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Physiopathologie des infections ostéo-articulaires àStaphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis

Sophie Trouillet

To cite this version:Sophie Trouillet. Physiopathologie des infections ostéo-articulaires à Staphylococcus aureus et Staphy-lococcus epidermidis. Microbiologie et Parasitologie. 2011. �hal-01482584�

MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHEÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES

Sciences de la Vie et de la Terre

MÉMOIREprésenté

par

Sophie TROUILLET

pour l’obtention du diplôme de l’École Pratique des Hautes Études

Physiopathologie des infections ostéo-articulaires àStaphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis

soutenu le 25 Octobre 2011 devant le jury suivant :

Pr Christophe Terzian- président du juryPr Jean-Marie Exbrayat - tuteur pédagogiqueDr Frédéric Laurent- tuteur scientifiqueDr Sylvestre Tigaud - rapporteur (examinateur)Dr Gérard Carret – rapporteur (examinateur)

Mémoire préparé sous la direction de :

Dr Frédéric LaurentLaboratoire de bactériologie, Centre National des Staphylocoques, INSERM U851Laboratoire de Bactériologie - Hopital de la Croix RousseCentre National de Reference des StaphylocoquesUnite Inserm 851 - Faculte de Medecine Lyon Est103 Grande Rue de la Croix Rousse69317 Lyon Cedex 04frederic.laurent@univ-lyon1.fr

Et de

Pr Jean-Marie Exbrayat - EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) - Reproduction etdéveloppement comparéUniversité de Lyon, UMRS 449,Laboratoire de Biologie Générale, UCLy;Laboratoire de Reproduction et Développement Comparé, EPHE;25, rue du Plat, 69288 Lyon Cedex 02jmexbrayat@univ-catholyon.fr

SOMMAIRESOMMAIRE .................................................................................................................................................................. 1

ABREVIATIONS.......................................................................................................................................................... 3

DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES........................................................................................................................... 5

I. Généralités sur le genre Staphylococcus ........................................................................................................ 6

I.1 Staphylococcus aureus..................................................................................................................................... 6I.1.2 Réservoir et niche écologique................................................................................................................ 7I.1.3 Infections à Staphylococcus aureus....................................................................................................... 7

I.2 Staphylococcus epidermidis............................................................................................................................. 8

II. Le tissu osseux et les infections ostéo-articulaires ......................................................................................... 9

II.1. Fonction et structure de l’os. ............................................................................................................................. 9II.1.1. Fonction. ..................................................................................................................................................... 9II.1.2. Os cortical et os trabéculaire.................................................................................................................... 10

II.2. Les cellules osseuses. ....................................................................................................................................... 10II.2.1. Les ostéoblastes........................................................................................................................................ 10II.2.2. Les ostéocytes........................................................................................................................................... 12II.2.3. Les cellules bordantes. ............................................................................................................................. 12II.2.4. Les ostéoclastes. ....................................................................................................................................... 12II.2.5. Equilibre osseux ....................................................................................................................................... 13

II.3. Infections ostéo-articulaires d’origine bactérienne........................................................................................ 13II.3.1. Les infections primitives.......................................................................................................................... 14II.3.2. Les infections secondaires. ...................................................................................................................... 15II.3.3. Les infections sur matériel. ...................................................................................................................... 15

III. Mécanismes physiopathologiques des IOA à S. aureus et S. epidermidis ................................................... 15

III.1. Le caractère chronique et récidivant des IOA.............................................................................................. 16

III.2. La formation de biofilm .................................................................................................................................. 16

III.3. L’internalisation de Staphylococcus ............................................................................................................. 17III.3.1. Techniques d’études ............................................................................................................................... 17III.3.2. Mécanismes d’internalisation................................................................................................................. 18

III.4. Le phénotype Small Colony Variant............................................................................................................... 19

IV. Problématiques............................................................................................................................................... 21

ABREVIATIONS

Ac : Anticorps

AFU : Unité Arbitraire de Fluorecence

ATB : Antibiotique

BCC : Bouillon Cœur Cervelle

CASFM : Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie

CBA : Cytometry Based Array

DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO : DiMéthylSulfOxide

DO : Densité Optique

EDTA : Acide Ethylène Diamine Tétracétique

FACS : Fluorescence Activated Cell Sorting

FCBA : Flow Cytometry Based Assay (nom donné à l’une des techniques mises au point dans

le mémoire)

FnBP : Fibronectin Binding Protein

FSC : Forward Scatter (mesure de la taille de l’évènement en cytométrie en flux)

GPA : Gentamicin Protection Assay

IL: Interleukine

IOA : Infections Ostéo-Articulaires

LDH : Lactate DesHydrogenase

LPA : Lysostaphin Protection Assay

LPV : Leucocidine de Panton Valentine

MALDI-TOF-MS : Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation -Time Of Flight – Mass

Spectrometry

MCC : Milieu de Culture Complet

MOI : Multiplicity Of Infection (nombre de bactéries par cellule)

PBS : Phosphate Buffer Saline

RPM : Rotations Par Minute

SCoN : Staphylocoques à Coagulase Négative

SCV : Small Colony Variant

SSC : Side Scatter (mesure de la granularité de l’évènement en cytométrie en flux)

SVF : Serum de Veau Fœtal

TSA : Trypticase Soja Agar

UFC : Unité Formant Colonie

VBFL: Vancomycin-Bodipy-FL® (molécule de vancomycine couplé au fluorochrome

Bodipy-FL)

DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES

I. Généralités sur le genre Staphylococcus

Sir Alexander Ogston et Louis Pasteur ont mis en évidence l’existence du « vibrion

pyogénique » pour la première fois en 1880. Pasteur a ainsi observé, après la mise en culture

de pus de furoncle, « un organisme unique, formé de petits points sphériques réunis en couple

de 2 grains, rarement de 4 mais fréquemment associés en amas ».

