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Pleiotrope Effekte von Erythropoietin auf renale Regenerationsmechanismen

während des akuten ischämischen Nierenversagens der Ratte

Sora Enders-Comberg

Aus der Medizinischen Klinik I

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. Hendrik Lehnert

Pleiotrope Effekte von Erythropoietin auf renale Regenerationsmechanismen während des akuten ischämischen Nierenversagens der Ratte

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck

- Aus der Sektion Medizin -

vorgelegt von

Sora Maria Enders-Comberg

aus Hagen

Lübeck 2015

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Jan Kramer

2. Berichterstatter/-in: Prof. Dr. med. Christoph Thorns

Tag der mündlichen Prüfung: 18.02.2015

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 18.02.2015

- Promotionskommission der Sektion Medizin -

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung und Zielsetzung 10

1.1 Einleitung 10

1.1.1 Das akute Nierenversagen 10

1.1.2 Ischämie-Reperfusionsschaden als Ursache des

akuten Nierenversagens 13

1.1.3 Mögliche Reparaturvorgänge im akuten Nierenversagen 15

1.2 Zielsetzung 19

2 Material & Methoden 21

2.1 Geräte und Material 21

2.1.1 Geräte 21

2.1.2 Material, Lösungen, Additive, Pharmaka 22

2.2 Isoliert perfundierte Niere 26

2.2.1 Versuchstiere 27

2.2.2 Präparation der Versuchstiere 27

2.2.3 Präparation der isoliert perfundierten Niere 28

2.2.4 Perfusionsmedium 29

2.2.5 Probengewinnung 29

2.2.6 Analytik 30

2.3 Durchflusszytometrie 32

2.3.1 Probenaufbereitung 32

2.3.2 Durchflusszytometrische Messung 33

2.4 Histologische Untersuchung 34

2.4.1 CD133 Immunhistochemische Färbung 34

2.4.2 Hämatoxylin-Eosin Färbung 35

2.4.3 Histologische Auswertung 36

2.5 Labormedizinische Untersuchung 36

2.5.1 Kreatininbestimmung 37

2.5.2 Harnstoffbestimmung 37

2.5.1 Hämatokritbestimmung 37

2.6 Statistik 37

3 Ergebnisse 39

3.1 Nierengewicht im Verhältnis zum Rattengewicht 39

3.2 Hämatokrit 40

3.3 Harnstoff und Kreatinin 42

3.4 Histologische Veränderungen 43

3.4.1 Tubuli mit Bürstensaum 44

3.4.2 Tubuli mit weitem Lumen 44

3.4.3 Zelldetritus 44

3.4.4 Anzahl von Tubuli 45

3.4.5 Zelluläre Inflammation 45

3.5 Funktionelle Ergebnisse der Untersuchung an der isoliert perfundierten

Rattenniere 47

3.5.1 Perfusionsflussrate und renaler Gefäßwiderstand 47

3.5.2 Glomeruläre Filtrationsrate und Urinflussrate 49

3.5.3 Fraktionierte Albuminclearance und Albumin Exkretionsrate 50

3.5.4 Fraktionierten Natrium- und Wasser Reabsorptionsrate 52

3.6 Ergebnisse der durchflusszytometrischen Untersuchung 53

3.6.1 Endotheliale Progenitorzellen 53

3.7 Ergebnisse der immunhistologischen Färbungen 55

3.7.1 CD133-positive Gefäße 55

4 Diskussion 57

4.1 Keine signifikante Verbesserung der Retentionsparameter nach

täglicher EPO-Gabe 59

4.2 EPO erhöht die Anzahl physiologischer Tubuli 60

4.3 Funktionelle Nierenparameter 61

4.4 Ausblick: Klinische Einsatzgebiete von EPO 63

5 Zusammenfassung 65

Literaturverzeichnis 67

Danksagung 75

Lebenslauf 76

Abkürzungen

Abb. Abbildung

ACh Acetylcholin

AK Antikörper

Alb. Albumin

ANV akutes Nierenversagen

AP Aktivatorprotein

Aqua. dest. Aqua destillatum (destilliertes Wasser)

ATP Adenosin-Triphosphat

BFU-E „burst-forming unit erythroid“

BSA “bovine serum albumin” (Bovines Serumalbumin)

°C Grad Celsius

Ca 2+ Calcium

CD „cluster of differentiation“

CFU-E „colony-forming units erythroid“

Cl Chlorid

CO2 Kohlendioxid

d Tag

DNA “desoxy ribonucleic acid” (Desoxyribonukleinsäure)

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EPC „endothelial progenitor cell“ (Endotheliale Progenitorzelle)

EPO Eryhtropoietin

EPO-R EPO-Rezeptor

FACS „flourescence activated cell sorting“

Fc “fragment crystallizable”

FCS “fetal calf serum” (Fetales Kälberserum)

FGF „fibroblast growth factor“ (Fibroblasten Wachstumsfaktor)

FITC Flouresceinisothiocyanat

FS „forward scatter“

g Gramm

GFR Glomeruläre Filtrationsrate

h Stunde

H2O Wasser

Hb Hämoglobin

Hg Quecksilber (mmHg = mm Quecksilbersäule)

HGF „hepatocyte growth factor“ (Hepatozyten Wachstumsfaktor)

HIF “hypoxia inducible factor” (Hypoxieinduzierter Faktor)

Hkt Hämatokrit

IGF „insulin-like growth factor“ (Insulinähnlicher Wachstumsfaktor)

IE Internationale Einheiten

IL Interleukin

i.p. intraperitoneal

I - R Ischämie – Reperfusion

i.v. intravenös

JAK/STAT Janus-Kinase / “signal transducers and acticators of

transcription”

K+ Kalium

kDa kilo Dalton

KM Knochenmark

L Liter

m Meter

min Minute

n Anzahl der durchgeführten Versuche

Na+ Natrium

NF-κB „nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B-cells“

NO Stickstoffmonoxid

O2 Sauerstoff

OP Operation

PBS Phosphate buffered saline

PE-Cy7 Phycoerythrin-Cy7

pH „pondus Hydrogenii”

PI3K Phosphatidyl-Inositol-3 Kinase

rhEPO “recombinant human EPO” (rekombinantes humanes EPO)

ROS “reactive oxygen species” (Reaktive Sauerstoffspezies)

rpm “rounds per minute” (Umdrehungen pro Minute)

SDF “stromal-cell derived factor”

SS “sideward scatter”

Tab. Tabelle

TNF-α Tumornekrosefaktor-α

VEGF “vascular endothelial growth factor” (Gefäßendothelialer

Wachstumsfaktor)

VEGFR VEGF-Rezeptor

1 Einleitung

1 Einleitung und Zielsetzung

1.1 Einleitung

1.1.1 Das akute Nierenversagen Das akute Nierenversagen (ANV) ist eine akut auftretende Verschlechterung der

Nierenfunktion mit der Folge, dass harnpflichtige Substanzen wie Harnstoff und

Kreatinin im Blut akkumulieren. Des weiteren kann es zu einer Störung des Säure-

Base-Haushalts sowie der Flüssigkeits- und Elektrolyt-Homöostase kommen. Ein

Nachlassen bzw. Versiegen der Harnsekretion (Oligurie, Anurie) tritt mit bis zu

50% relativ häufig im Rahmen eines ANV auf (Silva Junior et al., 2006).

Die Definition des ANV war international nicht einheitlich geregelt. Erst die

Bemühungen der Acute Dialysis Outcome Initiative group führten zur sogenannten

RIFLE-Klassifikation (Risk, Injury, Failure, Loss of kidney function, End-stage renal

disease), die unter Berücksichtigung des Serum-Kreatinins und der Urinmenge

eine Diagnose ermöglicht (Bellomo et al., 2004).

Klasse GFR Kriterien Urinmenge Risk Serum-Kreatinin x 1,5 oder GFR Abfall > 25% < 0,5ml/kg/h x 6h Injury Serum-Kreatinin x 2 oder GFR Abfall > 50% < 0,5ml/kg/h x 12h Failure Serum-Kreatinin x oder GFR Abfall > 75% oder

Serum-Kreatinin ≥ 4ml/dl mit akutem Anstieg von 0,5mg/dl

< 0,3/ml/kg/h x 24h oder Anurie x 12h

Loss Persistierendes akutes Nierenversagen = Verlust der Nierenfunktion > 4 Wochen

End-stage renal disease

Chronisches Nierenversagen > 3 Monate

Tabelle 1: Klassifikation verschiedener Stadien der Nierenschädigung nach RIFLE

10

1 Einleitung

Die RIFLE Kriterien wurden 2004 vom Acute Kidney Injury Network (AKIN)

modifiziert (Mehta et al., 2004). Es wurde eine neue Definition des akuten

Nierenversagens herausgegeben. Demnach ist das akute Nierenversagen:

„Eine plötzliche (innerhalb von 48h) Verminderung der Nierenfunktion definiert als

ein Anstieg des Serum-Kreatinins um ≥ 0,3 mg/dl (≥ 26,4 µmol/l), ein prozentualer

Anstieg des Serum-Kreatinins um ≥ 50% (1,5 fach vom Grundwert) oder eine

Verminderung der Urinmenge (dokumentierte Oligurie von < 0,5 mg/kg/h für mehr

als 6h.“

Analog zur RIFLE Klassifikation lassen sich 3 Stadien des ANV nach AKIN

unterscheiden.

Klasse Serum-Kreatinin Urinmenge 1 Anstieg ≥ 0,3 mg/dl (≥ 26,4 µmol/l) oder ≥ 150 –

200% <0,5ml/kg/h für mehr als 6h

2 Anstieg ≥ 200 – 300% <0,5ml/kg/h für mehr als 12h

3 Anstieg ≥ 4,0 mg/dl (≥ 354 µmol/l) mit akutem Anstieg ≥ 0,5 mg/dl (≥ 44 µmol/l) oder ≥ 300%

<0,3/ml/kg/h für 24h oder Anurie für 12h

Tabelle 2: Klassifikation des akuten Nierenversagens nach AKIN

Seitdem gab es viele Veröffentlichungen, die diese beiden Klassifikationen

verglichen. Bagshaw et al. (2007) konnten keine nennenswerte Verbesserung der

Sensitivität der Diagnose des ANV durch die AKIN Klassifikation feststellen. Lopes

et al. (2008) hingegen konnten eine Verbesserung der Sensitivität aufzeigen,

jedoch keine Verbesserung hinsichtlich der prädiktiven Aussagekraft bezüglich der

Mortalität von Patienten.

Dies verdeutlicht noch einmal, wie schwierig es trotz dieser Bemühungen ist, eine

einheitliche Definition zu finden. Momentan scheint es eine Präferenz der AKIN

Kriterien zu geben.

Aufgrund dieser bis dato uneinheitlichen Definition des ANV war es schwierig,

verlässliche epidemiologische Daten zu erheben. Vor diesem Hintergrund geht

man davon aus, dass die Inzidenz des ANV bei intensivpflichtigen Patienten bis zu

35% beträgt (The VA/NIH Acute Renal Failure Trial Network, 2008). Die Prognose

eines ANV ist ernst und der Krankheitsverlauf wird meist durch die zugrunde

11

1 Einleitung

liegende Erkrankung bestimmt. Die Mortalität liegt im intensivmedizinischen

Bereich bei 50-80% (Brar et al., 2008; Abosaif et al., 2005;) und hat sich in den

letzten Dekaden trotz Verbesserung der intensivmedizinischen Versorgung und

der Dialyseverfahren nicht wesentlich verbessert (Park et al., 2010; Ympa et al.,

2005). Auch heute noch beschränkt sich die Therapie des ANV auf

symptomatische oder präventive Maßnahmen; eine kausale Behandlung mit

Verbesserung der Prognose existiert bisher nicht. Bei Therapieversagen müssen

betroffene Patienten einer Nierenersatztherapie (Hämodialyse oder -filtration)

zugeführt werden (Rondon-Berrios und Palevsky, 2007). Andererseits ist das ANV

bei Überleben in aller Regel reversibel, so dass nur weniger als 1% der

betroffenen Patienten eine dauerhafte Nierenersatztherapie benötigen (Bagshaw,

2006).

Das ANV wird ätiologisch in 3 Gruppen eingeteilt. Die häufigste Ursache für ein

ANV ist das prärenale Nierenversagen (Obialo et al., 2000). Hierbei sind die

tubulären und glomerulären Funktionen primär intakt. Die Funktionsstörung geht

vielmehr auf die verschlechterten Arbeitsbedingungen der Niere zurück, welche

durch eine unzureichende renale Perfusion entstehen. Gründe dafür sind z.B.

Hypotension aufgrund einer peripheren Vasodilatation bei Sepsis oder

Volumenmangelschock, welche zu einer Verminderung des effektiven

Blutvolumens führen (Hilton, 2006).

Nach Wiederherstellung der Perfusion kommt es meist zu einer raschen Erholung

der Organfunktion. Bei länger anhaltenden Störungen kann es jedoch zu

strukturellen Schäden des Nierengewebes und einem Übergang in ein

intrinsisches renales Nierenversagen kommen. Durch andauernde Hypoxie kommt

es zur akuten Tubulusnekrose, die auch nach Wiederherstellung der

Nierenperfusion nicht sofort reversibel ist.

Mit 20-40% steht das intrarenale Nierenversagen bei den Ursachen an zweiter

Stelle der Häufigkeit eines ANV. Die Ursachen sind sehr heterogen und reichen

von vaskulären Störungen über glomeruläre und tubulointerstitielle Erkrankungen

bis zur ischämischen und toxischen Tubulusnekrose. Allen gemeinsam ist jedoch,

12

1 Einleitung

dass im Gegensatz zum prä- und postrenalen Nierenversagen ein struktureller

Schaden der Niere besteht (Haller et al., 2000).

Ursachen für ein postrenales Nierenversagen sind in Harnwegsobstruktionen zu

suchen. Es tritt jedoch mit einer Inzidenz von 1-10% eher selten auf. Ein Grund

dafür ist auch, dass eine einseitige Abflussbehinderung durch die gesunde zweite,

kontralaterale Niere kompensiert werden kann (Sykes und Cosgrove, 2007;

Chatterjee 2007)

1.1.2 Ischämie-Reperfusionsschaden als Ursache des akuten Nierenversagens Das ischämische ANV entsteht durch eine prärenal verursachte mangelhafte

Durchblutung der Niere. Gründe dafür sind u.a. Hypotension z.B. im Rahmen

eines Schocks, Stenosen oder Embolien der Nierenarterien sowie abdominell-

chirurgische Eingriffe, bei denen eine temporäre Unterbindung des aortalen

Blutflusses notwendig wird. Im Verlauf dieser signifikanten Minderperfusion kommt

es einerseits zu einer direkten Schädigung der Niere durch die Ischämie, und

andererseits zu einer Schädigung, die durch die darauf folgende Reperfusion

entsteht. Dies nennt man auch Ischämie-Reperfusions (I-R) Schaden, der sowohl

die Funktion der Kapillaren als auch die Funktion der Tubuluszellen betrifftt (Jang

et al., 2009).

