Pirminės ląstelių kultūros – informatyvus navikų tyrimų in vitro ...
Transcript of Pirminės ląstelių kultūros – informatyvus navikų tyrimų in vitro ...
VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS
BIOCHEMIJOS KATEDRA
Gintarė Milašiūtė
Pirminės ląstelių kultūros – informatyvus navikų tyrimų in vitro
eksperimentinis modelis
Magistro baigiamasis darbas
Biocheminės analizės studijų programa, valstybinis kodas 621C77001
Molekulinės biologijos, biofizikos ir biochemijos studijų kryptis
Vadovas (-ė) __________________ _________________ __________ (Moks.laipsnis, vardas, pavardė) (parašas) (data)
Apginta _____________ ________________ ________________ (Fakulteto dekanas) (parašas) (data)
Kaunas, 2016
2
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Leidimą išdavė Kauno regioninis biomedicininių tyrimų etikos komitetas. Ledimo nr. P2-
137/2006; išdavimo data: 2011m. gruodžio 8d.
Darbo autoriui interesų konflikto nekilo.
Magistro baigiamasis darbas atliktas LSMU Kardiologijos instituto Ląstelių kultūrų
laboratorijoje.
3
SANTRUMPOS
AMA – antimicinas A;
ATP – adenozintrifosfatas;
CD – diferenciacijos antigenai;
DAPI – 4,6-diamidino-2-fenilindiolo dihidrochloridas, nukleorūgščių dažas;
DMEM – Dulbeco modifikuota Eagle terpė;
MET – perėjimas iš mezenchiminio į epitelinį fenotipą (angl. mezenchymal-epythelial transition);
Er-α – estrogenų receptorius α;
F12 – maistinių medžiagų mišinys;
FAB – fibroblastų aktyvinimo baltymas;
FVS – fetalinis veršelio serumas;
KI67 – baltymas, koduojamas MKI67 geno (proliferacijos žymuo);
NADH – nikotinamidadenindinukleotidas;
NADPH – nikotinamidadenindinukleotido fosfatas (redukuota forma);
PBA – natrio fenilbutiratas;
PBS – (angl. Phosphate-buffered saline) fosfatinis buferis;
Sal – salinomicinas;
STAT3 – signalo daviklis ir transkripcijos 3 aktyvatorius (ang. signal transducer and activator of
transcription 3);
4
TURINYS
Santrauka................................................................................................................................. 6
Abstarct................................................................................................................................... 7
Įvadas...................................................................................................................................... 8
1. Literatūros analizė........................................................................................................... 10
1.1. Pirminės ląstelių kultūros...................................................................................... 10
1.2. Ląstelų heterogeniškumas navike......................................................................... 11
1.3. Naviko kamieninės ląstelės................................................................................... 13
1.4. Navikinių ląstelių žymenys................................................................................... 15
1.4.1. Diferenciacijos antigenai CD24 ir CD44................................................ 15
1.4.2. Proliferacijos žymuo Ki67....................................................................... 16
1.4.3. Fibroblastų aktyvinimo baltymas α (FAB).............................................. 16
1.5. Naviko slopikliai................................................................................................... 17
1.5.1. Salinomicinas.......................................................................................... 17
1.5.2. Antimicinas A.......................................................................................... 17
1.5.3. Natrio fenilbutiratas................................................................................. 18
1.6. Hipertermija.......................................................................................................... 18
2. Medžiagos ir metodai....................................................................................................... 21
2.1. Naudotos medžiagos............................................................................................. 21
2.2. Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų išskyrimas iš piktybinio audinio.......... 21
2.3. Tyrimams naudotų navikinių ir naviko neformuojančių ląstelių auginimas........ 22
2.4. Ląstelių proliferacijos įvertinimas fluorescenciniu metodu, naudojant Hoechst
33342....................................................................................................................
22
2.5. Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų žymenų (Ki67, CD24, CD44 ir FAB)
nustatymas imunocitocheminiu metodu.........................................
23
2.6. Kolonijų formavimo arba klonogeninė analizė.................................................... 23
2.7. Ląstelių invazyvumo tyrimas “žaizdos gijimo” metodu...................................... 23
2.8. Fluorescencinės mikroskopijos analizė................................................................ 24
2.9. Statistinė duomenų analizė................................................................................... 24
3. Rezultatai ir jų aptarimas................................................................................................. 25
3.1. Naviko žymenų raiška krūties naviko pirminių ląstelių kultūrose....................... 25
3.2. Krūties adenokarcinomos MDA-MB-231 ir pirminių naviko ląstelių kultūrų 27
5
(krūties naviko – BC1, BC2, BC4, BC5, BC6 ir gerklų karcinomos LSCC)
proliferacijos pokyčiai paveikus slopikliais, fluorescenciniu metodu, naudojant
Hoechst 33342......................................................................................................
3.3. Naviko neformuojančių ląstelių proliferacija, paveikus naviko slopikliais
fluorescenciniu metodu, naudojant Hoechst 33342..............................................
31
3.4. Krūties naviko ląstelių proliferacija, paveikus naviko slopikliais bei
hipertermija...........................................................................................................
32
3.5. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 gyvybingumo ir kamieniškumo įvertinimas pagal
kolonijų formavimo analizę, paveikus slopikliais................................................
33
3.6. Naviko slopiklių poveikis MDA-MB-231 ir pirminių krūties naviko ląstelių
kultūrų (BC2 ir BC5) judėjimui...........................................................................
37
3.7. Rezultatų apibendrinimas.................................................................................... 41
Išvados..................................................................................................................................... 45
Literatūra................................................................................................................................. 46
Dalyvavimas konferencijose.……………………………………………………………... 56
1 Priedas................................................................................................................................. 57
6
SANTRAUKA
Magistro darbo autorius: Gintarė Milašiūtė
Magistro darbo pavadinimas: Pirminės ląstelių kultūros – informatyvus navikų tyrimų in vitro
eksperimentinis modelis
Vadovas: Daktarė Ieva Antanavičiūtė
Darbas pristatytas: Vytauto Didžiojo Universiteto Gamtos mokslų fakultete, Kaunas, 2016 gegužė.
Puslapių skaičius: 57
Lentelių skaičius: 2
Paveikslų skaičius: 25
Priedų skaičius: 1
Dauguma naviko tyrimų atliekami naudojant jau sukurtas navikinių ląstelių linijas kaip in
vitro eksperimentinius modelius. Tačiau pirminės ląstelių kultūros turi pranašumų, lyginant jas su
ląstelių linijomis, kurios neatspindi heterogeniškumo ir vaistams atsparių navikų susiformavimo
priežasties. Pirminės naviko ląstelių kultūros tiriamos atlikus tik keletą persėjimų, todėl šios ląstelės
labiau atitinka naviko savybes ir gali būti panaudotos kaip ligos modelis.
Magistro baigiamojo darbo tikslas buvo įvertinti slopiklių (100 nM salinomicino (Sal),
10 µM antimicino A (AMA) ir 100 µM natrio fenilbutirato (PBA)) bei hipertermijos (5 val., 40 °C)
poveikį pirminėms naviko ląstelių kultūroms. Darbe tirta navikui būdingų žymenų (CD24, CD44,
Ki67 ir FAB) raiška imunocitocheminiu metodu, ląstelių proliferacija fluorescenciniu metodu,
naudojant Hoechst 33342, gyvybingumas pagal gebėjimą formuoti kolonijas ir invazyvumas
„žaizdos gijimo“ metodu. Tyrimai atlikti su pirminėmis ląstelių kultūromis – krūties naviko (BC1,
BC2, BC4, BC5, BC6) ir gerklų plokščiųjų ląstelių karcinomos (LSCC), krūties naviko ląstelių
linijomis (MDA-MB-231 ir MCF-7) bei naviko neformuojančiomis ląstelėmis (kvėpavimo takų
lygiųjų raumenų ląstelės, ASM; žmogaus plaučių diploidiniai fibroblastai, Wi38; triušio mioblastai,
RMB; kamieninės kaulų čiulpų ląstelės, MSC).
Įvertinus slopiklių poveikį pasirinktais metodais, nustatyta, kad didžiausią neigiamą
poveikį pirminėms naviko ląstelių kultūrų ir linijų proliferacijai, gyvybingumui ir judėjimui turi
antimicinas A. Įjautrinimo hipertermija naudojimas sukėlė BC2 ir MCF-7 ląstelių proliferacijos
didėjimą, o sumažėjusi proliferacija stebėta MDA-MB-231 ląstelėse. Tačiau įjautrinimas
hipertermija neturėjo įtakos slopiklių sukeltiems proliferacijos pokyčiams tirtose ląstelių linijose.
7
ABSTRACT
Author of Master Thesis: Gintarė Milašiūtė
Full title of Master Thesis: Primary cell lines - informative in vitro experimental model for cancer
research
Supervisor: Dr. Ieva Antanavičiūtė
Presented at: Faculty of Natural Sciences, Vytautas Magnus University, Kaunas, May 2016.
Number of pages: 57
Number of tables: 2
Number of pictures: 25
Number of appendices:1
Most of cancer studies are performed by using cell lines like in vitro models. Primary
cell cultures have more advantages, than cell lines, which do not properly represent heterogeneity
and cause of formation of drug-resistant tumors. Primary cell cultures are tested after few passages,
therefore, these cells are more in line with tumor properties and can be used as a tumor model.
The aim of this study was to evaluate the effect of different inhibitors (100 nM
salinomycin (Sal), 10 µM antimycin A (AMA) and 100 µM sodium phenylbutyrate (PBA)) and
hyperthermia (5 h, 40 °C) to primary cancer cell cultures. In this study we investigated the
expression of tumor-cell specific markers (CD24, CD44, KI67 and FAP) by imunocitochemistry,
also cell proliferation by Hoechst 33342 fluorimetric assay, cell viability by colony formation assay
and cell mobility by wound healing assay. Cells used in in this study: primary cell cultures – BC1,
BC2, BC4, BC5, BC6 and LSCC; human breast cancer cell lines (MDA-MB-231 and MCF-7);
normal cell lines (airway smooth muscle cell, ASM; human diploid cell line, Wi38; rabbit myoblast,
RMB; bone marrow mesenchymal stem cell, MSC).
Our results showed that antimycin A caused decreased proliferation, viability and
mobility in primary cell cultures and cell lines. Pretreatment with hyperthermia increased the
proliferation in BC2 and MCF-7 cells and decreased proliferation in MDA-MB-231 cells. We did
not observed any alterations on the effect of inhibitors on cell proliferation after pretreatment with
hypertehermia.
8
ĮVADAS
Dauguma naviko tyrimų atliekami naudojant jau sukurtas naviko ląstelių linijas kaip in vitro
tyrimų modelius. Galima alternatyva šioms linijoms – pirminės ląstelių kultūros, išskirtos iš naviko
audinio (Turin ir kt., 2014). Iš nedidelio navikinio audinio kiekio galima išskirti ląsteles, kurios
neribotai dalinasi. Tokios ląstelės gali būti naudojamos įvertinti įvairių krūties naviko tipų atsaką į
skirtingus gydymo metodus, gerinant supratimą apie navikinėse ląstelėse įvykusius pakitimus (Ochs
ir kt., 2003).
Yra žinoma, kad daugumai navikų būdingos ląstelių subpopuliacijos, tai yra, ląstelės navike
nėra vieno tipo. Piktybinio darinio sudėtyje gali būti epitelinių ląstelių, su naviku susijusių
fibroblastų ar mezenchiminių (kamieninių) ląstelių. Pastarosios ląstelės yra atsparios chemoterapijai
ir daug agresyvesnės (Tveit ir kt., 1981; Shiavo ir kt., 2007). Pirminės naviko ląstelių kultūros
tiriamos atlikus keletą persėjimų. Jose randamos ląstelių subpopuliacijos, todėl šios ląstelės labiau
atitinka naviko savybes ir gali būti panaudotos kaip naviko mikroaplinkos modelis (Burdall ir kt.,
2003). Išvestos ląstelių linijos yra homogeniškos bei neatspindi tikrosios klinikinės situacijos.
Pirminės ląstelių kultūros turi ir trūkumų – ilgai kultivuojamos keičia fenotipą, o tai sukelia
sunkumų interpretuojant gautus tyrimų rezultatus, tačiau išvestos ląstelių linijos, naudojamos ilgą
laiką taip pat gali kisti (Hass ir kt., 2009; Bonner-Weir ir kt., 2000).
Nors krūties naviko pirminės ląstelių kultūros gali būti naudingos siekiant nuspėti atsaką į
gydymą, duomenų apie šių ląstelių fenotipą yra mažai. Dažniausiai tiriama naviko ląstelių CD24- ir
CD44+ žymenų raiška (Ricardo ir kt., 2011), taip pat Ki67 proliferacijos žymens raiška (Gerdes ir
kt., 1991), tačiau kitų ligos vystymuisi reikšmingų žymenų tyrimų atlikta nedaug.
Tiriamajame darbe naudojami naviko slopikliai salinomicinas, antimicinas A ir natrio
fenilbutaratas. Tai pat buvo vertinamas hipertermijos (40 °C) poveikis ląstelių proliferacijai atskirai
ir kartu su minėtais slopikliais. Šios strategijos neigiamai paveikti naviko ląsteles turi nevienodus
veikimo mechanizmus ir veikia skirtingus naviko ląstelių tipus, todėl atlikti tyrimai yra aktualūs,
nes tikrojoje naviko mikroaplinkoje ląstelės nebūna vieno tipo ir tai labiau atspindi klinikinę
situaciją bei gali būti pritaikoma personalizuotos medicinos vystymui (Lu ir kt., 2014).
9
Darbo tikslas:
Įvertinti naviko slopiklių ir hipertermijos poveikį krūties naviko pirminėms ląstelių
kultūroms.
Uždaviniai:
1. Ištirti CD24, CD44, Ki67 ir FAB raišką krūties naviko pirminėse ląstelių kultūrose
imunocitocheminiu metodu.
2. Nustatyti salinomicino, antimicino A ir natrio fenilbutirato poveikį pirminių krūties naviko
ląstelių kultūrų (BC), gerklų plokščiųjų ląstelių karcinomos (LSCC), krūties adenokarcinomos
(MDA-MB-231) ir naviko neformuojančių ląstelių proliferacijai fluorescenciniu metodu, naudojant
Hoechst 33342.
3. Įvertinti įjautrinimo hipertermija bei salinomicino, antimicino A ir natrio fenilbutirato
poveikį krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų, MDA-MB-231 ir MCF-7 ląstelių proliferacijai.
4. Nustatyti salinomicino, antimicino A ir natrio fenilbutirato poveikį pirminių ląstelių
kultūrų ir MDA-MB-231 ląstelių linijos gyvybingumui, atliekant kolonijų formavimo analizę.
5. Įvertinti BC2 ir MDA-MB-231 ląstelių invazyvumą „žaizdos gijimo“ metodu, paveikus
slopikliais.
10
1. LITERATŪROS ANALIZĖ
1.1. Pirminės ląstelių kultūros
Ląstelių kultūra – dirbtinėje aplinkoje auginamos ir tam tikriems tyrimams naudojamos
eukariotinės ląstelės. Ląstelės, ką tik išskirtos iš gyvų audinių, vadinamos pirmine kultūra. Paprastai
tai yra heterogeninė ląstelių masė, pasižyminti specifinėmis, tam tikram audiniui būdingomis
savybėmis (Abhisek ir kt., 2013).
Jau kelis dešimtmečius imortalizuotos navikinių ląstelių linijos yra pasiekiamas ir lengvai
naudojamas biologinis modelis naviko biologijos ir galimo antinavikinių vaistų veiksmingumo
tyrimams. Tačiau daug tyrimų parodė, kad šios ląstelių linijos prastai atstoja įvairovę,
heterogeniškumą ir vaistams atsparių navikų susiformavimo priežastį Michel ir kt., 2000). Išvedama
trumpalaikė kultūra iš pirminių ląstelių, išskirtų iš solidinio naviko, gali būti naudojama ir įgijo
didelę svarbą kaip modelis personalizuotoje medicinoje (Abhisek ir kt., 2013).
1.1 pav. Pirminio naviko mikroaplinka. Modifikuota pagal Upreti, Jyoti ir Sethi, 2013.
Pirminio naviko mikroaplinką sudaro naviko ląstelės, apsuptos normaliomis epitelinėmis
ląstelėmis, mezenchiminėmis kamieninėmis ląstelėmis, endotelinėmis kamieninėmis ląstelėmis ir
įvairiomis iš kaulų čiulpų kilusiomis ląstelėmis. Heterogeninių ląstelių buvimas, signalinės
11
molekulės, ekstraląstelinis užpildas ir mechaniniai ženklai, skatinantys neoplastines transformacijas
naviko mikroaplinkoje, palaiko naviko augimą ir invazyvumą (1.1 pav.) (Schwartz ir kt., 2012;
Liotta ir kt., 2001).