Le chirurgien écossais Alexander Ogston est ensuite parvenu à différencier le genre

Staphylococcus du genre Streptococcus. Le terme Staphylococcus provient de l’association du

mot grec « Staphyle » qui signifie « grappe de raisin » et de « Kokkos » qui signifie « graine ».

I.1 Staphylococcus aureus

I.1.1 Propriétés.

Les bactéries de l’espèce Staphylococcus aureus appartiennent à la famille des

Staphylococcaceae et au genre Staphylococcus. Ce sont des cocci Gram positives d’environ 1

µm de diamètre, asporulés, immobiles, aéro-anaérobie facultatifs, et habituellement disposés

en amas ou en paires à l’examen microscopique (Brun, 2000).

Comme toutes les bactéries à Gram positif, la paroi de S. aureus est composée de

peptidoglycane en l’absence de paroi externe, ce qui lui confère cette couleur violette après

coloration de Gram.

La plupart des staphylocoques possèdent une microcapsule constituée de

polysaccharides recouvrant la paroi bactérienne, qui lui confère une résistance élevée à la

phagocytose (Roghmann, et al., 2005).

Les bactéries appartenant à l’espèce S. aureus possèdent des caractéristiques communes

au genre Staphylococcus (catalase positive, oxydase négative,…), associées à un équipement

enzymatique élaboré propre à cette espèce et permettant son identification. Elles disposent

notamment d’une coagulase, d’une thermonucléase, de la protéine A et sont capables de

dégrader le mannitol sur gélose Chapman. Pour les conditions de culture, il est à noter que

cette espèce est à la fois mésophile (croissance dans des conditions de température modérée),

neutrophile (croissance dans des milieux à pH neutre) et halophile (croissance en présence de

fortes concentrations en sel).

I.1.2 Réservoir et niche écologique.

Le principal réservoir naturel de S. aureus est l’Homme et les animaux à sang chaud tels

que les ovins, bovins, caprins et canidés (Boerema, et al., 2006). S. aureus est un commensal

de la peau et des muqueuses. Cette bactérie se retrouve préférentiellement au niveau du

périnée, de l’intestin, du pharynx, des doigts et des cheveux, mais l’habitat préférentiel de S.

aureus chez l’homme est la muqueuse nasale. Il est présent à l’êtat commensal chez 10% à

40% des individus en dehors de tout contact hospitalier (Lecomte, et al., 2001).

I.1.3 Infections à Staphylococcus aureus.

S. aureus est à l’origine de deux types de syndromes : les toxémies staphylococciques,

et les infections suppuratives. Les syndromes toxémiques sont dus à des toxines produites par

les souches in vivo (leucocidine de Panton-Valentine (LPV), toxine du choc toxique

staphylococcique (TSST-1), exfiolatines (ETA, ETB)) ou introduites préformées dans

l’organisme (entérotoxines (SE) dans les aliments), l’ingestion de toxine en l’absence de la

bactérie elle-même étant suffisante à reproduire la maladie. A l’inverse, les infections

suppuratives impliquent la prolifération bactérienne, l’invasion, la destruction des tissus de

l’hôte et une réponse inflammatoire locale et systémique.

I.1.3.1 Les infections toxiniques

Parmi les toxines staphylococciques, recensées au nombre de quarante (Jarraud, et al.,

2002), trois types sont majoritairement impliqués dans les infections toxiniques dues à

Staphylococcus aureus. La toxine du choc toxique staphylococcique (TSST-1), codée par le

gène tst, est responsable du choc toxique staphylococcique lié à une activité de type

superantigénique. Décrit par Todd et al en 1978, ce syndrome associe fièvre, hypotension,

hyperhémie des muqueuses, signes d’atteintes multi-viscérales et rash scarlatiniforme

évoluant vers la desquamation (Todd, et al., 1978). Les chocs toxiques sont classiquement liés

à l’utilisation de tampons vaginaux ou secondaires à une infection cutanée localisée.

La LPV est, elle, une toxine synergo-hyménotrope constituée de deux exoprotéines

hydrosolubles nommées LukF-PV et LukS-PV. La PVL agit sur les membranes cellulaires des

cellules cibles (polynucléaires, monocytes, macrophages) provoquant la formation de pores

membranaires entraînant la fuite des cations divalents et conduisant à la mort cellulaire. Elle

est classiquement retrouvée chez les souches isolées de lésions cutanées primitives

nécrosantes et de pneumonies communautaires sévères nécrotiques et hémorragiques chez

l'enfant et le jeune adulte.

Enfin les entérotoxines notamment l'entérotoxine A, codée par le gène sea, sont responsables

de toxiinfections alimentaires par activation des récepteurs de la paroi cellulaire sur le modèle

des neurotoxines.

I.1.3.2. Les infections suppuratives

Le pouvoir invasif de S. aureus implique l’invasion, la prolifération bactérienne, et

enfin la destruction des tissus de l’hôte, entraînant une réponse inflammatoire locale et parfois

systémique. Les infections suppuratives sont principalement des infections cutanéo-

muqueuses se traduisant par l’apparition de furoncles, d’abcès, de folliculites ou encore de

panaris. Toutefois, elles peuvent se compliquer ou entraîner des infections plus profondes

telles que les endocardites, les pneumopathies, ainsi que les infections ostéo-articulaires

(IOA) associées dans un certain nombre de cas à des bactériémies. De plus, S. aureus est l’un

des principaux agents responsables d’infections nosocomiales sur matériel de type cathéters et

de prothèses valvulaires, articulaires et endovacsulaires (Brun, 2000).

