehrfarben-Analysen als DNA-Farbstoff eingesetzt. Auch in dieser Studie wurde der Trigger

zur Erkennung einer Zelle auf die rote Fluoreszenz des PI gelegt. Die Messungen erwiesen

sich als stabil und reproduzierbar. Messereignisse mit weniger als dem 0,5fachen oder mehr

als dem 2,5fachen als dem einfachen DNA-Gehalt stellen Zelldebris, Dubletten oder

Zellhaufen dar und wurden daher in die weiteren Analysen nicht einbezogen.

5.1.3.2 indirekte Immunfluoreszenzfärbung über Zytokeratin-Biotin-Streptavidin-APC

Immunzytologische Färbemethoden beruhen auf Antigen-Antikörper-Reaktionen, mit deren

Hilfe spezifische Proteinstrukturen dargestellt werden können. Es gelang ein Protokoll zu

entwickeln, das die Darstellung des Zytokeratin-Antigens ohne Verwendung eines FITC-

konjugierten Antikörpers erlaubt. Zytokeratin-positive Populationen stellen epitheliale

Strukturen dar, die sich aus dem embryonalen Ektoderm entwickelt haben. Der Klon MNF

116 reagiert mit den Zytokeratinen 5, 6, 8, 17 und auch 19 (Herstellerangaben). Er gilt als

relativ unempfindlich gegenüber verschiedenen Fixierungen und ist auch für die Ethanol-

Fixierung geeignet. Die indirekte Färbung mit Biotin-Streptavidin-Allophycocyanin (APC)

führt zu einer Intensivierung der Fluoreszenz (Gerstner et al. 2002b).

Bei allen Messungen konnte eine große Population Zytokeratin-positiver Zellen dargestellt

werden, so dass der gewählte Antikörper zur Untersuchung von Nasenpolypen gut geeignet

erscheint. Die so detektierten Zellen stellen die epitheliale Komponente der Nasenpolypen

dar. Da die Zellanzahl aller diploiden Zellen durch das LSC bestimmt wurde, konnte auf die

Anzahl der nicht-epithelialen Zellen rechnerisch geschlossen werden. Die als „stromale“

Zellen bezeichneten Elemente sind u.a. Fibroblasten und -zyten, vaskuläre Zellen,

Becherzellen und Lymphozyten, Makrophagen, Mastzellen sowie Granulozyten.

5.1.3.3 Unspezifische Anfärbung der eosinophilen Granulozyten mit Fluorescein-

Isothiocyanat (FITC)

Die Standardmethode der histopathologischen Untersuchung von Gewebe der Nase und

Nasennebenhöhlen ist die lichtmikroskopische Beurteilung nach HE-Färbung. Sie ist einfach

und schnell durchzuführen und außerdem kostengünstig. Die 1879 von Paul Ehrlich als

eosinophile Granulozyten bezeichneten Zellen zeichnen sich durch die Anfärbbarkeit ihrer

azidophilen Granula mit dem sauren Farbstoff Eosin, einem bromierten Fluoreszeinderivat,

aus. Die Bestimmung der Gewebseosinophilie kann auch semiquantitativ durchgeführt

__________________________________________________________________Diskussion

63

werden, indem Zellsuspensionen z.B. nach Giemsa- oder Kimura-Färbung in einer Neubauer-

Zellzählkammer untersucht werden. Gewebsschnitte werden nach Paraffineinbettung und HE-

Färbung des polypösen Gewebes bei 400facher Vergrößerung in konventioneller

Durchlichtmikroskopie begutachtet. Zu einem Verlust der typischen Färbeeigenschaften

eosinophiler Granulozyten kann es nach deren Aktivierung und Entleerung der Granula

kommen (Kiehl & Kapp 1998). Juhlin & Venge (1991) wiesen nach, dass nach

immunhistochemischer Färbung mehr eosinophile Granulozyten nachweisbar waren als durch

HE-Färbung.

In dieser Studie konnten eosinophile Granulozyten in allen Polypen mithilfe des Fluorescein-

Isothiocyanats (FITC) nachgewiesen werden. In der Literatur wurde die unspezifische

Färbung der eosinophilen Granulozyten durch unkonjugiertes f-Isothiocyanat (FITC) schon

bei sehr geringen Konzentrationen des FITC beschrieben (Floyd et al. 1983). Zur

Ausschaltung dieser unspezifischen Färbung wird die Anwendung von Chromotrop 2R,

einem wasserlöslichen Azofarbstoff empfohlen (Patterson et al. 1989, Woltmann et al. 1999).

Die eosinophilen Granulozyten stellen sich nach Färbungen mit FITC-konjugierten

Antikörpern bei der FCM und LSC als uniforme, deutlich zu unterscheidende Population

diploider Zellen mit hoher Grün-Fluoreszenz dar. Das Maximum der Färbung ist schon nach

einer Minute erreicht (Bedner et al. 1999). Da in kommerziell angebotenen Lösungen immer

ein Anteil des FITC ungebunden vorliegt und dieser Anteil nicht zu beeinflussen ist, wurde

diese Zellpopulation als Fehlerquelle gewertet (Bedner et al. 1999). Hier wird der große

Vorteil der optischen Kontrolle von Messereignissen bei der LSC deutlich. Unklare

Ergebnisse können relokalisiert und beurteilt werden, so dass Fehler reduziert und beweisende

Aussagen möglich werden.

In der vorliegenden Studie sollte FITC als unkonjugierter Farbstoff verwendet werden. Um

sichere und reproduzierbare Ergebnisse, eine gute Abbildungsqualität und eindeutige

Messergebnisse zu erhalten, wurden zur Bestimmung der geeigneten FITC-Konzentration

Titrationsversuche an peripheren Blutzellen durchgeführt. Blutausstriche eignen sich

besonders, da kaum Zelldetritus vorliegt. Bei hohen Konzentrationen (5mg/ml und 10mg/ml)

besteht ein hohes Hintergrundleuchten, was zu einem geringen Kontrast zwischen Zellen und

Hintergrund führt. Teilweise ist das FITC sogar unvollständig gelöst, was zu Fehlmessungen

führen kann. Bei geringen Konzentrationen sind die eosinophilen Granulozyten anfärbbar; das

Messergebnis bei der Färbung mit 50µg/ml stellte sich aber deutlicher dar. Andere

Granulozyten, Lymphozyten oder Monozyten wurden bei dieser Konzentration nicht

detektiert, was den Erfahrungen anderer Forschungsgruppen entspricht. In einer

__________________________________________________________________Diskussion

64

Vergleichsstudie über die FITC- Affinität verschiedener Leukozyten stellten Bedner et al.

(1999) fest, dass eosinophile Granulozyten das FITC bei dreifach geringeren Konzentrationen

als andere Leukozyten binden. Eosinophile Granuloyzten lassen sich mit FITC bei

Konzentrationen von 2-800 nmol anfärben. Als optimale Konzentration geben Bedner et al.

