BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

--------------------------------

Nguyễn Hải Minh

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA SULFATE POLYSACCHARIDE

CHIẾT TÁCH TỪ RONG LỤC CHAETOMORPHA LINUM.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2020

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

--------------------------------

Nguyễn Hải Minh

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA SULFATE POLYSACCHARIDE

CHIẾT TÁCH TỪ RONG LỤC CHAETOMORPHA LINUM.

Chuyên ngành: Hóa Phân tích.

Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Hướng dẫn 1: PGS.TS Thành Thị Thu Thủy

Hướng dẫn 2: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân

Hà Nội - 2020

i

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, đƣợc thực hiện

dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS Thành Thị Thu Thủy và PGS.TS

Trần Thị Thanh Vân. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu đƣợc trình bày

trong luận văn này hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

về lời cam đoan này.

Nha Trang, ngày ... tháng ... năm 2020

Tác giả luận văn

Nguyễn Hải Minh

ii

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên

cạnh sự nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hƣớng dẫn nhiệt tình của quý

Thầy Cô, cũng nhƣ sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt

thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ.

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Thành Thị Thu Thủy

và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân, ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ về

kiến thức, tài liệu và phƣơng pháp để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa

học này. Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Ban lãnh và toàn thể quý

Thầy, Cô phòng Đào tạo trong Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn

Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình truyền đạt những kiến

thức quý báu cũng nhƣ tạo mọi điều kiện thuận lợi tốt nhất cho tôi trong suốt

quá trình học tập nghiên cứu và cho đến khi thực hiện đề tài luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, các anh chị và các

bạn đồng nghiệp đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập,

nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh.

Nha Trang, ngày ... tháng ... năm 2020

Học viên thực hiện

Nguyễn Hải Minh

iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

APTT Activated Partial Thromboplastin

Time

Thời gian

Thromboplastin hoạt

hóa từng phần

Da Dalton Trọng lƣợng

DMSO

FT - IR

Dimethylsulfoxide

Fourier transform Infrared spectroscopy

(CH3)2SO

Quang phổ hồng ngoại

biến đổi Fourier

Gal Galactose

Glc Glucose

GPC Gel Permeation Chromatography Sắc ký thẩm thấu gel

HMBC Heteronuclear Mutiple Bond Cohence Phổ tƣơng tác dị hạt

nhân qua nhiều liên kết

1H-NMR Proton Magnetic Resonance

spectroscopy

Phổ cộng hƣởng từ hạt

nhân proton

HSQC

HPLC

Heteronuclear single-quantum

coherence

High Performance Liquid

Chromatography

Phổ tƣơng tác dị hạt

nhân qua một liên kết

Sắc ký lỏng hiệu năng

cao

IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại

MWCO Molecular weight cut-off Trọng lƣợng phân tử cắt

Mw

Mn

Molecular weight

Molecular number

Trọng lƣợng phân tử

khối

Trọng lƣợng phân tử số

13C-NMR Carbon 13 Nuclear Magnetic

Resonance spectroscopy

Phổ cổng hƣởng từ hạt

nhân carbon 13

NMR Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy

Phổ cộng hƣởng từ hạt

nhân

iv

NOESY Nuclear overhauser effect spectroscopy Phổ NOESY

TPP

PCL

Tetrapolyphosphate

Polysaccharide Chaetomorpha ligustica

RID Refractive Index Detector Đầu dò RID

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần loài và phân bố của rong lục ....................................... 10

Bảng 1.2. Phân loài rong lục trên thế giới có sulfate polysaccharide ............ 16

Bảng 1.3: Một số nhóm đặc trƣng của phổ FT-IR của polysaccharide. ......... 23

Bảng 1.4. Độ chuyển dịch hoá học δ (ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của

dạng glucose và galactose ............................................................................... 26

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hiệu suất chiết polysaccharide .......... 41

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ DM:NL lên hiệu suất chiết polysaccharide .. 42

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian chiết lên hiệu suất chiết polysaccharide 42

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của pH đến hiệu suất chiết polysaccharide ................. 43

Bảng 3.5. Hiệu suất chiết tách polysaccharide (% khối lƣợng rong khô) ...... 44

Bảng 3.6. Thành phần hóa học của rong (% trọng lƣợng rong khô) .............. 46

Bảng 3.7. Thành phần hóa học của polysaccharide (%w/w) .......................... 48