I.2 Staphylococcus epidermidis

S. epidermidis fait partie de la famille des staphylocoques à coagulase négative

(SCoN). Il doit son nom à sa principale niche écologique. En effet S. epidermidis est une

espèce très dispersée sur la peau et les muqueuses. Certains individus hébergent 10 à 24

souches différentes de cette espèce. S. epidermidis est une espèce résidente pouvant persister

plusieurs mois ou années chez un même sujet. La muqueuse nasale est colonisée par

S. epidermidis, présent en densité importante en l’absence de S. aureus (Otto, 2009).

S. epidermidis n’est plus considéré uniquement comme un commensal universel de la

peau et des muqueuses, il est désormais reconnu comme un pathogène opportuniste majeur,

notamment dans les infections nosocomiales et/ou sur matériel étranger (Otto, 2009,

Schierholz et Beuth, 2001). S. epidermidis est à l’origine d’infections chez les sujets porteurs

de matériel étranger (cathéter intra-vasculaires, prothèses ostéo-articulaires, boîtiers de

stimulation cardiaque, valves de dérivation du liquide céphalo-rachidien…). Dans ce cadre, il

est l’un des principaux agents étiologiques des IOA sur matériel orthopédique pour lesquelles

les staphylocoques à coagulase négative, dont S. epidermidis, représentent 30 à 43% des

agents étiologiques, devant S. aureus (Darouiche, 2004, Uckay, et al., 2009, Zimmerli, et al.,

2004).

II. Le tissu osseux et les infections ostéo-articulaires

L’os est un tissu conjonctif dans lequel sont associées une phase minérale (60%) et une

matrice organique (35%) composée essentiellement de collagène de type I. C’est un tissu

possédant également des cellules spécifiques (5%) nécessaires à son remodelage :

ostéoblastes, ostéoclastes et ostéocytes (Giudicelli et Souberbielle, 1998).

II.1. Fonction et structure de l’os.

II.1.1. Fonction.

Les propriétés du tissu osseux lui permettent d’assurer plusieurs fonctions :

• une fonction mécanique en tant que support du poids de l’organisme

• une fonction de protection des organes vitaux (cage thoracique, boîte cranienne )

• une fonction métabolique avec le stockage des minéraux en particulier du calcium et

du phosphore

• une fonction de contenance de la moelle osseuse

II.1.2. Os cortical et os trabéculaire.

Du point de vue anatomique, l’os est composé de deux parties distinctes : l’os cortical et

l’os spongieux.

L’os cortical représente 80% de la structure osseuse et est localisé essentiellement dans

les os longs et à la périphérie des os plats (Giudicelli et Souberbielle, 1998).

Il s’agit d’une juxtaposition d’ostéons cylindriques (les ostéones) de 200 à 300 µm de

diamètre alignés parallèlement. Chaque ostéon est composé de lamelles concentriques

disposées autour d’un canal où passe les éléments vasculo-nerveux. Ces canaux sont reliés

entre eux, mais aussi avec la surface de l’os et avec la moelle osseuse par des canaux dits

transversaux. Les fibres de collagènes sont orientées de façon à conférer au tissu cortical une

résistance mécanique optimale une fois minéralisé.

L’os spongieux constitue les 20 % restant de la structure osseuse. Il est situé à

l’extrémité des os longs (métaphyse), dans la partie centrale des os plats et des os courts. Il est

organisé selon un système de lamelles osseuses irrégulières que l’on nomme les trabécules, ce

qui lui confère une structure alvéolaire (Giudicelli et Souberbielle, 1998). C’est à cet endroit

que l’on trouve la moelle osseuse et les vaisseaux sanguins. Son organisation

tridimensionnelle lui donne un rôle important dans la résistance mécanique de l’os.

II.2. Les cellules osseuses.

II.2.1. Les ostéoblastes.

Les ostéoblastes prolifèrent le long des travées osseuses (Giudicelli et Souberbielle,

1998). Leur fonction principale est de synthétiser et de minéraliser la matrice osseuse au cours

de la croissance du squelette, du renouvellement de cette matrice chez l’adulte et de la

réparation osseuse tout au long de la vie.

Dans les os trabéculaires, les ostéoblastes se différencient à partir des cellules souches

de la moelle osseuse (stroma médullaire). Ces précurseurs ostéoblastiques ou cellules

ostéoprogénitrices proviennent de la prolifération de clones de cellules pluripotentes qui

peuvent évoluer vers divers types de cellules (Couret, 2004). Après une prolifération initiale

des cellules ostéoprogénitrices, un arrêt de la multiplication cellulaire est observé, puis les

ostéoblastes se différencient. La différenciation ostéoblastique est sous le contrôle de facteurs

de transcription, d’interactions cellulaires et matricielles ainsi que de facteurs systémiques et

locaux (Marie, 2001).

Plusieurs facteurs de croissance affectent la formation osseuse : les « insulin-like growth

factors » (IGFs), les « fibroblasts growth factors » (FGFs) et spécifiquement les membres de

la famille des « transforming growth factors beta » (TGF-_). Les ostéoblastes sont aussi la

cible des hormones qui contrôlent la différenciation des ostéoclastes. Eux-mêmes sont

capables de produire un large éventail de facteurs qui peuvent potentiellement agir comme des

régulateurs autocrines ou paracrines de la fonction cellulaire osseuse. Ainsi plusieurs

cytokines comme le RANK-Ligand, les interleukines (IL) -6 et 11 peuvent activer la

différenciation des ostéoclastes (Marie, 2001).

Les ostéoblastes forment un tapis de cellules jointives et communiquent entre eux par

des structures appelées jonction gap permettant le passage de certaines molécules. Le noyau

est situé au pôle basal et la partie apicale de leur cytoplasme fortement basophile contient de

nombreux organites : mitochondries, appareil de Golgi… Les ostéoblastes sécrètent d’abord

la matrice organique structurée par les fibres de collagène où les protéines non collagéniques

sont intriquées. Les ostéoblastes matures contrôlent ensuite la minéralisation de la matrice par

dépôt de cristaux d’hydroxyapatite grâce notamment à la sécrétion de phosphatase alcaline

osseuse, facteur important pour la minéralisation.