(1999) 50-100 nmol an. Eine andere Forschungsgruppe verwendete eine FITC-Konzentration

von 20µg/ml, um eosinophile Granulozyten im peripheren Blut für die FCM zu markieren

(Efthimiadis et al. 1996). Auch mit anderen Fluoreszenz-Farbstoffen sind eosinophile

Granulozyten anfärbbar, z.B. mit 1- Hydroxy-3, 6, 8- Pyrenetrisulfonat (HPTS), Fluoreszein-

Diacetat oder natürlichem Safran (Trigoso & Stockert 1995, Sandström et al. 2000). Trigoso

& Stockert (1995) vermuteten, dass die Färbungen auf einer ionischen Bindung zwischen den

Farbstoffen und den kationischen Proteinen in den Granula der eosinophilen Granulozyten

beruhen.

FITC ist als Marker zur Detektion eosinophiler Granulozyten geeignet. In dieser Studie wurde

diese Möglichkeit genutzt und die eosinophilen Granulozyten in nur einem Färbeschritt

markiert. Durch Auslassung mehrerer Färbeschritte können Material und Zeit, und somit auch

Kosten eingespart werden. Efthimiadis et al. (1996) errechneten einen Kostengewinn von

9,50$ pro Färbung. In bisherigen immunzytologischen Studien wurden eosinophile

Granulozyten mithilfe spezifischer Antikörper von anderen Zellen diskriminiert. So wird

CD49 nur von aktivierten eosinophilen Granulozyten exprimiert und bildet zusammen mit

CD29 den VLA4-Komplex. Der Nachweis von CD49 eignet sich zur Detektion eosinophiler

Granulozyten ebenso wie die Untersuchung der CD16-Expression, das auf eosinophilen

Granulozyten fehlt und sie somit von den neutrophilen Granulozyten unterscheidet (Thurau et

al. 1996). Mit dem EG-2-Antikörper lassen sich sowohl zellgebundenes als auch

extrazelluläres ECP und EPX anfärben. Der Antikörper EG-1 färbt nur ECP. Häufig wird der

Antikörperklon BMK13, selten der teurere Proteoglykan-2-Antikörper zur Detektion von

MBP genutzt. Weitere Oberflächenantigene eosinophiler Granulozyten sind CD9, CD11b,

CD44 und CD69. Nach Stimulation mit IL-3, IL-5 und GM-CSF exprimieren eosinophile

Granulozyten auch HLA-DR zur Antigenpräsentation, was ebenfalls durch monoklonale

Antikörper detektiert werden kann. Antikörper zur Erkennung von EDN/ EPX stehen für EIA-

oder ELISA-Anwendungen zur Verfügung.

5.1.4 Betrachtungen zur Eosinophilie

Der Begriff „Eosinophilie“ bezeichnet im klinischen Sprachgebrauch meist die Erhöhung der

eosinophilen Granulozyten im peripheren Blutbild. Allgemein beschreibt der Begriff die

__________________________________________________________________Diskussion

65

Neigung von Zell- und Gewebestrukturen, sich mit Eosin anzufärben (Lexikon Medizin,

Urban & Schwarzenberg 1997)

Die Eosinophilie der polypösen Nasenschleimhaut ist kein feststehender Begriff und wird in

verschiedenen Studien unterschiedlich definiert. Meist basiert die Bestimmung der

Eosinophilie in der Lichtmikroskopie auf der Betrachtung von fünf Gesichtsfeldern bei

400facher Vergrößerung (entspricht „high power fields“ – HPF). Kaldenbach et al. (1999)

legen vier Schweregrade fest: Grad 0 = 0-4 Eos/5 HPF, Grad 1 = 5-15 Eos/5 HPF, Grad 2 =

16-30 Eos/5 HPF und Grad 3 = >30 Eos/5 HPF. Olze et al. 2006 und Schaefer et al. 2006

teilen die Polypen nur noch in eosinophil (>100 Eos/5 HPF) oder nicht eosinophil (<100

Eos/5 HPF) ein. Nach dieser Einteilung wären also alle Polypen der Studie von Kaldenbach et

al. (1999) „nicht eosinophil“. Eine Vergleichbarkeit der mit dieser Methode erhaltenen

Ergebnisse scheint nicht zu bestehen. Auch werden bei Betrachtung der HPF keine

Unterscheidungen von z.B. ödematösen Arealen vorgenommen. Jankowski et al. (2002)

bestimmen dagegen die eosinophilen Granulozyten als prozentualen Anteil an insgesamt 1000

Entzündungszellen ebenfalls bei 400facher Vergrößerung in der Durchlichtmikroskopie. Die

Grenze wurde in dieser Studie bei 10% gesetzt. Alle Patienten mit chronischer Sinusitis ohne

Polypen zeigten einen Anteil unter 10%, 88% der Patienten mit Polypen lagen über den 10%

(Jankowski et al 2002).

Eine Zellmenge kann als Relativ- oder Absolutwert angegeben werden. Der Relativwert

beschreibt den prozentualen Anteil bestimmter Zellen (z.B. der eosinophilen Granulozyten)

an einer Referenzpopulation (z.B. alle Leukozyten), wie in der Studie von Jankowski et al.

(2002). Der Absolutwert gibt die Zellzahl in einem bestimmten Volumen oder einer

bestimmten Fläche an, wie von den Forschungsgruppen um Kaldenbach et al. (1999), Olze et

al. (2006) und Schäfer et al. (2006) angewendet.

Der Anteil der eosinophilen Granulozyten ist mit 1,5% aller diploiden Zellen in der

vorliegenden Studie eher gering. Der Maximalwert liegt bei 14,4%. Die Vergleichbarkeit zu

Ergebnissen anderer Forschungsgruppen gestaltet sich schwierig, da die Bezugsgröße nicht

die Gesamtzahl der diploiden Zellen wie in der vorliegenden Studie, sondern z.B. die

Gesamtzahl aller Immunzellen sind (Jankowski et al. 2002). Noch schlechter ist die

Vergleichbarkeit zu Untersuchungen, bei denen die Begutachtung lichtmikroskopisch mithilfe

der HPF durchgeführt wurde und keine Verhältnisse der Zellen zueinander bestimmt wurden.

Da die Bezugsgröße in der bisherigen Forschung nicht die diploiden Zellen waren, existiert

auch keine festgelegte Grenze der Eosinophilie. Deshalb wurden mehrere Grenzen (

__________________________________________________________________Diskussion

66

statistischen Zusammenhang zu Allergie und Rezidiv untersucht (s. Punkt 5.2.4).

Da die Infiltration der Polypen durch verschiedene Entzündungszellen unterschiedlich stark

ist, wurden in dieser Studie die eosinophilen Granulozyten auf die Gesamtzahl der diploiden

Zellen bezogen. Dieser Ansatz erwies sich aufgrund der automatisierten Messung aller Zellen

als gut praktikabel und kommt der Angabe als Absolutwert am nächsten. Außerdem bietet die

Bezugnahme auf alle diploiden Zellen für weitere Studien eine gute Möglichkeit der

Vergleichbarkeit.