Dauguma krūties naviko tyrimų atliekami naudojant jau sukurtas krūties naviko ląstelių
linijas kaip in vitro modelius. Kaip alternatyvą šioms linijoms, galima naudoti pirmines ląstelių
kultūras, išskirtas iš krūties naviko audinio. Genetiškai pakeistos naviko ląstelių linijos in vitro
sąlygomis neatstoja tikrosios klinikinės situacijos. Be to, skirtingų pacientų atsakas į tuos pačius
vaistus prieš navikus, kurie genetiškai yra tapatūs, skiriasi [6]. Gali būti sunku suprasti genetinius ir
epigenetinius milijonų pacientų skirtumus iš kelių navikinių ląstelių linijų. Taigi, skirtingas
klinikinis atsakas į antinavikinius vaistus ir nuo pacientų priklausoma navikų įvairovė yra esminis
dalykas, vedantis į personalizuotą mediciną (Abhisek ir kt., 2013).
Tai skatina vystyti metodus pirminių navikinių ląstelių kultūrų išvedimui ir kultivavimui,
kad pasiektume didesnį efektyvumą naviko gydymo procese. Pirminio naviko ląstelių kultūrų
modelis turi keletą pranašumų - ląstelės yra izoliuojamos tiesiai iš naviko, be to, duomenys apie
patologiją leidžia palyginti kultūros ir pirminio naviko ląstelių charakteristiką (Tveit ir kt., 1981).
Pirminės ląstelių kultūros geriausiai atitinka in vivo situacijų eksperimentinius modelius, ir
jos gali išreikšti charakteristikas, kurių nematyti dirbtinai išaugintose ląstelių linijose (Abhisek ir
kt., 2013).
1.2. Ląstelių heterogeniškumas navike
Įvairios naviko ląstelės gali turėti skirtingą morfologiją ir fenotipą, įskaitant ir ląstelės
morfoflogiją, genų raišką, metabolizmą, judėjimą, proliferaciją ir metastazavimo potencialą
(Marusyk ir kt., 2009). Šį reiškinį galima matyti ne tik tarp skirtingų navikų ląstelių, bet ir tarp to
paties naviko ląstelių (Almendro ir kt., 2013). Toks naviko ląstelių heterogeniškumas sukelia
sunkumų ieškant veiksmingo gydymo metodo. Tyrimai, atliekiami ląstelių heterogeniškumo
supratimui ir apibūdinimui gali padėti suprasti ligos atsiradimo ir progresavimo priežastis
(Almendro ir kt., 2013). Naviko heterogeniškumas pastebėtas leukemijos (Campbell ir kt., 2008),
krūties (Shipitsin ir kt. 2007), prostatos (MacIntosh ir kt., 1998; Alvarado ir kt., 2005; Konishi ir
kt., 1995), smegenų (Heppner, 1984), galvos ir kaklo (Califano ir kt., 1996), šlapimo pūslės (Sauter
ir kt., 1995), storosios žarnos (Gonzalez-Garcia ir kt., 2002; Samowitz ir Slattery, 1999; Giaretti ir
kt., 1996), liposarkomos (Horvai ir kt., 2009) ir ginekologinių navikų (Fujii ir kt., 2000) ląstelėse.
Genetiniai ir epigenetiniai skirtumai tarp naviko ląstelių to paties naviko viduje gali
paaiškinti, kodėl kai kurios naviko ląstelės išlieka net baigus gydymą. Skirtingos klonų populiacijos
heterogeniškame navike gali turėti skirtingą jautrumą citotoksiniams vaistams. Tai yra siejama su
12
sąveika tarp klonų, ji gali slopinti arba keisti gydymo poveikį, o tai sukelia sunkumų heterogeniškų
navikų ir jų metastazių sėkmingam terapiniam gydymui. Tokiam navikui gydyti naudodami
citotoksinį vaistą nužudysime didžiąją populiaciją naviko ląstelių, tačiau kelios, atsparios
naudojamam vaistui išgyvens, kurios vėlau pradės daugintis ir užaugins naują naviką klonų
evoliucijos būdu. Toks naujas navikas yra heterogeniškas ir atsparus pirminiam vaistui bei gali būti
daug agresyvesnis (Zellmer ir Zhang, 2014). Dėl atsparumo vaistams yra atsakingos ir naviko
kamieninės ląstelės, kurioms reikia specifiškai kamienines ląsteles veikančio vaisto, nes įprasti
vaistai nužudo įprastas naviko ląsteles, o likusios kamieninės suformuoja naują naviką, kuris yra
heterogeniškas ir turi atsparumą ne tik pirminiam vaistui (1.2. pav.) (Markman ir kt., 2013).
1.2 pav. Du pagrindiniai naviko atsparumo vaistams mechanizmai: A paveikslėlyje parodyta kaip
populiacija 3 yra visiškai sunaikinama, o populiacija 4 yra dominuojanti navike, kuri atsinaujina; B paveikslėlyje pavaizduota heterogeninė naviko ląstelių populiacija su kamieninėmis ląstelėmis, po gydymo išlieka tik kamieninės ląstelės, kurios po tam tikro laiko sugeba sukurti buvusias ląstelių
populiacijas. Modifikuota pagal Markman ir kt., 2013.
Naviko heterogeniškumui paaiškinti yra remiamasi dviem modeliais – klonų evoliucijos ir
naviko kamieninių ląstelių (1.3. pav.) (Shackleton ir kt., 2009).
Klonų evoliucijos modelis pirmą kartą buvo pasiūlytas 1976 m. (Nowell ir kt., 1976). Pagal
šį modelį navikas susiformuoja iš vienos mutavusios ląstelės, kuri progresuodama kaupia
papildomas mutacijas. Šie pokyčiai duoda pradžią papildomų subpopuliacijų atsiradimui, kurios turi
gebėjimą toliau dalintis ir mutuoti. Toks heterogeniškumas gali padėti atsirasti subklonams, kurie
turi pranašumą prieš kitas navike esančias ląsteles ir šie subklonai bėgant laikui tampa
dominuojančiais naviko mikroaplinkoje (Swanton, 2012; Merlo ir kt., 2006). Šis modelis padeda
13
suprasti naviko augimą, nepasisekimą gydyme ir naviko agresyvumą, kuris atsiranda naviko
formavimosi procese (1.3 pav. A) (Swanton, 2012).
1.3 pav. Naviko ląstelių gebėjimas formuoti naviką pagal klonų evoliucijos (A) ir kamieninių ląstelių modelius (B). Modifikuota pagal Magee ir kt., 2012.
Naviko kamieninių ląstelių modelis teigia, kad naviko populiacijoje yra tik nedidelė grupė
ląstelių, kurios geba formuoti naviką. Jos vadinamos naviko kamieninėmis ląstelėmis ir pasižymi
gebėjimu atsinaujinti ir diferencijuotis į naviko neformuojančias ląsteles. Naviko ląstelių
heterogeniškumas tam pačiam navike yra aiškinamas skirtingų ląstelių susidarymu iš naviko
kamieninių ląstelių. Kamieninių ląstelių pakitimai dažnai sukelia epigenetinius pokyčius, tačiau taip
pat gali atsirasti ir dėl kamieninių ląstelių populiacijos klonų evoliucijos, kai genetinės mutacijos
kaupiasi kamieninėse ląstelėse ir jų palikuonyse (1.3 pav. B) (Shackleton ir kt., 2009).
1.3. Naviko kamieninės ląstelės
Naviko kamieninės ląstelės turi pagrindines atsinaujinimo, klonų inicijavimo savybes ir
ilgalaikį populiacijos atkūrimo potencialą. Naviko kamieninės ląstelės gyvena nišomis, kurios yra
14
anatomiškai skirtingi regionai naviko mikroaplinkoje. Šios nišos išlaiko pagrindines navikinių
kamieninių ląstelių savybes, išsaugo fenotipinį plastiškumą, apsaugoja nuo imuninės sistemos ir
palengvina metastazavimą (Plaks ir kt., 2015).
Kamieninės ląstelės padarė pagrindą daugybei klausimų apie vystymosi biologiją. Žmogus
vystosi pagal iš anksto nustatytą planą, kuris paverčia apvaisintą kiaušinėlį į sudėtingą daugialąstį
organizmą. Apvaisintas kiaušinėlis vystosi į totipotentinių ląstelių kamuolėlį, kurios vėliau vystosi į
tris gemalo sluoksnius: endodermą, ektodermą ir mezodermą. Šie trys primityvūs ląstelių tipai
vystosi į visus suaugusio kūno audinius. Audiniai, kuriuose atsiranda piktybiniai dariniai, tokie kaip
kraujas, smegenys, krūtys, oda ir kiti gyvybiniai organai turi ląstelių hierarchiją su maža audiniui
specifinių kamieninių ląstelių populiacija, atsakinga už vystymąsi ir audinių priežiūrą, kad žmogus
gyventų (Lobo ir kt., 2007).
Keli svarbūs tyrimai privedė prie hipotezės, kad naviko kamieninės ląstelės gali būti
atsakingos už naviko augimą ir išlikimą. Pirmiausia, daugybė navikų atsiranda iš vienos ląstelės, bet
ne visos ląstelės navike yra identiškos. Tai taip pat yra žinoma kaip naviko heterogeniškumas.
Navike yra daugybė skirtingų naviko ląstelių tipų, kai kurios iš jų yra navikinės, kai kurios
infiltruotos naviko neformuojančios ląstelės, kurios manoma padeda naviko ląstelėms augti. Beja,
navikai atsiranda iš vienos transformuotos ląstelės, o navikinės ląstelės navike gali rodyti skirtingus
fenotipus, kurie šiek tiek primena normalų audinį iš kurio yra kilusios (pvz.: įvairi morfologija,
specifinių baltymų raiška, kurie būdingi subrendusioms arba nesubrendusioms to organo ląstelėms)
bei turi besikeičiantį proliferacijos potencialą (Park ir kt., 1971).
1.4 pav. Naviko kamieninės ląstelės ir terapija. Modifikuota pagal
http://www.eurostemcell.org/factsheet/cancer-disease-stem-cells
15
Jei terapiniai vaistai nužudo didžiąją dalį naviko ląstelių, tačiau naviko kamieninės ląstelės
išlieka, jos pradeda dalintis ir tampa naviko atsinaujinimo priežastimi (1.4 pav.) (Magee ir kt.,
2012).
1.4. Navikinių ląstelių žymenys
Duomenų apie pirminių krūties naviko ląstelių fenotipą yra mažai. Dažniausiai tiriama
naviko ląstelių CD24- ir CD44+ žymenų raiška (Ricardo ir kt., 2011), taip pat KI67 proliferacijos
žymens raiška (Gerdes ir kt., 1991), tačiau kitų ligos vystymuisi reikšmingų žymenų tyrimų atlikta
nedaug.
1.4.1. CD24 ir CD44 diferenciacijos antigenai
Žmogaus krūties navikuose esti nedidelė dalis ląstelių populiacijos, kuri turi kamieninėms
ląstelėms būdingų požymių. Šios ląstelės, vadinamos kamieninėmis naviko ląstelėmis. Jos geba
diferencijuotis į skirtingų tipų ląsteles, atsinaujinti bei formuoti navikus ksenografiniame modelyje,
pvz.: pelės organizme (Al-Hajj ir kt., 2003). Šios ląstelės apibūdinamos kaip turinčios CD44
antigeno ir neturinčios CD24 antigeno arba turinčios jo nedaug (CD44+/CD24-) (Naor ir kt., 2008;
Ponta ir Herrlich, 2003).
CD24 – viengrandis transmembraninis glikoproteinas (Fang ir Tang, 2010). Jis veikia kaip
specifinis hialiurono rūgšties receptorius, skatinantis naviko neformuojančių ląstelių judėjimą
(Baumann ir kt., 2005). CD24 žymens raiška pasižymi hematopoetinės, nervinio audinio, epitelinės,
raumenų, kasos ir kitos ląstelės bei įvairių tipų naviko ląstelės. CD24 raiška siejama su
invazyvumu, mobilumu ir padidėjusia navikinių ląstelių proliferacija (Rostoker ir kt., 2015).
Svarbus žymuo krūties navikinėse ląstelėse yra ir transmembraninis glikoproteinas CD44
(Sneath ir Mangham, 1998). Šis baltymas yra susijęs su ląstelių proliferacija, judėjimu ir
diferenciacija bei dalyvauja daugelyje viduląstelinių signalų perdavimo pakopų, (Adamia ir kt.,
2005). Skirtingos CD44 formos randamos daugelyje normalių žmogaus organizmo ląstelių, ypač
epiteliniuose ir hematopoetiniuose audiniuose (Stamenkovic ir kt., 1991). Tiek in vitro tiek in vivo
tyrimai parodė, kad CD44 yra aktyvus krūties naviko ląstelėse, o naviko neformuojančiose krūties
audinio ląstelėse jis neaktyvus (Yang ir kt., 2015). Slopinant šį baltymą yra skatinama ląstelių
proliferacija, todėl amnoma, kad CD44 yra būdingas naviko kamieninėms ląstelėms (Pham ir kt.,
2011). CD44 žymuo taip pat reikalingas kamieninių naviko ląstelių įsitvirtinimui tolesniuose
audiniuose (Zoller, 2011).
16
1.4.2. Ki67 proliferacijos žymuo
KI67 – nehistoninis branduolio baltymas (Gerdes ir kt., 1991), kuris naudojamas kaip
ląstelių proliferacijos žymuo, nes šis baltymas aptinkamas visose ląstelės ciklo fazėse, išskyrus G0,
kai ląstelė nesidalija (Jonat ir Arnold, 2011). Dar nėra žinomos tikslio Ki67 baltymo funkcijos, bet
nustatyta, kad jis reikalingas ląstelės dalijimuisi (Ross ir Hall, 1995).
KI67 nustatomas atliekant imunohistocheminį naviko audinio arba imunocitocheminį
fiksuotų ląstelių tyrimą (van Dierendonck ir kt., 1989; Cuzick ir kt., 2011), o rezultatai vertinami
apskaičiuojant ląstelių, kurių branduolyje aptinkamas šis žymuo, procentą (Munzone ir kt., 2012;
Aleksandarany ir kt., 2011). Skirtingos ląstelės ciklo fazės pasižymi nevienoda KI67 raiška – šio
baltymo gali būti tiek branduoliuose bei branduolėliuose. Skiriasi ir dažymosi intensyvumas –
pastebimas skirtingas grūdelių ar dėmelių dydis bei kiekis (Stathopoulos ir kt., 2014).
Ki67 baltymo raiška normaliame krūties audinyje nėra didelė – siekia vos 3 % (Harper-
Wynne ir kt., 2002; Clarke ir kt., 1997). Įprastai krūties naviko ląstelės pasižymi ganėtinai aukšta
Ki67 raiška, šio žymens aptinkama nuo 20 iki 100 % ląstelių (Subik ir kt., 2010), o Ki67 raiška
daugumoje pirminių navikų yra mažesnė nei 15 % (Inwald ir kt., 2013). Didelė Ki67 raiška siejama
su prasta ligos prognoze bei geru atsaku į chemoterapiją (Urruticoechea ir kt., 2005).
1.4.3. Fibroblastų aktyvavimosi baltymas α (FAB)
Fibroblastų aktyvavimo baltymas α (FAB) – ląstelių paviršiaus glikoproteinas, priklausantis
serino proteazių šeimai ir pasižymintis peptidaziniu aktyvumu (Shi ir kt., 2012). Ištirta, kad FAB
yra svarbus naviko mikroaplinkai. FAB laikomas su naviku susijusių fibroblastų žymeniu
(Christiansen ir kt., 2013; Liu ir kt., 2015).
Šio baltymo sunku aptikti sveikuose suaugusio žmogaus audiniuose, tačiau didele jo raiška
pasižymi audinių persitvarkymo sritys: embrioniniai audiniai, navikai, kepenų ir plaučių fibrozės
bei kt. (Hamson ir kt., 2014). FAB gali būti aptinkamas ir pačiose navikinėse ląstelėse ir naviko
stromoje (Zhang ir kt., 2015; Shi ir kt., 2012). FAB nustatytas krūties naviko ląstelėse (Shi ir kt.,
2012) bei kasos navikinių ląstelių linijose (Fang ir kt., 2010; Baumann ir kt., 2005). Manoma, kad
didelė FAB raiška įvairių tipų navikuose gali būti susijusi su padidėjusia metastazių limfmazgiuose
formavimosi tikimybe bei prasta ligos prognoze (Jis ir kt., 2014).