Une fois la déposition de la matrice terminée, trois destins sont possibles pour les

ostéoblastes :

• soit il meurt par apoptose.

• soit l’ostéoblaste est emmuré dans la matrice minéralisée et évolue alors en ostéocyte

(environ 10 à 20% des ostéoblastes),

• soit il s’aplatit et présente une activité métabolique très réduite et se transforme en une

cellule bordante,

II.2.2. Les ostéocytes.

Ces cellules, les plus abondantes de l’os, sont incluses dans la matrice osseuse et sont

reliées entre elles et avec les cellules de la surface osseuse par des extensions de la membrane

cytoplasmique. Les ostéocytes sont probablement les cellules qui orientent dans l’espace

l’activité des ostéoblastes et ainsi adaptent l’architecture osseuse afin d’assurer une résistance

maximale aux contraintes physiques. Ils sont espacés régulièrement et forment un réseau de

communication. Ils sont sensibles aux stimuli mécaniques et détectent aussi le besoin d’une

augmentation ou d’une diminution de la formation osseuse dans le processus d’adaptation

fonctionnelle ou en cas de micro-fractures (Couret, 2004).

II.2.3. Les cellules bordantes.

Ce sont des cellules plates et allongées situées à la surface de l’os à l’état quiescent et

qui séparent l’espace osseux de l’espace médullaire. Ces cellules sont alignées sur une couche

de matrice non minéralisée. Elles seraient capables d’évaluer le besoin de remodelage en un

lieu spécifique. (Couret, 2004)

II.2.4. Les ostéoclastes.

Ce sont les principales cellules responsables de la résorption osseuse.

Les ostéoclastes se différencient à partir des cellules souches hématopoïétiques de la lignée

monocyte/macrophage sous l’influence de divers facteurs parmi lesquels des cytokines. La

différenciation des précurseurs en ostéoclastes est initiée et reste sous le contrôle des cellules

préostéoblastiques qui sécrètent deux facteurs : le M-CSF (macrophage colony-stimulating

factor) et le RANK-L (Couret, 2004). Le système RANK/RANK-Ligand, découvert

récemment, est l’un des principaux systèmes de régulation pour le recrutement des

ostéoclastes.

La maturation des ostéoclastes se fait après migration vers la surface osseuse et fusion des

proostéoclastes. Les ostéoclastes sont donc des cellules multinucléées de 50 à 100 µm de

diamètre qui contiennent de grandes quantités de phosphatase acide tartrate résistante

nécessaire à l’ostéoclasie (résorption osseuse). La morphologie de ces cellules se caractérise

par un pôle basal présentant une membrane plissée. Cette bordure en brosse est formée par

des extensions en « doigts » (Couret, 2004).

II.2.5. Equilibre osseux

Le remodelage osseux et le renouvèlement harmonieux de la masse osseuse nécessitent un

équilibre subtil entre l’activité de résorption osseuse assurée par les ostéoclastes et la

minéralisation osseuse réalisée par les ostéoblastes. Un mauvais équilibre entre ces deux types

cellulaires est responsable de nombreuses pathologies du remodelage osseux. Une activité

ostéoclastique trop importante est responsable de l’ostéoporose, une activité ostéoblastique

incontrôlée peut entrainer des pathologies osseuses telles que l’ostéopétrose ou

l’ostéosclérose.

Le bon équilibre et la communication entre les cellules osseuses, notamment entre les

ostéoclastes et les ostéoblastes, sont essentiels dans le contrôle de l’infection osseuse. En

effet, les cellules osseuses jouent un rôle primordial dans le contrôle de l’infection et

l’éradication bactérienne. Les ostéoclastes sont des cellules phagocytaires et sont décrites

comme cellules présentatrices d’antigènes.

Les IOA sont des modèles importants pour comprendre la physiopathologie des infections

invasives à staphylocoques, premiers agents étiologiques des IOA, comme en témoigne le

nombre croissant de publications dans la base de données Pubmed (en utilisant comme mots-

clefs « Staphylococcus » et « osteomyelitis ») : 233 articles pour la période 1995-2000, 294

entre 2000 et 2005 et 504 pour la période 2005-2010.

II.3. Infections ostéo-articulaires d’origine bactérienne.

Les infections ostéo-articulaires (IOA) rassemblent : i) une diversité de situations

cliniques en fonction du site ostéo-articulaire atteint, du ou des germes impliqués, du terrain,

de la présence ou non de matériel (prothèses, ou matériel d’ostéosynthèse) et ii) une grande

variété évolutive (aigüe, chronique, récidive, récurrence,…). Tous les os peuvent être atteints,

principalement les os longs. Les IOA surviennent majoritairement au niveau des membres

inférieurs, avec en premier lieu le genou puis la hanche. Le développement d’une IOA est en

fait multifactoriel et repose sur l’interaction entre l’organisme hôte et l’agent invasif.

S. aureus et les SCoN sont les deux familles d’agents bactériens qui prédominent dans ce type

d’infections, qui regroupent différentes formes cliniques.

II.3.1. Les infections primitives.

Les IOA qui surviennent de manière primitive regroupent trois grands types de

pathologies : les arthrites, les ostéomyélites et les spondylodiscites.

II.3.1.1. L’arthrite septique.

L’arthrite septique est une infection d’une articulation due à la présence et au

développement d’une bactérie au sein même de celle-ci. Elle se différencie des arthrites post-

infectieuses ou réactionnelles au cours desquelles le germe se développe à distance de

l’articulation. La multiplication du germe dans l’articulation engendre un épanchement

purulent qui contient des enzymes protéolytiques libérées par les polynucléaires neutrophiles,

responsables de la destruction articulaire. En l’absence d’un traitement antibiotique adapté, le

risque d’envahissement septique local voire général est élevé. La mortalité est estimée à près

de 11 % et la morbidité atteint 40 à 50 % (Goldenberg, 1998, Shirtliff et Mader, 2002).