5.2 Diskussion der Ergebnisse

5.2.1 Geschlechts- und Altersverteilung im Patientengut sowie Lokalisation der Polypen

In dieser Studie wurde Material von 41 Patienten untersucht. Das Geschlechtverhältnis ergab

eine Verteilung von 3:1 zugunsten der männlichen Patienten. Ähnliche

Geschlechtsverteilungen wurden auch in anderen Studien gefunden (Drake-Lee 1994,

Hedman et al. 1999, Johansson et al. 2003, Larsen & Tos 2004).

Bei den Patienten dieser Studie liegt der Altersgipfel bei den 36 bis 40jährigen Patienten. Dies

liegt nahe dem von Rasp et al. (2000) beschriebenen Altergipfel von 45 ± 14 Jahren. Das

Durchschnittsalter bei Ersterkrankung wird bei 42 Jahren angegeben (Larsen & Tos 1994).

Ein weiterer Gipfel findet sich in der vorliegenden Studie bei den 66-70jährigen. Dies

entspricht nicht den Angaben von Drake-Lee (1994), der eine abnehmende

Erkrankungshäufigkeit bei Patienten über 60 Jahre feststellte. Diese Studie wurde am

Patientengut einer Universitätsklinik durchgeführt. Möglicherweise kommt die Häufung von

älteren Patienten in der Studie durch die vermehrte Behandlung multimorbider Patienten an

einer Universitätsklinik zustande.

Durch Analyse der Operationsberichte konnte die Lokalisation der Polypen in den

Nasennebenhöhlen deutlich gemacht werden: in allen Fällen ließen sich Polypen im

Siebbeinbereich nachweisen. Bei 22% der Patienten fanden sich außerdem polypöse

Schleimhautschwellungen in den Kieferhöhlen und bei 3% der Patienten zusätzlich in den

Stirn- oder Keilbeinhöhlen. Diese Daten bestätigen die Beobachtungen, dass die Krankheit im

ostiomeatalen Komplex des Siebbeins beginnt und sich dann auf die nachgeschalteten

Nasennebenhöhlen ausbreitet (Stammberger 1999).

__________________________________________________________________Diskussion

67

5.2.2 Allergierate im Patientengut

Im untersuchten Patientengut ergab sich ein Anteil allergischer Patienten von 48,8% im

Patientengut, wobei die Angaben auf anamnestischen Daten beruhen und nicht immer durch

einen Allergietest (z.B. Prick-Test oder serologische Untersuchungen) verifiziert wurden. Die

Rate liegt höher als die Allergierate der Normalbevölkerung von 15- 25% (Bauchau &

Durham 2004) und würde in dieser Höhe den Angaben von Albegger entsprechen, der bei

50% der Polyposis-Patienten eine allergische Genese vermutete (Albegger 1977). Weitere

Autoren sehen in inhalativen oder digestiven Allergien eine mögliche Ursache für

Nasenpolypen (Sin et al. 1997, Krause 2003). In Frankreich wurden bei 31% der Polyposis-

Patienten Nahrungsmittel- und Arzneimittelallergien gefunden (Rugina et al. 2002). Die

Prävalenz von positiven Skin-Prick-Tests bei Patienten mit chronischer Rhinosinusitis wird in

der Literatur mit einer großen Spanne von 16% bis 94% angegeben (Emanuel et al. 2000,

Fokkens et al. 2007). Zum Teil entsprechen diese Häufigkeiten denen der Normalbevölkerung

(Klima et al. 1993, Drake-Lee et al. 1984). In 60% der Fälle bestehen Sensibilisierungen

gegen mehrere Allergene (Emanuel et al. 2000).

Umgekehrt wird die Häufigkeit der Polyposis nasi bei Vorliegen einer allergischen Rhinitis in

der Literatur auf 1,5% (0,5-4,5%) geschätzt (Settipane & Chafee 1977, Lund 1995, Settipane

1996b, Hosemann et al. 2000) und wäre somit im Vergleich zur Normalbevölkerung (1-2%)

nicht oder nur geringfügig erhöht.

Bachert et al. (2007) fanden eine lokale totale und spezifische IgE-Produktion im

Polypengewebe, konnten aber keine positiven Reaktionen im Skin-Prick-Test nachweisen.

Auch IgE-Bestimmungen im Serum blieben negativ. Sie deuteten die Ergebnisse als

Ausdruck einer lokalen allergisch-entzündlichen Reaktion auf Pilzantigene.

Der hohe Anteil von Allergikern in dieser Studie ist bemerkenswert. Möglichweise kam es im

Untersuchungszeitraum zu einem Selektionsvorteil von Patienten mit Allergien und Polypen,

da in der Ambulanz des Universitätsklinikums Leipzig gleichzeitig die allergologische

Sprechstunde sowie die Einweisersprechstunde für stationäre Behandlungen stattfanden.

Der pathogenetische Zusammenhang zwischen allergischen Erkrankungen und der Polyposis

nasi bleibt weiter unklar, die Datenlage lässt aber die Annahme zu, dass allergische

Erkrankungen keinen Einfluss auf die Entstehung der chronischen Entzündungsreaktion in der

Nasenschleimhaut haben. Inwieweit sie die Aufrechterhaltung der Entzündung und das

Fortschreiten des Polypenwachstums fördern, lässt sich noch nicht einschätzen. Da allergische

Erkrankungen die Symptome der Polyposis nasi verstärken, sollten sie in jedem Falle

therapiert werden (Bachert et al. 2003).

__________________________________________________________________Diskussion

68

5.2.3 Rezidivrate im Patientengut

Im untersuchten Patientengut ergab sich eine Rezidivrate von 36,6%. Es wurden alle

Operationen im Bereich der Nasennebenhöhlen unabhängig vom Ausmaß der Operation

gewertet. Meist fehlte die Angabe über ein Vorhandensein von Nasenpolypen bei einer

vorausgegangenen Operation. Operationen an den unteren Nasenmuscheln sowie Septum-

oder Rhinoplastiken wurden nicht als Vor-Operation einbezogen.

Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen die hohe Rezidivrate der Polyposis nasi. Ein Anteil

der Rezidive von 36,6% ist vergleichbar mit den Ergebnissen anderer Forschungsgruppen, die

Raten zwischen 16% und 52% fanden (Drake-Lee et al. 1984, Slavin 1988, Jäntti-Alanko et

al. 1989, Friedman & Katsantonis 1990, Hilka et al. 1992, Settipane 1996a, Senior et al. 1998,

Kaldenbach et al. 1999).