Bảng 3.8. Kết quả đánh giá hoạt tính oxi hóa của SP1 và SP2 ....................... 48

Bảng 3.9. Kết quả đánh giá hoạt tính chống đông tụ máu của SP1 và SP2 .... 49

Bảng 3.10. Khả năng chống đông tụ máu của SP1 ......................................... 50

Bảng 3.11. Kết quả đo GPC của SP1 và SP2 .................................................. 51

Bảng 3.12. Kết quả phân tích phổ IR của SP1 ............................................... 52

Bảng 3.13. Kết quả phân tích phổ 1H và

13C NMR ........................................ 60

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1. Hình ảnh về một số loài rong nâu ..................................................... 5

Hình 1.2. Hình ảnh về một số loài rong đỏ ....................................................... 6

Hình 1.3. Hình ảnh về một số loài rong lục ...................................................... 7

Hình 1.4. Hình ảnh về rong Chaetomorpha linum ............................................ 9

Hình 1.5. Cấu trúc một số phân đoạn của arabinogalactan chiết từ rong lục chi

Chaetomorpha ................................................................................................. 19

Hình 1.6. (a) Phổ 1H-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan;

(b) Phổ 13

C-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan ................ 25

Hình 1.7. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong phân tử polysaccharide

......................................................................................................................... 28

Hình 1.8. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo SAXS ........................................ 29

Hình 2.1. Hình ảnh rong Chaetomorpha linum a) và Chaetomorpha ligustica b)

......................................................................................................................... 31

Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của polysaccharide C.ligus a) và C.linum b) ........... 45

Hình 3.2. Sắc ký đồ phép đo GPC của 2 mẫu SP1 Và SP2 ............................ 51

Hình 3.3. Phổ IR .............................................................................................. 52

Hình 3.4. Phổ 1H NMR ................................................................................... 54

Hình 3.5. Phổ 13

C NMR .................................................................................. 55

Hình 3.6. Phổ COSY ....................................................................................... 56

Hình 3.7: Phổ HSQC ....................................................................................... 58

Hình 3.8: Phổ HMBC ...................................................................................... 59

Hình 3.9. Cấu trúc hóa học của arabinogalactan sulphate .............................. 60

Hình 3.10. Biểu đồ Kratky của dung dịch SP1 1% trong nƣớc ...................... 61

Hình 3.11. Biểu đồ Guinier của dung dịch SP 1% .......................................... 62

vii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. RONG BIỂN VÀ SULFATE POLYSACCHARIDE TỪ RONG BIỂN .. 3

1.1.1. Phân loài rong biển .................................................................................. 4

1.1.2. Giới thiệu về rong Lục Chaetomorpha linum ......................................... 8

1.1.2.1. Tên gọi và phân loại thực vật ............................................................... 8

1.1.2.2. Đặc điểm loài, phân bố, sử dụng .......................................................... 9

1.1.3. Thành phần dinh dƣỡng, ứng dụng của rong biển và polysaccharide từ

rong biển .......................................................................................................... 11

1.1.4. Sulfate polysaccharide từ rong biển ...................................................... 14

1.1.4.1. Sulfate polysaccharide từ rong nâu .................................................... 14

1.1.4.2. Sulfate polysaccharide từ rong đỏ ...................................................... 15

1.1.4.3. Sulfate polysaccharide từ rong lục ..................................................... 15

1.1.4.4. Polysaccharide chiết xuất từ rong lục chi Chaetomorpha .................. 18

1.1.4.5. Hoạt tính sinh học của polysaccharide chiết xuất từ một số loài rong

lục chi Chaetomorpha ..................................................................................... 19

1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA

POLYSACCHARIDE ..................................................................................... 21

1.2.1. Phƣơng pháp sắc kí thẩm thấu gel (GPC) ............................................. 21

1.2.2. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR) ........................................................ 22

1.2.3. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) .............................. 24

1.2.4. Phƣơng pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) .......................................... 29

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 31

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 31

2.2. THU THẬP VÀ XỬ LÝ RONG .............................................................. 31

viii

2.3. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ SULFATE POLYSACCHARIDE ........ 32

2.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC ......................................................................... 34