Zur Aufrechterhaltung ihrer physiologischen Funktion benötigt die Niere wie jedes

andere Organ oder Gewebe Adenosin-Triphosphat (ATP). Im Rahmen einer

Ischämie kommt es in den proximalen Tubuluszellen zu einer Dysfunktion und

Umverteilung der normalerweise basolateral eingebauten ATP-abhängigen

Natrium-Kalium-Pumpen, und dadurch zu einem Verlust der Zellpolarität. Natrium-

und Calcium-Ionen strömen ein und führen zu einem osmotisch bedingten

Anschwellen der Zelle, woraufhin es zu einem Verlust von Zell-Zell-Adhäsion und

zur Ablösung von der Basalmembran kommt (Spiegel et al., 1989). Durch diese

Unterbrechung verliert die Epithelschicht ihre Barrierefunktion, wodurch es zum

13

1 Einleitung

sogenannten „Backleak“, d.h. einem Rückstrom des glomerulären Filtrats aus dem

Tubuluslumen in das Interstitium, kommt.

Der Zelltod durch Nekrose oder Apoptose ist die Folge. Abgestorbene oder

geschädigte Epithelzellen werden ins Tubuluslumen abgeschilfert und führen zu

einer mechanischen Obstruktion (Bonventre, 1993).

Auch im Bereich des Endothels der Kapillaren kommt es durch ähnliche Vorgänge

zu einem Flüssigkeitsverlust aus dem Intravasalraum und folglich einem relativen

Anstieg des Anteils zellulärer Bestandteile im Blut (Hämatokrit). Dieser Anstieg der

Viskosität führt zu einer verschlechterten Mikrozirkulation bis hin zur Obstruktion

der Kapillaren. Dieser Prozess wird zusätzlich durch eine Störung des

Autoregulationsmechanismus verstärkt: die Niere reagiert physiologisch auf einen

erniedrigten Blutdruck mit einer Vasodilatation am Vas afferens sowie einer

Vasokonstriktion am Vas efferens, um eine ausreichende Perfusion und somit die

GFR aufrecht zu erhalten. Bei einem ischämischen Ereignis hingegen kommt es

zu einer paradoxen Vasokonstriktion. Die Arteriolen reagieren verstärkt auf

vasokonstriktive Mediatoren wie Endothelin oder Angiotensin; im Gegensatz dazu

ist die Antwort auf vasodilatative Stoffe wie Stickstoffmonoxid (NO), Acetylcholin

(ACh) oder Bradykinin herabgesetzt (Bonventre und Weinmann, 2003). Diese

Vasokonstriktion reduziert den renalen Blutfluss weiterhin und potenziert den

ischämiebedingten Schaden.

Zusätzlich verstärkt wird diese kapilläre Obstruktion durch einen

inflammatorischen Prozess, in dessen Verlauf es zu einer Freisetzung von

proinflammatorischen Mediatoren wie Interleukin-1 (IL-1), IL-6 und

Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) kommt. Durch Adhäsion von aktivierten

Leukozyten und Thrombozyten kommt es zu einer Verlegung des Gefäßlumens

(Bonventre et al., 2003).

Obwohl nach einer Hypoxie der Niere eine schnellstmögliche Reperfusion

notwendig ist und therapeutisch angestrebt wird, führt sie zur Freisetzung von

reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS), die eine Schädigung

des Gewebes bedingen können. In Situationen mit oxidativem Stress werden

14

1 Einleitung

diese ROS generiert, die durch direkte Schädigung der Zellen einerseits, sowie

durch Hochregulierung der Produktion zytotoxischer Substanzen wie Nuclear

factor κ-light-chain-enhancer of activated B-cells (NF-κB) und Aktivatorprotein-1

(AP-1 ) zu einer akuten Tubulusnekrose, und somit einem Transit des prärenalen

ischämischen Nierenversagens in ein intrinsisches Nierenversagen führen

(Midhun et al., 2005). 1.1.3 Mögliche Reparaturvorgänge im akuten Nierenversagen Anders als z.B. das Gehirn oder Herz besitzt die Niere die Fähigkeit, sich nach

einem passageren ischämischen Ereignis vollkommen zu regenerieren.

Reparaturvorgänge finden dabei sowohl an den Tubulusepithel- als auch an den

Endothelzellen der Kapillaren statt.

Um die Regeneration im Tubulus einzuleiten, müssen sich überlebende

Tubulusepithelzellen aus anliegenden Regionen ausbreiten oder migrieren, um die

vorhandenen Substanzdefekte in der Epithelschicht zu decken. Diese Zellen

dedifferenzieren und treten erneut in den Zellzyklus ein, um so die Tubulusstruktur

und –funktion wieder herzustellen (Nony und Schnellmann, 2003). Dabei ist die

normale Proliferationsgeschwindigkeit der Zellen um ein vielfaches gesteigert und

wird durch Genexpression von Wachstumsfaktoren (z.B. IGF-1, HGF) gesteuert

(Witzgall et al., 1994)

Die Reparatur des Tubulusepithels durch Progenitorzellen und mesenchymale

Stamm-/Stromazellen (Msc) aus dem Knochenmark spielt, im Gegensatz zu den

Gefäßendothelien, nach neusten Erkenntnissen im Vergleich zum oben erwähnten

Mechanismus wahrscheinlich nur eine untergeordnete Rolle (Liu und Brakeman,

2008).

15

1 Einleitung

Abbildung 1: Reparaturvorgänge am Tubulusepithel und Kapillarendothel nach ischämischem Trauma. Es kommt sowohl zu lokalen Reparaturmechanismen, als auch zur Mobilisierung von Vorläuferzellen aus dem Knochenmark. Es gibt Hinweise, dass diese Vorgänge durch Erythropoietin unterstützt werden.

Zusätzlich zu diesen lokalen, epithelialen Reparaturmechanismen kommt es auch

zu einer endothelialen Regeneration. Lange Zeit nahm man an, dass postnatale

Neovaskularisierung allein darauf beruht, dass bereits existierende, voll

differenzierte Endothelzellen migrieren und proliferieren (Heeschen et al., 2003).

Dieser Vorgang wird auch Angiogenese genannt.

Trotz dieser Fähigkeit haben reife, terminal differenzierte Endothelzellen ein

niedriges Proliferationspotential, so dass sie nur bedingt einen endothelialen

Schaden ersetzen können. Aus diesem Grund muss der Reparaturvorgang durch

andere Mechanismen unterstützt werden. Im peripheren Blut fand man aus dem

16

1 Einleitung

Knochenmark freigesetzte Stammzellen, die in ihren Eigenschaften den

embryonalen Angioblasten ähneln (Hristov und Weber, 2008). Diese Zellen, auch

endotheliale Progenitorzellen (Endothelial Progenitor Cells, EPCs) genannt,

besitzen das Potential, in Regionen der Neovaskularisierung einzuwandern und

sich dort in reife Endothelzellen zu differenzieren.

Erstmalig beschrieben Asahara et al. (1997) die Isolation und das Vorkommen von

EPCs. Später fand man heraus, dass EPCs 3 charakteristische Oberflächen-

marker exprimieren: CD34, CD133 und den vascular endothelial growth factor

receptor-2 (VEGFR-2). Vorläuferzellen, die diesen Phänotypen zeigen, können vor

allem im Knochenmark detektiert werden. Im peripheren Blut dagegen gibt es nur

noch wenige Zellen die CD133 exprimieren. (Kaushal et al., 2001). Peichev et al.

(2000) inkubierten CD34-, CD133- und VEGFR-2-positive EPCs mit VEGF und

fibroblast growth factor-2 (FGF-2), woraufhin diese in CD133-negative, reife

Endothelzellen differenzierten. Gehling et al. (2000) zeigten, dass CD133-positive

Zellen in Anwesenheit von VEGF und Stammzell-Wachstumsfaktor in reife

Endothelzellen differenzieren. Aufgrund dieser Ergebnisse kann man vermuten,

dass proliferationsfähige endotheliale Progenitorzellen CD133 exprimieren, und

sich erst mit der terminalen Differenzierung in CD133-negative Zellen umwandeln.

Diese Hypothese macht man sich zunutze, um durch Markierung von CD133 die

proliferationsfähigen EPCs zu identifizieren.

Es wurde bereits für viele Organe und Gewebe wie z.B. Herz, Hirn, Gefäße und

Nerven berichtet, dass EPCs eine Neovaskularisierung fördern. In verschiedenen

Fallstudien wurde gezeigt, dass renale Tubulusepithelzellen von weiblichen

Nagetieren, denen (hämatopoetische) Stammzellen von männlichen Tieren

implantiert wurden, Y-Chromosomen besaßen (Gupta et al., 2002; Masuya et al.,

2003; Lin et al., 2003). Diese Beobachtung führte zu der Hypothese, dass

Stammzellen aus dem Knochenmark auch in der Niere zur epithelialen

Regenerationsfähigkeit beitragen können.

Damit EPCs zu den Regionen der Neovaskularisierung gelangen können, müssen

sie zunächst aus dem Knochenmark mobilisiert werden. Diese Freisetzung wird

17

1 Einleitung

durch Chemokine und Wachstumsfaktoren wie z.B. VEGF, Angiopoetin und SDF

(Stromal cell-derived factor) gesteuert.

In den letzten Jahren konnte gezeit werden, dass auch Erythropoietin (EPO) die

Mobilisierung von EPCs aus dem Knochenmark ins periphere Blut steigert

(Heeschen et al., 2003).

Das Glycoprotein EPO besitzt eine Molekülmasse von 30.4 kDa und wird

hauptsächlich durch peritubuläre Fibroblasten der Nierenrinde prozduziert; ein

kleiner Anteil wird beim Erwachsenen auch in der Leber synthetisiert (Bernhardt

und Eckhardt, 2008). EPO stimuliert die Erythropoese, indem es die Apoptose der

roten Vorläuferzellen (hauptsächlich colony-forming units erythroid [CFU-E] und

burst-forming units erythroid [BFU-E]) im Knochenmark hemmt. Die EPO-

Produktion wird über einen negativen Feedback Mechanismus mit hypoxia

inducible factor (HIF-1) reguliert, welches bei Gewebe Hypoxie ausgeschüttet

wird und den stärksten Stimulus für die EPO-Expression darstellt (Ghezzi et al.

2004). Bei intakter renaler Funktion wird die EPO-Konzentration bei fallenden

Hämoglobin-Werten exponentiell erhöht. Der Serumspiegel kann dabei auf das

600fache der Norm ansteigen (Jelkmann, 2004). Die Entwicklung des recombinant

human EPO (rhEPO) bildete die Basis für den weitverbreiteten klinischen Einsatz

von EPO in der Therapie der renalen oder tumorbedingten Anämie.

Der positive Effekt von EPO auf ischämiebedingte Zellschäden wurde in den

letzten Jahren in verschiedenen Organsystemen beforscht. Bei Mäusen die mit

EPO behandelt wurden stieg die Anzahl der EPCs im Knochenmark und im Blut

signifikant an (Müller-Ehmsen et al., 2006). Vesey et al. (2004) stellte mit in vitro-

Verfahren fest, dass proximale Tubuluszellen unter hypoxischen Zuständen durch

EPO-Applikation signifikant weniger Apoptose zeigten als ohne EPO-Applikation.

Der positive Effekt von EPO in vivo kann damit also auf zwei Mechanismen

basieren: der durch EPCs vermittelten gefäßproliferativen Wirkung (Heeschen et

al., 2003) und/oder der direkten antiapoptotischen Wirkung in den proximalen

Tubulusepithel- sowie Gefäßendothelzellen. Diese direkte Wirkung wird durch den

EPO-R vermittelt, der von vielen Zielzellen exprimiert wird, unter anderem von

Neuronen, Gefäßendothelzellen und renalen Tubulusepithelzellen (Westenfelder

18

1 Einleitung

et al., 1999). Bei Aktivierung des EPO-R wird eine Signalkaskade über JAK/STAT

und PI3K (Phosphatidyl-Inositol-3 Kinase) initiiert, die einen proliferativen,

promigratorischen und antiapoptotischen Effekt auf die Zelle hat (Salahudeen et

al., 2008).

Diese durch EPO induzierten zellulären Vorgänge stellen einen

vielversprechenden Ansatz für die Therapie von ischämisch bedingten

Erkrankungen wie z.B. dem akuten Nierenversagen dar, und sind Gegenstand der

aktuellen Forschung (s. Tabelle S. 56).

1.2 Zielsetzung Wie im vorangehenden Abschnitt dargelegt, kommt es im ANV nicht nur zu

epithelialen Regenerationsvorgängen, sondern es werden möglicherweise auch

Endothelschäden, u.a. durch Freisetzung von CD34- und CD133-positiven EPCs

aus dem Knochenmark, repariert. Dabei kann EPO als Mobilisator der EPCs oder

als parakriner Mediator bei Reparaturvorgängen eine Rolle spielen.

Die aktuelle Literatur hierzu beschränkt sich auf Arbeiten, bei denen EPO bereits

prophylaktisch vor der Induzierung eines ANV appliziert wurde. Da dieses

Vorgehen nicht dem realistischen Ablauf in der Klinik entspricht, war es unsere

Intention, ein klinikorientierteres Modell zu etablieren, bei dem der Effekt der EPO-

Applikation im Verlauf eines bereits aufgetretenem ANV unter standardisierten

Bedingungen untersucht werden konnte.

Bei den Untersuchungen sollte zunächst durchflusszytometrisch überprüft werden,

ob durch die Gabe von EPO im ANV-Tiermodell eine Mobilisation von CD133-

positiven und somit proliferationsfähigen EPCs ins Blut erzielt werden kann.

Anhand der Entwicklung des Hämatokritwerts nach Applikation wurde die

physiologische Wirksamkeit von EPO demonstriert.