Zahlreiche Studien wurden nicht nur zur Klärung der Entstehung von Nasenpolypen, sondern

auch zur Suche nach prognostischen Faktoren für die Rezidivwahrscheinlichkeit

durchgeführt. Eine erhöhte Rezidivrate fand sich bei gleichzeitigem Vorliegen einer

Analgetika-Intoleranz, rezidivierenden Infektionen der oberen Atemwege, Asthma bronchiale,

inhalativen Allergien, hohem Lebensalter und einem chronischen Hautekzem (Slavin 1988,

Settipane 1996a). In einer Studie von Amar et al. (2000) erlitten 23% der Patienten ohne

Analgetika-Intoleranz und 36% der Patienten mit Analgetika-Intoleranz ein Rezidiv. Bei

Analgetika-intoleranten Patienten sollte eine operative Sanierung angestrebt werden, auch

wenn das Risiko einer Rezidivpolyposis und Ostienstenose mit bis zu 80% über dem

Durchschnitt liegt. Eine Sanierung der Nasennebenhöhlen führt zu einer Verbesserung der

Asthmabeschwerden und Lungenfunktionsprüfung ein Jahr postoperativ bei 20-85% der

Patienten (Schmid et al. 1999).

1993 fanden Stoop et al. bei 50% der Allergiker ein Rezidiv im Gegensatz zu 25% bei

Nichtallergikern. Drake-Lee et al. (1984) beschrieben einen tendenziellen Zusammenhang

zwischen Rezidivpolypen und dem Vorliegen von Asthma, Ekzem und Analgetika-Intoleranz,

konnten aber keinen Zusammenhang zu einer allergischen Rhinitis finden. Hilka et al. (1992)

fanden bei allergischen Patienten eine erhöhte Rezidivrate bei Patienten mit einer chronischen

Rhinosinusitis ohne Polypen. Einen Einfluss einer Allergie auf die Rezidivrate bei Patienten

mit Polyposis nasi konnten sie nicht nachweisen. Senior et al. 1998 fanden keinen

Zusammenhang zwischen Asthma, Allergie, Analgetika-Intoleranz und einem Rezidiv. In

einer 1989 durchgeführten Studie von Jäntti-Alanko et al. fand sich unter Atopikern sogar

eine geringere Rezidivrate als bei Patienten ohne Atopie. Settipane (1996b) stellte fest, dass

__________________________________________________________________Diskussion

69

sich Patienten mit einem positiven Allergie-Hauttest häufiger einer Revisions-Operation

unterzogen und die Rezidive bei Allergikern gehäuft in der Pollensaison auftreten.

In dieser Studie wurde der Zusammenhang zwischen einer vorhandenen Allergie und dem

Auftreten eines Rezidivs nicht anhand der anamnestischen Daten, sondern anhand der

objektiven Analyse der eosinophilen Infiltration im Gewebe untersucht.

5.2.4 Die eosinophile Infiltration und deren Einfluss auf Allergie und Rezidiv

Eine Vielzahl von Studien beschäftigte sich mit einem möglichen Zusammenhang zwischen

der eosinophilen Infiltration und möglichen Begleiterkrankungen sowie der

Rezidivwahrscheinlichkeit. Die eosinophile Infiltration von Nasenpolypen stellt ein

herausragendes Merkmal der Polypen da. Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen die

Aussage, dass die Anzahl eosinophiler Granulozyten im nasalen Schleimhautgewebe bei

Patienten mit Polyposis nasi erhöht ist (Jankowski 1996, Kaldenbach et al. 1999). Die in

dieser Arbeit untersuchten Polypen waren ausschließlich eosinophile Polypen. Dies lässt sich

sowohl anhand der histopathologischen Beurteilung der routinemäßig durchgeführten

Untersuchungen, durch die manuelle Auszählung der eosinophilen Granulozyten, als auch in

den mit dem LSC erhobenen Daten bestätigen.

Bei der objektiven Quantifizierung des Polypengewebes zeigte sich eine unterschiedlich

starke Infiltration durch eosinophile Granulozyten. Somit stellte sich die Frage, inwieweit die

Stärke der eosinophilen Entzündung mit möglichen Begleiterkrankungen und der

Rezidivwahrscheinlichkeit korreliert. Eine erniedrigte Eosinophilenzahl findet sich bei

Polypen von an zystischer Fibrose Erkrankter (Mygind 1999). Da diese Patienten primär

ausgeschlossen waren, kann im Rahmen dieser Studie keine Aussage zum Zusammenhang

zwischen der eosinophilen Infiltration und der zystischen Fibrose gemacht werden. Stark

erhöht ist die Eosinophilenzahl bei Patienten mit Asthma bronchiale und Analgetika-

Intoleranz (Jankowski et al. 2002). Diese Patientengruppen wurden im Rahmen dieser Studie

nicht gesondert untersucht, so dass eine Aussage zum Einfluss dieser Erkrankungen ebenfalls

nicht möglich ist.

Die Auswertung der Ergebnisse ergab für eosinophile Granulozyten keine signifikanten

Unterschiede zwischen der Patientengruppe mit Allergie im Vergleich zu den Patienten ohne

Allergie unabhängig von der gewählten Grenze der Eosinophilie ( . Auch

hinsichtlich der histopathologischen Gradeinteilung findet sich kein statistischer

Zusammenhang zwischen der eosinophilen Infiltration und der Allergieanamnese. Bei

allergischen Reaktionen ist die Anzahl der eosinophilen Granulozyten im Blut und in

__________________________________________________________________Diskussion

70

Geweben erhöht. Aufgrund der hohen Anzahl eosinophiler Granulozyten in Nasenpolypen

wird seit Jahren eine allergische Genese der Polyposis nasi diskutiert (Bachert et al. 2003). In

dieser Studie kann kein Zusammenhang zwischen der eosinophilen Infiltration bei der

Polyposis nasi und Allergien festgestellt werden. Die Akkumulation der eosinophilen

Granulozyten in Nasenpolypen besteht, ist aber nach den erhobenen Daten nicht von einer

vorhandenen Allergie abhängig. Übereinstimmend mit mehreren Studien konnte bei Patienten

mit Polyposis nasi kein Unterschied der Eosinophilenzahl bei Atopikern im Vergleich zu

Nicht-Atopikern gefunden werden (Park et al. 1998, Jankowski et al. 2002). Fokkens et al.

(1990) konnten in ihrer Studie ebenfalls keinen Unterschied in der Verteilung der

eosinophilen Granulozyten im Polypengewebe bei Gesunden, Allergikern oder Patienten mit

rezidivierender Polyposis nasi finden. Dagegen beschreiben Baumgarten et al. (1980) in ihrer

Studie einen unterschiedlichen Index von eosinophilen Granulozyten zu Plasmazellen beim

Vergleich von Patienten mit und ohne Allergie. In zwei weiteren Studien wurde ebenfalls eine

erhöhte Anzahl eosinophiler Granulozyten im Gewebe von Allergikern im Vergleich zu

Nicht-Allergikern beschrieben (Kawabori et al. 1994, Kaldenbach et al. 1999).

Studien zu den Regulationsmechanismen ergaben ein Zytokinprofil von IL-5, IL-3 und GM-

CSF bei der Polyposis nasi. Bei allergischen Reaktionen ist IL-5 in hohen Maßen

nachweisbar, aber kein IL-3 und GM-CSF, weshalb man die Aktivierung eosinophiler

Granulozyten durch allergische Reaktion in Frage stellt (Bachert et al. 2003).