Taip pat manoma, kad šį baltymą galima aptikti su naviku susijusiuose leukocituose (Peng ir
kt., 2013). Parodyta, kad FAB svarbus naviko augimui ir angiogenezei, be to, FAB raiškos
sumažinimas naviko ląstelėse skatina ląstelių apoptozę bei kolageno skaidulų kaupimąsi (Lai ir
Wang, 2012).
17
1.5. Naviko slopikliai
Viena iš didžiausių problemų klinikiniame antinavikinių vaistų pritaikyme yra navikinių
ląstelių gebėjimas tapti atsparioms daugybei vaistinių preparatų. Išmėginama nemažai naujų ir jau
žinomų antinavikinių vaistų ir jų derinių siekiant atrasti didžiausią poveikį įvairioms navikinėms
ląstelėms turintį būdą (Lu ir kt., 2015).
1.5.1. Salinomicinas
Salinomicinas – monokarboksirūgšties polieterio antibiotikas, išskirtas iš Streptomyces
albus, kurio pagrindinis taikinys navike – navikinės kamieninės ląstelės. Tačiau mechanizmas,
kuriuo jis veikia, dar nėra gerai apibūdintas (Verdoodt ir kt., 2012). Šio antibiotiko gebėjimas
specifiškai žudyti lėtai proliferuojančias navikines kamienines ląsteles daug efektyviau nei
diferencijuotas navikines ląsteles net ir mažomis koncentracijomis privedė prie tyrimų naudojant
dažniausiai sutinkamus chemoterapinius preparatus kartu su salinomicinu (Fuchs ir kt., 2009;
Florian ir kt., 2014). Salinomicinas ir jo dariniai pasižymi stipriu antiproliferaciniu poveikiu prieš
vaistams atsparias navikinių ląstelių linijas. Šis antibiotikas sukelia mitochondrijų disfunkciją,
ląstelinio ATP koncentracijos sumažėjimą ir autofagiją (Naujolat ir Steinhart, 2012; Florian ir kt.,
2014).
Buvo nustatyta, kad mažos salinomicino koncentracijos skatina krūties naviko kamienines
ląsteles keisti fenotipą į navikines epitelines ląsteles, o didelės šio preparato koncentracijos sukelia
ląstelių apoptozę (Gunasinghe ir kt., 2012). Ląstelių perėjimas iš mechenchiminių į epitelines
(MET, angl. mesenchymal-epithelial transition) yra paremtas mezenchiminių savybių praradimu ir
epitelinio fenotipo įgijimu. Šie procesai gali slopinti navikinių ląstelių progresiją ir invaziją į
supančią mikroaplinką. Tokie pokyčiai stabdo krūties naviko progresavimą ir metastazavimą, už
kurį būtent ir yra atsakingos navikinės kamieninės ląstelės (Dianbo ir kt., 2011; Hyunsook ir kt.,
2015).
Nustatyta, kad salinomicinas gali potencialiai efektyviausiai veikti nusitaikydamas į krūties
naviko kamienines ląsteles per STAT3 (signalo daviklis ir transkripcijos 3 aktyvatorius) geno
slopinimą (Koddapully ir kt., 2014; Peibin ir Turkson, 2009).
1.5.2. Antimicinas A
Antimicinas A (AMA) yra stiprus priešgrybelinis preparatas, randamas simbiotinėse
Streptomyces kitazawensis bakterijose. AMA tiesiogiai veikia ląstelių mitochondrijas. Jis yra
mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso slopiklis, slopina sukcinato ir NADH oksidazę.
Oksidaciniame fosfirilinime elektronų transporto grandinėje veikia kaip ubikvinolio oksidacijos ir
mitochondrijų elektronų transporto tarp citochromų b ir c slopiklis. Pagal AMA gebėjimą sutrikdyti
18
mitochondrijų funkciją, šis antibiotikas buvo išmėgintas kaip potencialus antinavikinis preparatas
(Yong ir kt., 2008; Mohamad ir kt., 2015). Neseniai buvo nustatyta, kad AMA gali stabdyti plaučių
naviko ląstelių proliferaciją, sukeldamas oksidacinį stresą. Įdomiausia tai, kad AMA buvo įvardytas
kaip vienas iš efektyviausių junginių kovoje prieš navikines kamienines ląsteles (Chi-Tai ir kt.,
2013)
1.5.3. Natrio fenilbutiratas
Natrio fenilbutiratas (PBA) – histono diacetilazės slopiklis (HDACI). Tai aromatinė riebalų
rūgštis, in vivo oksiduojama į fenilacetatą β-oksidacijos būdu. Žmoguje taip susidaręs fenilacetatas
yra pašalinamas konjugacija su glutaminu susidarant fenacetilglutaminui, kuris yra išskiriamas su
šlapimu (Seisuke ir kt., 2012).
Natrio fenilbutirato gebėjimas slopinti histono diacetilazę padaro jį efektyviu preparatu
kovojant prieš naviką, kuris gali sukelti ląstelių diferenciaciją per chromatino modifikacijas ir genų
raiškos reprogramavimą. Tyrimuose in vitro buvo nustatyta, kad PBA turi potencialų antinavikinį
efektą, slopina navikinių ląstelių augimą ir diferenciaciją įvairiose žmogaus naviko ląstelėse
(pavyzdžiui storosios žarnos karcinomoje, Burkito limfomoje, pirminėje ūminėje mieloidinėje
leukemijoje, retinoblastomoje, prostatos navike ir kt.) (Dyer ir kt., 2002). Rezultatai parodė, kad
PBA efektyviai veikia skirtingus naviko tipus: hormonams atsparų prostatos naviką, hematologinį
piktybinį naviką, aukšto laipsnio astrocitomą, krūties karcinomą ir t.t. (Reynolds ir kt., 2000).
1.6. Hipertermija
Hipertermija – nauja terapija, turinti didelį potencialą, kaip pagalbinė naviko gydymo
priemonė. Vokietijoje hipertermija dar vadinama „onkotermija“ bei dešimtmečius naudojama kartu
su chemoterapija ir radioterapija. Taikoma aukštesnė nei 39°C temperatūra sukelia svarbius
metabolinius pokyčius naviko ląstelėse bei padaro jas labiau pažeidžiamas įprastiniu gydymu (Noh
ir Myoung, 2014; Sugaharu ir Tsutomu, 2008; Bettaieb ir kt., 2013).
Kaip veikia hipertermija? Šilumos taikymas sukelia svarbius metabolinius pokyčius naviko
ląstelėse, įskaitant ir baltymų denatūraciją bei agregaciją, dėl to sukeliamas ląstelės areštas ir
baltymų sintezės inaktyvacija (1.5 pav.) (Lepock ir James, 2005). Šiluma taip pat sukelia ląstelės
membranos pralaidumo pokyčius ir pasireiškia sumažėjusiu ląstelinio ATP kiekiu (Richter ir kt.,
2010; Sonna ir Larry, 2002). Naviko ląstelių branduolių baltymai yra ypač jautrūs hipertermijai
(Sugaharu ir Tsutomu, 2008). Šiluma naviko ląstelėms sukelia nemažai streso ir įvykę metaboliniai
pokyčiai padaro jas labiau jautrias chemoterapijai bei radioterapijai (Bettaieb ir kt., 2013; Van Der
Zee, 2002; Van Der Zee, 2008).
Pagrindinis visų standartinių naviko gydymo terapijų tikslas yra kuo efektyviau pažeisti
19
navikines ląsteles. Yra žinoma, kad hipertermijos taikymas sukelia pakitusioms ląstelėms nemažai
streso. Streso, sukelto hipertermijos ir chemoterapijos ar radioterapijos, kombinacija naviko
ląstelėms yra neįveikiama. Hipertermija ir kitos terapijos kartu veikia sinergistiškai, todėl toks
gydymo taikymas pacientams su solidiniais navikais, kuriems jau taikoma chemoterapija arba
radioterapija turėtų būti potencialiai apsvarstytas.
Chemoterapijai naudojami vaistai dažnai būna toksiški ne tik naviko ląstelėms, bet ir
sveikoms. Naviko ląstelėms blogiau sekasi tvarkytis su aukštesne temperatūra, nes jos yra labai arti
viena kitos, o normalios ląstelės yra geriau išsidėsčiusios erdvėje, todėl jos geriau paskirsto šilumą.
Keletas tyrimų parodė, kad naviko ląstelės yra labiau pažeidžiamos šiluma, nei normalios ląstelės
(Babbs ir kt., 1980).
1.5 pav. Hipertermijos sukeliami procesai ląstelėje. Modifikuota pagal
http://yaletownnaturopathic.com/loco-regional-hyperthermia
Chemoterapijai naudojami vaistai dažnai būna toksiški ne tik naviko ląstelėms, bet ir
sveikoms. Naviko ląstelėms blogiau sekasi tvarkytis su aukštesne temperatūra, nes jos yra labai arti
viena kitos, o normalios ląstelės yra geriau išsidėsčiusios erdvėje, todėl jos geriau paskirsto šilumą.
Keletas tyrimų parodė, kad naviko ląstelės yra labiau pažeidžiamos šiluma, nei normalios ląstelės
(Sugaharu ir Tsutomu, 2008; Babbs ir kt., 1980). Hipertermija yra citotoksiška naviko ląstelėms ir
gali sinergistiškai citotoksiškai veikti kartu su chemoterapija.
20
Reaktyviosios deguonies formos (ROS) yra didelio reaktyvumo molekulės, kurios naikina
DNR ir kitus svarbius elementus naviko ląstelėse. Dauguma chemoterapinių vaistų veikia būtent
generuodami ROS, kurios ir naikina šias nesustabdomai augančias ląsteles. Aukšta temperatūra
padidina biocheminių reakcijų lygį, bendras efektas ląstelėms – pagreitėjęs ląstelių metabolizmas.
Tai aktualu pacientams, kuriems taikoma chemoterapija, nes pagreitėjęs ląstelių metabolizmas
sukelia svarbų ROS padidėjimą ir oksidacinį stresą (Moryyama-Gonda, 2000; Katschinski ir
Dorthe, 1999; Bettaieb ir kt., 2008). Hipertermijos taikymas padidina reaktyvių deguonies formų
generaciją, pvz.: vandenilio peroksidai, superoksidai. Aukšta temperatūra padaro šias molekules
netgi labiau reaktyvias (Lord-Fontaine ir kt., 1999). Bendras aukštesnės temepratūros efektas yra
svarbus ROS susidarymo ir aktyvumo padidėjimas naviko ląstelėse.
Vienas iš didžiausių iššūkių chemoterapijoje – efektyviai vaistu pasiekti naviką. Navikai
prastai aprūpinami krauju, nes ląstelės yra labai arti viena kitos. Dažnai tik mažas procentas
chemoterapijai naudojamų vaistų iš tiesų patenka į naviką (Drummond ir Daryl, 1999). Kai bet
kuris audinys žmogaus organizme yra šildomas, sukeliamas kraujagyslių išsiplėtimas. Šildant
naviką, padidinamas kraujo tiekimas į naviką, todėl vaistas daug efektyviau patenka į piktybinį
darinį. Tai ypač svarbu pacientams, kuriems išsivystę solidiniai navikai, nes hipertermija padidina
vaisto patekimo į naviką efektyvumą.
Chemoterapija dažnai susilpnina imuninę sistemą, o tai yra didelė problema, nes stipri
imuninė sistema būtina nugalėti navikui. Chemoterapija ar radioterapija nebus efektyvios, jei
imuninė sistema nebus pajėgi sutvarkyti metabolinę netvarką. Aukštos temperatūros taikymas
stimuliuoja įvairius imuninės sistemos elementus (Bogovic, 2001). Yra žinoma, kad aukšta
temperatūra pagreitina imuninių ląstelių migraciją prie taikinio ir padidina jų aktyvumą kovojant
prieš naviko ląsteles (Hiraga ir kt., 2011).
21
2. MEDŽIAGOS IR METODAI
2.1. Naudotos medžiagos
Ląstelių auginimui buvo naudota Dulbeco modifikuota Eagle terpė (DMEM), krūties naviko
ląstelių auginimui buvo naudota DMEM/Ham‘s F12 (1:1) terpė. Naudoti terpių priedai: fetalinis
veršelio serumas (FVS), penicilinas/streptomicinas (P/S). Prilipusių ląstelių monosluoksnio
suardymui buvo naudotas 0,025% tripsino EDTA tirpalas (Sigma Aldrich, Vokietija).
Ląstelių gyvybingumo įvertinimui naudotas tripano mėlis (Biochrom AG, Vokietija).
Tyrimuose naudoti fluorescenciniai dažai – bis Benzimide trihydrochloride HOECHST 33342
(Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Šveicarija).
Ląstelių išskyrimui iš biopsinės medžiagos buvo naudota III tipo kolagenazė (150 U/ml),
(Sigma-Aldrich, JAV).
Imunocitochemijai buvo naudoti pirminiai antikūnai Ki67, CD24, CD44 ir FAB ir antrinis
AlexaFluor 488 Green.
Tyrimuose naudoti slopikliai: salinomicinas (Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Izraelis),
antimicinas A (Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Izraelis) ir natrio fenilbutiratas (Sigma-Aldrich
Chemie Gmbh, Jungtinės Amerikos Valstijos). Ląstelės buvo auginamos vienkartiniuose auginimo induose ląstelių kultūroms ir Petri
lėkštelėse, imunocitocheminiams tyrimams ląstelės augintos 24 šulinėlių plokštelėse su
dengiamaisiais stikleliais, o kolonijų formavimo analizei ;ąste;ės augintos 12 šulinėlių plokštelėse.
Ląstelių gyvybingumui įvertinti fluorescenciniu metodu, jos buvo auginamos 96 šulinėlių
plokštelėse juodu dugnu (Greiner, Vokietija).
2.2. Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų išskyrimas iš naviko
Krūties naviko pirminės ląstelių kultūros buvo paruoštos iš dalies navikinio audinio
biopsijos medžiagų, paimtų iš LSMU pacienčių.
Ląstelės buvo išskiriamos dviem būdais: 1) Navikinio audinio biopsijos pavyzdys ląstelėms
išskirti užpilamas 1 ml 0,025 % tripsino tirpalu ir perkeliamas į 15 ml mėgintuvėlį. Mėginiai 60 min
laikomi kratytuve (37 °C, 350 rpm), po to 5 min centrifuguojami (420 g). Supernatantas nupilamas,
o likusi medžiaga perkeliama į indelį ląstelių kultūroms auginti ir užpilama 4 ml auginimo terpės,
paruoštos iš DMEM, 10 % FVS ir 1 % P/S.
2) Navikinio audinio biopsijos pavyzdys ląstelėms išskirti buvo paveiktas 1 mg/ml
kolagenaze (tipas III) ir 0,025 % tripsino tirpalu. Mėginys susmulkinamas, padalinamas į du
22
mėgintuvėlius ir centrifuguojamas 5 min (420 g). Supernatantas nupilamas, o ant likusios
medžiagos užpilama 1 ml tripsino arba III tipo kolagenazės tirpalo. Mėginiai 60-čiai minučių
perkeliami į kratytuvą (37 °C, 350 rpm), po to 5 min centrifuguojami (420 g). Supernatantas
nupilamas, o likusi medžiaga užsėjama į indelius ląstelių kultūroms auginti su augimo terpe
(DMEM/Ham’s F12, 10 % FVS, 100 U/ml penicilino - 100µg/ml streptomicino) ir inkubuojama
37°C drėgnoje 5 % CO2 atmosferoje.
Po 24 val. visos negyvos ir neprilipusios ląstelės pašalinamos. Augimo terpė keičiama
kiekvieną dieną, kol prilipusios ląstelės pasiekia 90 % konfluenciją. Susiformavus ląstelių
monosluoksniui, ląstelių kultūros persėjamos 1–2 kartus per savaitę. Tyrimams naudojamos ne
didesnio nei 10 pasažo pirminės ląstelių kultūros.
2.3. Tyrimams naudotų navikinių ir naviko neformuojančių ląstelių auginimas
Navikinių ląstelių kultūros buvo auginamos DMEM/Ham‘s F12 terpėje (1:1), praturtintoje
10 % FVS ir antibiotikais (100 U/ml penicilino, 100 µg/ml streptomicino). Naviko neformuojančios
ląstelės auginamos DMEM terpėje, papildytoje tokiomis pačiomis koncentracijomis FVS ir
antibiotikais.
Ląstelės kultivuojamos persėjant jas esant 70 – 80 % konfluencijai.