Durch Ermittlung der funktionellen Nierenretentionsparameter (Harnstoff und

Kreatinin) im Blut sollte geprüft werden, ob es durch EPO zu einer Verbesserung

19

1 Einleitung

20

der Nierenfunktion kommt, was vor allem in Bezug auf Therapieoptionen eine

Rolle spielt.

Mithilfe histologischer Untersuchungen sollte nachgewiesen werden, ob durch

EPO-Applikation eine Verminderung des Tubulusepithelschadens in vivo erreicht

werden kann, und ob sich CD133-positive Zellen auch im Sinne eines

Reparaturvorganges im Endothel der Gefäße im Nierengewebe darstellen lassen.

Mit Hilfe des Modellsystems der isoliert perfundierten Rattenniere sollte zusätzlich

geprüft werden, ob Parameter der glomerulären, tubulären und/oder endothelialen

Funktion nach EPO-Applikation beeinflusst werden.

Die Fragestellung der Arbeit kann damit in zwei wesentliche Teilaspekte gegliedert

werden:

1. Führt die Applikation von EPO im ANV zu einer verbesserten

Nierenfunktion?

2. Auf welcher Ebene (Glomerulum, Tubulusapparat, Endothel) kann nach der

EPO-Applikation eine funktionelle und strukturelle Verbesserung

beobachtet werden?

2 Material & Methoden


2.1 Geräte und Material

2.1.1 Geräte Absaugpumpe Vacuum Pump XF54 230 50 (Millipore, Billerica, USA)

BGA-Messgerät ABL5 (Radiometer, Willich)

Durchflusszytometer Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, Krefeld)

Elektrolytautomat Efox 5053 (Eppendorf, Hamburg)

Entwässerungsbad TP 1020 (Leica Mikrosysteme, Wetzlar)

Feinwaage 444-33 (Kern & Sohn, Balingen-Frommern)

Hämatokrit-Messgerät Microspin (Compur Monitors, München)

Hämoglobin-Messgerät D1M1000 (Compur Monitors, München)

Laborchemisches Analysegerät AU2700 (Beckman Coulter, Krefeld)

Linienschreiber Typ 2041 (Linseis Messgeräte, Selb)

Mikroskop Laborlux 11 (Leitz, Oberkochen), Axioplan 2 (Carl Zeiss, Oberkochen)

Mikroskopkamera AxioCam MRc5 (Carl Zeiss, Oberkochen)

Mikrotom HM 440E (Thermo Fisher Scientific, ehem. Microm, Walldorf)

Mikrowelle (Medion, Essen)

OP Tisch (Spezialanfertigung)

Perfusionssystem (Spezialanfertigung)

Pumpe MC-MS/CA4 (Ismatec, Wertheim-Mondfeld)

Verstärkersystem (Druckaufnehmer + Flussregulator) (Spezialanfertigung)

Vortex Vibrofix VF1 (IKA, Staufen)

Wasserbad Tissue Floating Bath TFB45 (Medite, Burgdorf)

Zellzähler COULTER Counter AC-T 8 (Beckman Coulter, Krefeld)

Zentrifugen Varifuge 3.0 R (Heraeus, Hanau), Biofuge pico (Heraeus, Hanau)

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2.1.2 Material, Lösungen, Additive, Pharmaka 2.1.2.1 Material

EDTA Röhrchen S-Monovette®, 5 ml (Sarstedt, Nümbrecht)

Jugularis- und Urinkatheter Polythene tube Portex, 0,28 mm (neoLab, Heidelberg)

Hämatokrit-Röhrchen heparinisiert, 9 µl, (ST 06550 A, BDH, über VRW

International, Darmstadt)

Hämoglobin-Röhrchen heparinisiert, 5 µl, ST 00150 A (BDH)

Objektträger SuperFrost® Plus (Menzel-Gläser, Braunschweig)

Reaktionsgefäß, 1,5 ml (Eppendorf, Hamburg)

Zentrifugenröhrchen, 25 ml (Sarstedt)

Zentrifugenröhrchen, 50 ml (Sarstedt)

2.1.2.2 Additive

CD34 PE-Cy7 conjugated SC-7324 (Santa Cruz, Heidelberg)

CD133 rabbit polyclonal IgG M-286 (Santa Cruz, Heidelberg)

CD133 antibody (Selleck Chemicals, Houston, USA)

Eosin B (C.I. 45400) (Carl Roth, Karlsruhe)

Entellan® (Merck, Darmstadt)

Ethanol (Apotheke des UKSH Lübeck)

Färbungs-Kit EnVision Kit G2 (Dako, Hamburg)

FCS-Rinderserum, Gibco® (Invitrogen GmbH, Karlsruhe)

Ficoll® 400 (BDH, über VWR International, Darmstadt)

FITC-conjugated goat anti rabbit IgG (Jackson Immuno Research, Suffolk UK)

Hämalaunlösung nach Meyer (Carl Roth, Karlsruhe)

Primär-AK M286 (Santa Cruz, Heidelberg)

Rinderserum Albumin (genaue Zusammensetzung im Anhang)

Roti®-Histofix 4% (Carl Roth, Karlsruhe)

Waschpuffer 0,3 % Tween 20 (Sigma Aldrich, München)

Xylol (Isomere) (Carl Roth, Karlsruhe)

22


2.1.2.3 Pharmaka

Erythropoetin Erypo FS 2000 (Ortho Biotech Janssen-Cilag, Neuss)

Heparin-Natrium 25000 (ratiopharm, Ulm)

Thiopental Trapanal® (Altana, Wesel)

2.1.2.4 Lösungen

Für die genaue Zusammensetzung der Folgenden s.u.

5000 ml Dialysat

300 ml Perfusat (150 ml 10%ige Albuminlösung + 150 ml Substitutionslösung)

Alle folgenden Materialien der Firmen Merck, Seva, Rath, Biomol, Hassa Lab

Dialysat 3000,0 ml Aqua dest.

319,0 ml 10% NaCl

115,0 ml NaHCO3

22,5 ml 7,45% KCl

15,0 ml MgCl2 (= 0,2M)

1,8g Harnstoff

14,5 ml 0,1M NaH2PO4

33,0 ml 0,1M Na2HPO4

56,4 ml Aminosäuregemisch (Aminoplasmal L 10)

1,5 g Glutamin

0,8 g Cystein

10,0 ml Inulin (Inutest)

250,0 µl ADH (Pitressin 1:100)

1,1 g Na-Pyruvat

1,2 g Na-Lactat

0,5 ml Genamicinsulfat (Gentamixin Beecham 80)

15,0 ml 50% Glucose

1,54 g Glutathion, red.

0,8 g Na-Malat

23


0,66 g Oxalessigsäure in 10,0 ml 8,4% NaHCO3

50 mg Vitamin C

0,5 g Glycin

16,0 ml CaCl2 (=0,5M)

Substitutionslösung 60,0 ml Aqua dest.

10,0 ml 10% NaCl

2,44 ml 8,4% NaHCO3

0,75 ml 7,45% KCl

0,9 ml MgCl2

108,0 mg Harnstoff

0,44 ml 0,1M NaH2PO4

1,9 ml 0,1M Na2HPO4

3,4 ml Aminosäuregemisch (Aminoplamal L 10)

88,0 mg Glutamin

51,0 mg Cystein

0,6 ml Inulin (Inutest)

15,0 µl ADH (Pitressin 1:100)

66,0 mg Na-Pyruvat

69,0 Na-Lactat

30,0 µl Gentamicinsulfat (Gentamicin Beecham 80)

1,0 ml 50% Glucose

93,0 mg Glutathion, red.

45,0 α-Ketoglutarat

48,0 mg Na-Malat

40,0 mg Oxalessigsäure in 1,0 ml 8,4 NaHCO3

5,0 mg Vitamin C

25,0 mg Glycin

0,75 ml CaCl2

24


Rinderserum Albumin Rinderserum Albumin Stammlösung

BSA (K 51-001, PAA Lab GmbH, Pasching, Österreich)

PBS-Lösung (phosphate buffered saline)

8,0 g NaCl

0,2 g KCl

1,44 g Na2HPO4

0,24 g KH2PO4

Citratpuffer 9,0 ml Stammlösung A

41,0 ml Stammlösung B

450,0 ml Aqua dest.

Stammlösung A 0,1 M Zitronensäure

21,01 g C6H8O7xH20 (#244, Mercke) in 1000 ml Aqua dest.

Stammlösung B 0,1 M Natriumcitrat

29,41 g C6H5O7Na3xH2O (#6448, Mercke) in 1000 ml Aqua dest.

FACS-Puffer PBS

1% BSA

0,1% NaN3

25


2.2 Isoliert perfundierte Niere

Das Modell der isoliert perfundierten Rattenniere wurde bereits vor ca. 50 Jahren

zum ersten Mal publiziert (Weiss et al., 1959) und ist heute ein Standardverfahren,

um physiologische und biochemische Vorgänge in der Niere unter möglichst

kontrollierbaren Bedingungen untersuchen zu können. Dabei wird die Niere vom

Organismus komplett isoliert; der Kreislauf wird durch eine

Rezirkulationsanordnung und das Blut durch ein Perfusionsmedium ersetzt.

Bei der hier verwendeten Versuchsanordnung wurde die Niere an ein System

angeschlossen, in dem das Perfusionsmedium kontinuierlich gegen das 25fache

Volumen einer eiweiß- und zellfreien Lösung dialysiert wurde. Damit war es

möglich, eine stabile Organfunktion durch eine weitgehend konstante

Zusammensetzung des Perfusionsmediums über mehrere Stunden aufrecht zu

erhalten. Das Modellsystem der isoliert perfundierten Rattenniere ist in der

Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Horst Pagel, Institut für Physiologie (Direktor: Prof. Dr.

W. Jelkmann), Universität zu Lübeck, etabliert. Die hier beschriebenen Analysen

wurden in enger Kooperation durchgeführt.

26


.2.1 Versuchstiere ene Sprague-Dawley Ratten aus der Zucht

m für Landwirtschaft, Umwelt und ländliche Räume in

Abbildung 2: Modell der isoliert perfundierten Niere. Über eine doppelläufige Kanüle wurde das Perfusionsmedium druckkontrolliert (100 mmHg) der Niere zugeführt; über einen unter der Niere befindlichen Trichter wurde das venöse Effluat aufgefangen und der Rezirkulation zugeführt. Verbrauchte Substrate wurden aus dem Dialysat ersetzt; gleichzeitig wurde das Dialysat oxygeniert (95% O2, 5% CO2) und mit dem Perfusionsmedium über einen dazwischen geschalteten Dialysator äquilibriert. Anfallenden Stoffwechselprodukten stand ein großes Verteilungsvolumen von über 5 Litern zur Verfügung. Der von der isolierten Niere produzierte Urin wurde separat aufgefangen. (nach Pagel et al., 1991) 2Verwendet wurden männliche, erwachs

von Charles River (Kißlegg) mit einem Gewicht von 190-510 g. Die Ratten hatten

jederzeit freien Zugang zu Nahrung und Wasser.

Die Genehmigung zur Durchführung der Versuche wurde am 27.12.2007 durch

das zuständige Ministeriu

Kiel an Dr. med. Jan Kramer, Medizinische Klinik I, UKSH Lübeck erteilt

(Versuchs-Nr.: V312-72241.122-4 [85-8/07] „Erythropoietin und Stammzellbasierte

Therapie des akuten Nierenversagens“).

2.2.2 Präparation der Versuchstiere Die Präparation erfolgte modifiziert nach Pagel et al. (1988). Nach

intraperitonealer Anästhesie mit 60 ml/kg KG Thiopental wurden die Tiere in

Rückenlage auf einer 37°C warmen Metallplatte laparotomiert, und die Nieren und

renalen Gefäße freigelegt. Die Aa. renales wurden beidseits für jeweils 30 min mit

Metall-Clips abgeklemmt.

27


ach 1h wurde in die linke V. jugularis ein Katheter gelegt, über den 0,5 ml Blut

zur Bestimmung des Hämatokrits und der Hämoglobin-Konzentration entnommen

wurden. Danach wurden in einem ersten Versuchsarm 500 IE/kg KG EPO in einer

Vorverdünnung von 1:10 langsam einmalig i.v. injiziert. Die Dosis wurde aufgrund

bisher publizierter Studien gewählt (s. Tabelle S. 56).

Der Katheter wurde anschließend wieder entfernt und die Bauchdecke

verschlossen. Die Tiere verbrachten die postoperative Zeit bei den gleichen

Bedingungen wie bereits oben geschildert. In einem weiten Versuchsarm wurden

die Tiere während des Versuchsverlaufs zusätzlich ab dem 1. postoperativen bis

zum 3. postoperativen Tag mit 500 IE/kg KG EPO i.p./Tag behandelt.

lossen. iziert.

N

Abbildung 3: Vorbehandlung der Versuchstiere. Als Kontrollen dienten schein-operierte Tiere, bei denen lediglich eine Laparotomie erfolgte sowie nicht-operierte Tiere. Bei allen anderen Tieren wurden die Aa. renales beidseits für 30 Minuten ligiert, und die Laparotomie wieder verschDen Tieren der EPO-Gruppe wurde 30 Minuten nach der Ligatur 500 IE EPO / kg KG i.v. inj

2.2.3 Präparation der isoliert perfundierten Niere Der Tag an dem die Operation zur Erzeugung des ANV durchgeführt wurde, wurde

als Tag 0 bezeichnet. Alle weiteren Tageszeitangaben beziehen sich auf die

postoperative Phase. Die Tiere wurden am 1., 3., 5. oder 7. postoperativen Tag

untersucht.

Dazu erfolgte die Freilegung und Präparation der Nieren wie bereits oben

beschrieben. Urin wurde direkt aus der ebenfalls frei gelegten Blase mittels

28


agel et al. (1991). Die jeweils

chte Niere wurde in einer temperierten (37°C) Metallkammer platziert, und 5 ml

in EDTA-Röhrchen entnommen. Die doppelläufige

indungen

urchtrennt und die isolierte Perfusion fortgesetzt.

ätzlich frisch

ewonnene, gewaschene humane Erythrozyten (Hkt 5 %) und Rinderserum-

lbumin (10 g/l) enthielt. Um anfallende Metaboliten zu eliminieren und fehlende

ubstrate und Volumen zu ersetzen, wurde das Perfusat kontinuierlich gegen das

5fache Volumen einer zell- und eiweißfreien Lösung dialysiert. Gleichzeitig diente

als „Dialunge“, indem ein angewärmtes und angefeuchtetes

urde.

ung

Rest wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Punktion entnommen und der rechte Ureter für die spätere Uringewinnung

katheterisiert. Es wurden 60 IE Heparin über den Jugulariskatheter injiziert.