II.3.1.2. L’ostéomyélite.

C’est une infection des métaphyses ou des épiphyses au contact des cartilages de

croissance, touchant n’importe quel os en croissance dont le foyer infectieux est le plus

souvent unique et au voisinage des cartilages fertiles. Dans sa forme aigüe, l’ostéomyélite se

localise surtout au niveau des métaphyses fertiles des os longs à la suite d’une bactériémie. La

guérison est obtenue si un traitement antibiotique est débuté précocement, associé à une

immobilisation. Dans le cas contraire, l’infection peut s’étendre en direction de la diaphyse.

II.3.1.3.La spondylodiscite.

La spondylodiscite infectieuse est une infection d’un ou plusieurs disques

intervertébraux et des deux vertèbres adjacentes. Primitives, ces infections sont généralement

secondaires à une bactériémie ou à une infection de voisinage. En absence de traitement

(habituellement une antibiothérapie adaptée et une immobilisation), cette infection peut

évoluer vers l’extension locale et être associée à des lésions neurologiques parfois

irréversibles.

II.3.2. Les infections secondaires.

Ces infections sont issues d’un traumatisme (fracture ouverte, par exemple) ou

surviennent après un geste invasif (ponction, infiltration, chirurgie). Selon le segment de

squelette atteint, il peut s’agir d’une ostéite, d’une arthrite ou d’une spondylodiscite

infectieuse. Les ostéites résultent donc d’une inoculation directe du germe et, en cas de mise

en place de matériel, la pathogénie rejoint celle des infections sur prothèse.

II.3.3. Les infections sur matériel.

Ces IOA, surviennent sur un matériel orthopédique implanté ((prothèse de genou,

hanche,…) ou matériel d’ostéosynthèse (plaque, vis,…)). Ce sont des pathologies graves qui

peuvent engager le pronostic fonctionnel et le pronostic vital du patient. Ces infections sont

sources de difficultés de diagnostic et thérapeutiques, et sont associées à une importante

morbidité et à un coût médical élevé dû à la nécessité d’interventions, d’hospitalisations et

d’antibiothérapies de longue durée. L’attitude thérapeutique (antibiothérapie, chirurgie en un

ou deux temps) lors d’une infection sur matériel dépend du délai de survenue de l’infection,

de la nature du germe en cause et de la nature du terrain.

III. Mécanismes physiopathologiques des IOA à S.

aureus et S. epidermidis

S. aureus et S. epidermidis sont à la fois les bactéries les plus fréquemment responsables

des IOA mais aussi celles qui sont les plus difficiles à éradiquer. Ces IOA ont un taux de

morbidité particulièrement important, et les difficultés d’éradication bactérienne sont

classiquement rattachées dans la littérature à l’existence de résistances aux antibiotiques

acquises par les staphylocoques (Ellington et al., 1999) et/ou au caractère potentiellement

chronique de ces infections.

III.1. Le caractère chronique et récidivant des IOA.

Le problème majeur des IOA, notamment celles causées par les staphylocoques, est le

passage à la chronicité observé chez de nombreux patients. A titre d’exemple, en 2005, un cas

a été rapporté aux Etats-Unis dans lequel un homme de 40 ans a présenté une ostéomyélite à

S. aureus récidivant 12 ans après le premier épisode, les deux souches étant génétiquement

identiques (Stevens et al., 2007).

Plusieurs travaux ont été menés pour comprendre ce passage à la chronicité, avançant

plusieurs propriétés staphylococciques pour expliquer ce phénomène, parmi lesquelles i)

l’existence de résistances acquises aux antibiotiques chez les staphylocoques (Ellington et al.,

1999), ii) la capacité de ce pathogène à développer du biofilm, iii) la sanctuarisation des

staphylocoques à l’intérieur des cellules.

III.2. La formation de biofilm

Le biofilm est une structure dynamique, composée de nombreuses molécules

polysaccharidiques comprenant entre autre des débris cellulaires et bactériens, des

composants de la matrice extra-cellulaire et de molécules d’ADN. Cette structure

tridimensionnelle en forme de champignon favorise le développement bactérien et la

communication inter-bactérienne appelée quorum sensing (Ader et al., 2004). Le biofilm créé

un microclimat favorable au développement des staphylocoques dans un milieu hostile.

La structure et la composition du biofilm permettent un échappement au système immunitaire

de l’hôte et empêchent l’action de nombreux antibiotiques (Brady, et al., 2008, Costerton, et

al., 1999, Hall-Stoodley et Stoodley, 2009). En effet, les cellules phagocytaires pénètrent mal

dans le biofilm, et peuvent perdre, en présence de biofilm, leur capacité de mobilité et de

phagocytose. De même, les bactéries empactées dans le biofilm sont peu accessibles aux

anticorps (Costerton, et al., 1999, Hall-Stoodley et Stoodley, 2009). Enfin, du fait de la faible

pénétration des agents anti-bactériens dans le biofilm (Costerton, et al., 1999) associée à leur

inactivation par certaines enzymes matricielles (Hall-Stoodley et Stoodley, 2009), à la

diminution de l’activité métabolique des bactéries vivant en phase stationnaire (Hall-Stoodley

et Stoodley, 2009), et à l’expression spécifique de certains mécanismes de résistance aux

antibiotiques au sein du biofilm (Hall-Stoodley et Stoodley, 2009), l’activité de la plupart des

antibiotiques apparaît réduite dans les biofilms bactériens. La formation de biofilm par les

staphylocoques serait en partie responsable de la persistance et de la chronicisation des

infections sur matériel.