Wir fanden auch eosinophile Granulozyten bei Patienten, die unter Polypen ohne weitere

Begleiterkrankung litten. Einige dieser Begleiterkrankungen wie Asthma bronchiale oder

Analgetika-Intoleranz können zeitlich nach den eosinophilenreichen Nasenpolypen auftreten.

Da sich die Symptome der Polyposis nasi meist über Jahre entwickeln, wären prospektive

Studien ein sinnvoller Ansatz, um die Entwicklung der Entzündungsreaktion zu beobachten.

Eine Nachuntersuchung der Patienten dieser Studie könnte ebenfalls interessante Erkenntnisse

liefern.

Die Auswertung der Ergebnisse ergab für eosinophile Granulozyten keine signifikanten

Unterschiede zwischen der Patientengruppe mit Rezidiv im Vergleich zu den Patienten ohne

Rezidiv unabhängig von der gewählten Grenze der Eosinophilie ( . Auch

hinsichtlich der histopathologischen Gradeinteilung findet sich kein statistischer

Zusammenhang zwischen der eosinophilen Infiltration und der Rezidivanamnese. Krajina et

al. (1996) fanden bei einer rezidivierten Polyposis nasi bei 74% eine eosinophile Infiltration

im Gegensatz zu 44% bei nicht-rezidivierter Polyposis nasi. Stoop et al. (1993) dagegen

konnten keinen Zusammenhang zwischen der Infiltration durch eosinophile Granulozyten

__________________________________________________________________Diskussion

71

oder Mastzellen und einem Polypenrezidiv nachweisen. Zum gleichen Ergebnis kam die

Gruppe um Fokkens et al. 1990.

Man vermutet für die Entstehung der Polyposis nasi sowie deren Rezidiven die gleichen

pathogenetischen Mechanismen. Da operative Maßnahmen unabhängig von der

Erkrankungshäufigkeit erst bei ausgeprägter Symptomatik und somit längerer

Erkrankungsdauer der Polyposis nasi durchgeführt werden, kann man vermuten, dass die

eosinophile Infiltration gleiche Ausprägungsgrade annimmt. Häufig werden topische

Kortikoide oder auch hochdosiert systemische Kortikoide prä- und perioperativ gegeben. Das

verringert die Infiltration der Nasenschleimhaut durch Entzündungszellen und hat somit einen

bedeutenden Einfluss auf die Ergebnisse bei Untersuchungen zur Infiltration durch

Entzündungszellen. Die Stärke der eosinophilen Infiltration wird häufig als Kriterium für eine

postoperative Anwendung topischer und systemischer Kortikoide herangezogen. Um Befunde

besser einordnen zu können, werden Angaben zur Medikation auch bei routinemäßig

durchgeführten histopathologischen Untersuchungen gefordert (Jankowski et al. 2002).

Ob von einer mit der Polyposis nasi assoziierten Erkrankung auf die eosinophile Infiltration

des Gewebes geschlossen werden kann oder umgekehrt, eine Erkrankung allein durch die

Bestimmung der eosinophilen Infiltration vermutet werden kann, bleibt weiter ungeklärt.

Allerdings erscheint dieser Ansatz aufgrund der Gemeinsamkeiten der beteiligten

Entzündungszellen und Zellbotenstoffe als wenig Erfolg versprechend. Ebenso erlaubt die

Bestimmung der eosinophilen Infiltration keinen Rückschluss auf die Rezidivanamnese und

erscheint damit auch wenig aussagekräftig bezüglich einer Voraussage künftiger Rezidive.

5.3 Ausblick

Im Rahmen der vorliegenden, retrospektiven Studie gelang es, ein leicht durchführbares,

kostengünstiges und schnelles Protokoll zur objektiven Quantifizierung eosinophiler

Granulozyten in Nasenpolypen zu erstellen. Das LSC eignet sich hervorragend zur Analyse

entzündeter Gewebe. Klinische Befunde wie Allergie und Rezidiv wurden erstmals mit

quantitativen zytologischen Daten untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Bestimmung der

Eosinophilenzahl in Nasenpolypen keine Aussage über Begleiterkrankungen oder Rezidiv

zulässt. Die objektive Quantifizierung der eosinophilen Granulozyten kann aber im Rahmen

weiterer Studien angewendet werden. Dabei könnten auch andere Methoden der

Materialgewinnung wie eine nasale Lavage oder Bürstenzytologie etabliert werden (Piacentini

et al. 1998).

__________________________________________________________________Diskussion

72

Die Anwendung topischer oder systemischer Kortikoide bei entzündlichen Erkrankungen der

Nasenschleimhaut wird gefordert (Fokkens et al. 2007). Es zeigt sich aber, dass aufgrund der

Budgetierung im Gesundheitswesen die Versorgung mit topischen Kortikoiden nur teilweise

realisiert wird. Zur Kostenreduktion im Gesundheitswesen könnte es sinnvoll sein,

insbesondere im ambulanten Bereich eine objektive Nachweismethode für beteiligte

Entzündungszellen zu entwickeln und anhand dieser Daten eine Therapientscheidung

(topisches Kortikoid oder operatives Vorgehen) zu treffen. Die Laser Scanning Zytometrie

bietet ein objektives Verfahren zur Analyse an geringen Proben. Auch Untersuchungen an

Nasenspülflüssigkeiten und Bürstenzytologien könnten zufrieden stellende Ergebnisse liefern.

Weiterhin könnten mithilfe der Laser Scanning Zytometrie auch wertvolle Hinweise über

beteiligte Infektionserreger ermittelt werden.

Durch verschiedene Antikörper ist der Nachweis vieler Rezeptoren und Syntheseprodukte der

eosinophilen Granulozyten möglich. Diese könnten mit der Laser Scanning Zytometrie

dargestellt und analysiert und somit weitere Zusammenhänge und Einflüsse der einzelnen

Zellpopulationen im Rahmen der Entzündung erforscht werden. Aufgrund der Möglichkeit,

mehrfach Färbungen und kombinierte Messungen an einer Zellpopulation durchzuführen,

erweitert sich das diagnostische Spektrum der Laser Scanning Zytometrie beträchtlich.

Zusätzlich ist immer die Möglichkeit der Kontrolle durch bewährte Techniken sowie der

Dokumentation gegeben. Dazu müssen aber noch Protokolle entwickelt und etabliert werden,

die auch dem Anspruch der Vergleichbarkeit unter verschieden Laboren standhalten müssen.

Die Laser Scanning Zytometrie bietet eine weitere interessante Möglichkeit: aufgrund der

Relokalisierungsfunktion können Aktivierungsmechanismen, Proliferation, Apoptose und

deren Beeinflussung durch Zytokine als Funktion der Zeit untersucht werden. Ebenso könnten

Medikamentenwirkungen an Zellkulturen analysiert werden (Barnard et al. 2008).

____________________________________________________________Zusammenfassung

73

VI Zusammenfassung der Arbeit

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med.