2.4.1. Phân tích thành phần hóa học ............................................................... 34

2.4.1.1. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học của rong ........................ 34

2.4.1.2. Phân tích thành phần hóa học của sulfate polysaccharide [33, 34] ... 36

2.4.2. Phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ............................................ 38

2.4.3. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR) ........................................................ 38

2.4.4. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) .............................. 38

2.4.5. Phƣơng pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) .......................................... 38

2.5. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC.................................................... 39

2.5.1. Hoạt tính chống oxy hóa ....................................................................... 39

2.5.2. Hoạt tính chống đông tụ máu ................................................................ 39

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 41

3.1. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT

......................................................................................................................... 41

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC ............................ 46

3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SİNH HỌC ................................. 48

3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC ..................................................... 50

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 64

4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 64

4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 65

1

MỞ ĐẦU

Rong biển là nguồn các hoạt chất sinh học bao gồm carotenoid, các axit

béo, vitamin, muối khoáng... Trong số các hoạt chất sinh học trên thì

polysaccharide là chất thu hút các nhà nghiên cứu và nhà sản xuất thực phẩm

chức năng nhất do có cấu trúc đa dạng và hoạt tính sinh học phong phú.

Rong lục đƣợc biết đến nhƣ là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất

có hoạt tinh sinh học nhƣ lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid,

hợp chất phenolic, alkaloid,… trong đó polysaccharide đƣợc quan tâm nghiên

cứu nhiều nhất do khả năng ứng dụng đa dạng của nó. Việt Nam là đất nƣớc

có một vùng biển nhiệt đới rộng với bờ biển dài hơn 3000 km, là nguồn cung

cấp các loài rong biển phong phú và đa dạng, rong lục với trữ lƣợng rất lớn

lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về các chi Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha,

Enteromorpha, trong đó chi Chaetomorpha gồm 69 loài với loài phổ biến

nhất ở biển Nha Trang là Chaetomorpha linum [13].

Nhƣ đã biết, cấu trúc của polysaccharide biến đổi tùy theo loài rong, vị

trí địa lí thu hái cũng nhƣ phƣơng pháp chiết. Vì thế, mỗi loại polysaccharide

mới đƣợc chiết tách từ một loại rong biển là một hợp chất mới với cấu trúc

riêng và do vậy tiềm ẩn hoạt tính sinh học mới. Với hơn 150 loài đã đƣợc

định danh, ngành rong lục ở nƣớc ta có tiềm năng lớn nhƣng việc khai thác

nguồn tài nguyên biển này còn hạn chế khi so sánh với ngành rong đỏ và rong

nâu. Nguyên nhân một phần là do các thành phần có hoạt tính bao gồm các

polysaccharide từ rong lục chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều. Polysaccharide chiết

tách từ rong đỏ và rong nâu nhƣ carrageenan, alginate và fucoidan đã đƣợc

nghiên cứu và thu đƣợc các kết quả tốt ứng dụng vào cuộc sống thì cho đến

nay rất ít công bố về polysaccharide từ các loài thuộc ngành rong lục nói

chung và chi Chaetomorpha nói riêng. Trên thế giới hoạt tính chống đông tụ

máu và chống huyết khối là tính chất đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất của

sulfate polysaccharide chiết tách từ rong biển chi Chaetomorpha.

Ở Việt Nam, rong lục chi Chaetomorpha hay còn gọi là rong mền có trữ

lƣợng không lớn so với các chi rong khác gồm các loài chủ yếu nhƣ

2

Chaetomorpha linum, Chaetomorpha ligustica, Chaetomorpha antennia và

Chaetomorpha sinensis đƣợc tìm thấy ở những vùng nƣớc lợ.

Với mong muốn góp một cái nhìn đầy đủ hơn về nguồn lợi rong lục ở

Việt Nam đặc biệt của các chi rong sinh trƣởng ở vùng nƣớc lợ, từ đó định

hƣớng sử dụng nguồn nguyên liệu này, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu của

luận án “Phân tích cấu trúc của sulfate polysaccharide chiết tách từ rong lục

Chaetomorpha linum” với mục tiêu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá

hoạt tính sinh học của sulfate polysaccharide từ loài Chaetomorpha linum ở

Việt Nam.