III.3. L’internalisation de Staphylococcus

Longtemps considéré comme un pathogène extracellulaire, de récents travaux ont démontré

que les staphylocoques ont la capacité d’être internalisés dans des cellules-hôtes. A l’abri des

cellules immunitaires et des antibiotiques, les bactéries intracellulaires constituent un

réservoir bactérien pouvant expliquer la chronicité et les rechutes des IOA observées

cliniquement. L’internalisation est un phénomène observé in vitro mais, également in vivo. En

effet, Bosse et al. ont rapporté dans la littérature le cas d’un homme de 73 ans présentant une

ostéite chronique du péroné, chez lequel une biopsie osseuse a été réalisée. Par microscopie

électronique, cette biopsie a révélé la présence de S. aureus internalisés au sein d’ostéocytes

et d’ostéoblastes (figure 11) (Bosse, et al., 2005).

III.3.1. Techniques d’études

Différentes techniques ont été décrites pour quantifier l’adhésion et l’internalisation des

staphylocoques dans les cellules :

Technique « gentamicin protection assay » (GPA) :

L’une des plus utilisées repose sur l’utilisation de gentamicine. Cet antibiotique,

inactif dans le compartiment cytosolique des cellules, permet l’élimination des bactéries

extracellulaires en préservant les bactéries intracellulaires. Après une étape de co-culture

bactéries/cellules, l’ajout d’antibiotique permet d’éliminer les bactéries extracellulaires sans

impacter la survie des bactéries internalisées. Après rinçage des puits et élimination des

antibiotiques résiduels, les bactéries intracellulaires sont dénombrées après étalement des

lysats cellulaires sur gélose (Jevon, et al., 1999, Wright et Friedland, 2004).

Utilisation de bactéries modifiées génétiquement

D’autres méthodes reposent sur l’utilisation de bactéries modifiées génétiquement

dans le but d’exprimer une molécule fluorescente. Classiquement, les bactéries sont

transfectées avec le gène codant la gfp (green fluorescent protein) qui confère une

fluorescence verte constitutivement exprimée par les bactéries. Après contact

bactéries/cellules, les bactéries extracellulaires et/ou intracellulaires peuvent être localisées

grâce à l’utilisation d’un microscope à fluorescence ou quantifiées par cytométrie en flux

(Deloid, et al., 2009).

Utilisation de bactéries modifiées chimiquement

Certaines approches utilisent des staphylocoques marqués à l’aide de marqueurs

fluorescents tels que la phycoérythrine, l’isothiocyanate de fluorescéine par exemple, avant

l’étape d’infection afin qu’ils soient détectables par cytométrie en flux ou sous un microscope

à fluorescence (Agerer, et al., 2004).

III.3.2. Mécanismes d’internalisation

Ces différentes techniques ont permis de démontrer le caractère invasif des

staphylocoques dans différents types cellulaires comme les cellules endothéliales et

épithéliales humaines et bovines (Almeida et Oliver, 2001, Anaya-Lopez, et al., 2006,

Hirschhausen, et al., 2010, Lammers. S, et al., 1999, Oviedo-Boyso, et al., 2009), ou plus

rarement les ostéoblastes humains (Jevon, et al., 1999).

Le mécanisme d’internalisation des staphylocoques repose sur un processus passif sur le

versant bactérien. En effet, des staphylocoques vivants ou tués par la chaleur ont la même

capacité d’internalisation. En revanche, il s’agit d’un processus actif sur le versant cellulaire.

L’internalisation des bactéries s’apparente en fait à un phénomène de phagocytose faisant

intervenir les microfilaments d’actine comme l’ont montré Ellington et al. (1999) en utilisant

différents inhibiteurs du cytosquelette comme la colchicine, la cytochalasine ou le

monodansylcadaverine qui empêchent l’internalisation des bactéries.

Bien que les staphylocoques aient un rôle passif dans le processus d’internalisation, la

présence de plusieurs constituants staphylococciques membranaires leur est indispensable. En

fait, S. aureus possède un grand nombre de protéines exprimées à sa surface, parmi lesquelles

celles appartenant à la famille des MSCRAMMs (Microbial Surface component Recognizing

Adhesive Matrix Molecules). Ces facteurs d’adhésion, liés de façon covalente au

peptidoglycane, ont la capacité de lier les protéines de la matrice extracellulaire comme la

laminine, l’élastine, le collagène, ou encore le fibrinogène et la fibronectine (Foster et Hook,

1998). Les protéines liant la fibronectine (appelées Fibronectin binding protein (FnBP)), les

mieux caractérisées, sont nécessaires et suffisantes à l’internalisation de la bactérie par la

cellule hôte. Les gènes fnbA et fnbB codant pour les protéines FnBPA et FnBPB sont

retrouvés respectivement chez 98 % et 99 % des souches d’IOA(Wright et Nair, 2010).

Sinha et al. (2000) ont montré à l’aide de couples isogéniques (ΔfnbA/B) que

l’internalisation de S. aureus est totalement inhibée en l’absence des protéines FnBP A et B à

leur surface (Sinha, et al., 2000). Ils ont également démontré que l’intégrine humaine α5β1

présente sur la membrane cellulaire, fonctionne comme un co-ligand pour permettre une

internalisation efficace. Cette liaison semble spécifique de S. aureus comme l’ont prouvé les

travaux de Khalil et al. (2007) démontrant que l’intégrine α5β1 n’est pas impliquée dans le

processus d’invasion de S. epidermidis (Khalil, et al., 2007).

III.4. Le phénotype Small Colony Variant

III.4.1. Qu’est-ce que le phénotype Small Colony Variant ?