Polyposis nasi: Quantitative Analyse der eosinophilen Granulozyten mit der Laser Scanning Zytometrie

eingereicht von Manuela Gutsche

angefertigt an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig in der Klinik und Poliklinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde/ Plastische Operationen

betreut von Prof. Dr. med. habil. F. Bootz

Oktober 2009

Ätiologie und Pathogenese der Polyposis nasi konnten bisher nicht vollständig geklärt

werden. Nasenpolypen sind Ausdruck einer chronisch-entzündlichen Erkrankung der

Nasenschleimhaut. Eosinophile Granulozyten sind bei den meisten Polypen die

vorherrschenden Entzündungszellen und halten die Entzündungsreaktion aufrecht. Inwieweit

sie bei der Entstehung der Polyposis nasi eine entscheidende Rolle spielen, ist Gegenstand

aktueller Forschungen.

Ob eine inhalative Allergie die Entwicklung von Nasenpolypen induziert oder die

Unterhaltung der zugrunde liegenden chronischen Entzündung fördert, wird seit Jahren

kontrovers diskutiert.

Trotz medikamentöser und operativer Therapien erleiden viele Patienten ein Rezidiv der

Nasenpolypen. Die Wahrscheinlichkeit eines Rezidivs beim einzelnen Patienten kann nicht

prognostiziert werden.

Die Standardmethode der histopathologischen Begutachtung von Nasenpolypen ist die

Lichtmikroskopie von HE-gefärbten Gewebsschnitten und subjektive Einschätzung der

Gewebseosinophilie. Teilweise hängt von dieser interindividuell stark variierenden

Einschätzung die weitere Therapie (z.B. Anwendung topischer Kortikoide) ab.

____________________________________________________________Zusammenfassung

74

Ziel dieser Studie war die objektive Analyse von operativ entfernten Nasenpolypen mit der

Laser Scanning Zytometrie. Diese Ergebnisse sollten mit histologischen Standardmethoden

verglichen und statistische Zusammenhänge zu den klinischen Angaben über Allergie und

Rezidiv geprüft werden.

Es gelang die Erstellung eines Protokolls zur objektiven Quantifizierung eosinophiler

Granulozyten. Das polypöse Gewebe von 41 Patienten wurde zu Einzelzellsuspensionen

aufbereitet und auf Objektträgern immobilisiert. DNA, Zytokeratinfilamente und eosinophile

Granula wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt und mit dem Laser Scanning Zytometer

untersucht. Hierbei wurde die selektive Färbung der eosinophilen Granulozyten mit

Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) etabliert. Eine FITC-Konzentration von 50µg/ml ergab eine

stabile und reproduzierbare Färbung der eosinophilen Granulozyten. Nach der lasergestützten

Messung wurden die gleichen Objektträger mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und die

Messergebnisse der ersten Messung ebenfalls mit dem Laser Scanning Zytometer visuell

kontrolliert.

Die untersuchten Proben wurden gleichzeitig bei routinemäßig durchgeführten pathologischen

Begutachtungen in vier Schweregrade bezüglich der eosinophilen Infiltration eingeteilt.

Außerdem erfolgte eine semiquantitative Bestimmung der Eosinophilie durch Zellzählung in

high power fields (HPF). Die LSC-Daten zeigten eine gute Korrelation zu den

Vergleichsdaten der semiquantitativen Bestimmung (r=0,79). Die Ergebnisse der

histopathologischen Begutachtung stimmten weder mit den im LSC objektiv bestimmten,

noch durch manuelle Zählung per high power field erhaltenen Maß der eosinophilen

Infiltration überein.

Weder die LSC- Daten noch die histopathologische Beurteilung zeigten einen statistischen

Zusammenhang zwischen der Eosinophilie und dem Vorliegen einer Allergie oder eines

Rezidivs unabhängig von der Definition der Eosinophilie (

berechnet mit Fishers exaktem Test.

Die Laser Scanning Zytometrie ermöglicht die schnelle, zuverlässige und quantitative

Untersuchung einer großen Anzahl unterschiedlicher Zellen eines Gewebes. Sie stellt ein

automatisiertes und objektives Verfahren der histologischen Untersuchungstechniken dar. Die

Färbung eosinophiler Granulozyten mit FITC führt zu einer Kostenreduktion, da teure

Antikörper eingespart werden können. Allerdings ist durch die quantitative Bestimmung der

Eosinophilie im Polypengewebe eine Aussage über den pathogenetischen Aspekt einer

Allergie nicht möglich. Auch kann kein Rückschluss von der Quantität der eosinophilen

Granulozyten auf die mögliche Entwicklung eines Rezidivs geschlossen werden. Die

____________________________________________________________Zusammenfassung

75

weiterführende Erforschung funktioneller Parameter der eosinophilen Granulozyten wie

Zytokinproduktion, Proliferation und Apoptose oder der Nachweis von Infektionserregern mit

der LSC könnten eher zum Verständnis der pathogenetischen Zusammenhänge bei der

Polyposis nasi führen. Zur Festlegung der optimalen Therapiestrategie wird die Bestimmung

von Zellparametern und Regulationsmechanismen entscheidend sein, da sich in Zukunft das

therapeutische Konzept vermehrt auf antientzündliche Therapieoptionen stützen wird.

Aufgrund der optimalen Kombination von zytometrischen Messungen und morphologischer

Dokumentation könnte die die Laser Scanning Zytometrie neben anderen objektträger-

basierten Verfahren eine wichtige Rolle spielen.

____________________________________________________________________Literatur

76

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_____________________________________________________________________Anhang

92

VIII Anhang

Abkürzungsverzeichnis

5-HPETE 5-Hydro-Peroxy-Eicosa-Tetranoid-Säure

AK Antikörper

ANCA Antineutrophile zytoplasmatische Autoantikörper

APC Antigen präsentierende Zellen

ASS Acetylsalicylsäure

BENARES Nicht-allergische Rhinitis mit Bluteosinophilie-Syndrom

BSA bovines Serumalbumin

C3, C5 Komplementfaktor 3 bzw. 5

CCD "charge coupled device", lichtempfindliche Fotodioden

CCR3 C-C-Chemokinrezeptor 3

CD Zelloberflächenmoleküle humaner Leukozyten (cluster of

differentiation)

CD4+-Zellen T-Helferzellen

CFTR-Gen zystische Fibrose-transmembranöses Konduktor-Regulations-Gen

CG-RP Calcitonin-Gen assoziiertes Peptid

COX Cyclooxigenase

DNA, DNS Desoxyribonukleinsäure

ECP Eosinophilen-kationisches Protein

EDN/ EPX Eosinophilen-Neurotoxin

EIA Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay = EIA

EPO Eosinophilen-Peroxidase

Fc Fragment cristalline, Teilkomponente eines Antikörpers

FITC Fluorescin- Isothiocyanat

FSC Flow Zytometrie

G-CSF Granulozyten koloniestimulierender Faktor

GM-CSF Granulozyten- Makrophagen koloniestimulierender Faktor

GRO- wachstumsassoziiertes Onkogen

HCl Salzsäure

HE Hämatoxylin und Eosin

_____________________________________________________________________Anhang

93

HIV Humanes Immundefizienzvirus

HLA-DR humanes Leukozytenantigen DR

HPF ein Gesichtsfeld bei größter Auflösung (high power field)