Mục tiêu của đề tài:

Xác định thành phần, cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học

của sulfate polysaccharide chiết tách từ rong lục Chaetomorpha linum thu

thập ở vùng biển Khánh Hòa.

Để đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu đặt ra, các nội dung nghiên cứu cụ thể

là:

1. Thu thập và định danh rong lục Chaetomorpha linum.

2. Chiết tách, tinh chế sulfate polysaccharide từ loài rong này.

3. Nghiên cứu đặc trƣng cấu trúc của sulfate polysaccharide thu đƣợc.

4. Đánh giá hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính chống oxi hóa và

chống đông tụ máu của polysaccharide.

3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. RONG BIỂN VÀ SULFATE POLYSACCHARIDE TỪ RONG BIỂN

Rong biển hay còn gọi là tảo bẹ, tên khoa học là marine – algae, marine

plant hay seaweed là nững loài thực vật sinh sống ở biển, thuộc nhóm tảo

biển. Rong biển có thể sống ở cả hai môi trƣờng nƣớc mặn và nƣớc lợ, chúng

mọc trên các rạn san hô hoặc trên các vách đá, có thể mọc dƣới tầng nƣớc sâu

với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp. Chúng có thể là

đơn bào hay đa bào sống thành quần thể. Có kích thƣớc hiển vi hoặc có thể

dài hàng mét [24].

Các yếu tố sinh thái có thể ảnh hƣởng đến đời sống của rong biển nhƣ:

địa bàn sinh trƣởng, nhiệt độ, ánh sáng, độ muối, độ pH, muối dinh dƣỡng,

khí hòa tan trong nƣớc, mức chiều, sóng, gió, hải lƣu…

Rong biển từ những năm cuối thế kỉ XIX đã đƣợc sử dụng để chế ra xà

phòng bằng việc chiết các chất K2O, Na2O lấy từ rong biển. Sau đó ngƣời ta

lại phát hiện trong rong nâu chứa Iod do đó ngƣời ta sử dụng rong nâu để

chiết Iod. Đến đầu thế kỉ XX, Mỹ và Đức dùng rong nâu để điều chế KCl và

than hoạt tính… Tuy nhiên các ứng dụng này của rong biển đều đƣợc thay thế

bằng các nguyên liệu khác. Đến năm 1930 công nghệ chế biến các chất nhƣ

alginate, mannitol, agar từ rong biển ra đời và phát triển cho đến ngày nay.

Giá trị công nghiệp của rong biển là cung cấp các chất keo rong quan

trọng nhƣ agar, alginat, carrageenan, furcellazan dùng cho công nghiệp thực

phẩm, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, công nghệ sinh học…

Rong biển có giá trị dinh dƣỡng cao khi cung cấp đầy đủ các chất

khoáng, đặc biệt là các nguyên tố vi lƣợng, các acid amin cần thiết cho cơ thể,

các loại vitamin (nhóm A, B, C, E…), các carbohydrat đặc trƣng và các chất

có hoạt tính sinh học (lectin, sterol, antibiotics,…) có lợi cho cơ thể và có khả

năng phòng bệnh tật (huyết áp, nhuận tràng, béo phì, đông tụ máu). Do đó

4

ngày nay rong biển đƣợc xếp vào loại thực phẩm chức năng và đang ngày

càng đƣợc ƣa chuộng trên thế giới.

1.1.1. Phân loài rong biển

Trên thế giới, các nhà khoa học đã xác định đƣợc khoảng 10.000 loài

rong biển. Căn cứ vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, thành phần sắc

tố, nơi sinh sống mà rong biển đƣợc chia thành 10 ngành bao gồm:

Rhodophyta, Phaetophyta, Cyanophyta, Chlorophyta, Xanthophyta,

Euglenophyta, Chrysophyta, Pyrrophyta, Cryptophyta, Bacillarriophyta.

Trong đó 3 ngành rong đỏ (Rhodophyta), rong nâu (Phaetophyta), rong lục

(Chlorophyta) có tiềm năng kinh tế lớn, đƣợc nghiên cứu khai thác nhiều. So

với các nƣớc vùng Đông Nam Á, nƣớc ta thuộc vào nƣớc có nguồn rong biển

đa dạng và phong phú [20].