2.4. Ląstelių proliferacijos įvertinimas fluorescenciniu metodu, naudojant
Hoechst 33342
Prieš dažant ląstelės vieną kartą nuplaunamos DMEM terpe. Ant nuplautų ląstelių
užpilama terpė be serumo, kurioje Hoechst 33342 koncentracija 4 µg/ml ir inkubuojama 37°C
drėgnoje 5 % CO2 atmosferoje 45 min. Po praėjusio laiko, ląstelės tris kartus plaunamos
fiziologiniu tirpalu. Hoechst 33342 dažo fiksuotas ir gyvas ląsteles. Fluorescencija nustatoma
fluorimetru Fluoroskan Ascent™ Microplate Fluorometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Jungtinės
Amerikos Valstijos). 96 šulinėlių plokštelėje juodu dugnu matavimai atliekami esant sužadinimo
355±10 nm ir emisijos - 460±10 nm bangos ilgiams (atliekami mažiausiai 3 kiekvieno pavyzdžio
matavimai 100 µl ląstelių suspensijos 3x104 ląst./ml). Matuojant fluorescenciją, įvertinamas PBS
buferio fonas.
23
2.5. Kolonijų formavimo arba klonogeninė analizė
Ląstelės sėjamos į 12 šulinėlių plokšteles po 100 ląstelių į šulinėlį, sekančią dieną ląstelės
veikiamos slopikliais, kurie keičiami kas trečią dieną, po 5-10 parų ląstelės fiksuojamos 15 min 4 %
paraformaldehido tirpalu ir dažomos kristalo violetu. Nudažytos ląstelės fotografuojamos ir
skaičiuojamas kolonijų kiekis ir plotas (tikra kolonija laikoma tokia, kuri susideda iš daugiau nei 50
ląstelių).
2.6. Navikinių ląstelių žymenų (CD24, CD44, KI67 ir FAB) nustatymas
imunocitocheminiu metodu
Ląstelių suspensijos išsėjamos į 24 šulinėlių ląstelių auginimo plokštelę su dengiamaisiais
stikliukais dugne augimo terpėje DMEM/Ham‘s F12 su 10 % FVS, 100 U/ml penicilino ir 100
µg/ml streptomicino. Po 24 h nupilama augimo terpė, ląstelės kartą plaunamos kambario
temperatūros PBS tirpalu, fiksuojamos 15 min 4 % paraformaldehidu, po to tris kartus plaunamos
PBS. Ląstelės permeabilizuojamos 15 min. 0,2 % Triton X-100/PBS ir blokuojamos 1 % JSA/PBS
tirpalu vieną valandą.
Pirminiai antikūnai paruošiami su 1 % JSA tirpalu tokiu santykiu 1:20 (triušio polikloninis
antikūnas prieš FAB) arba 1:30 (pelės monokloninis antikūnas CD24, triušio polikloninis antikūnas
CD44, pelės monokloninis antikūnas KI67). Ląstelės su antikūnais inkubuojamos 1 val. 37 °C
temperatūroje. Po pirminio antikūno veikimo mėginiai penkis kartus plaunami JSA/PBS tirpalu.
Antrinis ožkos polikloninis antikūnas prieš pelės imunoglobulinus ar asilo polikloninis antikūnas
prieš triušio imunoglobulinus, konjuguoti su Alexa Fluor 488 dažu veikia ląsteles santykiu 1:125 su
JSA/PBS tirpalu. Plokštelė įdedama į vandens vonelę ir inkubuojama 30 min 37 °C. Po inkubacijos
dengiamieji stikleliai tris kartus plaunami JSA/PBS tirpalu ir vieną kartą PBS tirpalu. Dengiamieji
stikleliai su paruoštomis ląstelėmis nusausinami ir ant objektinio stiklelio užlašinama tvirtinimo
terpės su DAPI („Vectashield“, JAV). Stikliukai klijuojami prie objektinio stiklelio. Pavyzdžiai
analizuojami motorizuotu invertuotu mikroskopu Olympus IX81 (Olympus, Japonija).
2.7. Ląstelių invazyvumo tyrimas „žaizdos gijimo“ metodu
Ląstelių invazyvumas buvo tiriamas “žaizdos gijimo” metodu. Ląstelės šiam metodui
auginamos iki 90 % konfluencijos ant plonadugnių lėkštelių, tada monosluoksnis perbraukiamas
steriliu 10 µl pipetės antgaliu. Ląstelės plaunamos šviežia terpe ląstelių nuolaužoms
pašalinti. Ląstelių gebėjimas užpidyti įbraižą įvertintas apskaičiuojant procentinę užpildytą ląstelių
24
dalį įbraižoje. Vaizdai laike fiksuojami 10 val. 37 °C temperatūroje drėgnoje 5 % CO2 atmosferoje,
naudojant inkubavimo sistemą INUBG2EONICS (Tokai Hit, Shizuoka-ken, Japonija) ant motorinio
Olympus IX81 mikroskopo (Olympus Europe holding Gmbh, Hamburg, Germany), įrengto su x20
DIC imersijos objektyvu prie kurio įmontuotas inkubatorius.
2.8. Fluorescencinės mikroskopijos analizė
Fluorescencinės mikroskopijos nuotraukos darytos invertuotu mikroskopu Olympus IX81
(Olympus Europe holding Gmbh, Hamburgas, Vokietija) su vaizdo analizės sistema Olympus
xcellence 2.0. Naudoti filtrai: žalias (sužadinimui naudotas 470 nm filtras, o emisijai registruoti –
525 nm filtras), mėlynas (sužadinimui naudotas 350 nm filtras, o emisijai registruoti – 470 nm
filtras).
2.9. Statistinė duomenų analizė
Kiekybiniai duomenys pateikiami kaip aritmetiniai vidurkiai ± standartinė paklaida (SE),
apskaičiuoti iš mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų, jei nenurodyta kitaip. Eksperimentinių
duomenų analizė buvo atliekama naudojant SigmaPlot (v10.0) kompiuterinę programą. Duomenų
kitimo patikimumas įvertintas taikant neporinių eksperimentų, dviejų nuokrypių Stjudento t-testą.
Duomenys laikomi statistiškai patikimais, kai P yra mažesnis nei 0,05 (* - p < 0.05).
25
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Naviko žymenų raiška krūties naviko pirminių ląstelių kultūrose
Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų (BC1, BC2, BC4, BC5 ir BC6) būdingų žymenų
CD24, CD44, KI67 ir FAB raiška buvo vertinama darant fluorescencinės mikroskopijos nuotraukas
su invertuotu mikroskopu Olympus IX81 su vaizdo analizės sistema Olympus xcellence 2.0.
Nurodytos ląstelių kultūros buvo sėjamos į 24 šulinėlių plokšteles ant dengiamųjų stikliukų
po 2000 ląstelių į šulinėlį. Po 24 valandų ląstelės dažomos imunocitocheminiu metodu, kaip
nurodyta metodikoje.
3.1 pav. CD24 žymens raiška pirminėse krūties naviko ląstelių kultūrose (didinimas x20)
Visose tirtose krūties naviko pirminėse ląstelių kultūrose nustatyta CD24 žymens raiška (3.1
pav.), tačiau ląstelių, turinčių šį žymenį kiekis kultūrose skiriasi. BC1 ir BC4 ląstelių kultūrose yra
mažiau ląstelių, turinčių CD24 baltymo, nei BC2 ir BC5 ląstelių kultūrose. BC6 ląstelių kultūroje
CD24 žymuo pasiskirstęs visoje ląstelių citoplazmoje.
3.2 pav. CD44 žymens raiška pirminėse krūties naviko ląstelių kultūrose (didnimas x20)
BC1, BC5 ir BC6 kultūrose CD44 žymenį turinčių ląstelių yra daugiausia, šiose ląstelėse šis
žymuo pasiskirstęs po visą ląstelių citoplazmą. BC2 ląstelių kultūroje tokių ląstelių yra mažiau,
negu anksčiau minėtose kultūrose. Dauguma BC4 ląstelių šio žymens neturi, o jį turinčiose ląstelėse
šis baltymas susitelkęs prie branduolio (3.2 pav.). Gautus rezultatus sunku interpretuoti, nes ląstelės
turinčios CD44(+), bet neturinčios CD24(-) vadinamos turinčiomis navikinių kamieninių ląstelių
BC1 BC2 BC4 BC5 BC6
BC1 BC2 BC4 BC5 BC6
26
fenotipą, tačiau BC6 ląstelių kultūroje abiejų žymenų raiška yra gan didelė, todėl galime teigti, kad
ši ląstelių kultūra yra heterogeniška – ląstelės nėra vieno tipo.
3.3 pav. Ki67 žymens raiška pirminėse krūties naviko ląstelių kultūrose (didinimas x10)
Visos tirtos ląstelių kultūros pasižymi didele proliferacijos žymens Ki67 raiška. BC5
kultūroje, ląstelių turinčių šį žymenį yra daugiau, nei kitose ląstelių kultūrose (3.3 pav.). Kultūras
lyginant tarpusavyje, BC6 turi mažiausiai Ki67 proliferacijos žymens.
Krūties naviko pirminių ląstelių kultūros, kaip ir literatūroje aprašytos komercinės krūties
navikų ląstelių linijos, naudojamos eksperimentams, pasižymi didele Ki67 proliferacijos žymens
raiška.
3.4 pav. FAB žymens raiška pirminėse krūties naviko ląstelių kultūrose (didinimas x20)
Iš 3.4 pav. matyti, kad šios ląstelių kultūros yra heterogeniškos: yra tiek FAB raiška
pasižyminčių, tiek šio baltymo neturinčių ląstelių. Su naviku susijusiems fibroblastams būdingo
FAB turinčios ląstelės išsidėsčiusios grupėmis. Dalis BC1, BC2, BC4 ir BC5 ląstelių kultūrų
FAB(+) ląstelių šį baltymą turi tik branduolyje, o kitos ląstelės – ir branduolyje, ir citoplazmoje.
BC6 ląstelių kultūros FAB(+) ląstelėse šis baltymas nustatytas tik branduoliuose.
Visose tirtose ląstelių kultūrose nustatyta FAB turinčių ląstelių, tačiau jų kiekis nedidelis
(iki 10%). Šio baltymo raiška krūties naviko pirminėse ląstelių kultūrose literatūroje nėra aprašyta.
Siekiant tiksliau įvertinti skirtumus tarp BC ląstelių kultūrų, atliktas kiekybinis navikui
būdingų žymenų CD24, CD44, Ki67 ir FAB raiškos tyrimas. Gauti rezultatai (± standartinė
paklaida) pateikti 3.1 lentelėje:
BC1 BC2 BC4 BC5 BC6
BC1 BC2 BC4 BC5 BC6
27
3.1 lentelė. Navikui būdingų žymenų raiška pirminėse krūties naviko ląstelių kultūrose kiekybiškai (%)
CD24 CD44 Ki67 FAB
BC1 24±1,1 64±1,8 89±1,9 7±0,5
BC2 63±2,3 32±1,2 82±7,7 4±1,4
BC4 21±1,7 15±0,8 83±1,1 6±1,2
BC5 59±3,1 73±2,7 98±1,3 2±0,2
BC6 84±4,0 71±1,9 77±5,6 4±0,8
Ištirta, kad BC ląstelių kultūros pasižymi aukšta Ki67 proliferacijos žymens raiška bei turi
navikinėms ląstelėms būdingus (stipriai išreikštus audinių persitvarkymo srityse) su fibroblastais
susijusius baltymus, todėl galima teigti, kad šios ląstelių kultūros yra navikinės.
3.2. Krūties adenokarcinomos MDA-MB-231 ir pirminių naviko ląstelių
kultūrų (krūties naviko – BC1, BC2, BC4, BC5, BC6 ir gerklų karcinomos
LSCC) proliferacijos pokyčiai paveikus slopikliais, fluorescenciniu metodu,
naudojant Hoechst 33342
Įvertintos fluorescencinio metodo, naudojant Hoechst 33342, jautrumo ribos ir atlikti MDA-
MB-231 ląstelių Hoechst 33342 fluorescencijos intensyvumo priklausomybės nuo ląstelių kiekio
tyrimai ląstelių kiekio matavimui (3.5 pav.).
3.5 pav. MDA-MB-231 ląstelių linijos Hoechst 33342 fluorescencijos priklausomybė nuo ląstelių
skaičiaus
y = 2.933x + 1.412R² = 0.967
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25
Fluo
resc
enci
ja, s
.f.v.
Ląstelių skaičius, x103
28
Gauti rezultatai (3.5 pav.), kad Hoechst 33342 fluorescencijos intensyvumas patikimai
priklauso ląstelių kiekio esant ir mažai ir didelei ląstelių koncentracijai. Gautas koreliacijos
koeficientas 0,967 parodo, kad ląstelių skaičius patikimai atitinka Hoechst 33342 fluorescencijos
intensyvumą .
MDA-MB-231 ir krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų (BC1, BC2, BC4, BC5 ir BC6) bei
pirminių gerklų plokščiųjų ląstelių karcinomos LSCC ląstelių proliferacijos pokyčiai paveikus
slopikliais (100 nM salinomicinas, 10 µM antimicinas A ir 100 µM natrio fenilbutiratas) buvo
vertinami fluorescenciniu metodu, ląstelių branduolius dažant Hoechst 33342. Duomenų
išsibarstymą galima paaiškinti tuo, kad pirminės krūties naviko ląstelių kultūros tiriamos atlikus tik
keletą persėjimų, todėl šios ląstelės labiau atitinka naviko savybes, joms būdingos ląstelių
subpopuliacijos – piktybiniame darinyje gali būti su naviku susijusių fibroblastų ar mezenchiminių
(kamieninių) ląstelių, tai gali lemti svarbius ląstelių fenotipo pokyčius ir sukelti sunkumų
interpretuojant gautus tyrimų rezultatus.
Aukščiau nurodytos ląstelės buvo sėjamos į 96 šulinėlių fluorescencijos matavimams skirtas
plokšteles, 3x103/100 µl koncentracija. Po 24 val. DMEM/Ham‘s F12 (MDA-MB-231 ir BC) arba
DMEM (LSCC) terpė keičiama į paruoštą terpę su atitinkama slopiklio koncentracija. Praėjus 48 ir
72 val., atliekami matavimai fluorimetru prie sužadinimo 355±10 nm ir emisijos - 460±10 nm
bangos ilgių.
3.6 pav. MDA-MB-231 ląstelių proliferacija pagal Hoechst 33342 fluorescencijos intensyvumą po
48 (A) ir 72 valandų (B) slopiklių poveikio (n=3)
Po 48 val. poveikio slopikliais, MDA-MB-231 kontrolinių ląstelių proliferacija buvo beveik
5 kartus didesnė, nei ląstelių, paveiktų salinomicinu, o antimicinas A ir natrio fenilbutiratas mažino
ląstelių proliferaciją 4 kartus.
Po 72 val. poveikio slopikliais, didžiausią neigiamą efektą MDA-MB-231 ląstelių
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
K Sal AMA PBA
Fluo
resc
enci
ja, s
.f.v.
A
***
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
K Sal AMA PBA
Fluo
resc
enci
ja, s
.f.v.
B
*
*
29
proliferacijai turėjo antimicinas A (~50 %), o salinomicinas ląstelių proliferaciją paskatino 40 %
(3.6 pav.).
3.7 pav. Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų proliferacija pagal fluorescencijos intensyvumą, po
48 valandų slopiklių poveikio (n=3)
Praėjus 48 eksperimento valandoms buvo stebimas didelis rezultatų išsibarstymas. Atliktų
eksperimentų su BC1, BC2 ir BC4 ląstelių kultūromis rezultatus sunku įvertinti proliferacijos
sumažėjimą ar padidėjimą. BC5 ląstelių kultūros proliferaciją mažino visi slopikliai, didžiausias
neigiamas efektas pasiektas naudojant salinomiciną – proliferacija sumažėjo ~86 %. BC6 ląstelių
kultūros proliferaciją taip pat mažino visi naudoti slopikliai, natrio fenilbutiratas proliferaciją
sumažino net ~90 % (3.7 pav.).
3.8 pav. Krūties naviko pirminių ląstelių kultūrų proliferacija pagal fluorescencijos intensyvumą, 72
val. po slopiklių poveikio (n=3)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
BC1 BC2 BC4 BC5 BC6
Fluo
resc
enci
ja, s
.f.v.
K
Sal
AMA
PBA
* * *
***
0
5
10
15
20
25
30
35
40
BC1 BC2 BC4 BC5 BC6
Fluo
resc
enci
ja, s
.f.v.