Une fois internalisés, les staphylocoques se trouvent à l’abri du système immunitaire et des

antibiotiques. Cette sanctuarisation des souches de S. aureus est classiquement proposée pour

expliquer la chronicité et les échecs de traitement observés au cours des IOA. Plusieurs cas

cliniques ont été décrits dans la littérature rapportant des récidives d’IOA des années après le

premier épisode avec la même souche de staphylocoque. Ceci témoigne de l’adaptation

possible des staphylocoques à la vie dans le compartiment intracellulaire. Des formes

mutantes de ces bactéries ont été retrouvées chez des patients atteints d’infections persistantes

(Acar, et al., 1978, Borderon et Horodniceanu, 1976). Les premiers phénotypes mutants ont

été décrits il y a 1 siècle par Kolle et Hetsch en 1911. Ces mutants, formant des

microcolonies, ont été appelés small colony variant (SCV). Depuis, différentes études ont

montré que des phénotypes SCV existaient chez différentes espèces de staphylocoques parmi

lesquelles des staphylocoques à coagulase négative tels que S. capitis, S. epidermidis et S.

lugdunensis, mais aussi chez S. aureus. Des espèces non staphylococciques sont également

capables de former des phénotypes SCV parmis lesquelles Escherichia. coli (Colwell, 1946),

Pseudomonas. aeruginosa (Haussler, et al., 1999), Burkholderia cepacia (Haussler, et al.,

2003), …Toutefois, les variants SCV de S. aureus restent à ce jour les mieux documentés.

Différentes caractéristiques phénotypiques ont été associées aux formes SCV chez S. aureus :

- une croissance ralentie aboutissant à la formation de colonies 10 fois plus

petites que celles formées par le phénotype sauvage,

- une réduction de l’activité hémolytique,

- une perte de coloration des colonies,

- une résistance accrue aux aminosides,

- l’altération du métabolisme bactérien (Wright et Nair, 2010).

Cette dernière caractéristique semble jouer un rôle central. Ainsi, plusieurs types de

modification du métabolisme bactérien ont été décrits et sont à l’origine d’un ralentissement

de la croissance bactérienne. Parmi les souches cliniques de staphylocoques présentant un

phénotype SCV se distinguent : i) celles présentant une interruption du fonctionnement de la

chaîne de transport d’électron, et ii) celles présentant une inhibition de la biosynthèse de la

thymidine. L’interruption de la chaîne de transport d’électron est causée par l’inhibition de la

biosynthèse de la ménadione ou de l’hémine liées respectivement à l’expression des gènes

menD et hemB (figure 14). En fait, ces SCV peuvent s’exprimer de deux façons. La plus

courante correspond à une dysrégulation de l’expression des gènes menD et hemB

probablement sous la dépendance de stimuli extérieurs qui restent actuellement mal connus,

mais qui serait vraisemblablement liée au passage intracellulaire des bactéries. De ce fait, ces

formes SCV sont capables de réverter vers une forme normale après subculture sur milieux

gélosés en raison de l’absence de ces mêmes stimuli inducteurs. Plus rarement, l’apparition

de ces SCV correspond à l’apparition de mutations dans les gènes menD et hemB, induisant

de façon stable le phénotype. Après subculture, ces SCV conservent donc leurs phénotypes

avec transmission horizontale à l’ensemble de la descendance. Ces souches deviennent dès

lors auxotrophes pour l’hémine et la ménadione. En présence de ménadione, d’hémine ou de

thymidine, les souches retrouvent un phénotype sauvage. Cette faculté de réversion observée

chez les staphylocoques SCV associée à une pousse lente et l’obtention de colonie atypique

compliquent l’identification des bactéries présentant un phénotype SCV.

III.4.2. Etudes in vitro menées sur le phénotype SCV

Différentes études ont été réalisées pour comprendre les interactions entre les cellules

eucaryotes et les SCV-S. aureus (Nguyen, et al., 2009). Afin de s’affranchir de la capacité des

bactéries possédant un phénotype SCV à réverter en phénotype sauvage, des mutants stables

de S. aureus ont été créés in vitro pour comprendre les mécanismes physiopathologiques liés

aux SCV. Chez ces mutants stables, les gènes hemB ou menD ont été inactivés (Von Eiff, et

al., 2006, Von Eiff, et al., 2006).

Des études in vitro ont été réalisées sur des cellules endothéliales, épithéliales et sur des

kératinocytes. Les SCV-S. aureus semble avoir un phénotype adapté à la vie intracellulaire,

les souches s’internalisent mieux, provoquent moins de mort cellulaire, et persistent plus

longtemps dans ces types cellulaires par rapport au phénotype sauvage.

A ce jour, alors que la présence de S. aureus-SCV est classiquement rapportée lors des

isolements à partir de prélèvement d’IOA et semble associée à des échecs cliniques, aucune

étude in vitro n’a été construite afin d’explorer le comportement des variants SCV vis-à-vis

des cellules.

IV. Problématiques

Afin de mieux connaître la physiopathologie des IOA et de comprendre le passage à la

chronicité observé chez de nombreux patients, la première étape de notre travail consiste à

mettre au point une technique permettant de quantifier précisément à la fois la capacité

d’adhésion et d’internalisation des staphylocoques sur et dans les ostéoblastes, cellules de

soutien du tissu osseux. La maîtrise d’un outil robuste de mesure était un prérequis pour la

mise en place de notre projet. Pour quantifier l’internalisation bactérienne, les méthodes

classiques de dénombrement sur gélose ont pour limites une lourdeur de réalisation, et une

précision imparfaite. Les méthodes de cytométrie en flux déjà décrites, quant à elles,

nécessitent de travailler soit sur des bactéries modifiées génétiquement pour exprimer une

molécule fluorescente (ce qui limite le nombre de souches étudiées), soit sur des bactéries

préalablement marquées (et donc modifiées) par un fluorophore en amont de l’étape

d’infection (ce qui pourrait modifier les intéractions hôte/pathogène). Cette nouvelle méthode

que nous avons cherchée à développer devrait permettre de s’affranchir de ses différentes

limites en utilisant la cytométrie en flux avec un marquage universel de l’ensemble des

staphylocoques en aval de l’étape d’infection. Cette approche devrait en outre permettre de

mesurer simultanément l’adhésion et l’internalisation de S. aureus par les cellules eucaryotes.