ICAM interzelluläres Adhäsionsmolekül

IFN Interferon

IgA, IgM, IgG, IgE Immunglobulin (A, M, G, E)

IGF-1 insulin like growth factor

IL Interleukin

IL1-RA IL1-Rezeptor-Antagonist

ISAAC the International Study of Asthma and Allergies in Childhood

LFA-1 Leukozyten funktionsassoziiertes Adhäsionsmolekül

LOX Lipoxigenase

LSC Laser Scanning Zytometer

LT C/ D/ E Leukotrien C/ D/ E

M-CSF Makrophagen koloniestimulierender Faktor

MAC-1 Makrophagen-Antigen-1 (CD11b/ CD18)

MBP Major basic Protein

MCP Monozyten chemotaktisches Protein

MIP Makrophagen inflammatorisches Protein

MPO Myeloperoxidase

NARES Nicht-allergische Rhinitis mit Eosinophilie-Syndrom

NOX Stickoxid

NSAR Nicht steroidale Antirheumatika

PAF Plättchenaktivierender Faktor

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PG Prostaglandin

PI Propidium Jodid

PMT Photomultiplier

RANTES released upon activated normal t-cells secreted

RAST Radio-allergen-sorbent-test

RNA, RNS Ribonukleinsäure

SAG Superantigen

SD Standardabweichung

SO2 Schwefeldioxid

_____________________________________________________________________Anhang

94

TGF transformierender Wachstumsfaktor

TH-Zellen T-Helferzellen

TNF Tumor-Nekrose-Faktor

VCAM vaskuläres Zelladhäsionsmolekül

VIP vasoaktives intestinales Polypeptid

VLA very late antigen

_____________________________________________________________________Anhang

95

Lösungen und Hilfsmittel

1. Lösungen

Ammoniak, 1%ig Apotheke der Universität Leipzig

aufsteigende Alkoholreihe Ethanol 70%ig, 80%ig, 96%ig, absolut, vergällt;

Apotheke der Universität Leipzig

BSA-PBS-Lösung, 0,5%ig Herstellung durch Verdünnen von 50µl BSA-

Stammlösung in 950µl PBS-Lösung

BSA-PBS-Lösung, 1%ig Herstellung durch Verdünnen von 100µl BSA-

Stammlösung in 900µl PBS-Lösung

BSA-Stammlösung, 10%ig Lagerung bei -4°C;

Albumin, bovine, Fraction V; Sigma-Aldrich Chemie

GmbH, Steinheim, Deutschland

destilliertes Wasser Aqua destillata; Apotheke der Universität Leipzig

Eosin, 1% alkoholische Eosinlösung;

Apotheke der Universität Leipzig

Ethanol, 70%ig Raumtemperatur, gepuffert, pH 7,4;

Apotheke der Universität Leipzig

Eukitt® O. Kindler GmbH & Co, Freiburg, Deutschland

FITC-Färbelösung, 50µg/ml Herstellung durch Verdünnen von 50µl FITC-

Stammlösung in 950µl PBS-Lösung

Flourescin Isothiocyanat, mixed isomers, Sigma-

Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland

FITC-Stammlösung, 10mg/ml Herstellung durch Lösen von 10 mg FITC-Pulver in

1,0ml destilliertem Wasser

Glycerol-PBS-Lösung Herstellung durch Verdünnen von 750µl Glycerol in

250µl PBS-Lösung;

Glycerol: Apotheke der Universität Leipzig

Hämatoxylin, 1% Hämatoxylin nach Delafield;

Apotheke der Universität Leipzig

HCL-Alkohol Ethanol-Salzsäure, 30ml 8molare HCl auf 1000ml

96%igen, vergällten Ethanol;

Apotheke der Universität Leipzig

Lyse-Puffer FACS™ Lysing Solution, Becton Dickinson

_____________________________________________________________________Anhang

96

(FACS™ Lysing Solution) Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA

Mäuse-IgG1-anti-Cytokeratin-

Antikörper Klon MNF116

Dako Glostrup, Dänemark

Mäuse-IgG1-

Negativkontrollantikörper

Dako Glostrup Dänemark

Natriumchloridlösung, 0,9%ig Apotheke der Universität Leipzig

Phosphate Buffered Saline (PBS)

pH 7,40

Herstellung durch Lösen von 9,6g Dulbecco´s PBS

Pulver in 1l destilliertem Wasser, Lagerung

lichtgeschützt bei 4°C;

Dulbecco´s phosphate buffered saline w/o NaHCO3,

Gibco, Invitrogen Corporation, UK

PI-Glycerol-PBS-Lösung Herstellung durch Verdünnen von 50µl PI (Propidium

Iodine)- Färbelösung in 950µl Glycerin-PBS-Lösung

(entspricht 25µg/ml PI in Glycerin-PBS)

Propidium Iodine (PI)-

Färbelösung, 50µg/ml

Herstellung durch Verdünnen von 50µl PI-Stammlösung

in 950µl PBS-Lösung

Propidium Iodine (PI)-

Stammlösung, 10mg/ml

Herstellung durch Verdünnen von 10mg PI-Pulver in

1ml destilliertem Wasser;

Propidium Iodine; Molecular Probes, Eugene, Oregon,

USA

Streptavidin-APC-Färbelösung Herstellung durch Verdünnen von 10µl gelieferter

Stammlösung in 90µl PBS-Lösung;

Streptavidin, Allophycocyanin, crosslinked, conjugate

1mg/ml; Molecular Probes MoBiTec, Eugene, Oregon,

USA

Xylol Merck, Deutschland

Ziege-anti-Maus-IgG1-

Färbelösung, konjugiert mit Biotin

Ziege-anti-Maus-IgG1-Antikörper verdünnt 1:10 in PBS;

goat-anti-mouse-IgG1, human ads. Biotin Conjugate

affinity isolated;

Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA

_____________________________________________________________________Anhang

97

2. Hilfsmittel

Aufbewahrungsbehälter Kartell, Italien

DAKO Medicon,

Medimachine und

Filcon System

DAKO Corporation, Carpinteria, CA, USA

Deckgläschen 24×24mm, Menzel-Gläser, Deutschland

Einmalspritze Einmalspritze 5ml, steril, B. Braun Melsungen AG, Melsungen,

Deutschland

Eppendorfhütchen Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Fettstift Dako PEN® for Immunohistochemistry,

Dako Glostrup, Dänemark

Glasküvette Apotheke der Universität Leipzig

Laser Scanning

Zytometer (LSC)

bestückt mit einem Argon- und einem Helium-Neon-Laser

CompuCyte Corporation, Cambridge, MA, USA

Lichtmikroskop Carl Zeiss, Jena, Deutschland

Microsoft Excel, Word,

Power Point

Microsoft Corporation, USA

Objektträger SuperFrost®Plus Objektträger 25x 75x 1.0mm, Menzel-Gläser,

Deutschland

Pipetten Pipettiervolumen von 2 bis 20µl, 10 bis 100µl sowie 100 bis

1000µl;

Eppendorf Pipette Reference mit Bedienknopf, Eppendorf AG,

Hamburg, Deutschland

Rundbodenröhrchen 5ml Polysterol Rundbodenröhrchen, steril, Becton Dickinson and

Company, Franklin Lakes, NJ, USA

Skalpell Disposable Scalpel, Feather Safety Razor CO., LTD Medical

Divison

SPSS 12.0 SPSS 12.0 für Windows, The Apache Software Foundation 2000

Taschenrechner Casio® Scientific Calculator fx-4800 P, Casio Computer Co., LTD.