Das weitere operative Vorgehen erfolgte nach P

re

Blut aus der Aorta in e

Perfusionskanüle nach Schurek et al. (1976), mit der gleichzeitig die Perfusion und

die Messung des Perfusionsdrucks möglich waren, wurde distal des Abgangs der

A. renalis dexter in die Aorta eingeführt. Die A. mesenterica superior, die linke A.

renalis und die Aorta proximal des Abgangs der rechten A. renalis wurden ligiert,

und die Perfusion der Niere zunächst in situ gestartet. Das venöse Blut wurde in

einem Trichter aufgefangen und dem Kreislauf wieder zugeführt. Der Urin wurde

gesammelt und alle 30 Minuten dessen Menge bestimmt. Die Perfusion erfolgte

druckkonstant bei 100 mmHg. Nach 3-5 min wurden alle Gefäßverb

d

2.2.4 Perfusionsmedium Das Perfusionsmedium bestand aus einem substrat- und

aminosäurenangereicherten Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4), der zus

g

A

S

2

der Dialysator

Gasgemisch (95 % O2, 5 % CO2) zur Oxygenierung beigemischt w

2.2.5 ProbengewinnDie linke, nicht perfundierte Niere wurde dekapsuliert, ausgewogen und in 4

gleichgroße Sektionen geteilt. Ein Teil wurde für die immunhistologische Färbung

in Formalin fixiert, der

29


erfusionsflussrate

2.2.6 Analytik Sämtliche Angaben wurden auf 1 g Nierengewicht umgerechnet.

P

sflussrate wurde aus der Drehzahl der Perfusionspumpe abgeleitet

eit:

e)].

d (RVR)

Die Perfusion

(Tacho-Signal) und kontinuierlich auf einem Linienschreiber dokumentiert [Einh

ml / (min x g Nier

Renaler Gefäßwiderstan

t

g

Der renale Gefäßwiderstand wurde gemäß dem Ohmschen Gesetz errechne

[RVR = Perfusionsdruck/Perfusionsflussrate), Einheit: mmHg / [ml / (min x

Niere)]].

Urinflussrate

Der Urin wurde gesammelt und das Volumen alle 30 min bestimmt [Einheit: µ

(min x g N

l /

iere)].

Albumin-Exkretionsrate

Die glomeruläre Filtrationsbarriere ist für Albumin weitgehend undur

Ultrafiltrat gelangtes Albumin wird normalerweise im proximalen Tubulus zu 96%

resorbiert; erhöhte Albumin Konzentrationen im Urin sprechen normalerwe

chlässig. Ins

ise für

ine glomeruläre Dysfunktion. Da die isoliert perfundierte Niere aber aus bisher

nicht geklärten Gründen massiv mehr Protein glomerulär filtriert als eine Niere in

vivo (Pagel et. al., 1998), müssen die Ergebnisse zurückhaltend interpretiert

e

werden.

Glomeruläre Filtrationsrate (GFR)

Die Inulinkonzentrationen in den Urin-Proben und den Proben des

Perfusionsmediums wurden nach der Hexokinase-Methode nach Schmidt (1961)

estimmt. Daraus wurde die GFR errechnet [Einheit: µl / (min x g Niere)]:

GFR = Urinzeitvolumen × Inulinkonzentration (U)Inulinkonzentration (P)

b

30


Fraktionelle Albuminclearance

Die fraktionelle Clearance (FCL) einer Substanz ist definiert als der Anteil der

usgeschiedenen Substanz an der Menge der glomerulär filtrierten Substanz. Die

t daher Auskunft über die renale

Albuminkonzentration (P)

a

fraktionelle Albuminclearance gib

Albuminausscheidung in Relation zur GFR:

FCL Alb (%) = Albuminkonzentration (U) Inulinkonzentration (P)Inulinkonzentration (U)

100

Albumin-Konzentrationen wurden nach einer Mikromodifikation der Methode nach

Lowry et al. (1951) bestimmt.

Fraktionelle Natrium-Resorptionsrate

Natrium wird über sekundär-aktiven Transport in den Tubuluszellen resorbiert,

woraufhin Wasser passiv einströmt. Die fraktionelle Natrium-Resorptionsrate ist

somit Indikator für die Funktionalität der Tubuli (Thurau, 1961).

Frakt. Na-Reabsorption (%) = Natriumkonzentration (P)Natriumkonzentration (U)

100

raktionelle Wasser-Resorptionsrate

F

Da die Tubuluswand für Inulin undurchlässig ist, lässt sich mit dem Quotienten aus

er Inulinkonzentration im Plasma und der Inulinkonzentration der

ubulusflüssigkeit die bis dorthin stattgefundene fraktionelle Wasser-Resorption

estimmen.

Frakt. H2O-Reabsorption (%) = Inulinkonzentration (P)Inulinkonzentration (U)

d

T

b

100

31


n einzeln

urch eine feine Kanüle gesaugt, in der sie einen Lichtstrahl (meist Argon- oder

e Emission wird im Gerät registriert; so kann im

den Informationen

iner bestimmten Zellpopulation zugeordnet werden. Durch die Verwendung

nti rabbit IgG, Jackson

muno Research) und des CD34-Antikörpers (CD34 PE Cy-7 conjugated, Santa

2.3 Durchflusszytometrie

Mit dem Durchflusszytometer können Zellen anhand ihrer Größe und Granularität

unterschieden werden. Nach Anfärbung mit bestimmten Floureszenzfarbstoff-

markierten Antikörpern können weitere Parameter wie DNA-Gehalt oder

Oberflächenantigene bestimmt werden.

Die Zellen müssen sich dabei in einer Suspension befinden und werde

d

Neon-Laser) passieren. Di

„Forward-Scatter“ (FS) die Zellgröße, und im „Sideward-Scatter“ (SS) die

Zellgranularität bestimmt werden. Allein durch die unterschiedlichen

physikalischen Eigenschaften können die Zellen mit diesen bei

e

verschiedener Antikörper gegen Oberflächenantigene kann anhand des

Expressionsmusters eine genaue Charakterisierung der Zellen erfolgen.

2.3.1 Probenaufbereitung Zur Etablierung der Methode wurde zunächst Knochenmark als Probenmaterial

verwendet, da sich dort quantitativ mehr EPCs befinden als im peripheren Blut.

Die Verarbeitungsschritte waren für beide Materialien identisch.

Die von den Herstellern empfohlene Antikörpermenge bezieht sich üblicherweise

auf eine Zellzahl von 1x10^6 Zellen. Daher musste zunächst die Zellzahl der

aufbereiteten Blut- und Knochenmarksproben ermittelt werden. Dafür wurde

jeweils eine kleine Menge von 50 µl in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und die

Zellzahl mittels Zellzähler bestimmt. Von beiden Proben wurden jeweils 1x10^6

Zellen in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und mit 10 µl des primären CD133-

Antikörpers (CD133 rabbit polyclonal IgG, Santa Cruz) für 15 min bei 4 °C

inkubiert.

Um überschüssigen Antikörper zu entfernen wurden die Proben für 2 min bei 4000

rpm zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Das Pellet wurde mit jeweils 10 µl

des sekundären Antikörpers (FITC-conjugated goat a

Im

32


kommt. Somit wurden 2 verschiedene Antigene

leichzeitig auf derselben Zellpopulation nachgewiesen.

c-

ezeptoren muss als Referenzwert eine Negativ-Kontrolle mitgeführt werden.

en substrahiert. Bei diesen

r. med. Jan Kramer und Prof. Dr. rer. nat.

urden

genden Promotionsarbeit durchgeführt.

ben (Größe und Granularität der

n ann auf

n zu reduzieren.

Cruz) resuspendiert, inkubiert und wie bereits oben beschrieben gewaschen. Der

CD34-Antikörper war bereits floureszenzmarkiert, so dass dort kein sekundärer

Antikörper nötig war. Die Floureszenzfarbstoffe für CD133 und CD34 besitzen

unterschiedliche Emmisionsspektren (FITC vs. PE Cy-7), und können somit als

Doppelfärbung zusammen in einer Probe angewendet werden, ohne dass es

dabei zu Interferenzen

g

Aufgrund von Autofloureszenz und unspezifischer Bindung von Antikörpern an F

R

Diese wird in der Auswertung von den Ergebniss

Negativ-Kontrollen erhielten die Blut- und Knochenmarksproben lediglich den

sekundären Antikörper und wurden unter den gleichen Bedingungen wie bereits

oben genannt verarbeitet.

Anschließen wurden die Proben mit FACS-Puffer auf 500 µl aufgefüllt und jeweils

100 µl dieser Suspension für die durchflusszytometrische Messung verwendet.

2.3.2 Durchflusszytometrische Messung Das Protokoll zur qualitativen Bestimmung CD133- und CD34-positiver Zellen

wurde in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Ulrich Lindner (Interdisziplinäre AG

Stammzellbiologie, Medizinische Klinik I und Institut für Virologie und Zellbiologie

der Universität zu Lübeck; Leitung: PD D

Jürgen Rohwedel) erstellt. Die Messungen am Durchflusszytometer w

eigenständig von mir im Rahmen der vorlie

Es wurden sowohl zweidimensionale Daten erho

Zellen), als auch einzelne Parameter durch sogenannte „Gates“ bestimmt. Dabei

wurde im FS- und SS-Streulichthistogramm eine Auswahl um die

Lymphozytenregion gelegt. Nur Zellen innerhalb dieser Region wurde d

Floureszenzintensität untersucht. Somit ist es möglich, Verunreinigung durch

andere Zellpopulatione

33


unhistochemische Färbung

en Ethanolkonzentrationen.

it inem Mikrotom in 3 µm dicke Schichten

ttung der Oberflächenschicht des Paraffins zu

der aus den Schnitten ausgewachsen

erden. Dazu wurden die Objektträger jeweils ca. 9 min in verschiedenen

2.4.1.3 Denaturierung durch Hitze

s Gewebes wiederherzustellen wurden die

2.4 Histologische Untersuchung

2.4.1 CD133 ImmDie Vorbereitung der Präparate und die immunhistochemischen Färbungen

wurden mit technischer Unterstützung von Frau Ann-Katrin Hellberg-Schnieder

(Institut für Physiologie, Direktor: Prof. Dr. W. Jelkmann) durchgeführt.

2.4.1.1 Dehydrierung

Zunächst erfolgte die Entwässerung der zuvor in Formalin (Roti®-Histofix) fixierten

Präparate für insgesamt ca. 24 h in 12 absteigend

Daraufhin wurden die Präparate in 53 °C warmes Paraffin überführt und mit dem

Paraffin in Blöcke gegossen. Anschließend kühlten sie auf einer Metallplatte bis

auf -11 °C ab.

Die ausgehärteten Blöcke wurden m e

geschnitten. Anschließend wurden die Schichten auf ein auf 40 °C erhitztes

Wasserbad gelegt, um so eine Glä

erzielen. Im Anschluss wurden die Schichten auf positiv geladene Objektträger

aufgebracht.

2.4.1.2 Entparaffinisierung und Antigendemaskierung

Anschließend musste das Paraffin wie

w

Ethanolkonzentrationen absteigender Reihenfolge von 100 % bis 70 % und zuletzt

in Citratpuffer bei pH 6 gewaschen.

Um die Immunreaktivität de

Objektträger in einer Mikrowelle erwärmt. Dafür wurden sie in einem wärmefesten

Behältnis in Citratpuffer gelagert und für 2 min bei höchster Stufe aufgekocht;

danach weitere 15 min bei niedrigster Stufe in der Mikrowelle belassen. Danach

kühlten die Objektträger für 15 min aus.

34


schienen aufgelegt. Nacheinander wurden

ht bei 4°C im

ben zunächst 3x6 min in Puffer gewaschen

e (ENHANCER) aus EnVision Kit G2, Dako). Es

luss daran eine Gegenfärbung mit

Liquid-permanent-Red (nach Anleitung angemischt aus Permanent Red Substrate

urden mit Hilfe der technischen Unterstützung

Im Anschluss erfolgte ein weiterer Waschgang mit destilliertem Wasser und

Waschpuffer, welcher gleichzeitig als „Signalverstärker“ diente.

2.4.1.4 Inkubation und Färbung

Erst nach der unter 2.4.1.1 bis 2.4.1.3 geschilderten Vorbereitung erfolgte das

Aufbringen des Primärantikörpers (CD133 antibody, Selleck Chemicals). Dazu

wurden die Objektträger auf Metall

Enzymblocker zur Verminderung der Hintergrundanfärbung sowie Proteinblocker

aufgebracht. Nach einer kurzen Einwirkzeit wurden sie abgeschüttet und

Restmengen vorsichtig mit Zellstoff abgetupft. Danach wurde der Antikörper mit

FCS-Rinderserum in einer Verdünnung von 1:50 aufgebracht. Eine Ausnahme

bildeten die Negativ-Kontrollen bzw. sekundären Kontrollen, bei denen nur FCS

ohne Antikörper resp. nur der sekundäre Antikörper aufgetragen wurde.

Es wurden große Objektdeckel aufgelegt und die Metallschienen in eine feuchte

Kammer eingesteckt. Diese soll Hintergrundfärbung durch eingetrocknete

Antikörper verhindern. Die Objektträger wurden über Nac

Kühlschrank inkubiert.

Nach der Inkubation mussten die Pro

werden, erst dann konnte der sekundäre Antikörper (Rabbit/Mouse (LINK),

entnommen aus EnVision Kit G2, Dako) auf alle Proben bis auf die Negativ-

Kontrollen aufgebracht werden. Die Proben wurden gespült und ein Enzym-

Verstärker aufgebracht (AP Enzym

folgte ein erneuter Waschgang und im Ansch

Buffer und Permanent Red Chromogen aus EnVision Kit G2, Dako). Der Zeitpunkt

der korrekten Anfärbung wurde mit dem Mikroskop überprüft.

2.4.2 Hämatoxylin-Eosin Färbung Die Hämatoxylin-Eosin Färbungen w

von Frau Ann-Kathrin Hellberg-Schnieder (Institut für Physiologie, Direktor: Prof.

Dr. W. Jelkmann) auf der Basis eines in der Routinediagnostik verwendeten

Standard-Protokolls durchgeführt.