Các khảo sát điều tra cho thấy số lƣợng các loài rong biển tại các vùng

biển nhƣ sau: Phú Quốc có 108 loài; Trƣờng Sa 66 loài; Vịnh Hạ Long 99

loài; Cồn Cỏ 48 loài; Bạch Long Vĩ 46 loài. Riêng vùng Nha Trang có 210

loài. Năm 2003, tác giả Đàm Đức Tiến, Trần Đình Toại và CS cho biết riêng

vùng ven biển Bắc Bộ đã có 259 loài [10, 11].

Với tổng số gần 800 loài rong tìm thấy ở vùng biển Việt Nam, các nhà

khoa học Việt Nam cùng thống nhất xếp chúng vào 3 ngành trong hệ thống

phân loại 10 ngành của Gollerbakh năm 1977 [12]:

+ Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

+ Ngành rong nâu (Phaeophyta)

+ Ngành rong lục (Chlorophyta)

Rong nâu: Là loài rong thƣờng có kích thƣớc lớn, loại lớn thƣờng dài

khoảng 20 mét, loài trung bình dài từ 2-4 mét, các loài nhỏ hơn dài từ 30 - 60

cm [2]. Chúng chứa sắc tố xanthophyll-fucoxanthin cùng với chlorophyll a và

c nên cá thể của rong nâu đều thể hiện màu nâu lục đặc trƣng. Rong nâu là

loài rong phổ biến nhất với trữ lƣợng lớn, khoảng 1800 loài, thƣờng sinh

trƣởng ở vùng biển đá, nƣớc biển lạnh thuộc bán cầu Bắc, chúng không chỉ

5

mọc trên đá mà còn trên các chân đập, cầu cảng, san hô, động vật thân mềm

và ngay cả trên các loài rong khác.

Rong nâu phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp đến là Canada, Việt

Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ…. Trƣớc đây, rong nâu

đƣợc sử dụng để tách iodine và kalium. Trong thời gian gần đây, rong nâu

đƣợc khai thác rộng rãi để chiết tách alginate và fucoidan. Hình 1.1 là ảnh của

một số loài rong nâu.

Sargassum microcystum Padina australis

Hình 1.1. Hình ảnh về một số loài rong nâu

Rong đỏ: Là loài rong có kích thƣớc nhỏ hơn rong nâu, thƣờng dài từ

vài centimet đến hàng mét; tuy nhiên rong đỏ không luôn luôn có màu đỏ:

thỉnh thoảng chúng có màu tím, thậm chí là nâu đỏ nhƣng chúng vẫn đƣợc

xếp vào ngành rong đỏ do những đặc tính khác nhƣ màu sắc của chúng là do

các hạt sắc tố phycobilin tạo thành, phycobilin là sắc tố đặc trƣng cho rong

đỏ. Ngành rong đỏ có khoảng 6500 loài, gồm 400 chi thuộc nhiều họ. Phần

lớn các loài rong đỏ sống ở biển, có cấu tạo từ nhiều tế bào, trừ một số ít

thuộc dạng một tế bào hay quần thể. Rong đỏ có dạng hình trụ dẹp dài, phiến

chia hoặc không chia nhánh, phần lớn chia nhánh kiểu một trục, một số ít theo

kiểu hợp trục [26, 20]. Hình 1.2 là ảnh của một số loài rong đỏ.

6

Porphyra Vietnameusis Acanthophora spicifera

Hình 1.2. Hình ảnh về một số loài rong đỏ

Rong đỏ phân bố nhiều ở Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Chile,

Indonesia, Philippine tiếp đến là Thailand, Brazil, Pháp, Trung Quốc, Hawaii,

Ấn Độ, Anh, Mỹ … Trên thế giới, rong đỏ đƣợc sử dụng với khối lƣợng lớn

để phục vụ cuộc sống con ngƣời, một số loài có hàm lƣợng cao về agar,

carageenan, furcellaran đƣợc sử dụng để chế biến keo rong biển và làm phụ

gia thực phẩm.

Các loài rong đỏ đƣợc chia thành hai nhóm chính [12]:

- Nhóm rong cho agar (Agarophit): Bao gồm các loại nhƣ Gelidium,

Gracilaria và Acanthopeltis.

