Plaatsgerichte mutagenese Primrose & Twyman
-
Upload
russell-ryan -
Category
Documents
-
view
70 -
download
0
description
Transcript of Plaatsgerichte mutagenese Primrose & Twyman
Plaatsgerichte mutagenesePrimrose & Twyman
Principles of Gene Manipulation and Genomics,
7e editie (2006), Hoofdstuk 8
- doel: enkelvoudige of enkele posities gericht wijzigen in een DNA fragment (kloon)
(enkelvoudige, gerichte wijzigingen in een genoom vergen bijzondere technieken, kunnen
ondermeer via in vivo recombinatietechnieken ; worden hier niet behandeld)
- 'reverse genetics' :
klassieke genetica : willekeurig mutaties invoeren om fenotype te creëren
=> plaats van mutatie zoeken (en karteren)
'reverse' genetica : mutatie invoeren op welbepaalde plaats
=> mogelijk effect op fenotype (functie) bekijken
- drie basisbenaderingen: (1) cassettemutagenese (2) primerverlenging (3) PCR
(klassieke) genetica
causaliteitfenotypeDNA
‘reverse genetics’
Relatie tussen mutagenese-efficiëntie en het aantal kloons, nodig om deaanwezigheid van de gewenste mutant te verzekeren, met 90% probabiliteit
Het aantal geanalyseerde kloons moet voldoende hoog zijn om met behoorlijkekans de gewenste mutant te vinden (afhankelijk van de probabiliteit van voorkomen van de mutatie, hetgeen afhankelijk is van de gebruikte procedure (of techniek)).
*
Cassettemutagenese
- excisie van een DNA fragment (restrictieknipplaatsen !)
+ vervanging door een chemisch-gesynthetiseerd fragment(2 of meer oligonucleotiden)
- VOOR - hoge efficiëntie
- multipele uitwisseling mogelijk, inclusief degeneraties
- TEGEN - vereist flankerende "unieke" knipplaatsen
- synthesecapaciteit moet voldoende hoog zijn
- gebruik overlappende sets oligonucleotiden mogelijk (cfr. chemische synthese)
- bij complexe degeneraties : 2de streng aanmaken door fill-in (vanaf 3’ uiteinde)
- gebruik van inosine mogelijk om mismatches tussen de strengen te vermijden
- ook deleties en grote inserties zijn mogelijk
mismatch posities
Uitwisseling van restrictiefragmenten
gebruik van inosine op gerandomiseerde posities(N hoeft niet per se 25% van elk te zijn, maar kan ook bvb. 97% van het oorspronkelijke nucleotide en 1% van elk van de 3 andere)
nb. alleen Met en Trp vereisen een G op de derde positie van het triplet, voor de andere 18 volstaat een C of G (m.a.w. hun derde letter is Y of R, voor Ile is dit H). => NNS vertegenwoordigt dus de 20 mogelijke aminozuren (inclusief het oorspronkelijke)
Vooral de beperking door de noodzakelijke unieke (of bijna-unieke) restrictieknipplaatsen, maaktedat gezocht werd naar methoden met mismatch-primer-afhankelijke invulreacties, en later op basis PCR.
Mismatch primerverlenging ('primer extension')=> oligonucleotide-gestuurd, mismatch-afhankelijk
- vereist enkelstreng matrijs (eventueel partiëel enkelstrengig)- M13- of fasmide kloon- aanmaak van gapped-duplex
- vereist mismatch oligonucleotide (chemische synthese)- belang van positie van mismatch in oligonucleotide op matrijs- 3'-effect (repair) => keuze polymerase !- 5'-effect (displacement) => keuze polymerase !
- mogelijkheden: puntmutatie, multipele puntmutaties, insertie, deletie(ook 'sticky feet‘ mutagenese genoemd)
- efficiëntie is (zeer) laag tenzij bijzondere maatregelen genomen worden
waarom ? => afhankelijk van diverse factoren
- transformatie door heteroduplex EN de oorspronkelijke matrijs (ss) => de oorspronkelijke (ss) matrijs geeft alleen niet-mutante transformanten
- herstelmechanismen in E.coli (GATC !)=> gebruik van mutL, mutS, mutH stammen
Mutagenese doormismatch primerverlenging op een enkelstrengige matrijs
T
C
*
5’ 3’
Enkelvoudige of meervoudige puntmutaties, insertiemutations en deletiemutatieszijn mogelijk. Hoofdbekommernis is de efficiëntie van screening.
Theoretisch concept, geeft50% wild-type en 50 mutantenakomelingen.
maar :
ook de enkelstrengige moleculentransformeren de waardcel, zodat meerwild-type dan mutante kloons worden gevormd ;
bovendien :
herstelmechanismen favoriseren deoriginele sequentie.
A repair enzyme, MutS, binds to mismatches in DNA and recruits MutL, which subsequently activates the endonuclease MutH. MutH bindshemimethylated GATC sites (which can be up to 1 kb from the mismatch) and when activated will selectively cleave the unmethylated daughter strand, allowing a specific helicase and exonucleases to excise the nascent strand in the region surrounding the mismatch. The strand is then re-synthesized by DNA polymerase III.