35


ie so vorbereiteten Schnitte wurden anschließend mit A. dest.

ewaschen.

eyer für 5 min mit

nschließendem Bläuen in Leitungswasser (Sichtkontrolle, ca 1 min).

n Xylol, sowie eine Eindeckung

it Entellan®.

in repräsentativer Bereich

efroren.

2.4.2.1 Dehydrierung und Entparrafinisierung

Als erstes erfolgte eine Dehydrierung und Entparaffinisierung der Schnitte wie

bereits bei der immunhistochemischen Färbung unter 2.4.1.1 sowie 2.4.1.2

beschrieben. D

g

2.4.2.2 Hämatoxylin-Eosin Färbung

Zunächst erfolgte eine Kernfärbung mit Hämalaun nach M

a

Anschließend wurden die Präparate für 3 min mit Eosin gegengefärbt. Es folgte

eine kurze Differenzierung mit 80%igem Ethanol, sowie eine aufsteigende

Alkoholreihe mit 96%igem Ethanol sowie 2x 100%igem Ethanol für jeweils 4 min.

Abschließend erfolgte eine zweimalige Immersion i

m

2.4.3 Histologische Auswertung Das Protokoll zur Auswertung der HE-Färbung wurde in Kooperation mit Herrn

Prof. Udo Helmchen (Pathologie UKE, Hamburg) erarbeitet.

Mit dem Lichtmikroskop (20er Objektiv) wurde e

ausgewählt. Anschließend wurden unter Verwendung des 40er Objektivs je 100

Tubuli ausgezählt; die Beurteilung des Ödems bzw. der interstitiellen Zellularität

erfolgte an jeweils 3 Gesichtsfeldern pro Präparat.

2.5 Labormedizinische Untersuchung Die Bestimmung von Kreatinin und Harnstoff wurde im medizinischen Routinelabor

des Medizinischen Versorgungszentrums MVZ Dr. Kramer & Kollegen, LADR

GmbH, Geesthacht, durchgeführt. Die Analytik wurde in Serien durchgeführt.

Hierfür wurde das Untersuchungsmaterial zentrifugiert, und der Überstand bei

-20°C bis zur Durchführung der Analyse eing

36


erfolgte im direkten Zusammenhang mit der

insäure. Die

nm ist proportional zur Kreatinin-

onzentration der Probe. Ermittelt wurde die Kreatininkonzentration mit dem

omaten AU2700, Beckman Coulter.

ip der Harnstoffbestimmung basiert auf einem kinetischen UV-Test.

arnstoff wird durch Urease zu Ammoniumionen und CO2 hydrolysiert. Die

n und 2-Ketoglutarat bilden in Gegenwart von GLDH und NADH

Hämatokrit wurde während der OP Blut über einen V.

2.6 Statistik Die biometrische Planung der Experimente erfolgte mit Unterstützung durch Herrn

Dr. Bernd-Wolfgang Igl (Dipl.-Stat.), Institut für Medizinische Biometrie und

Statistik (IMBS; Direktor: Prof. rer. nat. Andreas Ziegler), Universität zu Lübeck.

Die Anzahl der jeweils pro Analysezeitpunkt unabhängig voneinander

untersuchten Versuchtstiere wird in den entsprechenden Abbildungen im

Die Hämatokritbestimmung

Durchführung der isoliert perfundierten Rattenniere im Forschungslabor des

Instituts für Physiologie, Universität zu Lübeck (Prof. Dr. Jelkmann).

2.5.1 Kreatininbestimmung Grundlage der Kreatininbestimmung ist ein kinetischer Farbtest. Kreatinin bildet in

alkalischen Medien eine gelborange Verbindung mit Pikr

Absorptionsabweichungsrate bei 520/800

k

klinisch-chemischen Analyseaut

Untersuchungsmaterial war EDTA-Plasma.

2.5.2 Harnstoffbestimmung Das Prinz

H

Ammoniumione

Glutamat und NAD+. Die Extionktionsabnahme pro Zeiteinheit ist proportional der

Harnstoffkonzentration. Ermittelt wurde die Harnstoffkonzentration mit dem

klinisch-chemischen Analyseautomaten AU2700, Beckman Coulter.

Untersuchungsmaterial war EDTA-Plasma.

2.5.3 Hämatokritbestimmung Zur Bestimmung des

jugularis Katheter entnommen. Das Blut wurde in ein Hämatokrit-Glasröhrchen

überführt, und der Wert im Messgerät (Microspin, Compur Monitors, München)

ermittelt.

37


38

Ergebnisteil dieser Arbeit aufgeführt. Dargestellt in den Abbildungen sind

Mittelwerte ± Standardabweichung.

Zur statistischen Auswertung sowie zur graphischen Darstellung der Daten wurde

das Programm „Sigma Plot 10.0“ (Systat Software) verwendet. Zur Berechnung

der Wahrscheinlichkeit p wurde der students-t-test angewendet. Das

Signifikanzniveau wurde mit α = 0,05 festgelegt.

3 Ergebnisse

3 Ergebnisse

3.1 Nierengewicht im Verhältnis zum Rattengewicht Zur Abschätzung des Ausmaßes des Gewebeödems wurde das Verhältnis des

Nierengewichts zum Rattengewicht berechnet (g Niere / g Ratte). Die Tiere

wurden dafür vor Beginn der OP gewogen. Nach Beendigung der OP wurde

jeweils die linke Niere entfernt und gewogen. Es wurde das einfache Verhältnis

der Gewichte zueinander berechnet (g Niere / g Ratte).

Abbildung 4: Im akuten Nierenversagen führte das Ödem ab Tag 3 zu einer Gewichtszunahme der Niere mit einem Maximum am Tag 5 und 7. Das Verhältnis von Nierengewicht zum Rattengewicht unterschied sich nach EPO-Applikation an den Tagen 0-1 nach der Operation nicht signifikant zur Kontrolle. Am Tag 7 konnte zwar eine Verringerung dieser Ratio unter EPO im Vergleich zu unbehandelten ANV Tieren beobachtet werden, diese war jedoch nicht signifikant (p = 0,11). Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von mehreren unabhängigen Versuchen (n = 57). Die Zahlen über den Balken geben die jeweils unabhängig voneinander untersuchte Anzahl von Versuchstieren pro Analysezeitpunkt an.

Bei den Kontrolltieren zeigte sich ein durchschnittliches Verhältnis von

Nierengewicht zu Rattengewicht von 0,0041 ± 0,00037 (n = 5). An den Tagen 0

(OP-Tag) und 1 zeigte sich sowohl mit als auch ohne EPO-Applikation sowie bei

den scheinoperierten Tieren noch keine signifikante Änderung dieser Ratio. Erst

am 3. postoperativen Tag kam es zu einer Zunahme des Verhältnisses auf

39

3 Ergebnisse

0,00561 ± 0,00152 ohne EPO Applikation sowie auf 0,00641 ± 0,00141 mit EPO

Applikation.

Am Tag 7 zeigte sich schließlich eine Verschiebung des Verhältnisses zu Gunsten

der Tiere die EPO erhielten (0,007762 ± 0,00198 ohne EPO vs. 0,00563 ±

0,00133 mit EPO). Diese Verringerung des Verhältnisses und damit die Abnahme

des Nierengewichts in der EPO-Gruppe war jedoch im Vergleich zu den

unbehandelten Tieren im ANV nicht signifikant (p = 0,11).

Auch durch eine tägliche EPO Gabe über 3 Tage hinweg zeigte sich keine

signifikante Verbesserung im Vergleich zur nicht-EPO Gruppe mit ANV am 3.

postoperativen Tag (p = 0,85).

3.2 Hämatokrit Im Rahmen der Operation der isoliert perfundierten Niere wurde den

Versuchstieren Blut über einen V. jugularis Katheter entnommen und der

Hämatokrit ermittelt. Die erste Blutentnahme erfolgte noch vor der EPO-

Applikation am Tag 0; die zweite Entnahme wurde am Tag 0 4h nach EPO-

Applikation bzw. am 1., 3. oder 7. Untersuchungstag durchgeführt.

Abbildung 5: Der Hämatokrit stieg nach EPO-Applikation im ANV im Vergleich zur Kontrolle an. Hierbei bestand am Tag 3 nach ANV-Induktion kein Unterschied, wenn EPO einmalig am Tag 0 bzw. über 3 Tage täglich appliziert wurde. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von mehreren unabhängigen Versuchen (n = 23). Die Zahlen über den Balken geben die jeweils unabhängig voneinander untersuchte Anzahl von Versuchstieren pro Analysezeitpunkt an.

40

3 Ergebnisse

Der durchschnittliche Hämatokrit am Tag 0 vor EPO-Gabe lag bei 42,1 ± 2,02%.

Die darauf folgenden Messungen zeigten, dass der Hämatokrit nach EPO-

Applikation an den Tagen 1 (p = 0,03) und 3 (P = 0,06) im Vergleich zur Kontrolle

signifikant ansteigt.

Am Tag 7 nach EPO-Applikation erreichte der Hämatokrit sein Maximum (51,0 ±

1,0 %) in der durchgeführten Versuchsreihe. Im Vergleich zur Kontrolle zeigte sich

somit eine signifikante Erhöhung des Hämatokrits (p = 0,0027) am Tag 7 nach

EPO-Applikation

Bei täglicher EPO Applikation ergab sich nach 3 Tagen ein durchschnittlicher

Hämatokrit von 45,3 ± 0,58 %. Es lag somit auch nach 3 Tagen täglicher EPO-

Gabe eine signifikante Hämatikriterhöhung im Vergleich zur Kontrolle vor (p =

0,044).

41

3 Ergebnisse

3.3 Harnstoff und Kreatinin

Abbildung 6: Harnstoff ist nach täglicher EPO-Applikation im Vergleich zur einmaligen Gabe am Tag 3 verringert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von mehreren unabhängigen Versuchen (n = 64). Die Zahlen über den Balken geben die jeweils unabhängig voneinander untersuchte Anzahl von Versuchstieren pro Analysezeitpunkt an.

Abbildung 7: Kreatinin ist bei täglicher EPO-Gabe im Vergleich zur einmaligen Gabe am Tag 3 des ANV verringert (Anzahl der Versuchstiere für den jeweiligen Untersuchungstag s. Abb. 6)

42

3 Ergebnisse

Im ANV stiegen die renalen Retentionsparameter Harnstoff (Abb. 6) und Kreatinin

(Abb.) am 1. postoperativen Tag nach Ischämie-Induktion auf ein Maximum an.

Die Retentionsparameter blieben dann im weiteren Verlauf erhöht und

normalisierten sich erst am 7. Tag nach ANV-Induktion.

Bei einer einmaligen EPO-Gabe zeigte sich am Tag 1 des ANV eine Verbesserung

des Harnstoffs und des Kreatinins.

Die Ergebnisse zeigten ansonsten keine Verringerung des Harnstoffs und des

Kreatinins nach einmaliger EPO-Applikation. Im Gegenteil, es ließ sich sogar ein

Anstieg der beiden Werte nach EPO-Applikation im Vergleich zur Kontrolle an den

Tagen 0, 3 und 7 verzeichnen. In der EPO-Gruppe ließ sich am 3. Tag ein

Kreatinin-Wert von 1,07 ± 0,36 mg / dl im Vergleich zu 1,83 ± 0,48 mg / dl in der

non-EPO-Gruppe. Dies entspricht einer signifikanten Erhöhung des Kreatinins

nach EPO-Gabe am 3. postoperativen Tag (p = 0,04). Die Harnstoffwerte waren

nach EPO-Gabe am 3. Tag ebenfalls erhöht; hier ergab sich jedoch keine

Signifikanz (p = 0,1). Nach einmaliger EPO-Applikation verlief das ANV somit

prolongiert.

Die Kreatininwerte der Kontroll- sowie der scheinoperierten Tiere lagen relativ

konstant zwischen 0,41 und 0,53 mg / dl.

Durch eine tägliche EPO-Gabe konnte zwar am 3. postoperativen Tag eine

Verringerung des Kreatinins von 1,07 ± 0,36 auf 0,99 ± 0,96 mg/dl erreicht

werden, doch im Vergleich zur nicht-EPO-Gruppe war dieses Ergebnis nicht

signifikant (p = 0,73).

Harnstoff konnte zwar nach täglicher EPO Gabe im Vergleich zur nicht-EPO

Gruppe am Tag 3 von 126,8 ± 57,0 mg/dl auf 107,7 ± 3,79 mg/dl reduziert werden,

jedoch zeigt sich auch hier keine Singnifikanz (p = 0,6).

3.4 Histologische Veränderungen Die morphologischen Veränderungen nach einmaliger EPO-Applikation im ANV

wurden anhand von HE angefärbten Präparaten (Abb. 8) beurteilt. Falls nicht

weiter angegeben beziehen sich die Angaben auf jeweils 10 Tubuli, wobei immer

100 Tubuli pro Versuchsprobe (n = 3) ausgezählt wurden.

Es wurden folgende Aspekte untersucht: Anzahl der Tubuli mit Bürstensaum,

Anzahl der Tubuli ohne Bürstensaum, Anzahl der Tubuli mit weitem Lumen, Anzahl

43

3 Ergebnisse

der Tubuli mit intraluminalem Zelldetritus, sowie Anzahl der Tubuli pro Gesichtsfeld

und Anzahl der mononukleären Zellen pro Gesichtsfeld. Alle Proben wurden am

jeweils ersten postoperativen Tag gewonnen, da an diesem Tag ein positiver Effekt

der einmaligen EPO-Gabe auf die renalen Retentionsparameter Kreatinin und

Harnstoff zu beobachten war. Als Kontrolle dienten nicht-operierte Tiere.

3.4.1 Tubuli mit Bürstensaum Als erstes Anzeichen für eine tubuläre Schädigung im ischämisch bedingten ANV

kommt es zu einem Rückgang des Bürstensaums.

Bei der ANV-Gruppe ohne EPO-Applikation konnten keine Tubuli mit Bürstensaum

beobachtet werden, im Gegensatz zu 0,66 ± 1,3342 Tubuli mit Bürstensaum nach

EPO-Gabe (p = 0,031). In der Kontrolle fanden sich 10,0 ± 0,00 Tubuli mit

Bürstensaum.

Dementsprechend fanden sich 9,34 ± 1,3342 Tubuli ohne Bürstensaum in der

ANV-Gruppe nach EPO-Gabe und 10,0 ± 0,00 Tubuli ohne Bürstensaum in der

non-EPO ANV-Gruppe (p = 0,031).