KSalAMAPBA
*
**
**
*
*
*
30
Praėjus 72 val. po poveikio slopikliais, didžiausias efektyvumas visų ląstelių kultūrų
proliferacijos sumažėjimui buvo pasiektas naudojant natrio fenilbutiratą, išskyrus BC1 ląstelių
kultūrą, kuriai patikimo proliferacijos mažinimo negalinme įvertinti dėl didelio rezultatų
išsibarstymo. Salinomicino poveikis BC2 ląstelių kultūros proliferaciją patikimai padidino.
Antimicinas A slopino BC4, BC5 ir BC6 ląstelių augimą (3.8 pav.).
Atlikus proliferacijos tyrim duomenų palyginimui tarp pirminių ląstelių kultūrų ir
komerciškai prieinamų išvestų ląstelių linijų, galima daryti išvadą, kad BC2 ląstelių kultūros atsakas
į naudotų slopiklių poveikį yra panašus į MDA-MB-231 atsaką – praėjus 48 eksperimento
valandoms, naudoti slopikliai šių ląstelių priliferaciją mažina, o po 72 eksperimento valandų,
salinomicinas jų proliferaciją skatina, o antimicinas A slopina.
3.9 pav. LSCC ląstelių proliferacija pagal Hoechst 33342 fluorescencijos intensyvumą po 48 (A) ir
72 val. (B) slopiklių poveikio (n=3)
Po 48 val. poveikio slopikliais, LSCC ląstelėms didelį poveikį ląstelių proliferacijos
sumažęjimui turėjo visi naudoti slopikliai (~80 %).
Praėjus 72 val., didžiausią poveikį ląstelių augimui turėjo natrio fenilbutirato poveikis –
proliferacija sumažėjo net ~84 %, paveikus antimicinu A - ~78 %, o salinomicinu - ~55 %
(3.79pav.).
Lyginant slopiklių poveikį priminių krūties ir gerklų navikų ląstelių proliferacijai, nustatyta,
kad jautresnės po 48 ir 72 valandų slopiklių poveikio, yra pirminės gerklų plokščiųjų ląstelių
karcinomos LSCC ląstelės.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
K Sal AMA PBA
Fluo
resc
enci
ja, s
.f.v.
* * *
A
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
K Sal AMA PBA
Fluo
resc
enci
ja, s
.f.v.
**
*
B
31
3.3. Naviko neformuojančių ląstelių linijų proliferacijos pokyčiai paveikus
slopikliais fluorescenciniu metodu, naudojant Hoechst 33342
Naviko neformuojančių ląstelių (ASM, WI38, RMB ir MSC) proliferacija paveikus
slopikliais (100 nM salinomicinas, 10 µM antimicinas A ir 100 µM natrio fenilbutiratas) buvo
vertinama fluorescenciniu metodu, ląstelių branduolius dažant Hoechst 33342.
Aukščiau nurodytos ląstelės buvo sėjamos į 96 šulinėlių plokšteles juodu dugnu, 3x103/100
µl koncentracija. Po 24 valandų DMEM terpė keičiama į paruoštą terpę su atitinkama slopiklio
koncentracija. Praėjus 48 ir 72 val., atliekami matavimai fluorimetru prie sužadinimo 355±10 nm ir
emisijos - 460±10 nm bangos ilgių.
3.10 pav. Naviko neformuojančių ląstelių proliferacija pagal fluorescencijos intensyvumą, veikiant
slopikliais 48 valandas (n=3)
Naviko neformuojančių ląstelių linijoms didžiausią poveikį po 48 val. poveikio slopikliais
turėjo antimicinas A – sumažino RMB ir ASM ląstelių proliferaciją, tačiau wi38 ir MSC ląstelių
proliferacijos šis slopiklis nemažino. RMB ląstelių proliferaciją salinomicinas mažino tik keliais
procentais, natrio fenilbutiratas patikimo poveikio šių ląstelių proliferacijai neturėjo. Paveikus MSC
ląsteles nurodytais slopikliais, nebuvo stebimas ląstelių proliferacijos slopinimas. ASM ląstelių
proliferaciją paveikė visi naudoti slopikliai – salinomicinas jų augimą sumažino ~20 %, natrio
fenilbutiratas apie ~34 %, o antimicinaas A net ~77 % (3.10 pav.).
05
10152025303540
wi38 RMB MSC ASM
Fluo
resc
enci
ja, s
.f.v.
KSalPBAAMA
*
*
**
*
*
*
**
*
32
3.11 pav. Naviko neformuojančių ląstelių proliferacija pagal fluorescencijos intensyvumą, veikiant
slopikliais 72 valandas (n=3)
Praėjus 72 slopiklių poveikio valandoms, salinomicinas ir natrio fenilbutiratas reikšmingo
poveikio naviko neformuojančių ląstelių proliferacijai neturėjo, o antimicinas A RMB, MSC ir
ASM ląstelių proliferaciją mažino. Fibroblastų augimo naudoti slopikliai neveikė reikšmingu
pokyčiu (3.11 pav.).
3.4. Hipertermijos ir navikinių slopiklių poveikis krūties naviko ląstelių
proliferacijai
Pirminių krūties naviko ląstelių kultūrų (BC2 ir BC5), krūties adenokarcinomos MDA-MB-
231 ir krūties duktalinė karcinomos MCF-7 ląstelių proliferacija, paveikus hipertermija bei naviko
slopikliais buvo vertinama fluorescenciniu metodu, ląstelių branduolius žymint Hoechst 33342.
Aukščiau nurodytos ląstelės buvo sėjamos į 96 šulinėlių plokšteles, juodu dugnu, po 3000
ląstelių į šulinėlį. Po 24 val. plokštelė ląstelių įjautrinimui temperatūra įdedama 5 valandoms į
inkubatorių, kuriame temperatūra 40 °C, po 5 valandų DMEM/Ham‘s F12 terpė keičiama į paruoštą
terpę su atitinkama slopiklio koncentracija ir plokštelė dedama į normalią 37 °C temperatūrą.
Praėjus 48 val., atliekami matavimai fluorometru prie sužadinimo 355±10 nm ir emisijos - 460±10
nm bangos ilgių.
0
10
20
30
40
50
60
wi38 RMB MSC ASM
Fluo
resc
enci
ja, s
.f.v.
KSalPBAAMA*
**
33
3.12 pav. BC2, BC5, MDA-MB-231 ir MCF-7 ląstelių proliferacija po 5 val. poveikio hipertermija
ir 48 val. poveikio slopikliais (n=3)
Ląstelės 5 valandas 40 °C temperatūroje buvo laikomos siekiant jas įjautrinti, tam, kad
pasiekti efektyvesnį slopiklių poveikį ląstelių proliferacijos slopinimui. Buvo gautas ir netikėtas
hipertermijos efektas, ląsteles paveikus 40°C temperatūra 5 val., kai kuriais atvejais stebėtas
didesnis ląstelių atsparumas slopiklių poveikiui. Abiem atvejais, paveikus ląsteles minėtais
veiksniais, buvo pasiektas skirtingas efektas su skirtingoms ląstelių linijoms. Po 48 val. slopiklių
poveikio, BC2 ląstelių kultūros proliferacija paveikus jas antimicinu A buvo patikimai mažesnė,
negu ląstelių, paveiktų abiem veiksniais. BC5 ląstelių proliferacija patikimai padidėjo lyginant su
kontrolinėmis ląstelėmis paveikus 5 val. hipertermija, antimicinas A ląstelių prioliferaciją taip pat
mažino. MDA-MB-231 ląstelių proliferaciją sumažino ir slopikliai ir hipertermija, tačiau naudojant
natrio fenilbutiratą buvo stebėta didesnė proliferacija naudojant abu veiksnius. MCF-7 ląstelių
proliferaciją hipertermija patikimai didino, kaip ir paveikus natrio fenilbutiratu bei hipertermja, o
naudojant vien antimiciną A bei su hipertermja buvo stebimas proliferacijos sumažėjimas beveik
perpus (3.12 pav).
3.5. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 gyvybingumo ir kamieniškumo įvertinimas
pagal kolonijų formavimo testą, paveikus slopikliais
Pirminių krūties naviko ląstelių kultūrų (BC2 ir BC5) bei krūties adenokarcinomos MDA-
MB-231 ląstelių gyvybingumas ir kamieniškumas paveikus navikiniais slopikliais buvo vertinamas
kolonijų formavimo testu. Kolonijų formavimo arba klonogeninė analizė yra in vitro ląstelių
gyvybingumo analizė, pagrįsta vienos ląstelės gebėjimu formuoti koloniją. Ląstelė identiškų
ląstelių, t.y. klonų, koloniją formuoja dalindamasi.
0
10
20
30
40
50
60
BC2 BC5 MDA-MB-231 MCF-7
Fluo
resc
enci
ja, s
.f.v. K
K+TSalSal+TAMAAMA+TPBAPBA+T
**
*
***
*
*
**
**
*
34
Aukščiau nurodytos ląstelės buvo sėjamos į 12 šulinėlių plokšteles, maža (100 ląstelių/
šulinėlį) koncentracija. Po 24 val. DMEM/Ham‘s F12 terpė keičiama į paruoštą terpę su atitinkama
slopiklio koncentracija (slopikliai keičiami kas antrą dieną) ir po 5, 7 ir 10 parų ląstelės fiksuojamos
paraformaldehidu, dažomos kristalo violetu ir skaičiuojamos kolonijos.
Kolonijų kiekio bei ploto skaičiavimai atliekami dviem skirtingais būdais: 1) naudojant
SynGene GBox įrangą, nuotraukos darytos Genesys vaizdinimo programine įranga, analizuotos
GeneTools analizės programa (3.13 pav.); 2) darant nuotraukas invertuotu mikroskopu Olympus
IX81 ir atliekant analizę Olympus xcellence 2.0 vaizdo analizės sistema (3.14 pav.).
3.13 pav. Ląstelių kolonijų skaičiavimo pavyzdys, naudojant GeneTools analizės programą, raudona spalva automatiškai pažymimas kolonijos plotas, geltonai – kolonija, kaip vnt.
3.14 pav. Ląstelių kolonijų skaičiavimo pavyzdys, naudojant Olympus xcellence 2.0 analizinę programą, kolonijos apvedamos mechaniškai, suskaičiuojamas jų kiekis, o pagal nustatytą mąstelį
automatiškai apskaičiuojamas kolonijų plotas
35
3.15 pav. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 ląstelių kiekis veikiant slopikliais 7 paras pagal kolonijų formavimo testą (A – skaičiavimai atlikti su Olympus xcellence 2.0 vaizdo analizės sistema,, B –
skaičiavimai atlikti su GeneTools analizės programa), n=3
Ląstelių kolonijų kiekio bei ploto analizė buvo atlikta abiem analizės metodais, praėjus 7
eksperimento paroms. Didžioji dalis rezultatų koreliuoja, o nekoreliuojančių rezultatų priežastis gali
būti žmogiškasis faktorius, duomenis apdorojant Olympus xcellence 2.0 vaizdo analizės sistema,
kolonijas apibrėžiant mechaniškai (3.15 pav.).
Vertinant ląstelių kolonijų plotą abiem analizės metodais, stebėta geresnė koreliacija tarp
aptartų rezultatų (3.16 pav.)
3.16 pav. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 bendras ląstelių plotas veikiant slopikliais 7 paras pagal kolonijų formavimo testą (A – skaičiavimai atlikti su Olympus xcellence 2.0 vaizdo analizės
sistema, rezultatai pateikti mm2, B – skaičiavimai atlikti su GeneTools analizės programa, rezultatai pateikti procentais (%)), n=3
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
BC2 BC5 MDA-MB-231
Kol
onijų
kie
kis,
vnt.
* *
**
0
10
20
30
40
50
60
70
BC2 BC5 MDA-MB-231
KSalAMAPBA
**
**
*
*
0
20
40
60
80
100
120
BC2 BC5 MDA-MB-231
Kol
onijų
ben
dras
plo
tas,
mm
2
*
* *
*
*
0
5
10
15
20
25
30
35
BC2 BC5 MDA-MB-231
Kol
onijų
ben
dras
plot
as, %
K
Sal
AMA
PBA*
*
**
*
A
36
3.2 lentelė. BC2, BC5 ir MD
A-M
B-231 ląstelių gyvybingumas ir kam
ieniškumas pagal kolonijų form
avimo testą,
paveikus slopikliais 5, 7 ir 10 parų, n=3 (žalia spalva pažymėtas patikim
as gyvybingumo m
ažinimas, raudona –
didinimas)
37
Kolonijų formavimo analizės duomenys buvo analizuojami GeneTools analizės programa po 5,
7 ir 10 eksperimento parų.
BC2 kolonijų kiekio ir ploto mažėjimas praėjus 5 eksperimento paroms buvo stebimas po
antimicino A ir natrio fenilbutirato poveikio, BC5 ląstelių kolonijų kiekį ir bendrą plotą sumažino visi
naudoti slopikliai. MDA-MB-231 ląstelių kolonijų formavimąsi sumažino antimicinas A ir natrio
fenilbutiratas, o salinomicinas padidino šių ląstelių kolonijų bendrą plotą.
Po 7 eksperimento parų buvo stebimas BC5 ląstelių kolonijų kiekio padidėjimas po
salinomicino ir natrio fenilbutirato poveikio, o MDA-MB-231 ląstelių kolonijų kiekį antimicinas A
sumažino. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 ląstelių kolonijų bendrą plotą sumažino antimicino A poveikis,
o BC5 ląstelių kolonijų plotą salinomicinas padidino ~7%.
Po 10 eksperimento parų kolonijų kiekio mažinimas BC2 ir MDA-MB-231 ląstelėms pasiektas
naudojant antimiciną A. Visų ląstelių bendrą kolonijų plotą efektyviai mažino antimicino A poveikis, o
BC2 ir MDA-MB-231 kolonijų plotą mažino ir natrio fenilbutiratas.
Apie ląstelių kamienškumą galima spręsti iš gebėjimo formuoti kolonijas, nes tai yra metodas
ne tik apibūdinantis ląstelių gyvybingumą, dėl vienos ląstelės gebėjimo formuoti klonus. Šis metodas
gali apibūdinti skirtingo fenotipo ir biologinių savybių ląsteles, tokias kaip kamieninės ir naviko
kamieninės ląstelės. Vertinant šių trijų linijų kontrolinių ląstelių gebėjimą formuoti kolonijas,
kamieniškiausiomis ląstelėmis galima vadinti MDA-MB-231, kurios pagal literatūroje aprašomus
duomenis turi kamieninių ląstelių fenotipą (Hiraga ir kt., 2011). Vertinant pirmines ląstelių kultūras
BC2 ir BC5, kamieniškesnėmis galima vadinti BC2 dėl didesnio gebėjimo formuoti kolonijas
(3.2 lentelė).
3.6. Naviko slopiklių poveikis kriūties naviko ląstelių judėjimui
Ląstelių judėjimo tyrimai buvo atlikti su krūties adenokarcinomos MDA-MB-231 bei pirmine
krūties naviko ląstelių kultūra BC2. Šios ląstelės per trumpą laiką puikiai suformuoja monosluoksnį
(apie 90 % konfluenciją).
Sutrikimai ląstelių judėjimo procese gali turėti rimtų pasekmių, tokių kaip naviko formavimasis
ir metastazavimas.
3.17 paveikslėlyje pateiktas pavyzdys, kaip skaičiuojamas ląstelių plotas įbraižoje.
38
3.17 pav. Ląstelių judėjimo įvertinimas “žaizdos gijimo” metodu. A – raudona spalva apvestas plotas žymi tuščią plotą po ką tik atliktos įbraižos; B – žalia spalva pavaizduotas ląstelių užpildytas plotas po
5 arba 10 val.
Literatūroje aprašytuose salinomicinu paveiktų ląstelių judėjimo greičio tyrimuose buvo
naudojamos palyginus didelės salinomicino koncentracijos, todėl negalima vertinti jo poveikio
judėjimo slopinimui, tokiais atvejais reikėtų įvertinti nespecifinį citotoksiškumą (Dong ir kt., 2011;
Kusunoki ir kt., 2013; Lieke ir kt., 2012).
Kontrolinės ląstelės po atliktos įbraižos praėjus 5 val., užėmė apie 45 % ploto „žaizdoje“, tai yra
net tris kartus daugiau nei antimicinu A ir salinomicinu paveiktų ląstelių užimamas plotas (~15 %).
Natrio fenilbutiratu paveiktos ląstelės įbraižoje užėmė dvigubai mažiau ploto nei kontrolinės ląstelės
(~23 %).