Tokio, Japan

WinCyte™ Software CompuCyte Corporation, USA

Zentrifuge Hettich Zentrifuge EBA 8S, Hettich Zentrifugen, Tuttlingen,

Deutschland

_____________________________________________________________________Anhang

98

Beispiel: Darstellung der Messung in Diagrammen, statistische

Auswertung und Bilddokumentation

X059 Polyp vom 07.02.02: Messung am 12.02.02, Färbung: Zytokeratin-APC + FITC +PI Histogramme und statistische Tabellen (Wincyte-Software),

Erklärungen im Abschnitt Material & Methoden: Darstellung der Messdaten in Diagrammen, S. 36 u. 37

_____________________________________________________________________Anhang

99

„View cells in region“-Funktion: Darstellung der Messereignisse aus der grünen Region als Pixelmap

_____________________________________________________________________Anhang

100

„view cells in region..“-Funktion: Darstellung der Messereignisse aus der Region 1 (80,3%) als Pixelmap

_____________________________________________________________________Anhang

101

Danksagung

An dieser Stelle danke ich Herrn Prof. Bootz, Direktor der Klinik für Hals-Nasen-

Ohrenheilkunde der Universität Bonn, für die freundliche Überlassung des Themas und seine

stets fördernde Begleitung und Unterstützung bei der Durchführung dieser Promotion.

Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. med. Andreas Gerstner. Während der gesamten Zeit

war er durch sein reges Interesse und Hilfe bei auftretenden Problemen und Fragen ein

hervorragender Ansprechpartner. Seine großartige Unterstützung und sein Engagement bei

der Arbeit am Laser Scanning Zytometer erleichterten zu Beginn auftretende technische

Schwierigkeiten. Sein Interesse in neue Überlegungen und immer wiederkehrende

freundschaftliche Anregung und Kritik gaben mir entscheidende Impulse für das Fortschreiten

der Untersuchungen.

Ein großer Dank richtet sich an Frau Dipl.-Ing. I. Meinhardt, die große Hilfe bei der

Herstellung und Beschaffung verschiedener Materialien leistete und mit großem technischen

und organisatorischen Talent und enormer Hilfsbereitschaft und Freundschaftlichkeit sehr

gute Arbeitsbedingungen und ein herzliches Klima im Labor schuf.

Herrn PD Dr. rer. nat. Attila Tarnok (Herzzentrum Leipzig) danke ich dafür, dass er das Laser

Scanning Zytometer zur Verfügung stellte und zur Überwindung einiger technischer Hürden

beitrug. Herrn Prof. Dr. med. F. Emmrich (Institut für Immunologie, Universität Leipzig)

möchte ich dafür danken, dass er mir in seiner Einrichtung das Laser Scanning Zytometer

ebenfalls zur Verfügung stellte.

Für ihr großes Interesse am Fortschreiten der Arbeit sowie für ihre stetige Unterstützung

möchte ich mich ganz besonders bei meiner ganzen Familie, bei Dr. med. Julia Machlitt und

Dr. med. Wiebke Laffers bedanken.

Manuela Gutsche

_____________________________________________________________________Anhang

102

Lebenslauf

Persönliche Daten:

Manuela Gutsche

geb. am 10. Juli 1977 in Cottbus

ledig

Schulbildung:

1984 - 1990 20. POS Cottbus

1991 - 1997 Ludwig-Leichardt-Gymnasium Cottbus

Schulabschluss: Allgemeine Hochschulreife

Studium:

1997 - 2004 Studium der Humanmedizin an der Universität Leipzig

09/ 1999 Ärztliche Vorprüfung

09/ 2000 Erstes Staatsexamen

04/ 2003 Zweites Staatsexamen

05/ 2004 Drittes Staatsexamen

Zusatzqualifikationen:

10/1999 Ausbildung zur Rettungssanitäterin beim Arbeiter-Samariter-

Bund Leipzig,

1999- 2004 Beschäftigung als Rettungssanitäterin im kassenärztlichen

Notdienst

Beruflicher Werdegang:

seit 12/2004 Assistenzärztin in der Abteilung für Hals- Nasen- Ohren-

Heilkunde/ Plastische Operationen der Parkklinik Weißensee,

Berlin

_____________________________________________________________________Anhang

103

Wissenschaftlicher Werdegang

Vorträge:

Gutsche M., Gerstner A., Machlitt J., Emmrich F., Bootz F.:

Quantitative Bestimmung der Gewebseosinophilie bei Polyposis nasi.

10. Jahrestagung der Vereinigung Mitteldeutscher HNO- Ärzte, Jena, 07.-08.09.2001

Gutsche M., Emmrich F., Tárnok A., Bootz F., Gerstner A.:

Quantification of eosinophilia in nasal polyps by FITC binding. 15th. Heidelberg Cytometry

Symposium (HCS), Heidelberg, 17.-19.10.2002

Gutsche M., Behrbohm H.:

Die Chirurgie der knöchernen Nasenpyramide. 3. Lindauer Symposium für Ästhetische

Chirurgie und Kosmetische Zahnmedizin, Lindau 19.-20.06.2009

Abstracts:

Gutsche M., Gerstner A., Machlitt J., Emmrich F., Bootz F. (2001):

Quantitative Analysis of Eosinophilia in Polyposis of the Nose and Sinuses by LSC. The

Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents (ISSN 0393-974X) JBRHA 2001,

15(4): 478-79.

Gutsche M., Emmrich F., Tárnok A., Bootz F., Gerstner A.(2002):

Quantification of eosinophilia in nasal polyps by FITC binding. Program and Abstracts: 15th.

Heidelberg Cytometry Symposium (HCS) ISSN 0949-5347, 1: 31.

Publikation:

A.O.H. Gerstner, M. Gutsche, M. Bücheler, J. Machlitt, F. Emmerich, F. Sommerer, A.

Tárnok, F. Bootz (2004):

Eosinophilia in nasal polyposis: its objective quantification and clinical relevance. Clinical

and Experimental Allergy, 34: 65-70.

Berlin, 11.10.2009

Manuela Gutsche

_____________________________________________________________________Anhang

104

Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe

oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass

Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten

haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass

die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer

anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfverfahrens

vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene

Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird,

wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt

an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.

Berlin, 10.11.2009

Manuela Gutsche