L’une des hypothèses proposées pour comprendre le passage à la chronicité des IOA à

Staphylococcus aureus est la capacité de ce pathogène à être internalisé par les ostéoblastes.

Cette internalisation peut être suivie par l’apparition de variants présentant un phénotype

microcolonies ou Small Colony Variant (SCV), forme adaptée à la vie bactérienne dans le

compartiment intracellulaire. Le comportement des ostéoblastes face à ces staphylocoques

SCV n’ayant jamais été exploré ; dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié

l’impact du phénotype SCV sur l’interaction S. aureus-ostéoblastes en culture en termes de

capacité d’adhésion et d’internalisation, de cytotoxicité, de réponse cytokinique, grâce à

l’utilisation de mutants stables construits in vitro.

Enfin, bien que S. aureus soit la bactérie la plus fréquemment responsable des IOA, le groupe

des staphylocoques à coagulase négative représente environ 30 à 43% des étiologies dans le

cas particulier des IOA sur matériel, au sein desquelles S. epidermidis est très largement

majoritaire. Dans une troisième partie de notre travail, nous nous sommes intéressés aux IOA

sur matériel à S. epidermidis qui sont aujourd’hui principalement expliquées par l’inoculation

bactérienne, lors de la chirurgie, des souches responsables de portage chez le patient. Or, si le

portage de S. epidermidis est décrit comme universel, les infections sur matériel orthopédique

restent peu fréquentes. En dehors du rôle indéniable des facteurs liés à l’hôte

(immunodépression par exemple) ou à l’environnement (non-respect d’une asepsie

chirurgicale stricte notamment), la question de l’expression de facteurs bactériens chez

certaines souches favorisant la survenue des IOA sur matériel parait légitime. Les souches de

S. epidermidis responsables d’IOA pourraient alors représenter une sous-population

particulière des souches de portage, que l’on pourrait distinguer par la présence de caractères

de virulence particuliers. L’objectif de ce travail a ainsi été de comparer deux populations de

S. epidermidis, l’une regroupant des souches responsables d’IOA et la seconde des souches de

portage nasal vis-à-vis de leurs capacités d’internalisation par les ostéoblastes.

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ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ECOLESSCIENCES ET VIE DE LA TERRE

Physiopathologie des infections ostéo-articulaires à Staphylococcusaureus et Staphylococcus epidermidis

Sophie TROUILLETSoutenu le 25 Octobre 2011

RESUME

Staphylococcus aureus et S. epidermidis constituent les principaux agents étiologiques desinfections ostéo-articulaires (IOA), infections sévères, volontiers chroniques et récidivantes.L’objectif de notre travail était de mieux comprendre la physiopathologie des IOA enétudiant les interactions entre les staphylocoques et les ostéoblastes (cellules spécialiséesdans l’appositionosseuse) et plus particulièrement, les phénomènes d’internalisation, depersistance et de transition phénotypique des bactéries intracellulaires.La première étape de notre travail a consisté à développer et à valider i) un modèled’infection cellulaire à S. aureus in vitro (lignée ostéoblastique MG-63) et ii) des techniquesoriginales permettant de quantifier simultanément la capacité d’adhésion etd’internalisation des staphylocoques dans les ostéoblastes par cytométrie en flux enutilisant un antibiotique ciblant la paroi des bactéries Gram positive couplé avec unfluorochrome.A l’aide des outils mis en place, nous avons étudié l’impact de la transition phénotypiquedes bactéries intracellulaires conduisant à l’expression du phénotype microcolonie ou SmallColony Variant (SCV), forme adaptée à la survie intracytoplasmique, sur l’interactionbactéries/ostéoblastes ex vivo en culture cellulaire. Des mutants stables ont été générés invitro en invalidant les gènes codant pour la biosynthèse de l’hémine (hemB) ou de laménadione (menD). Les résultats obtenus avec un couple de souches isogéniques(menD/DmenD), indiquent que les taux d’internalisation, d’adhésion, de cytotoxicité et desécrétion cytokinique sont plus faibles avec le variant SCV qu’avec la souche sauvage. Cesrésultats qui s’opposent à ceux rapportés par certains auteurs, soulignent la complexité desinteractions hôtes-pathogènes dans les modèles ex vivo, l’influence du modèle cellulaireutilisé et de la voie métabolique inactivée dans le cas des SCV. Afin de compléter nosrésultats, les mêmes expériences devraient être reproduites avec un couple de souchesisogéniques inactivées pour le gène hemB.Enfin nous nous sommes intéressés aux IOA sur matériel à S. epidermidis qui sontaujourd’hui principalement expliquées par l’inoculation bactérienne, lors de la chirurgie,des souches responsables de portage chez le patient. Or, si le portage de S. epidermidis estdécrit comme universel, les infections sur matériel orthopédique restent peu fréquentes. Lessouches de S. epidermidis responsables d’IOA pourraient donc représenter une sous-population particulière au sein des souches de portage, présentant des facteurs de virulenceparticuliers favorisant l’apparition d’une IOA. La mesure des niveaux d’adhésion etd’internalisation de souches de S. epidermidis issues de portage nasal et d’IOA sur matérieln’a pas permis de distinguer les deux populations étudiées suggérant que i) les souches de Sepidermidis constitue une seule population Homogène, ii) les souches de S. epidermidis sontaccidentels. Nos résultats démontrent également que les souches de S. epidermidisprésentent une capacité d’adhésion et d’invasion nettement plus faible que les souches de S.aureus, suggérant que l’internalisation au sein des ostéoblastes joue probbalementun rôlemoins important dans la physiopathologie des IOA à S. epidermidis que dans les IOA à S.aureus. La capacité de formation de biofilm, élément essentiel dans la chronicisation desIOA sur matériel à S. epidermidis, mériterait d’être explorée et pourrait être un facteur plusdiscriminant pour distinguer les souches invasives parmi les souches de portage.MOTS CLES : Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, ostéoblastes, adhésion,

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