Po 10 val. kontrolinės ląstelės įbraižoje užėmė ~74 % „žaizdos“ ploto, o tai yra 1,5 karto
daugiau nei ląstelės, paveiktos salinomicinu. Antimicino A ir natrio fenilbutirato poveikis pasireiškė du
kartus mažesniu užimamu plotu, nei kontrolinių ląstelių, ląstelės užėmė ~38 % ir ~39 % įbraižos ploto
(3.18 pav.).
BC2 ląstelės, paveiktos salinomicinu po įbraižos praėjus 5 val. užėmė didesnį plotą, o
antimicinu A paveiktos ląstelės užėmė perpus mažesnį plotą lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis.
Natrio fenilbutiratu paveiktos ląstelės „žaizdoje“ užėmė ~28 % ploto.
Po įbraižos praėjus 10 val., kontrolinės ląstelės ir salinomicinu paveiktos ląstelės užėmė
vienodą plotą įbraižoje (~86 %). Antimicino A poveikis pasireiškė du kartus mažesniu užimamu plotu,
nei kontrolinių ląstelių, o PBA paveiktų ląstelių užimtas plotas buvo ~58 % (3.19 pav.).
A B
39
3.18 pav. MDA-MB-231 ląstelių judėjimas, paveikus slopikliais 5 ir 10 val.
3.19 pav. BC2 ląstelių judėjimas, paveikus slopikliais 5 ir 10 val.
Po naviko slopiklių naudojimo nustatytas sumažėjęs ląstelių judėjimo greitis, lyginant su
kontrolinių ląstelių judėjimu. Sumažėjęs navikinių ląstelių judrumas parodo ir sumažėjusį naviko
invazyvumą į kitus audinius, todėl tai yra labai svarbus kriterijus vertinant naviko savybes ir kovojant
0 10 20 30 40 50 60 70 80
K
Sal
AMA
PBA
Ląstelių užimtas plotas įbraižoje, %
10 h
5h
*
0 20 40 60 80 100
K
Sal
AMA
PBA
Ląstelių užimtas plotas įbraižoje, %
10h5h
*
*
40
su onkologiniais susirgimais. Naviko ląstelės gali keisti judėjimo mechanizmus kaip atsaką į
pasikeitusias sąlygas, pavyzdžiui paveikus slopikliais (Krakhmal ir kt., 2015).
41
3.7. Rezultatų apibendrinimas
Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis kiekvienais metais užregistruojama apie 14
mln., o Lietuvoje nacionalinio vėžio instituto duomenimis kasmet apie 17000 naujų onkologinių
susirgimų atvejų. PSO nurodo, jog kiekvienais metais nuo naviko miršta daugiau nei 8 mln. žmonių.
Nors žinoma vis daugiau apie naviko išsivystymo veiksnius, tikslūs mechanizmai iki šiol nėra iki galo
ištirti. Mirštamumas dėl onkologinioų susirgimų yra tiesiogiai susijęs su išplitimo laipsniu ir metastazių
atsiradimu. Dėl genetinių ir epigenetinių bei morfologinių naviko ląstelių skirtumų, sunku rasti vaistą
ar būdą gydymui, tinkantį visiems onkologinių ligų atvejams. Atliekant eksperimentus su pirminėmis
naviko ląstelių kultūromis, siekiama rasti efektyviausią būdą gydyti onkologiniams susirgimams, nes
tokios ląstelės labiau atspindi navikų įvairovę ir heterogeniškumą.
Pirminės krūties naviko ląstelių kultūros buvo tirtos atlikus tik keletą persėjimų, todėl šios
ląstelės labiau atitinka naviko savybes ir gali būti panaudotos kaip ligos modelis. Nors pirminės ląstelių
kultūros laikui bėgant keičia fenotipą, o tai sukelia sunkumų interpretuojant gautus tyrimų rezultatus,
tačiau šios ląstelės labiau atitinka naviko mikroaplinkos modelį ir gali būti panaudotos personalizuotos
medicinos vystymui.
Siekiantt apibūdinti pirmines naviko ląstelių kultūras, buvo atlikta kiekybinė ir kokybinė
navikui būdingų žymenų analizė. Visose tirtose BC ląstelių kultūrose nustatyta CD24 žymens raiška,
tačiau jo kiekis kultūrose skiriasi – mažiausia šio žymens raiška pasižymi BC4 ląstelės. BC1, BC5 ir
BC6 ląstelių kultūrose CD44 žymenį turinčių ląstelių yra daugiausia. Visos tirtos ląstelių kultūros, kaip
ir dažnai eksperimentams naudojamos krūties naviko ląstelių linijos pasižymi didele proliferacijos
žymens Ki67 raiška. BC ląstelių kultūros yra heterogeniškos – yra tiek FAB raiška pasižyminčių, tiek
šio baltymo neturinčių ląstelių.
Darbe naudoti slopikliai turi skirtingus veikimo mechanizmus ir veikia įvairius ląstelių tipus.
Nors tikslus salinomicino veikimo mechanizmas nėra nustatytas, tačiau žinoma, kad jis specifiškai
veikia naviko kamienines ląsteles įvairiuose žmogaus navikuose (manoma kad per wnt, mTOR arba
STAT3 kelius) taip pat nustatyta, kad jis geba keisti naviko kamieninių ląstelių fenotipą į naviko
epitelines ląsteles, kai ląstelės veikiamos mažomis salinomicino koncentracijomis. Naudojant šį vaistą,
atlikta daugybė tyrimų su įvairiais navikais, tačiau būtini ir tolimesni tyrimai, išsiaiškinti tiksliam jo
veikimui ir galimam pritaikymui klinikoje. Antimicinas A yra mitochondrijų „nuodas“ ir nors jo
veikimo mechanizmas žinomas, tačiau neseniai šis preparatas įvardytas kaip potencialus naviko
kamieninių ląstelių slopiklis. Kol kas atlikta nedaug tyrimų, naudojant antimiciną A, dėl nustatyto jo
42
citotoksinio poveikio naviko neformuojančioms ląstelėms. Literatūroje aprašyti tyrimai tik su plaučių
naviko ląstelėmis. Buvo parodyta, kad antimicino A naudojimas mažina šių ląstelių proliferaciją, tačiau
su kitais navikais tyrimų dar neatlikta. Trečiasis naudotas slopiklis – natrio fenilbutiratas, tai histono
diacetilazės slopiklis. Remiantis literatūra, būtent dėl šios savybės išmėgintas kaip vaistas gydyti
onkologiniams susirgimams. Atlikta nemažai tyrimų su krūties ir prostatos navikais, naudojant PBA,
tačiau su pirminėmis kultūromis tyrimų dar neatlikta. Būtent dėl šios priežasties šis preparatas buvo
pasirinktas, įvertinti jo poveikį ne išvestoms komercinėms ląstelių linijoms, o informatyvesniam
modeliui – ląstelėms, išskirtoms iš pirminio naviko.
Siekiant palyginti poveikį tarp pirminių ląstelių kultūrų ir komerciškai prieinamų išvestų
ląstelių linijų, buvo atliktas pirminių krūties naviko ląstelių kultūrų ir MDA-MB-231 slopiklių poveikio
ląstelių proliferacijai tyrimas. Pagal gautus rezultatus, galima daryti išvadą, kad BC2 ląstelių kultūros
atsakas į naudotų slopiklių poveikį yra panašus į MDA-MB-231 atsaką – praėjus 48 eksperimento
valandoms, naudoti slopikliai šių ląstelių priliferaciją mažina, o po 72 eksperimento valandų,
salinomicinas jų proliferaciją skatina, o antimicinas A slopina. Taip pat atlikome kito audinio naviko
pirminių ląstelių proliferacijos tyrimą – pirminių gerklų plokščiųjų ląstelių karcinomos (LSCC) ląstelių
atsako į naudotus slopiklius tyrimą. Po 48 val. poveikio slopikliais LSCC ląstelėms, didelį ir panašų
poveikį ląstelių proliferacijos sumažęjimui turėjo visi naudoti slopikliai (~80 %), o po 72 val.,
didžiausią poveikį ląstelių augimui turėjo natrio fenilbutiratas – proliferacija sumažėjo net ~84 %,
paveikus antimicinu A - ~78 % ir salinomicinu - ~55 % . Įvertinus gautus tyrimų rezultatus, galima
daryti išvadą, kad jautresnės, nei pirminės krūties naviko ląstelių kultūros, po 48 ir 72 valandų
slopiklių poveikio yra LSCC ląstelės.
Įvertinus duomenis, gautus atlikus fluorescencinę BC ir naviko neformuojančių ląstelių
proliferacijos analizę, galime spręsti, kad didžiausią poveikį visoms BC ląstelių kultūroms pagal
fluorescencijos intensyvumą, praėjus 48 ir 72 val. po slopiklių poveikio, turėjo natrio fenilbutiratas, o
naviko neformuojančias ląsteles labiausiai paveikė antimicinas A, išskyrus fibroblastus.
Salinomicinas pirminėms krūties naviko ląstelių kultūroms po 48 val. veikimo turi proliferaciją
mažinantį poveikį, o praėjus 72 val. šios ląstelių kultūros auga sparčiau net už kontrolines ląsteles.
Mažos salinomicino koncentracijos turi gebėjimą keisti navikinių kamieninių ląstelių fenotipą į
navikines epitelines ląsteles (MET, ang. mesenchymal-epithelial transition) (Kopp ir kt., 2014), o
didelės koncentracijos sukelia ląstelių apoptozę, todėl manoma, kad būtent ši antibiotiko savybė
atsakinga už ląstelių augimo paskatinimą, nors žinoma, kad kamieninės ląstelės yra atsakingos už
naviko metastazavimą (dėl jų agresyvumo ir invazyvumo), o epitelinių navikinių ląstelių dalijimosi
greitis yra mažesnis, tačiau jos nėra nužudomos salinomicinu. Navikinės kamieninės ląstelės yra
43
esminė priežastis, kodėl naviko gydymas būna neveiksmingas arba liga pasikartoja, nes įprasti vaistai
nenužudo kamieninių ląstelių (kurių navike būna iki 10 % (Yakisich, 2012)) (Park ir kt., 2014;
Visvader ir Lindeman, 2008; Li ir Laterra, 2012). Kadangi antimicinas A yra potencialus preparatas
naikinti navikinėms kamieninėms ląstelėms, tačiau jis turi toksinį poveikį, naviką gydyti būtų galima
įprastiniais vaistais, o likusias kamienines ląsteles įveikti naudojant būtent antimiciną A (kaip
citotoksinį vaistą) arba salinomiciną (Lu ir kt, 2015).
Įjautrinus ląsteles 5 val. 40 °C temperatūra, pasiekti efektyvesniam slopinančiam slopiklių
poveikiui ląstelių proliferacijai, ląstelės parodė net didesnį atsparumą slopiklių poveikiui. 48 val.
veikiant ląsteles slopikliais, BC2 kultūros ląstelių proliferacija, paveikus jas antimicinu A, buvo net
patikimai mažesnė, nei paveikus šias ląsteles hipertermija ir antimicinu A. BC5 ląstelių proliferacija
patikimai padidėjo lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis vien paveikus 5 val. hipertermija, antimicinas
A suveikė taip pat, kaip ir BC2 ląstelių proliferacijai. MDA-MB-231 ląstelių proliferaciją sumažino ir
slopikliai ir hipertermija, tačiau naudojant natrio fenilbutiratą buvo stebėta didesnė proliferacija
naudojant ir slopiklį ir hipertermiją. MCF-7 ląstelių proliferaciją hipertermija patikimai padidino, kaip
ir paveikus natrio fenilbutiratu bei hipertermja, o naudojant antimiciną A su hipertermija ir be jos buvo
stebimas proliferacijos sumažėjimas beveik perpus.
Kolonijų formavimo analizės duomenys po 5, 7 ir 10 parų parodė, kad patikimas BC2 kolonijų
kiekio ir ploto mažinimas praėjus 5 eksperimento paroms buvo stebimas po antimicino A ir natrio
fenilbutirato poveikio, BC5 ląstelių kolonijų kiekio formavimąsi ir bendrą plotą patikimai sumažino
visi naudoti slopikliai. MDA-MB-231 ląstelių kolonijų kiekio formavimąsi sumažino antimicinas A
(sumažino ir bendrą kolonijų plotą) ir natrio fenilbutiratas, o salinomicinas padidino šių ląstelių
kolonijų bendrą plotą. Po 7 eksperimento parų buvo stebimas patikimas BC5 ląstelių kolonijų kiekio
padidėjimas po salinomicino ir natrio fenilbutirato poveikio, o MDA-MB-231 ląstelių kolonijų kiekį
antimicinas A patikimai sumažino. BC2, BC5 ir MDA-MB-231 ląstelių kolonijų bendrą plotą
patikimai sumažino antimicino A poveikis, o BC5 ląstelių kolonijų plotą salinomicinas padidino ~7%.
Po 10 eksperimento parų patikimas kolonijų kiekio sumažinimas pasiektas naudojant antimiciną A BC2
ir MDA-MB-231 ląstelėms. Visų ląstelių bendrą kolonijų plotą efektyviai mažino antimicino A
poveikis, o BC2 ir MDA-MB-231 kolonijų plotą sumažino ir natrio fenilbutiratas.
Vertinant šių trijų linijų kontrolinių ląstelių gebėjimą formuoti kolonijas, kamieniškiausiomis
ląstelėmis galima vadinti MDA-MB-231, kurios pagal literatūroje aprašomus duomenis turi kamieninių
ląstelių fenotipą. Lyginant pirminių ląstelių kultūrų BC2 ir BC5 gebėjimą formuoti kolonijas nesant
išorinių dirgiklių, kamieniškesnėmis galima vadinti BC2 dėl didesnio kolonijų ploto ir kiekio, nei BC5
ląstelių kultūros.
44
Atlikus MDA-MB-231 ir BC2 ląstelių invazyvumo tyrimą „žaizdos gijimo“ metodu, MDA-
MB-231 ląstelės, nepaveiktos slopikliais, po 5 val. judėjimo tyrimo užėmė apie 45 % žaizdos ploto, tai
yra net tris kartus daugiau nei antimicinu A ir salinomicinu paveiktų ląstelių užimamas plotas. Natrio
fenilbutiratu paveiktos ląstelės „žaizdoje“ užėmė dvigubai mažiau ploto nei kontrolinės ląstelės (apie
23 % ploto). Po 10 val. kontrolinės ląstelės užėmė apie 74 % „žaizdos“ ploto, o tai yra 1,5 karto
daugiau nei ląstelės, paveiktos salinomicinu. Antimicino A ir natrio fenilbutirato poveikis pasireiškė du
kartus mažesniu užimamu plotu, nei kontrolinių ląstelių ( ląstelės užėmė ~38 % ir 39~ %) įbraižos
ploto.
BC2 ląstelės, veiktos salinomicinu po 5 val. judėjimo tyrimo užėmė didesnį plotą, nei
kontrolinės ląstelės, o antimicinu A paveiktos ląstelės užėmė perpus mažesnį plotą lyginant su
kontrolinėmis ląstelėmis. Natrio fenilbutiratu paveiktos ląstelės užėmė apie 28 % įbraižos ploto. Po 10
val., kontrolinės ląstelės ir salinomicinu paveiktos ląstelės užėmė vienodą plotą žaizdoje (~86 %).
Antimicino A poveikis pasireiškė du kartus mažesniu užimamu plotu, nei kontrolinių ląstelių, o natrio
fenilbutiratu paveiktų ląstelių užimtas plotas buvo ~58 %.
Atlikti tyrimai parodė, kad skirtingų pacientų navikai skiriasi genetiškai ir fenotipiškai, nes
pastebėtas skirtingas atsakas į naudotų slopiklių poveikį. Siekiant gauti tikslesnius rezultatus, reikėtų
atlikti genetinius tyrimus, išsiaiškinti tam tikrų genų raišką tarp skirtingų pirminių naviko ląstelių
kultūrų prieš ir po slopiklių naudojimo.
45
IŠVADOS
1. Pirminės ląstelių kultūros, išskirtos iš krūties naviko yra heterogeniškos – pasižymi CD24,
CD44, Ki67 ir FAB žymenų raiška, tačiau žymenį turinčių ląstelių kiekis kultūrose skiriasi. Nustatyta,
kad mažiausiai ląstelių turinčių CD24 žymens yra BC4 ląstelių kultūroje. BC1, BC5 ir BC6 kultūrų
ląstelės turi daugiau CD44 žymens, nei BC2 ir BC ląstelių kultūros. Ki67 proliferacijos žymens
turinčių ląstelių daugiausia rasta BC5 ląstelių kultūroje, o FAB baltymo kiekis BC kultūrų ląstelėse
nesiekia 10 %.