Selectie van de mutante streng : belangrijkste voorbeelden (vaak ook gemodificeerde oligonucleotiden of modificaties in de mismatch primer mogelijk, bvb. met inosine)
- methode van Eckstein :
- in vitro fixering van de mutatie
- gebruik van fosforothioaat nucleotiden (S-dCTP)- kenmerken van restrictieënzymen tegenover de S-modificatie
- methode van Kunkel :
- in vivo selectie van de mutant
- "doping“ van de matrijsstreng met uridylaat : 1 à 2 % U waar T thuishoort
- dubbelmutant : dut (voor dUTPase) ung (voor uracil-N-glycosidase)
- transformatie van de mismatch dubbelstreng naar een wt E.coli
Methode van Eckstein
Introduceer een S-gemodificeerde streng
Sommige restrictieënzymen wordengeïnhibiteerd door S-modificatie, maar splitsen wel nog de niet-gemodificeerde
streng (=> nicking) : bvb. NciI
Exonuclease III verwijdert de mismatch,maar alleen uit de parentale streng
vereist :
- vervanging van een dXMP door zijn zwavel-analoog op alle plaatsen
- volledige kopiëring, en ringsluiting door ligase
Structuur van dCTPS : het Sp isomeer wordt specifiek gebruikt door E. coli DNA polymerase I
De biochemie achter de methode van Kunkel voor plaatsgerichte mutagenese
Metabolisme van dUTP in E. coli
Pijlen geven de richting aan vande omzettingen in de algemene pathway eerder dan het evenwichtbij de individuele reacties.
Pijlen in vetjes duiden de majeurepathway aan.
In de kadertjes staan de namen van de betrokken genen : ung : uracil-DNA N-glycosylase dut : dUTPase dcd : dCTP deaminase cdd : (deoxy)cytidine deaminase deoA : thymidine phosphorylase (deoxyuridine)
dCyd : deoxycytidine ; dUrd : deoxyuridine ; dThd : deoxythymidine dRib-1-P : deoxyribose-1-fosfaat
20-30 dU’s in M13mp2 DNA bij isolatie uit een dut ung E.coli stam.
Vergelijking tussen strategievan Eckstein en van Kunkel.
Kunkel : => de matrijsstreng wordt gemodificeerd ; => via "manipulaties" in vivo
Eckstein : => de nieuwe streng wordt gemodificeerd; => manipulaties in vitro
nb. Kunkel methode :Diverse variaties werden getest, met al dan niet toevoeging van een in vitro ligatiestap, met al dan niet een uracil glycosylasestap, en deze al dan niet gevolgd door reactie in alkali. Het beste resultaat, qua aantal kloons en aantal mutanten werd echter bekomen, met alleen de ligatiestap na mismatch-primer extensie. (En dus herstelreacties voornamelijk in vivo.)
- gapped duplex methode, met extra (= begeleidende) mismatch tgo de complementaire streng
- transformatie naar een niet-suppressor stam (Su-)
- expressie vanaf de parentale streng vereist een amber suppressor
- gapped duplex method, met alternerende (= omwisselbare) ambermutaties :
- Apam => ApR en CmR => Cmam, en vice versa
- steeds transformatie naar een Su- stam
- maakt consecutieve mutageneses makkelijker
- in vivo selectie met een wijziging in de selectiemerker
- toevoeging van een selectieprimer die het bla gen wijzigt
- het mutante bla gen geeft resistentie tegen ceftazidime + ampicilline
- niet-mutante transformanten overleven niet op ceftazidime
- T4 polymerase vult de openingen (gaps) nauwkeurig in
(geen 5'-3' exo, geen ‘strand displacement’)
- er is een goede koppeling tussen de mismatchen
m.a.w. geen cross-over : aanwezigheid van beide gaat samen
Hybridisatie van twee lineaire DNA fragmenten, of één circulair DNA (de vector) met een complementaire streng die er deels mee overlapt (= vorming van de gap) ; tussen beide is een extra selecteerbare mismatch aanwezig, waardoor selectie van de mutant mogelijk is. Ook mogelijk met 2 (of 3) mismatch primers op een circulaire vector. Telkens hierbij is behoud van “koppeling” tussen de segmenten is noodzakelijk.
In vitro mutagenese met de ‘gapped duplex’ methode en fenotypische selectie door amber-suppressie
Omwisseling van waardcel
tussen “amber-suppressing”
en “non-suppressing” fenotype.
Selectie door gebruik van de
niet-suppresserende waardcel.
“Gapped duplex” methode met fenotypische selectie
Omwisseling tussen twee
resistentiegenen, rekening
houdend met de
suppressie-fenotypes.
Volle balk : wild-type genOpen balk : ambermutant
Gebruik van kloons in fasmidevectoren vooraanmaak van de enkelstrengige matrijsstreng.