3.4.2 Tubuli mit weitem Lumen Durch Verlust der interzellulären Verbindungen kommt es im ischämisch bedingten

ANV zu einem Ablösen der Tubuluszellen von der Basalmembran und einem

ödembedingten Aufquellen der Tubuli, welche in der histologischen Betrachtung

dann weit erscheinen.

Es konnten 6,15 ± 3,60 Tubuli mit weitem Lumen bei Tieren ohne EPO-Gabe im

ANV gezählt werden. Im Vergleich dazu verringerte sich diese Zahl in der mit EPO

behandelten ANV-Gruppe auf 4,4 ± 3,63 Tubuli (p = 0,07). In der Kontrollgruppe

ohne ANV fanden sich keine Tubuli mit weitem Lumen.

3.4.3 Zelldetritus Bei einer Schädigung der renalen Tubuli kommt es zu einer Abschilferung von

Zelldetritus in das Lumen.

Die Anzahl der Tubuli mit intraluminalem Zelldetritus konnte bei ANV-Tieren durch

EPO-Applikation nicht signifikant verbessert werden (9,52 ± 1,13 mit EPO vs. 9,60

44

3 Ergebnisse

± 1,10 ohne EPO [p = 0,79]). In der Kontrolle ohne ANV fanden sich keine Zellen

mit Detritus.

Die folgenden Angaben beziehen sich jeweils auf 1 Gesichtsfeld, wobei 3

Gesichtsfelder pro Probe ausgewertet wurden.

3.4.4 Anzahl von Tubuli Bei einem ausgeprägten Gewebeödem der Niere sollte sich theoretisch die Anzahl

der Tubuli pro Gesichtsfeld verringern. Die Anzahl der Tubuli betrug in der nicht-

EPO ANV-Gruppe 24,0 ± 2,97 (n = 2) im Gegensatz zu 22,2 ± 5,89 Tubuli in der

mit EPO behandelten ANV-Gruppe (n = 5). In der Kontrolle ohne ANV fanden sich

22,17 ± 4,16 (n = 6) Tubuli pro Gesichtsfeld.

3.4.5 Zelluläre Inflammation Mononukleäre Zellen wie Monozyten und Lymphozyten sind Teil des

Immunsystems, und ihre Anwesenheit im interstitiellen Gewebe spricht für eine

Inflammationsreaktion.

In der ANV-Gruppe konnten 56 ± 13,43 mononukleäre Zellen pro Gesichtsfeld

ausgezählt werden. In der Gruppe der mit EPO behandelten ANV-Tiere fanden

sich 57,27 ± 10,89 Zellen. In der Kontrollgruppe ohne ANV wurden 28,56 ± 10,56

mononukleäre Zellen ausgezählt.

45

3 Ergebnisse

Abbildung 8: Histologisch lässt sich eine teilweise signifikante Verbesserung der Morphologie der Tubuluszellen durch einmalige Gabe von EPO am 1. postoperativen Tag erzielen. Durch EPO lässt sich eine vermehrte Anzahl von Tubuli mit Bürstensaum beobachten (A, B). Ebenso finden sich bei EPO vermindert Tubuli mit weitem Lumen (C) oder intraluminalem Zelldetritus (D). G-I zeigen repräsentative Gesichtsfelder mit dem 40er Objektiv, die für die Auswertung ausgewählt wurden. Angaben zur Anzahl der ausgewerteten Proben sind im Text dargestellt. (Anzahl der Versuchstiere für den jeweiligen Untersuchungstag s. Abb. 8A)

46

3 Ergebnisse

3.5 Funktionelle Ergebnisse der Untersuchung an der isoliert perfundierten Rattenniere 3.5.1 Perfusionsflussrate und renaler Gefäßwiderstand

Abbildung 9: Sowohl die Perfusionsgeschwindigkeit (A) als auch der renale Gefäßwiderstand (B) werden durch eine EPO-Applikation positiv beeinflusst. Durch EPO-Applikation kann am Tag 0 eine Perfusionsflussrate erreicht werden, die annähernd den Werten der Kontrolltiere entspricht (A). Durch den endothelialen Schaden im ANV erhöht sich der renale Gefäßwiderstand auf maximal 30 mmHg / ml / min x g am Tag 3. Durch EPO-Applikation lässt sich der Gefäßwiderstand auf 10 mmHg / ml / min x g reduzieren (B). (Anzahl der Versuchstiere pro Untersuchungstag s. Abb. 9A)

47

3 Ergebnisse

Die Perfusionsflussrate wurde aus der Drehzahl der Perfusionspumpe, die das

System der isoliert perfundierten Niere speist, abgeleitet (Tacho-Signal) und

kontinuierlich auf einem Linienschreiber dokumentiert.

Durch EPO Applikation konnte am Tag 0 im ANV eine Perfusionsflussrate (Abb.

9A) erzielt werden (18,2 ± 1,6 ml / [min x g Niere]), die annähernd den Werten der

Kontrolltiere entspricht (18,8 ± 0,9 ml / [min x g Niere]). Verglichen mit der non-

EPO-Gruppe ergibt sich jedoch keine ausreichende Signifikanz durch EPO Gabe

am Tag 0 (p = 0,35). Am Tag 3 erreicht die Perfusionsflussrate nach EPO

Applikation im ANV ein Minimum (11 ± 0,8, p = 0,12). Obwohl im ANV die

Perfusionsflussrate unter EPO-Gabe an jedem Tag höher war als ohne EPO,

ergab sich für keinen Untersuchungstag eine ausreichende Signifikanz (Tag 7, p =

0,087).

Auch der renale Gefäßwiderstand (Abb. 9B) scheint durch eine EPO Gabe im ANV

positiv beeinflusst zu werden. Am Tag 0 konnte der Gefäßwiderstand durch die

EPO Applikation ebenfalls auf Werte gesenkt (6,5 ± 0,7 mmHg / (ml / [min x g

Niere])) werden, die annähernd denen der Kontrolltiere entsprachen (5,8 ± 0,4

mmHg / {ml / [min x g Niere]}). Im Vergleich zur Gruppe ohne EPO ergibt sich für

die EPO-Applikation am Tag 0 eine Signifikanz von p = 0,36.

Am 3. postoperativen Tag kam es bei den Tieren ohne EPO im ANV zu einer

massiven Zunahme des Gefäßwiderstands auf 30,4 ± 7,7 mmHg / {ml / [min x g

Niere]}. Durch eine EPO Applikation lässt sich der Gefäßwiderstand am Tag 3 des

ANV auf 10,8 ± 1,1 mmHg / {ml / [min x g Niere]} verringern (p = 0,32). Auch hier

scheint EPO zwar zu einer optisch deutlichen, jedoch nicht signifikanten

Verbesserung zu führen.

48

3 Ergebnisse

3.5.2 Glomeruläre Filtrationsrate und Urinflussrate

Abbildung 10: Durch ein ischämisches Trauma kommt es im ANV durch den Verlust der Autoregulationsmechanismen des golmerulären Filtrationsapparates zu einer Verringerung der GFR (A) und konsekutiv der Urinflussrate (B). Es lässt sich hier keine Verbesserung durch eine EPO-Applikation erzielen. (Anzahl der Versuchstiere pro Untersuchungstag s. Abb. 9A)

Obwohl auch im Glomerulum EPO-Rezeptoren vorhanden sind, lässt sich durch

eine EPO-Applikation keine Verbesserung der glomerulären Funktion im ANV

erzielen (Abb. 10).

49

3 Ergebnisse

Lediglich am Tag 1 (p = 0,64) und Tag 7 (p = 0,64) nach EPO-Gabe ist die GFR im

Vergleich zu den Tieren ohne EPO-Applikation im ANV erhöht. An den Tagen 0 (p=

0,18) und 3 (p = 0,25) ist die GFR nach EPO-Gabe sogar erniedrigt. Weder für

eine Verbesserung noch für eine Verschlechterung durch EPO Gabe ließ sich ein

signifikantes Ergebnis nachweisen.

Für die Urinflussrate gilt, dass an allen Untersuchungstagen eine

Verschlechterung durch EPO eintrat. Am Tag 3 betrug die Urin Flussrate in der

Gruppe ohne EPO 30,37 ± 54,05 µl / (min x g Niere) und war damit im Vergleich

zur EPO Gruppe mit 2,03 ± 1,57 µl / (min x g Niere) erhöht (p = 0,34). Auch für

keinen der anderen Tage konnte eine ausreichende Signifikanz für die Ergebnisse

nachgewiesen werden.

3.5.3 Fraktionierte Albuminclearance und Albumin Exkretionsrate

50

3 Ergebnisse

Abbildung 11: Im Modellsystem der isoliert perfundierten Rattenniere erhöhen sich im ischämischen ANV im Vergleich zu Kontrolltieren die fraktionelle Albuminclearance (A) und die Urin Albumin Exkretionsrate (B) Eine Verbesserung der Urin Albumin Exkretionsrate durch EPO-Applikation lässt sich lediglich am Tag 1 nach ANV-Induktion (B) nachweisen. (Anzahl der Versuchstiere pro Untersuchungstag s. Abb. 9A)

An allen Untersuchungstagen zeigte sich eine erhöhte Albuminclearance in der

EPO-Gruppe. Am 3. postoperativen Tag zeigte sich nach EPO Gabe eine

fraktionierte Albuminclearance von 360,4 ± 53,9 x 10¯³. Im Vergleich dazu zeigte

sich bei den Tieren ohne EPO Applikation im ANV ein Wert von 21,7 ± 4,4 x 10¯³ (p

= 0,003). Hier scheint EPO einen deutlich negativen Effekt auf die Clearance zu

haben (Tag 0 p = 0,04; Tag 1 p = 0,23).

Ähnliches zeigte sich bei der Urin Albumin Exkretionsrate. Hier gab es lediglich am

Tag 1 eine Verringerung nach EPO Applikation im Vergleich zu den Tieren, die

kein EPO nach einer ANV-Induktion erhielten (70,5 ± 16,6 µg / [min x g Niere] mit

EPO vs. 77,8 ± 13,5 µg / [min x g Niere] ohne EPO; p = 0,88). An den restlichen

Tagen kam es nicht zu einer Verbesserung durch die EPO Gabe, jedoch auch

keiner signifikanten Verschlechterung.

51

3 Ergebnisse

3.5.4 Fraktionierte Natrium- und Wasser Reabsorptionsrate

Abbildung 12: Im ANV führt die akute Tubulusnekrose zu einer Abnahme der fraktionellen Natrium- (A) und Wasserreabsorptionsrate (B). Eine EPO-Applikation im ANV führt nicht zu einer Verbesserung der fraktionierten Reabsorptionsraten von Natrium (A) und Wasser (B). (Anzahl der Versuchstiere pro Untersuchungstag s. Abb. 9A)

Die fraktionierte Natrium Reabsorptionsrate zeigte im ANV lediglich am Tag 7 eine

geringfügige Verbesserung durch EPO Applikation (90,0 ± 1,4 % mit EPO vs. 84,1

± 1,7 % ohne EPO; p = 0,08). An den anderen Untersuchungstagen konnte keine

Erhöhung der Reabsorptionsrate festgestellt werden.

52

3 Ergebnisse

Auch bei der Wasserreabsorptionsrate zeigte sich nur am 7. postoperativen Tag

ein positiver Einfluss durch EPO Gabe (88,8 ± 1,5 % mit EPO vs. 81,7 ± 1,7 %

ohne EPO; p = 0,10). Zusammenfassend konnte durch EPO-Gabe keine

signifikante Verbesserung der fraktionierten Natrium- und

Wasserreabsorptionsrate erzielt werden. Die an den Tagen 1 und 3 gemessene

Verringerung der Natrium- (p = 0,23 resp. 0,078) sowie Wasser-Reabsorptionsrate

(p = 0,23 resp. p =0,83) ist für keine der beiden Parameter signifikant.

3.6 Ergebnisse der durchflusszytometrischen Untersuchung 3.6.1 Endotheliale Progenitorzellen Durch EPO-Gabe kommt es im Knochenmark zu einer Mobilisierung von

endothelialen Progenitorzellen ins periphere Blut. EPC wurden

durchflusszytometrisch anhand der Expression der Oberflächenmarkermoleküle

CD133 und CD34 detektiert (Abb. 13). Um eine Probe mit möglichst geringer

Verunreinigung durch andere Zellpopulationen zu erhalten wurde bei der

durchflusszytometrischen Analyse eine Auswahl („Gate“) um die entsprechende

Lymphozytenregion gelegt (Abb. 13A). In Abb. 13B ist beispielhaft eine Population

von CD34- und CD133-positiven EPC dargestellt. In den folgenden Abbildungen

ist die Negativkontrolle jeweils rot dargestellt, die CD133 positiven Zellen hingegen

blau.

In Abb. 13E ist eine deutliche Kongruenz der Negativkontrolle und einer Probe

peripheren Bluts der nicht-EPO ANV-Gruppe zu erkennen. Auch in der Gruppe der

Schein-operierten Tiere (Abb. 13F) kommt es nicht zu einer erhöhten

Ausschüttung von CD133-positiven Zellen ins periphere Blut.

In den Abb. 13C (1d) und D (3d) hingegen zeigt sich ein deutlich erhöhtes

Vorkommen CD133 positiver Zellen im peripheren Blut nach EPO Applikation.

Durch EPO Gabe kommt es also zu einer erhöhten Konzentration CD133-positiver

Zellen im peripheren Blut in den Tagen 1-3 nach EPO-Applikation. Nur nach EPO-

Applikation konnten EPC im peripheren Blut detektiert werden.