2. Palyginus naudotų slopiklių poveikį pirminėms ląstelių kultūroms (BC) ir išvestai ląstelių linijai
(MDA-MB-231), nustatėme, kad BC2 ląstelių kultūros atsakas į naudotų slopiklių poveikį yra panašus
kaip ir MDA-MB-231 ląstelėms – praėjus 48 eksperimento valandoms, visi naudoti slopikliai šių
ląstelių proliferaciją mažina. Po 72 eksperimento valandų, salinomicinas paskatino BC2 ir MDA-MB-
231 ląstelių proliferaciją, o antimicinas A slopino. Atliktas kito audinio naviko pirminių ląstelių
(LSCC) proliferacijos tyrimas parodė, kad po 48 ir 72 val. poveikio slopikliais, ląstelių proliferaciją
mažina visi naudoti slopikliai. Gauti rezultatai parodė, kad LSCC ląstelės yra jautresnės, nei pirminės
krūties naviko ląstelių kultūros, po poveikio 48 ir 72 val. slopikliais. Didžiausias neigiamas poveikis
RMB ir ASM ląstelių proliferacijai buvo stebėtas paveikus šias ląsteles 48 val. antimicinu A, tačiau
wi38 ir MSC ląstelių proliferacijos šis slopiklis nemažino. Praėjus 72 val. po poveikio slopikliais,
salinomicinas ir natrio fenilbutiratas reikšmingo poveikio naviko neformuojančių ląstelių proliferacijai
neturėjo.
3. Įjautrinimas hipertermija (5 val., 40 °C) sukėlė BC2 ir MCF-7 ląstelių proliferacijos didėjimą.
Buvo nustatyta, kad įjautrinimas hipertermija neturėjo įtakos slopiklių sukeltiems proliferacijos
pokyčiams tirtose ląstelių linijose.
4. Efektyviausiai BC2, BC5 ir MDA-MB-231 ląstelių gyvybingumą pagal gebėjimą formuoti
kolonijas slopino antimicinas A, mažindamas kolonijų plotą ir kiekį. Slopinantis natrio fenilbutirato
poveikis BC2, BC5 ir MDA-MB-231 ląstelių gyvybingumui buvo stebėtas po 5 ir 10 parų. Po 7 parų
poveikio salinomicinu buvo nustatytas didesnis ląstelių kolonijų kiekis ir plotas BC5 ląstelių kultūroje.
5. Slopinantį efektą MDA-MB-231 ląstelių judėjimo greičiui po 5 ir 10 val. turėjo visi naudoti
slopikliai. BC2 ląstelių judrumą po 5 ir 10 val. AMA ir PBA slopino, o salinomicinas paskatino.
46
LITERATŪRA
1. Ilaria Turin, Roberta Schiavo, Marcello Maestri, Ombretta Luinetti, Barbara Dal Bello, Marco
Paulli, Paolo Dionigi, Marianna Roccio, Arsenio Spinillo, Federica Ferulli, Matteo Tanzi, Rita
Maccario, Daniela Montagna and Paolo Pedrazzoli. In Vitro Efficient Expansion of Tumor Cells
Deriving from Different Types of Human Tumor Samples. Med. Sci. 2014, 2, 70-81.
2. Ochs, R.L.; Fensterer, J.; Ohori, N.P.; Wells, A.; Gabrin, M.; George, L.D.; Kornblith, P.
Evidence for the isolation, growth and characterization of malignant cells in primary cultures of human
tumors. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 2003, 39, 63–79.
3. Burdall SE, Hanby AM, Lansdown MRJ, Speirs V. Breast cancer cell lines: friend or foe?
Breast Cancer Res 2003;5(2):89–95
4. Hass, R.; Bertram, C. Characterization of human breast cancer epithelial cells (HBCEC) derived
from long term cultured biopsies. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2009, 28, 127.
5. Bonner-Weir, S.; Taneja, M.; Weir, G.C.; Tatarkiewicz, K.; Song, K.H.; Sharma, A.; O’Neil J.J.
In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97,
7999–8004
6. Tveit, K.M.; Pihl, A. Do cell lines in vitro reflect the properties of the tumours of origin? A
study of lines derived from human melanoma xenografts. Br. J. Cancer 1981, 44, 775–786.
7. Schiavo, R.; Tullio, C.; la Grotteria, M.; Andreotti, I.C.; Scarpati, B.; Romiti, L.; Bozzi, F.;
Pedrazzoli, P.; Siena, S. Establishment and characterization of a new Ewing’s sarcoma cell line from a
malignant pleural effusion. Anticancer Res. 2007, 27, 3273–3278.
8. Ricardo S, Vieira AF, Gerhard R, Leitão D, Pinto R, Cameselle-Teijeiro JF, Milanezi F,
Schmitt F, Paredes J. Breast cancer stem cell markers CD44, CD24 and ALDH1: expression
distribution within intrinsic molecular subtype. J Clin Pathol 2011;64(11):937-46.
9. Gerdes J, Li L, Schlueter C, Duchrow M, Wohlenberg C, Gerlach C, Stahmer I, Kloth S, Brandt
E, Flad HD. Immunobiochemical and Molecular Biologic Characterization of the Cell Proliferation-
associated Nuclear Antigen That Is Defined by Monoclonal Antibody Ki-67. Am J Pathol
1991;138(4):867–73
10. Lu DY, Lu TR, Che JY, Wu HY (2014) Individualized cancer therapy. IPP 2:458-469.
11. Abhisek Mitra, Lopa Mishra, Shulin Li. Technologies for deriving primary tumor cells for use
in personalized cancer therapy. Trends in Biotechnology, June 2013, Vol. 31, No. 6
12. Michel M. Ouellette, Lisa D. McDaniel, Woodring E. Wright, Jerry W. Shay, Roger A. Schultz,
47
The establishment of telomerase-immortalized cell lines representing human chromosome instability
syndromes. Human molecular genetics. 2000. Vol. 9, No. 3, 403-411.
13. Swartz MA, Iida N, Roberts EW, et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in
cancer therapy. Cancer Res 2012;72:2473-80.
14. Liotta LA, Kohn EC. The microenvironment of the tumour-host interface. Nature
2001;411:375-9.
15. Marusyk, A; Polyak, K. "Tumor heterogeneity: Causes and consequences". Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer 2009, 1805 (1): 105–117.
16. Almendro V, Marusyk A, Polyak K: Cellular heterogeneity and molecular evolution in cancer.
Annu Rev Pathol-Mech. 2013, 8: 277-302.
17. Campbell, P. J.; Pleasance, E. D.; Stephens, P. J.; Dicks, E; Rance, R; Goodhead, I; Follows, G.
A.; Green, A. R.; Futreal, P. A.; Stratton, M. R. (2008). "Subclonal phylogenetic structures in cancer
revealed by ultra-deep sequencing". Proceedings of the National Academy of Sciences 105 (35):
13081–13086.
18. Shipitsin, M; Campbell, L. L.; Argani, P; Weremowicz, S; Bloushtain-Qimron, N; Yao, J;
Nikolskaya, T; Serebryiskaya, T; Beroukhim, R; Hu, M; Halushka, M. K.; Sukumar, S; Parker, L. M.;
Anderson, K. S.; Harris, L. N.; Garber, J. E.; Richardson, A. L.; Schnitt, S. J.; Nikolsky, Y; Gelman, R.
S.; Polyak, K (2007). "Molecular definition of breast tumor heterogeneity". Cancer Cell 11 (3): 259–
273.
19. MacIntosh, C. A.; Stower, M; Reid, N; Maitland, N. J. (1998). "Precise microdissection of
human prostate cancers reveals genotypic heterogeneity". Cancer Research 58 (1): 23–28.
20. Alvarado, C; Beitel, L. K.; Sircar, K; Aprikian, A; Trifiro, M; Gottlieb, B (2005). "Somatic
mosaicism and cancer: A micro-genetic examination into the role of the androgen receptor gene in
prostate cancer". Cancer Research 65 (18): 8514–8518.
21. Konishi, N; Hiasa, Y; Matsuda, H; Tao, M; Tsuzuki, T; Hayashi, I; Kitahori, Y; Shiraishi, T;
Yatani, R; Shimazaki, J (1995). "Intratumor cellular heterogeneity and alterations in ras oncogene and
p53 tumor suppressor gene in human prostate carcinoma". The American Journal of Pathology 147 (4):
1112–1122.
22. Heppner, G. H. (1984). "Tumor heterogeneity". Cancer Research 44 (6): 2259–2265.
23. Califano, J; Van Der Riet, P; Westra, W; Nawroz, H; Clayman, G; Piantadosi, S; Corio, R; Lee,
D; Greenberg, B; Koch, W; Sidransky, D (1996). "Genetic progression model for head and neck
cancer: Implications for field cancerization". Cancer Research 56 (11): 2488–2492.
48
24. Sauter, G; Moch, H; Gasser, T. C.; Mihatsch, M. J.; Waldman, F. M. (1995). "Heterogeneity of
chromosome 17 and erbB-2 gene copy number in primary and metastatic bladder cancer". Cytometry
21 (1): 40–46.
25. González-García, I; Solé, R. V.; Costa, J (2002). "Metapopulation dynamics and spatial
heterogeneity in cancer". Proceedings of the National Academy of Sciences 99 (20): 13085–13089.
26. Samowitz, W. S.; Slattery, M. L. (1999). "Regional reproducibility of microsatellite instability
in sporadic colorectal cancer". Genes, Chromosomes and Cancer 26 (2): 106–114.
27. Giaretti, W; Monaco, R; Pujic, N; Rapallo, A; Nigro, S; Geido, E (1996). "Intratumor
heterogeneity of K-ras2 mutations in colorectal adenocarcinomas: Association with degree of DNA
aneuploidy". The American Journal of Pathology 149 (1): 237–245.
28. Horvai, A. E.; Devries, S; Roy, R; O'Donnell, R. J.; Waldman, F (2009). "Similarity in genetic
alterations between paired well-differentiated and dedifferentiated components of dedifferentiated
liposarcoma". Modern Pathology 22 (11): 1477–1488.
29. Fujii, H; Yoshida, M; Gong, Z. X.; Matsumoto, T; Hamano, Y; Fukunaga, M; Hruban, R. H.;
Gabrielson, E; Shirai, T (2000). "Frequent genetic heterogeneity in the clonal evolution of
gynecological carcinosarcoma and its influence on phenotypic diversity". Cancer Research 60 (1): 114–
120.
30. Victoria R Zellmer and Siyuan Zhang, Evolving concepts of tumor heterogeneity. Cell &
Bioscience20144:69
31. Janet L. Markman, Arthur Rekechenetskiy, Eggehard Holler, Julia Y. Ljubimova.
Nanomedicine therapeutic approaches to overcome cancer drug resistance. Nanotechnology and drug
resistance Volume 65, Issues 13–14, 30 November 2013, Pages 1866–1879.
32. Shackleton, M; Quintana, E; Fearon, E. R.; Morrison, S. J. (2009). "Heterogeneity in cancer:
Cancer stem cells versus clonal evolution". Cell 138 (5): 822–829.
33. Nowell, P. C. (1976). "The clonal evolution of tumor cell populations". Science 194 (4260):
23–28.
34. Swanton, C (2012). "Intratumor heterogeneity: Evolution through space and time". Cancer
Research 72 (19): 4875–4882.
35. Merlo, L. M. F.; Pepper, J. W.; Reid, B. J.; Maley, C. C. (2006). "Cancer as an evolutionary and
ecological process". Nature Reviews Cancer 6 (12): 924–935.
36. Vicki Plaks, Niwen Kong, and Zena Werb, The Cancer Stem Cell Niche:How Essential Is the
Niche in Regulating Stemness of Tumor Cells? Cell Stem Cell, 2015. 10.1016
37. Neethan A. Lobo, Yohei Shimono, Dalong Qian and Michael F. Clarke. The Biology of Cancer
49
Stem Cells. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007. 23:675–99
38. Park CH, Bergsagel DE, McCulloch EA. 1971. Mouse myeloma tumor stem cells: a primary
cell culture assay. J. Natl. Cancer Inst. 46:411–22
39. Jeffrey A. Magee, Elena Piskounova, and Sean J. Morrison. Cancer Stem Cells: Impact,
Heterogeneity, and Uncertainty. Cancer Cell 21, March 20, 2012
40. Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF. Prospective
identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(7):3983-88
41. Naor D, Wallach-Dayan SB, Zahalka MA, Sionov RV. Involvement of CD44, a molecule with
a thousand faces, in cancer dissemination. Semin Cancer Biol 2008;18(4):260-67
42. Ponta H, Sherman L, Herrlich PA. CD44: from adhesion molecules to signalling regulators. Nat
Rev Mol Cell Biol 2003;4(1):33-45
43. Fang X, Zheng P, Tang J,Liu Y. CD24: from A to Z. Cell Mol Immunol 2010;7(2):100-3
44. Baumann P, Cremers N, Kroese F, Orend G, Chiquet-Ehrismann R, Uede T, Yagita H, Sleeman
JP. CD24 expression causes the acquisition of multiple cellular properties associated with tumor
growth and metastasis. Cancer Res 2005;65(23):10783-93
45. Rostoker R, Abelson S, Genkin I, Ben-Shmuel S, Sachidanandam R, Scheinman EJ, Bitton-
Worms K, Orr ZS, Caspi A, Tzukerman M, LeRoith D. CD24(+) cells fuel rapid tumor growth and
display high metastatic capacity. Breast Cancer Res 2015;17:78.
46. Sneath RJ, Mangham DC. The normal structure and function of CD44 and its role in neoplasia.
Mol Pathol 1998; 51(4):191–200
47. Adamia S, Maxwell CA, Pilarski LM. Hyaluronan and hyaluronan synthases: potential
therapeutic targets in cancer. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord 2005;5(1):3-14
48. Stamenkovic I, Aruffo A, Amiot M, Seed B. The hematopoietic and epithelial forms of CD44
are distinct polypeptides with different adhesion potentials for hyaluronate-bearing cells. EMBO J
1991; 10(2): 343–8
49. Yang C, He Y, Zhang H, Liu Y, Wang W, Du Y, Gao F. Selective killing of breast cancer cells
expressing activated CD44 using CD44 ligand-coated nanoparticles in vitro and in vivo. Oncotarget