- Nhóm rong cho carrageenan (Carrageenophit): Bao gồm các loại

nhƣ Gigartina, Eucheuma, Chondrus, Iridaea và Furcellaria.

+ Ngành rong lục (Chlorophyta)

Rong lục là loài rong có kích thƣớc nhỏ giống nhƣ rong đỏ, chúng bao

gồm cả những loài đơn bào và đa bào. Rong lục chứa chlorophylls cả hai dạng

a và b. Trên thế giới, rong lục phân bố chủ yếu tập trung tại Philipine, tiếp

theo là Hàn Quốc, Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam với các loài

nhƣ Ulva reticulata, Ulva lactuca, Caulerpa racemosa,… Ngoài ra, rong lục

còn phân bố rải rác ở các nƣớc: Canada, Chile, Pháp, Israel, Italy, Malaysia,

Achentina, Bangladesh… [20]. Hình 1.3 là ảnh của một số loài rong lục.

7

Theo các mô tả của tác giả Nguyễn Hữu Dinh, Phạm Hoàng Hộ,

Tsutsuicho đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm thấy trong ngành rong lục có

trên dƣới 360 chi và hơn 5700 loài, phần lớn là sống trong nƣớc ngọt, còn

nƣớc mặn chủ yếu là những chi sau đây: Monostroma, Enteromorpha, Ulva,

Ulothrix, Rhizoclonium, Cladophora, Chaetomorpha, Cladophoropsỉs,

Boergesenm, Valonia, Valoniopsis, Struvea, Boodlea, Microdyction,

Caulerpa, Bryopsis, Codium, Acetabularia v.v...

Hình 1.3. Hình ảnh về một số loài rong lục

Chúng có nhiều hình dạng và kích thƣớc khác nhau nhƣ: dạng sợi, dạng

vảy, dạng lá cờ, …Thành tế bào cấu tạo từ xenluloza và pectin. Rong lục có

màu xanh do các sắc tố diệp lục a và b chiếm ƣu thế. Ngoài ra, chúng cũng

chứa một vài các sắc tố khác nhƣ: β-carotenes, lutein, xanthophylls,… Chất

diệp lục cho phép chúng hấp thụ ánh sáng mặt trời, thực hiện quá trình quang

hợp để chuyển hóa nó thành thức ăn, nuôi sống tế bào.

8

Trong số các loài rong lục đƣợc biết đến, có khoảng 10% sống ở biển,

còn lại sống ở các vùng nƣớc ngọt, nƣớc lợ - những nơi có nhiều ánh sáng

mặt trời.

Ngành rong lục đƣợc chia thành 5 lớp: Chlorophyceae, Ulvophyceae,

Trebouxiophyceae, Pedinophyeae, Chlorodendrophyceae. Trong đó,

Chlorophyceae, Ulvophyceae, Trebouxiophyceae là 3 lớp chiếm số lƣợng

nhiều nhất, cũng nhƣ cung cấp nguồn polysaccharide nhiều nhất.

Nguyên sinh chất có thành mỏng, ngay sát thành là vỏ tế bào; ở giữa là

một túi lớn chứa đầy dịch bào. Trong chất nguyên sinh còn có những túi nhỏ

chứa sản phấm của quá trình trao đổi chất. Thành phần nguyên sinh chất: Thể

sắc tố có nhiều dạng khác nhau: phiến, đai vành móng ngựa, sao nhiều cạnh,

xoắn lò xo, mắt lƣới, hạt nhỏ v.v...; sắc tố chủ yếu là chlorophyll và

carotenoid, trong thể sắc tố còn có các hạt tạo bột hình tròn nhỏ và chứa tinh

thể protit ở giữa, hạt tạo bột khi gặp dung dịch KI dễ bắt màu, nên trở thành

một trong những tiêu chuẩn phân loại. Nhân thƣờng nằm ở giữa khoang túi

dịch bào, hay sát bên thành lớp nguyên sinh, thể nhiễm sắc hình que ngắn hay

hạt nhỏ. Trong dịch bào, sản phẩm của quá trình trao đổi chất chủ yếu là

đƣờng, tanin, sunfat canxi và các chất có màu antoxyan. Ở một vài loài, sản

phẩm quang hợp không phải là tinh bột mà là những giọt giống nhƣ chất bơ.