53

3 Ergebnisse

Abbildung 13: Nach EPO-Applikation steigt die Anzahl der CD133-positiven Zellen im peripheren Blut (Negativkontrolle rot dargestellt, CD133-positive Zellen blau dargestellt). A: Gate um die entsprechende Zellpopulation. B: Population von sowohl CD34- als auch CD133-positiven Zellen (= endotheliale Progenitorzellen, EPC) im peripheren Blut 1d nach EPO-Applikation. C: CD133-positive Zellen im peripheren Blut 1d nach EPO-Applikation. D: CD133-positive Zellen im peripheren Blut 3d nach EPO-Applikation. E: CD133-negative Zellpopulation im peripheren Blut in einem exemplarischen Beispiel einer Probe der ANV-Gruppe ohne EPO-Applikation. F: CD133-negative Zellpopulation im peripheren Blut 1d nach Schein-OP (Anzahl der Versuchstiere für die jeweiligen Untersuchungstage ohne EPO-Applikation: 0d n=1, 1d n=5, 3d n=1, 5d n=0, 7d n=0, insgesamt n=7; Anzahl der Versuchstiere für die jeweiligen Untersuchungstage mit EPO-Applikation: 0d n=2, 1d n=7, 3d n=4, 5d n=0, 7d n=3, insgesamt n=16; Anzahl der Versuchstiere mit Schein-OP: n=4)

54

3 Ergebnisse

3.7 Ergebnisse der immunhistologischen Färbungen 3.7.1 CD133-positive Gefäße

Die immunhistochemische Färbung der Präparate (beschrieben unter 2.4.1)

erfolgte durch Frau Ann-Kathrin Hellberg-Schnieder, Institut für Physiologie

(Direktor: Prof. Dr. W, Jelkmann), Universität zu Lübeck. Die Auswertung erfolgte

im Rahmen dieser Promotionsarbeit.

Abbildung 14: Eine EPO-Applikation im ANV führt zu einer Erhöhung der Anzahl (A) CD133-positiver Gefäße (B; rot = CD133-positiv) in den mikroskopisch analysierten Nieren pro Gesichtsfeld (p < 0,001)

55

3 Ergebnisse

56

In den histologischen Präparaten zeigte sich eine signifikante Erhöhung der

Anzahl CD133-positiver Gefäße in den untersuchten Nieren nach EPO Applikation

im ANV am 1. postoperativen Tag im Vergleich zu ANV-Nieren ohne EPO-

Applikation. Es ließen sich 7,64 ± 4,38 CD133-positive Gefäßanschnitte einen Tag

nach EPO-Gabe im Gegensatz zu 1,42 ±1,74 CD133-positiven Gefäßanschnitten

ohne EPO-Applikation pro Gesichtsfeld detektieren (p = 0,0000007). Prinzipiell

kommt es im ANV zu keiner Veränderung der Anzahl CD133-positiver

endothelialer Strukturen in den ischämisch geschwächten Nieren im Vergleich zu

den nicht-operierten Tieren.

4 Diskussion

4 Diskussion Das akute Nierenversagen (ANV) im Rahmen von Schock, Sepsis oder

postoperativen Komplikationen ist trotz sich ständig verbessernden

intensivmedizinischen Optionen ein gefürchteter Zustand, für den es bis lang keine

adäquate Therapie gibt.

In den letzten Jahren galt das Interesse der nephrologischen Forschung vor allem

der Erprobung verschiedener vasoaktiver, metabolischer und hormoneller

Substanzen zur therapeutischen Intervention. Erythropoetin (EPO) wurde bereits

für diverse Organe wie z.B. Herz (Calvillo et al., 2003), Leber (Yilmaz et al., 2004)

und Gefäße (Nakano et al., 2007) als Mittel zur Förderung regenerativer Prozesse

nach ischämischem Trauma eingesetzt (zur Übersicht: Patel et al., 2011).

Beispielsweise konnte auch durch zeitgleiche einmalige Gabe von 5000 IE/kg KG

EPO i.p. im Rattenmodell die neuronale Apoptose und Infarktrate nach einer

cerebralen Ischämie reduziert werden (Sirén et al., 2001).

Die Entdeckung des EPO-Rezeptors (EPO-R) in non-hämatopoetischen Organen

wie z.B. der Niere (Westenfelder et al., 1999) oder in Gefäßendothelien

(Anagnostou et al., 2004) erklärt die mögliche pleiotrope Wirksamkeit von EPO.

Auch im ANV wurde EPO zur Unterstützung reparativer Vorgänge eingesetzt (zur

Übersicht: Moore et Bellomo, 2011). In vielen dieser Studien wurde EPO jedoch

noch vor oder zeitgleich mit dem Auslösen eines ischämischen Ereignisses

eingesetzt. Kiris et al. (2008) z.B. behandelten Ratten 5 min vor Setzen eines I-R

Schadens mit 1000 IE/kg KH EPO. Diese EPO-Gruppe zeigte im Vergleich zu

Ratten ohne EPO-Behandlung eine signifikante Verringerung von Metaboliten des

anaeroben Stoffwechsels (Malondialdehyde, Superoxid Dismutase), sowie eine

signifikante Verringerung der glomerulären und tubulären Nekrose.

Auch andere Forschungsgruppen injizierten EPO überwiegend bevor ein

ischämisches Ereignis herbeigeführt wurde (s. Tabelle 3). Im klinischen Alltag

mögen diese Ergebnisse von Relevanz für elektive abdomino-aortale Eingriffe

sein, jedoch nicht für ein bereits eingetretenes ANV, bei dem eine prä-ischämische

Intervention nicht mehr möglich ist.

57

4 Diskussion

Unser Ziel war es daher, diesen theoretischen Ansatz in ein realitätsnahes Modell

umzuwandeln, das es ermöglicht, therapeutische Optionen in Hinblick auf spätere

klinische Relevanz zu analysieren. EPO wurde in der vorliegenden Arbeit daher

nicht zur Protektion eines ANV, sondern zur Behandlung eines bereits

bestehenden ANV eingesetzt.

Autor Spezies + Organ

EPO-Dosis Wann und wie lange EPO appliziert?

Effekt

Vesey et al., 2004

Ratte, Niere, I-R

5000 IE / kg KG

Einmalig prä Ischämie

Mitoserate im prox. & dist. Tubulus ↑, Apoptoserate ↓, Kreatinin ↓

Spandou et al., 2006

Ratte, Niere, I-R

500 IE /kg KG

Einmalig 45min prä Ischämie

Harnstoff ↓, Kreatinin ↓, Tubulusnekrose ↓, Apoptose ↓

Bahlmann et al., 2004

Ratte Niere, I-R

0,1 µg / kg KG, Darbopoietin s.c.

1x wöchentlich über 6 Wochen nach 5/6 Nephrektomie

Kreatinin ↓, RR ↓

Lee et al. 2005

Ratte, Niere, Ciclosporin A

100 IE /kg KG, rhEPO i.p.

3x wöchentlich, gleichzeitig mit CsA Gabe

CRP ↓, keine Verbesserung der Nierenfunktion

Sharples et al. 2004

Ratte, Niere, I-R

300 IE / kg KG, i.v.

Einmalig 30 min prä Ischämie oder 30 min post Ischämie

Kreatinin ↓, Nekrose ↓, Apoptose ↓

Kiris et al., 2007

Ratte, Niere, I-R

1000 IE/kg KG s.c.

Einmalig 5 min prä Ischämie

Nekrose ↓

Salahudeen et al., 2008

Ratten, Niere, Cisplatin

5000 IE/kg KG i.v. dreimalig

2d prä, während und 2d nach CP-Gabe

Kreatinin ↓

Nemoto et al., 2001

Ratten. Niere, I-R

500 IE/kg KG oder 3000 IE/kg KG

Einmalig gleichzeitig mit Ischämie

Hämatokrit ↑ Mortalität ↓

Tabelle 3: EPO-Gabe in verschiedenen Tier-Modellen

58

4 Diskussion

4.1 Keine signifikante Verbesserung der Retentionsparameter nach täglicher EPO-Gabe Als Zeichen des Funktionsverlusts der Niere steigen bei ANV die

Retentionsparameter im Blut an. In der vorliegenden Arbeit wurden deshalb

Kreatinin und Harnstoff im Rattenplasma bestimmt, jeweils mit und ohne EPO-

Applikation.

Harnstoff ist das Endprodukt des Aminosäurestoffwechsels und eine harnpflichtige

Substanz, die bei ANV retiniert wird und dann im Blut akkumuliert. Mit der

Bestimmung dieses Parameters kann man orientierende Aussagen über das

Ausmaß des ANVs treffen.

Kreatinin ist ebenfalls eine harnpflichtige Substanz und wird relativ konstant

glomerulär filtriert. Sinkt die GFR im ANV unter 50%, so kommt es zu einem

Anstieg des Kreatininwerts im Blut. Die Menge des ausgeschiedenen Kreatinins ist

außerdem abhängig von der Muskelmasse, körperlicher Aktivität und dem

Geschlecht, wird aber in der Klinik oft als Parameter zur Verlaufskontrolle

herangezogen (Hollmen, 2011). Weder für Kreatinin noch für Harnstoff ließ sich

durch eine EPO-Gabe eine positive Veränderung erzielen. Im Gegenteil; es zeigte

sich am 3. postoperativen Tag ein signifikanter Kreatinin-Anstieg nach EPO-Gabe

(p = 0,04). Auch eine tägliche EPO-Gabe führte nicht zu einer Verbesserung der

Retentionsparameter.

Da EPO die Apoptose von erythroiden Vorläuferzellen im Knochenmark hemmt,

wird es von peritubulären Fibroblasten der Niere in hypoxischen Situationen

sezerniert, um die Anzahl im Blut zirkulierender Erythrozyten zu erhöhen. EPO

führt dadurch zu einer Erhöhung des Hämatokrits, welcher somit auch ein

Indikator für die Effektivität der EPO-Applikation ist. In den durchgeführten

Versuchen wurde EPO am Tag der Operation verabreicht und der postoperative

Hämatokrit an den Tagen 1, 3, 5 und 7 ermittelt. Es konnte ein erhöhter Hämatokrit

im Vergleich zum Ausgangswert (Kontrollgruppe) als Zeichen einer erhöhten

Erythrozytenzahl nach EPO-Applikation beobachtet werden. Am 7. Tag nach EPO-

Gabe war der Unterschied zur Kontrollgruppe signifikant (p = 0,0027). Auch nach 3

Tagen täglicher EPO-Applikation war der Hämatokrit signifikant erhöht im

Gegensatz zur Kontrolle (p = 0,04).

59

4 Diskussion

In den meisten Arbeiten zu diesem Thema wurde EPO nur einmalig appliziert. In

unserer Versuchsanordnung konnte durch eine einmalige Gabe nur eine

Reduktion der renalen Retentionsparameter am 1. postoperativen Tag erreicht

werden, und nur eine mäßige oder sogar gar keine Verbesserung der funktionellen

Parameter erzielt werden. Da zudem das ANV nach einmaliger EPO-Gabe das

Maximum der Harnstoff- und Kreatinin-Werte auf den 3. Tag verschob und zu

einem prolongierten Verlauf des ANV führte, entschlossen wir uns zu einer

täglichen EPO-Gabe über 3d. Damit konnte sowohl für Kreatinin als auch für

Harnstoff eine Verringerung dieser Retentionsparameter erzielt werden. Lee et al.

(2008) applizierten Ratten mit Cisplatin-induziertem ANV ab dem 4. Tag nach ANV

Induktion bis zum 10. Tag täglich 100 IE/kg KG EPO. Am Tag 10 zeigte sich eine

signifikante Verringerung der Kreatininlevel im Serum sowie eine signifikante

Verbesserung der Kreatinin-Clearance im Vergleich zu einer non-EPO Gruppe.

Schlussfolgernd kann man sagen, dass eine wiederholte, tägliche EPO-

Applikation tendenziell einer einmaligen Gabe überlegen ist.

Wir beschränkten uns zunächst auf eine Untersuchung der Parameter Kreatinin

und Harnstoff (sowie Hämatokrit), da sie die größte Aussagekraft über den

tatsächlichen klinischen Verlauf und die Prognose besitzen. Dennoch wäre es

sicher interessant zu wissen, ob sich diese Verbesserung auch auf histologischer

Ebene verfolgen lässt, oder sich durch eine erhöhte und andauernde EPC-

Mobilisierung im Blut ausdrückt.

4.2 EPO erhöht die Anzahl physiologischer Tubuli Die histologische Auswertung wurde anhand von HE-gefärbten Präparaten

durchgeführt

Das größte Charakteristikum proximaler Tubuli ist ein Epithel mit vielen Microvilli,

die bei histologischer Betrachtung wie ein Bürstensaum erscheinen. Bei einem

ischämischen Trauma kommt es zu einem Verlust dieser funktionellen

Tubulusabschnitte.

In den Präparaten zeigte sich, dass bei ANV-Tiere, die EPO erhielten, signifikant

mehr Tubuli mit Bürstensaum detektiert werden konnten als bei ANV Tieren ohne

EPO-Applikation. Zwar war die Anzahl im Vergleich zu Kontrolltieren immer noch

stark verringert, dennoch kam es durch EPO zu einer erhöhten Anzahl von

60

4 Diskussion

morphologisch intakten Tubuli (p = 0,03) im Vergleich zu ANV-Nieren ohne EPO-

Behandlung.

Ein späteres Zeichen für die akute Tubulusnekrose (ATN) im ischämischen ANV ist

das Abschilfern avitaler Tubulusepithelzellen ins Lumen. Dieser Zelldetritus verlegt

das Lumen und kann zu einer mechanischen Obstruktion führen. In der

Untersuchtung zeigte sich keine signifikante Verringerung des intraluminalen

Zelldetritus nach EPO Gabe in den ANV-Nieren.

Als letztes Stadium der tubulären Schädigung kommt es durch den Verlust der

interzellulären Verbindungen zu einem ödematösen Anschwellen der Tubuli, die

mikroskopisch dann mit einem weiten Lumen imponieren. EPO verringerte zwar

die Anzahl der Tubuli mit weitem Lumen, allerdings nicht in signifikantem Ausmaß. Auch die Anzahl mononukleärer Zellen, welche ein Hinweis auf eine

inflammatorische Reaktion sein können, war nicht verringert.

Zusammengefasst scheint es durch EPO Gabe zu einer gering erhöhten

Wahrscheinlichkeit für das Antreffen morphologisch intakter Tubuli zu kommen.

Das Ausmaß der Korrelation zwischen verbesserter Morphologie und

verbessertem klinischen Outcome ist allerdings schwierig zu beurteilen.

4.3 Funktionelle Nierenparameter Durch EPO-Gabe konnte teilweise eine Verbesserung der funktionellen

Nierenparameter in der isoliert perfundierten Rattenniere erzielt werden. Der

renale Gefäßwiderstand verringerte sich annähernd auf Werte, die denen der

Kontrolltiere entsprachen. Auch die Perfusionsflussrate war unter EPO-Gabe

höher als ohne EPO. In Hinblick auf die Urin Albumin Exkretion konnte zwar an einigen Tagen eine

Verbesserung durch EPO erzielt werden, jedoch war keine konstante

Verbesserung zu erkennen.