2015;6(17):15283–96
50. Pham PV, Phan NL, Nguyen NT,Truong NH, Duong TT,Le DV, Truong KD, Phan NK.
Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J
Transl Med 2011;9:209
51. Zöller M. CD44: can a cancer-initiating cell profit from an abundantly expressed molecule? Nat
Rev Cancer 2011;11(4):254-67
50
52. Gerdes J, Li L, Schlueter C, Duchrow M, Wohlenberg C, Gerlach C, Stahmer I, Kloth S, Brandt
E, Flad HD. Immunobiochemical and Molecular Biologic Characterization of the Cell Proliferation-
associated Nuclear Antigen That Is Defined by Monoclonal Antibody Ki-67. Am J Pathol
1991;138(4):867–73
53. Jonat W, Arnold N. Is the Ki-67 labelling index ready for clinical use? Ann Oncol
2011;22(3):500-2
54. Ross W, Hall PA. Ki67: from antibody to molecule tounderstanding? Clin Mol Pathol
1995;48(3):113-7
55. Stathopoulos GP, Malamos NA, Markopoulos C, Polychronis A, Armakolas A, Rigatos S,
Yannopoulou A, Kaparelou M, Antoniou P. The role of Ki-67 in the proliferation and prognosis of
breast cancer molecular classification subtypes. Anticancer Drugs 2014;25(8):950-7
56. van Dierendonck JH, Keijzer R, van de Velde CJ, Cornelisse CJ. Nuclear Distribution of the
Ki-67 Antigen during the Cell Cycle: Comparison with Growth Fraction in Human Breast Cancer
Cells. Cancer Res 1989;49(11):2999-3006
57. Cuzick J, Dowsett M, Pineda S, Wale C, Salter J, Quinn E, Zabaglo L, Mallon E, Green AR,
Ellis IO, Howell A, Buzdar AU, Forbes JF. Prognostic Value of a Combined Estrogen Receptor,
Progesterone Receptor, Ki-67, and Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Immunohistochemical
Score and Comparison With the Genomic Health Recurrence Score in Early Breast Cancer. J Clin
Oncol 2011;29(32):4273-8
58. Munzone E, Botteri E, Sciandivasci A, Curigliano G, Nolè F, Mastropasqua M, Rotmensz N,
Colleoni M, Esposito A, Adamoli L, Luini A, Goldhirsch A, Viale G. Prognostic value of Ki-67
labeling index in patients with node-negative, triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res Treat
2012;134(1):277-82
59. Aleskandarany MA, Rakha EA, Macmillan RD, Powe DG, Ellis IO, Green AR. MIB1/Ki-67
labelling index can classify grade 2 breast cancer into two clinically distinct subgroups. Breast Cancer
Res Treat 2011;127(3):591-9
60. Harper-Wynne C, Ross G, Sacks N, Salter J, Nasiri N, Iqbal J,A’Hern R, Dowsett M. Effects of
the Aromatase Inhibitor Letrozole on Normal Breast Epithelial Cell Proliferation and Metabolic Indices
in Postmenopausal Women: A Pilot Study for Breast Cancer Prevention. Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev 2002;11(7):614-21
61. Clarke RB, Howell A, Potten CS, Anderson E. Dissociation between Steroid Receptor
Expression and Cell Proliferation in the Human Breast. Cancer Res 1997;57(22):4987-91
51
62. Subik K,Lee JF,Baxter L,Strzepek T,Costello D, Crowley P,Xing L, Hung MC,Bonfiglio T,
Hicks DG,Tang P. The Expression Patterns of ER, PR, HER2, CK5/6, EGFR, Ki-67 and AR by
Immunohistochemical Analysis in Breast Cancer Cell Lines. Breast Cancer (Auckl) 2010;4:35–41
63. Inwald EC, Klinkhammer-Schalke M, Hofstädter F, Zeman F, Koller M, Gerstenhauer M,
Ortmann O. Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-
based cohort of a cancer registry. Breast Cancer Res Treat 2013;139(2):539-52
64. Urruticoechea A, Smith IE, Dowsett M. Proliferation Marker Ki-67 in Early Breast Cancer. J
Clin Oncol 2005;23(28):7212-20
65. Shi M, Yu DH, Chen Y, Zhao CY, Zhang J, Liu QH, Ni CR, Zhu MH. Expression of fibroblast
activation protein in human pancreatic adenocarcinoma and its clinicopathological significance. World
J Gastroenterol 2012;18(8):840–6
66. Hamson EJ, Keane FM, Tholen S, Schilling O, Gorrell MD. Understanding fibroblast activation
protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy. Proteomics Clin Appl
2014;8(5-6):454-63
67. Zhang M, Xu L, Wang X, Sun B, Ding J. Expression levels of seprase/FAPα and DPPIV/CD26
in epithelial ovarian carcinoma. Oncol Lett 2015;10(1):34-42
68. Shi M, Yu DH, Chen Y, Zhao CY, Zhang J, Liu QH, Ni CR, Zhu MH. Expression of fibroblast
activation protein in human pancreatic adenocarcinoma and its clinicopathological significance. World
J Gastroenterol 2012;18(8):840–6
69. Jis J, Martin TA, Ye L, Jiang WG. FAP-α (Fibroblast activation protein-α) is involved in the
control of human breast cancer cell line growth and motility via the FAK pathway. BMC
CellBiology2014, 15:16
70. Christiansen VJ, Jackson KW, Lee KN, Downs TD, McKee PA. Targeting inhibition of
fibroblast activation protein-α and prolyl oligopeptidase activities on cells common to metastatic tumor
microenvironments. Neoplasia 2013;15(4): 348–58
71. Liu F, Qi L, Liu B, Liu J, Zhang H, Che D, Cao J, Shen J, Geng J, Bi Y, Ye L, Pan B, Yu Y.
Fibroblast activation protein overexpression and clinical implications in solid tumors: a meta-analysis.
PLoS One 2015;10(3):e0116683
72. Peng Q, Zhao L, Hou Y, Sun Y, Wang L, Luo H, Peng H, Liu M. Biological characteristics and
genetic heterogeneity between carcinoma-associated fibroblasts and their paired normal fibroblasts in
human breast cancer. PLoS One 2013;8(4):e60321
73. Lai D, Ma L, Wang F. Fibroblast activation protein regulates tumor-associated fibroblasts and
epithelial ovarian cancer cells. Int J Oncol 2012;41(2):541-50
52
74. Lu DY, Chen EH, Ding J, Xu B, Lu TR. Anticancer Drug Combinations, A Big Momentum is
Needed. Metabolomics 2015, 5:3
75. Berlinda Verdoodt, Markus Vogt, Inge Schmitz, Sven-Thorsten Liffers, Andrea Tannapfel,
Alireza Mirmohammadsadegh. Salinomycin Induces Autophagy in Colon and Breast Cancer Cells with
Concomitant Generation of Reactive Oxygen Species. PlosOne, September 2012, Volume 7, Issue 9,
e44132.
76. Fuchs D, Heinold A, Opelz G, Daniel V, Naujokat C (2009) Salinomycin induces apoptosis and
overcomes apoptosis resistance in human cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 390: 743–749.
77. Florian Kopp, Adam Hermawan, Prajakta Shirish Oak, Annika Herrmann, Ernst Wagner and
Andreas Roidl. Salinomycin treatment reduces metastatic tumor burden by hampering cancer cell
migration. Kopp et al. Molecular Cancer 2014, 13:16.
78. Naujokat C, Steinhart R: Salinomycin as a drug for targeting human cancer stem cells. J
Biomed Biotechnol 2012, 2012:950658.
79. Florian Kopp, Adam Hermawan, Prajakta Shirish Oak, Vijay Kumar Ulaganathan, Annika
Herrmann, Nefertiti Elnikhely, Chitra Thakur, Zhiguang Xiao, Pjotr Knyazev, Beyhan Ataseven,
Rajkumar Savai, Ernst Wagner and Andreas Roidl. Sequential Salinomycin Treatment Results in
Resistance Formation through Clonal Selection of Epithelial-Like Tumor Cells. Translational
Oncology (2014) 7, 702–711
80. Gunasinghe NP, Wells A, Thompson EW, Hugo HJ. Mesenchymal-epithelial transition (MET)
as a mechanism for metastatic colonisation in breast cancer. Cancer Metastasis Rev. 2012 Dec;31(3-
4):469-78. doi: 10.1007/s10555-012-9377-5.
81. Dianbo Yao, Chaoliu Dai, and Songlin Peng. Mechanism of the Mesenchymal–Epithelial
Transition and Its Relationship with Metastatic Tumor Formation. Mol Cancer Res; 9(12) December
2011
82. Hyunsook An, Ji Young Kim, Eunhye Oh, Nahyun Lee, Youngkwan Cho, Jae Hong Seo.
Salinomycin Promotes Anoikis and Decreases the CD44+/CD24- Stem-Like Population via Inhibition
of STAT3 Activation in MDA-MB-231. PLOS ONE DOI:10.1371/journal.pone.0141919 November 3,
2015.
83. Kodappully Sivaraman Siveen, Sakshi Sikka, Rohit Surana, Xiaoyun Dai, Jingwen Zhang, Alan
Prem Kumar, Benny K.H. Tan, Gautam Sethi , Anupam Bishayee,. Targeting the STAT3 signaling
pathway in cancer: Role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -
Reviews on Cancer Volume 1845, Issue 2, April 2014, Pages 136–154
84. Peibin Yue, James Turkson. Targeting STAT3 in cancer: how successful are we? Expert Opin
53
Investig Drugs. 2009 January ; 18(1): 45–56
85. Yong Hwan Han, Suhn Hee Kim, Sung Zoo Kim and Woo Hyun Park. Antimycin A as a
mitochondrial electron transport inhibitor prevents the growth of human lung cancer A549 cells.
ONCOLOGY REPORTS 20: 689-693, 2008 689.
86. Mohamad Hafizi Abu Bakar, Kian-Kai Cheng, Mohamad Roji Sarmidi, Harisun Yaakob and
Hasniza Zaman Huri. Celastrol Protects against Antimycin A-Induced Insulin Resistance in Human
Skeletal Muscle Cells. Molecules 2015, 20, 8242-8269.
87. Chi-Tai Yeh, Chun-Li Su, Chi-Ying F. Huang, Justin Kung-Yi Lin,8Wei-Hwa Lee, Peter M.-H.
Chang, Yu-Lun Kuo, Yu-Wen Liu, Liang-Shun Wang, Chih-Hsiung Wu, Yi-Shing Shieh, Yi-Hua Jan,
Yung-Jen Chuang, Michael Hsiao, Alexander T. H. Wu. A Preclinical Evaluation of Antimycin A as a
Potential Antilung Cancer Stem Cell Agent. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine
Volume 2013, Article ID 910451, 13 pages.
88. Seisuke Mimori, Yasunobu Okuma, Masayuki Kaneko, Koichi Kawada, Toru Hosoi, Koichiro
Ozawa, Yasuyuki Nomura and Hiroshi Hamana. Protective Effects of 4-Phenylbutyrate Derivatives on
the Neuronal Cell Death and Endoplasmic Reticulum Stress. Biol. Pharm. Bull. 35(1) 84—90 (2012).
89. Erica S. DYER, Michelle T. PAULSEN, Sonja M. MARKWART, Meidee GOH, Donna L.
LIVANT and Mats LJUNGMAN. Phenylbutyrate Inhibits The Invasive Properties Of Prostate And
Breast Cancer Cell Lines In The Sea Urchin Embryo Basement Membrane Invasion Assay. Int. J.
Cancer: 101, 496–499 (2002) Wiley-Liss, Inc.
90. Reynolds S, Cederberg H, Chakrabarty S. Inhibitory effect of 1-O (2 methoxy) hexadecyl
glycerol and phenylbutyrate on the malignant properties of human prostate cancer cells. Clin Exp
Metastasis 2000; 18:309–12.
91. Noh, Jae Myoung, et al. “In vivo verification of regional hyperthermia in the liver.” Radiation
oncology journal 32.4 (2014): 256-261.
92. Sugahara, Tsutomu, et al. “Kadota fund international forum 2004. Application of thermal stress
for the improvement of health, 15–18 June 2004, Awaji Yumebutai international conference center,
Awaji island, Hyogo, Japan. Final report.” International journal of hyperthermia: the official journal of
European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group 24.2 (2008): 123.
93. Bettaieb, Ahmed, Paulina K. Wrzal, and Diana A. Averill-Bates. “Hyperthermia: Cancer
treatment and beyond.” Cancer treatment—conventional and innovative approaches (2013).
94. Lepock, James R. “How do cells respond to their thermal environment?.” International journal
of hyperthermia 21.8 (2005): 681-687.
95. Richter, Klaus, Martin Haslbeck, and Johannes Buchner. “The heat shock response: life on the
54
verge of death.” Molecular cell 40.2 (2010): 253-266.
96. Sonna, Larry A., et al. “Invited review: effects of heat and cold stress on mammalian gene
expression.” Journal of Applied Physiology 92.4 (2002): 1725-1742.
97. Van der Zee, Jill. “Heating the patient: a promising approach?.” Annals of oncology 13.8
(2002): 1173-1184.
98. Van der Zee, J. “Hyperthermia in addition to radiotherapy.” Clinical Oncology 19.3 (2007):
S18.
99. Babbs, C. F., and D. P. DeWitt. “Physical principles of local heat therapy for cancer.” Medical
instrumentation 15.6 (1980): 367-373.
100. Moriyama-Gonda, N., et al. “Heat–Induced Cellular Damage and Tolerance in Combination
with Adriamycin for the PC–3 Prostate Cancer Cell Line: Relationships with Cytotoxicity, Reactive
Oxygen Species and Heat Shock Protein 70 Expression.” European urology 38.2 (2000): 235-240.
101. Katschinski, Dörthe M., et al. “Role of tumor necrosis factor α in hyperthermia-induced
apoptosis of human leukemia cells.” Cancer research 59.14 (1999): 3404-3410.
102. Bettaieb, Ahmed, and Diana A. Averill-Bates. “Thermotolerance induced at a fever temperature
of 40 C protects cells against hyperthermia-induced apoptosis mediated by death receptor signalling.”
Biochemistry and Cell Biology 86.6 (2008): 521-538.
103. Lord-Fontaine, Stephanie, and Diana A. Averill. “Enhancement of cytotoxicity of hydrogen
peroxide by hyperthermia in chinese hamster ovary cells: role of antioxidant defenses.” Archives of
biochemistry and biophysics 363.2 (1999): 283-295.
104. Drummond, Daryl C., et al. “Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to
solid tumors.” Pharmacological reviews 51.4 (1999): 691-744.
105. Bogovič, J., et al. “Posttreatment histology and microcirculation status of osteogenic sarcoma
after a neoadjuvant chemo-and radiotherapy in combination with local electromagnetic hyperthermia.”
Oncology Research and Treatment 24.1 (2001): 55-58.
106. Calderwood, Stuart K., Salamatu S. Mambula, and PHILLIP J. GRAY. “Extracellular heat
shock proteins in cell signaling and immunity.” Annals of the New York Academy of Sciences 1113.1
(2007): 28-39.
107. Toru Hiraga, Susumu Ito and HiroAki Nakamura. Side population in MDA-MB-231 human
breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.
Oncology Reports 25: 289-296, 2011.
108. N. V. Krakhmal, M. V. Zavyalova, E. V. Denisov, S. V. Vtorushin, V. M. Perelmuter. Cancer
Invasion: Patterns and Mechanisms. ACTA NATURAE , VOL. 7, No. 2 (25) 2015
55
109. Dong TT, Zhou HM, Wang LL, Feng B, Lv B, Zheng MH. Salinomycin selectively targets
‘CD133’+‘ cell subpopulations and decreases malignant traits in colorectal cancer lines. Ann Surg
Oncol. 2011;18:1797–1804.
110. Kusunoki S, Kato K, Tabu K, Inagaki T, Okabe H, Kaneda H, Suga S, Terao Y, Taga T, Takeda
S. The inhibitory effect of salinomycin on the proliferation, migration and invasion of human
endometrial cancer stem-like cells. Gynecol Oncol. 2013;129:598–605.
111. Lieke T, Ramackers W, Bergmann S, Klempnauer J, Winkler M, Klose J. Impact of
Salinomycin on human cholangiocarcinoma: induction of apoptosis and impairment of tumor cell
proliferation in vitro. BMC Cancer. 2012;12:466.
112. Florian Kopp, Adam Hermawan, Prajakta Shirish Oak, Vijay Kumar Ulaganathan, Annika
Herrmann, Nefertiti Elnikhely, Chitra Thakur, Zhiguang Xiao, Pjotr Knyazev, Beyhan Ataseven,
Rajkumar Savai, Ernst Wagner and Andreas Roidl. Sequential Salinomycin Treatment Results in
Resistance Formation through Clonal Selection of Epithelial-Like Tumor Cells. Translational
Oncology (2014) 7, 702–711
113. Yakisich JS (2012) Challenges and limitations of targeting cancer stem cells and/or the tumour
microenvironment. Drug Therapy Study 2: e10.
114. Park TS, Donnenberg VS, Donnenberg AD, Zambidis ET, Zimmerlin L (2014) Dynamic
interactions between cancer stem cells and their stromal partners. Current Pathobiol Reports 2: 41-52.
115. Visvader JE, Lindeman GJ (2008) Cancer stem cells in solid tumours: accumulating evidence
and unresolved questions. Nat Rev Cancer 8: 755-768.
116. Li Y, Laterra J (2012) Cancer stem cells: distinct entities or dynamically regulated phenotypes?
Cancer Res 72: 576-580.
56
Dalyvavimas konferencijose
1. Milašiūtė G., Puidokaitė S., Ceslevičienė I., Antanavičiūtė I., Mikalayeva V. Effect of
salinomycin, antimycin, sodium phenylbutyrate and glucose deprivation on cancer cell viability and
mobility. 9 th International Scientific Conference "The Vital Nature Sign" : May 14-16, 2015 Kaunas,
Lithuania. Proceedings, p. 78-78
2. Rimkutė L., Marandykina A., Palacios-Prado N., Jotautis V., Milašiūtė G., Venclovas Č.,
Bukauskas F., Skeberdis V.A. Modulation of Cx36 gap junction conductance by intracellular pH and
Mg2+. XIIIth International Conference of Lithuanian Biochemical Society "50th anniversary of FEBS"
June 18-20, 2014; Symposium "Young biochemistry" : June 17, 2014, Birštonas, Lithuania
57
1 PRIEDAS
1 pav. Išskirtų pirminių krūties naviko ląstelių kultūrų (BC1, BC2, BC4, BC5, BC6) bei žmogaus krūties duktalinės karcinomos (MCF-7) ir adenokarcinomos (MDA-MB-231) ląstelių linijų šviesinės
mikroskopijos nuotraukos (10x didinimas)
BC1 BC2
BC4
MCF-7
BC6
BC5
MDA-MB-231