Sinh sản bằng nhiều hình thức khác nhau. Sinh sản dinh dƣỡng: một tế

bào mẹ cắt thành hai tế bào mới; loại nhiều tế bào thì có thể một phần cơ thể

đứt ra rồi phát triển thành cây riêng khác. Sinh sản vô tính: tế bào dinh dƣỡng

phân chia thành nhiều bào tử, gặp điều kiện thuận lợi hình thành vỏ tế bào và

phát triển thành cá thể mới. Sinh sản hữu tính bằng sự thụ tinh giữa phối tử

đực với phối tử cái, phức tạp hơn là đã hình thành tinh tử và trứng gọi là noãn

phối. Sự hiểu biết chi tiết về sinh sản sẽ là tiền đề tạo ra sinh khối bền vững

cho phát triển nhiên liệu.

1.1.2. Giới thiệu về rong Lục Chaetomorpha linum

1.1.2.1. Tên gọi và phân loại thực vật

Tên gọi: Tên khoa học Chaetomorpha linum

9

Phân loại thực vật:

- Giới: Plantae

- Ngành: Chlorophyta

- Lớp: Ulvophyceae

- Bộ: Cladopholares

- Họ: Cladophoraceae

- Chi: Chaetomorpha

- Loài: Chaetomorpha linum

1.1.2.2. Đặc điểm loài, phân bố, sử dụng

Hình 1.4. Hình ảnh về rong Chaetomorpha linum

Chaetomorpha linum có dạng sợi, không phân nhánh, màu xanh đậm,

dài từ 5 – 10 cm, các sợi rong khá thô, rối, đan xen nhau, đƣờng kính (40-) 60

– 80 (-100) µm. Các tế bào hình trụ, dài từ 1 – 3 (-4) µm. Thành tế bào dày,

dày từ 2 – 3 (-5) µm, nhiều lớp, không bị giới hạn bởi các liên kết, khớp nối

[27]. Các tế bào đa nhân với 20 – 50 nhân mỗi tế bào. Tế bào cơ sở có đƣờng

kính từ 50 – 300 µm, và dài từ 350 – 450 µm, phần cuối tế bào có dạng thùy,

mỏng, mịn [27, 28]. Phát triển trên các chất nền cứng, ở khu vực giữa mực

thủy triều cao và thấp (vùng ven bờ), đôi khi chúng phát triển trên nền đất

10

mềm, hoặc biểu mô trên các loài rong khác ở các khu vực có mái che hay cửa

sông.

Chaetomorpha linum có ở khu vực Bắc Cực, châu Âu, biển Trắng, biển

Đen, quần đảo Đại Tây Dƣơng, Bắc, Trung và Nam Mỹ, châu Phi, các đảo Ấn

Độ Dƣơng, Tây Nam Á, châu Á (Trung Quốc, Nga: đảo Commander,

Kamchatka, vịnh Karaginsky, đảo Sakhalin), Đông Nam Á (Việt Nam, Thái

Lan, Singapore, Philippines), Australia, New Zealand, Thái Bình Dƣơng [24].

Loài Chaetomorpha linum nói riêng và chi rong Chaetomorpha nói

chung có khả năng chịu đƣợc dao động nhiệt độ cao (22 – 450C), và phát triển

tốt trong môi trƣờng có độ mặn cao (32 – 38‰), vì vậy chúng xuất hiện nhiều

vào tháng 4 – 12 trong năm [4]. Điều này đƣợc thể hiện trong bảng 1.1 dƣới

đây:

Bảng 1.1: Thành phần loài và phân bố của rong lục tại các điểm nghiên cứu

STT Tên loài Địa điểm Sinh

cảnh

Nhiệt độ

(0C)

Độ

mặn

(‰)

Sinh

lƣợng

(g

khô/m2)

Độ

phủ

(%)

1

Chaetomorpha

Linum

(Müller)

Kützing

Đồng rọ, Vĩnh

Thái, Nha

Trang

Ao

tôm 23 - 45 38 340 60

2

Chaetomorpha

Capillaris

(Kützing)

Børgesen

quốc Lộ 1A,

Cam Thịnh

Đông, Cam

Ranh

Ao xử

lý

nƣớc

22 - 44 35 210 45

3 Chaetomorpha

aerea

Cầu Trà Long

1, Ba Ngoài,

Ao xử

lý 23 - 44 36 300 80

11

(Dilwyn)