Amps en Cms staan voor Ampam en Cmam
mutante TEM bla S K G
5´ p AAA TCT GGA GCC TCC AAG GGT GGG TCT CGC 3´ aaa tct gga gcc GGT GAG Cgt ggg tct cgc
wild-type TEM bla G E R
Selectie van mutanten door een extra mutatie ineen bla gen zodat ceftazidime resistentie ontstaat.
De "begeleidende" mutatie wijzigt het bla gen
Met gebruik van 2 mismatch oligonucleotiden
Ceftazidime
Ter illustratie
PCR-gebaseerde plaats-specifieke mutagenese
- uitschakeling van de parentale matrijs door amplificatie
- mismatch primer op de doelwitpositie=> bij “terugpriming” (in 2de cyclus) wordt de wijziging gefixeerd
- uitbreiding van cassettemutagenese, maar de regio’s (fragmenten) kunnen veel groter zijn ; restrictieplaats "in de omgeving" van de mismatch is nodig, maar dat mag
niettemin op een redelijke afstand zijn (bvb. 25 of zelfs meer nucleotiden, zolang de primer synthetiseerbaar blijft)
- de nood aan restrictieplaats kan omzeild worden door een werkwijze die sterk op SOE lijkt
- 'megaprimer' mutagenese: tweestapsprocedure, waarin het vroege ampliconproduct de primer wordt in de daaropvolgende amplificatie
- door inverse PCR : indien de vector klein genoeg is - lineair product- circularisatie nodig- een splitsingsplaats is weerom zeer nuttig- primers met staarten maken substantiële inserties mogelijk - “universele” methode met Class-II restrictieplaatsen en enzymen
De megaprimer methode
De mutante moleculen gevormd in de eerste PCR-rondes fungeren als primers in de latere cycli van de PCR.
ook langere inserties kunnen gecrëëerd wordenAanpassingen van “inverse PCR” :
Linearisering bij : na amplificatie opnieuw splitsing aan de uiteinden en ligatie. => vereist dus een knipplaats “in de buurt”
(en uniek in de vector)
Gebruik van EarI of andere ClassII-S enzymen
herkenningssequentie van EarI
----CTCTTCn ----GAGAAGnnnn
EarI : afsplitsing van extra "staarten"
C T C T T C (1 / 4)
EarI
EarIEarI
ligase
PCR
Andere alternatieven :
- ExsiteTM methode : tegenselectie met DpnI
- GeneTailorTM methode : in vitro C-methylatie en in vivo afbraak van parentale streng
De PCR methoden zijn een majeure benadering geworden voor gerichte mutagenese
- VOOR - efficientie zo goed als 100% (onder optimale condities)
- eenvoud
- TEGEN - het product is lineair: inbouw in een vector of circularisatie is nodig om het amplicon te kloneren
- risico van extra mutaties (in de rest van het amplicon) => sequencing van het ganse amplicon nodig
=> keuze van polymerase is belangrijk
... veel andere alternatieven, met ondermeer meervoudige gerichte mutaties op een welbepaalde plaats in een coderende sequentie, insertie van ongewone aminozuren, gene shuffling, enz.
'ExsiteTM' -methode
Plasmide DNA uit een dam+ stam
Inverse PCR met 5'-gefosforyleerde primers(T4-kinase + ATP)
Behandeling met DpnI vernietigt de parentalestrengen (GmeATC) (inclusief de hemi-gemethyleerde)
Circularisatie met ligaseen transformatie van E. coli
'GeneTailor' -methode
In vitro methylatie van het plasmide DNA (meC)
Amplificatie via inverse PCR met overlappende5'-uiteinden (+ één mismatch primer)
Transformatie van een E. coli wt-stam (mcrBC+)
McrBC endonuclease vernietigt de gemethyleerde matrijsstreng
De 'repair'-enzymen circulariseren het linaire product.
E. coli McrBC is een restrictieënzym dat splitst bij C-gemethyleerde RC sequenties. CpG methylase kan in deze techniek gebruikt worden voor methylering (M.SssI) aangezien een deel van deze sequenties wel zal voorafgegaan worden door een purine-nucleotide.
any aa
Codewoord tabel voor ‘reverse translation’Leu = 1T2 Arg = 3G4 Ser = 567
met 1,2,3,4,5,6,7 als conditionele codes waarbij een extra relatie tussen de tripletposities is(1 versus 3, of 1 versus 2 en 3)
Detectie (bevestiging) van mutanten - fysisch: ontstaan of verdwijnen van een knipplaats (restrictieanalyse)
(reverse-translation analyse naar mogelijke manipulatie)- sequencing: extra primer nodig op korte afstand van de mismatch positie - hybridisatie: +/- analyse met de mismatch-primer
*
Creëren of verwijderen van een restrictieknipplaats als hulp bij screening naar plaatsspecifieke mutanten
Doel : vervangen Trp door Phe
Hulp bij screening : MnlI splitsing
Mismatch primer : …GCCCTGGGCTTCGGTGGCA…
*