Durch den Verlust der Autoregulationsmechanismen des glomerulären

Filtrationsapparats kommt es nach einem ischämischen Trauma zu einer

Verringerung der GFR und konsekutiv der Urinflussrate. Obwohl auch im

Glomerulum EPO-Rezeptoren vorhanden sind, lässt sich durch eine EPO-

Applikation keine Verbesserung erzielen.

61

4 Diskussion

Lediglich am Tag 1 und Tag 7 nach einmaliger EPO-Gabe waren sowohl die GFR

als auch die Urinflussrate im Vergleich zu den Tieren ohne EPO-Applikation im

ANV erhöht, was einer funktionellen Verbesserung entspricht. Leider ließ sich kein

signifikanter, kontinuierlicher Unterschied nachweisen.

Als weiterer Parameter für eine glomeruläre Schädigung wurde Albumin

untersucht. Albumin ist ein Makroprotein, das unter physiologischen Umständen

den glomerulären Filter nur in sehr geringem Ausmaß passieren kann. Erst wenn

es zu einer Schädigung des Glomerulums kommt lässt sich Albumin im Urin

detektieren. Die fraktionierte Albuminclearance und die Urin Albumin

Exkretionsrate sind somit Marker für das Ausmaß einer glomerulären Schädigung.

Allerdings muss man hinterfragen, ob die gefundenen Werte das wahre Ausmaß

der glomerulären Schädigung widerspiegeln, da es beim Modell der isoliert

perfundierten Niere aus noch nicht geklärten Gründen häufig zu einer erhöhten

Durchlässigkeit des Glomerulums kommt.

Unabhängig davon kam es durch EPO zu keiner Verbesserung der

Albuminexkretion.

Zusätzlich wurde der Effekt von EPO auf die fraktionierte Wasser- und

Natriumreabsorptionsrate im ANV untersucht. Durch einen sekundär-aktiven

Transport wird Natrium im Tubulus resorbiert, woraufhin Wasser passiv einströmt.

Die Natrium- und Wasserreabsorptionsraten sind somit Indikatoren für die

Funktionalität und Integrität der Tubuli, welche nach einem ischämischen Trauma

in ihrer Physiologie gestört sind. Doch auch hier kam es nicht zu einer

Verbesserung durch EPO.

Zusammenfassend kann man sagen, dass es nicht zu einer signifikanten

Verbesserung der Nierenfunktion durch EPO kommt. Dies steht in Diskrepanz zu

vielen Arbeiten der aktuellen Forschung (de Souza et al., 2012; Caetano et al.,

2011). Ein Grund hierfür mag vor allem die niedrige Fallzahl sein (n = 1 – 7), die

sich aufgrund der vielen einzelnen Untersuchungstage ergab.

In der vorliegenden Arbeit konnte allerdings gezeigt werden, dass es durch EPO

zu einem Anstieg CD133- und CD34-positiver Zellen ins periphere Blut kommt.

62

4 Diskussion

Diese Zellen, genannt EPCs, können, wie in diversen Veröffentlichungen gezeigt

wurde, an einer Regeneration der Nierengefäße beteiligt sein (Ward et al., 2011).

In der vorliegenden Arbeit konnten in einer histologischen Begutachtung signifikant

mehr CD133-positive Gefäße in der EPO Gruppe im Gegensatz zur nicht EPO

Gruppe nachgewiesen werden.

4.4 Ausblick: Klinische Einsatzgebiete von EPO

Eine 2010 von Endre et al. veröffentlichte Doppelblind-Plazebo-Studie an 529 ICU-

Patienten zeigte, dass eine frühe Intervention (innerhalb von 6h nach

Diagnosestellung) mit EPO den Verlauf des ANVs nicht positiv beeinflussen kann.

Allerdings wurden zur Diagnose des ANV zum ersten Mal die Enzyme γ-Glutamyl

Transpeptidase sowie Alkaline Phosphatase herangezogen, welche nur einen

schwachen positiven prädiktiven Wert zeigten.

Die vorliegende Arbeit konnte jedoch eine Verbesserung der Retentionsparameter

nach täglicher EPO-Applikation aufzeigen, welche als Verlaufsparameter eine

große klinische Relevanz besitzen. Desweiteren fanden sich morphologische und

histologische Verbesserungen, die durch eine EPO Gabe initiiert wurden.

Ein weiteres Einsatzgebiet von EPO ist jedoch die präoperative Gabe bei

Eingriffen, die mit einer erhöhten Inzidenz von ANV einhergehen (z.B. abdominal-

aortale Eingriffe). Da EPO bereits zum Ausgleich intraoperativer Blutverluste

eingesetzt wird (Ulrich et al., 2010), liegt eine Erprobung hier nahe.

Bedenken sollte man jedoch die erhöhte Thrombosegefahr die mit einer EPO-

induzierten erhöhten Erythrozytenzahl einhergehen kann. Bennett et al. zeigten

2008, dass die Anwendung von EPO zum Ausgleich einer Chemotherapie-

induzierten Anämie bei Tumorpatienten eine erhöhte Thrombosegefahr mit

verschlechterter Prognose aufweist. Zusätzlich negativ in Betracht zu ziehen bei

Patienten mit malignen Erkrankungen ist das gefäßproliferative Potential von EPO.

In vitro kann EPO zu einer Neovaskularisierung und somit zu schnellerem

Wachstum eines Tumors führen (Szenajch et al., 2010).

Ein großes Problem stellt allerdings nicht nur die Therapie des ANV dar, sondern

auch dessen Diagnose. Im klinischen Alltag wird vor allem Kreatinin zur Diagnostik

63

4 Diskussion

64

herangezogen, da es günstig und einfach zu bestimmen ist. Dieser Wert steigt

jedoch erst 24-78h nach einem ischämischen Ereignis, sowie ab einer GFR von

unter 50% im peripheren Blut an (Hollmen, 2011). Bereits nach 6h kann es jedoch

zu einem irreparablen Schaden der Niere kommen (Johnson et a., 2006).

Für eine effektive Therapie des ANV ist es also auch von großer Bedeutung, dass

die Diagnosesicherung verbessert wird, indem sensible und klinisch relevante

Marker (d.h. günstig und zeitnah zu bestimmen) gefunden werden, oder deren

Bestimmung effizienter gestaltet wird. Ein vielversprechender Früh-Marker für die

akute Nierenschädigung ist das Neutrophil Gelatinase-assozierte Lipocalin

(NGAL). NGAL im Urin ist bei Patientin die ein ANV entwickeln, z.B. 2h nach

kardiopulmonalem Bypass erhöht; Kreatinin im Serum hingegen steigt erst 48h

nach der operativen Intervention an (Mishra et al., 2005).

Ziel der zukünftigen therapeutischen Bemühungen muss es sein, eine effektive

Behandlung des ANV zu finden, die den Verlauf und die Prognose der Erkrankung

verbessert. EPO hat dabei in der aktuellen Forschung verheißungsvolle

Aussichten. Da eine EPO Applikation vor allem in experimentellen Studien

renoprotektive Effekte bewiesen hat, sowie in Ermangelung geeigneter

therapeutischer Alternativen zur Behandlung des ANV, sind weitere klinische

Studien unabdingbar um das volle Potential von EPO ausschöpfen zu können.

5 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung Das akute Nierenversagen (ANV) ist trotz Verbesserung der intensivmedizinischen

Möglichkeiten immer noch mit einer Mortalität von 50-80% behaftet. Vor allem

durch ein ischämisches Trauma kommt es zur akuten Tubulusnekrose und zum

Verlust der Nierenfunktion.

Reparaturvorgänge finden sowohl am Tubulusepithel als auch am Gefäßendothel

statt. Diese lokalen Regenerationsprozesse können u.a. durch Erythropoietin

(EPO) initiiert werden, dessen antiapoptotische und gefäßproliferative Wirkung

schon seit einigen Jahren bekannt ist und bereits in klinischen Studien für Herz

und ZNS bestätigt wurde.

EPO fördert die Mobilisierung von Stammzellen, den sog. Endothelialen

Progenitorzellen (EPC), aus dem Knochenmark. Diese EPC sind CD133- und

CD34-positiv und können sich im geschädigten Nierengewebe zu reifen

Gefäßendothelzellen differenzieren.

Ziel der Dissertation war es, die Wirkung von EPO in Hinblick auf funktionelle und

strukturelle Veränderungen im ANV zu untersuchen. Dafür wurde die

Nierenfunktion durch Bestimmung der renalen Retentionsparameter Kreatinin und

Harnstoff im Blut sowie verschiedene funktionelle Parameter im Modell der isoliert

perfundierten Niere analysiert. Zudem erfolgte eine durchflusszytometrische

Blutuntersuchung und eine histologische Betrachtung des Nierengewebes.

Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Gabe von EPO zum Auftreten von CD133-

und CD34-positiven EPC im peripheren Blut führt. Ebenso konnten CD133-

positive Gefäße in ischämisch geschädigten Nieren nach EPO-Applikation

nachgewiesen werden. Histologisch zeigte sich eine leichte Verbesserung der

akuten Tubulusnekrose durch EPO Applikation.

Funktionell konnten keine konstante, signifikante Verbesserung der tubulären und

glomerulären Funktion nach EPO-Applikation im ANV nachgewiesen werden.

Jedoch zeigte sich eine Verbesserung der renalen Retentionsparameter Kreatinin

und Harnstoff bei täglicher EPO-Gabe. Funktionell konnte unter EPO-Applikation

65

5 Zusammenfassung

66

ebenfalls eine Verbesserung des renalen Gefäßwiderstandes und der

Nierenperfusion demonstriert werden, so dass in Zusammenschau mit dem

Auftreten der EPC und den CD133-positiven Endothelien am ehesten von einem

pleiotropen Reparatureffekt durch EPO auf Ebene der Gefäße im ANV

ausgegangen werden kann.

In klinischen Studien ist es bisher nicht gelungen, den im Tiermodell gefundenen

renoprotektiven Effekt von EPO darzustellen. Hier besteht also weiterhin

Forschungsbedarf, um das volle Potential von EPO im ANV zu ergründen.

Tägliche EPO-Gaben scheinen hierbei für die Renoprotektion am

erfolgversprechendsten zu sein.

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Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Jan Kramer

bedanken. Ohne deine Unterstützung und ständige Motivation würde ich jetzt noch

die Einleitung schreiben. Du bist der beste Doktorvater den ich mir hätte wünschen

können!

Desweiteren möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Jan Kramer, Herrn Prof. Dr. N.

Tautz, Herrn Prof. Dr. W. Jelkmann und Herrn Prof. Dr. H. Pagel für die Überlassung

des Themas und die Bereitstellung des Arbeitsplatzes bedanken. Bedanken möchte

ich mich auch für die fachliche Unterstützung und die großzügige Bereitstellung von

Literatur.

Mein besonderer Dank gilt den Mitarbeitern des Instituts für Physiologie, Frau

Urszula Frackowski und Frau Ann-Katrin Hellberg-Schnieder, für ihre gute

Einarbeitung in das Thema und die immer währende Geduld bei all meinen Fragen.

Desweiteren möchte ich mich bei den Mitarbeitern der interdisziplinären

Arbeitsgruppe „Stammzellbiologie“ der Medizinischen Klinik I (Prof. Dr. Jan Kramer;

Direktor: Prof. Dr. H. Lehnert) und des Instituts für Virologie und Zellbiologie (Prof. Dr.

J. Rohwedel; Direktor: Prof. Dr. N. Tautz), Frau Barbara Andresen und Frau

Alexandra Tiedtke, für die freundliche Zusammenarbeit und stete Unterstützung

bedanken.

Außerdem danken möchte Herrn Dr. Ulrich Lindner, der mir die Welt der

Durchflusszytometrie erklärt hat.

An dieser Stelle möchte ich mich auch bei meinem ehemaligen Biologielehrer Herrn

Bernd Luhmann bedanken, der mein Interesse für Naturwissenschaften geweckt hat.

Im nächsten Leben werde ich Evolutionsbiologin!

Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Schwester und meinen Eltern, die mich

immer bei allem unterstützt haben. Ohne euch wäre ich nie so weit gekommen!

Lebenslauf

Nachname: Enders-Comberg

Vorname: Sora Maria

Geburtsdatum: 26.07.1983 in Hagen

Schulausbildung

1990-1994 Grundschule in Hilden

1994-1996 Gymnasium in Hilden

1996-2003 Gymnasium in Dortmund, Abitur

2000-2001 Auslandsjahr, The Leys School, Cambridge, England

Hochschulstudium

2003-2010 Studium der Humanmedizin an der Medizinischen Universität zu

Lübeck

2006 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Note „gut“

2010 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung, Note „gut“

Praktisches Jahr: Innere Medizin, Sana Kliniken, Lübeck; PD Dr. Bahr

(2009) Gynäkologie, Universitätsklinikum Lübeck; Prof. Dr. Diedrich

Allgemein- und Viszeralchirurgie; Prof. Dr. Bruch

Unfallchirurgie; PD. Dr. Paech

76

77

Weiterbildung

2011 - 2012 Assistenzärztin, Gynäkologie und Geburtshilfe, Sana Klinik Eutin

Seit 2013 Assistenzärztin, Gynäkologie und Geburtshilfe, St.-Johannes-

Hospital Dortmund

Wissenschaftliche Tätigkeit

06/2007-07/2008 Durchführung des experimentellen Teils der Promotionsarbeit

Veröffentlichungen

Poster

1. Kramer J, Lindner U, Enders-Comberg S, Meier M, Lehnert H, Steinhoff J,

Rohwedel J, Pagel H: Application of Epoetin alfa improves renal function

during acute ischemic renal failure in an animal model. 3rd Congress on

Regenerative Biology and Medicine, 3rd Congress of the German Society of

Stem Cell Research. Stuttgart, 09. – 11.10.2008

2. Kramer J, Lindner U, Enders-Comberg S, Meier M, Lehnert H, Steinhoff J,

Rohwedel J, Pagel H: Recruitment of endothelial progenitors by EPO

improves renal function durfin acute kidney injury in an animal model. 8th

International Luebeck Conference on the Pathophysiology and

Pharmacology of Erythropoietin and other hematopoietic Growth Factors.

Lübeck, 30.07. – 01.08.2009

Pleiotrope Effekte von Erythropoietin auf renale ... · PDF fileDas akute Nierenversagen (ANV)...

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