Kützing

Cam Ranh nƣớc

4

Chaetomorpha

javanica

Kützing

Phƣớc Trung,

Phƣớc Đồng,

Nha Trang

Ao

hoang 22 - 45 31 150 40

5

Chaetomorpha

ligustica

Kützing

Tuần Lễ, Vạn

Thọ, Vạn

Ninh

Ao

tôm 22 - 45 32 180 35

Ở Việt Nam, rong Chaetomorpha lium đƣợc tìm thấy chủ yếu ở vùng

ven biển, các ao nuôi thủy hải sản, kênh tƣới tiêu vùng nƣớc lợ nhƣ Nha

Trang, Khánh Hòa… Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, loài rong này có vai trò

quan trọng trong ngành nuôi tôm thẻ chân trắng, tôm sú khổng lồ. Bằng việc

tích hợp hệ thống nuôi tôm và rong này, lƣợng thức ăn thô hoặc khô cho tôm

sú có thể giảm 40% so với nuôi bằng thức ăn thƣơng mại trong cùng điều

kiện. Đồng thời, Chaetomorpha linum đã làm tốc độ tăng trƣởng của tôm sú

khổng lồ lên tới 157% ở giai đoạn con non. Bên cạnh đó, loài Chaetomorpha

lium nói riêng và ngành rong lục nói chung có hàm lƣợng carbohydrate cao, là

nguồn sinh khối thực vật tiềm năng cho sản xuất ethanol.

1.1.3. Thành phần dinh dƣỡng, ứng dụng của rong biển và

polysaccharide từ rong biển

Theo thống kê của FAO (1997) sản lƣợng rong biển trên toàn thế giới

đạt khoảng 7 triệu tấn rong tƣơi một năm. Năm 2001 rong nuôi trồng đạt sản

lƣợng 10.562.279 tấn tƣơng đƣơng với khoảng 5.784.324.000 USD. Trong đó

20% đƣợc sử dụng cho việc sản xuất các loại keo rong biển nhƣ: Agar,

Alginat, Carragenan, các phân loại Oligosaccharide và chế biến thức ăn gia

súc và làm phân bón. Số còn lại củ yếu dùng trực tiếp làm thức ăn cho ngƣời

[12]. Doanh thu hàng năm từ kinh tế rong biển trên thế giới ƣớc tính khoảng

trên 5 tỉ USD. Rong biển cung cấp đầy đủ các chất khoáng nhất là các nguyên

tố vi lƣợng, các acid amin, các cacbohydrate đặc trƣng (mono, olygo-, poly-

12

saccharide) và các chất hoạt tính sinh học (sterol, anti-bioties) có lợi cho cơ

thể và khả năng phòng chữa bệnh tật (huyết áp, nhuận tràng, béo phì, sơ vữa

động mạch…). Vì vậy ngày nay rong biển đƣợc xếp vào loại thực phẩm chức

năng và ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới.

Từ lâu con ngƣời đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho rất nhiều

ngành công nghiệp nhƣ thực phẩm, dệt may, mỹ phẩm, dƣợc phẩm. Rong còn

đƣợc dùng để làm phân bón, cung cấp nhiều K, Ca, P cho đất.... Rong biển

đƣợc coi là loại thực phẩm có giá trị cao, cả góc độ ẩm thực và dinh dƣỡng.

Tại các nƣớc trong vùng châu Á - Thái Bình Dƣơng, rong biển đƣợc

tiêu thụ nhiều nhất, chiếm 80% tổng sản lƣợng toàn cầu, châu Âu chỉ tiêu thụ

1%, rong biển đƣợc dùng nhiều để nấu súp, làm sushi, trộn salad….

Thành phần hóa học của rong biển bao gồm lipid, protein, peptide,

polysaccharide, carotenoid, các hợp chất phenolic, alkaloid... Trong đó,

polysaccharide là thành phần chính của rong biển, đƣợc coi là nguồn đƣờng

vô tận của rong biển, đƣợc cho là rất có giá trị về mặt kinh tế và đƣợc các nhà

khoa học quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cho mục đích y học. Ngoài chức

năng là làm vật liệu tạo nên thành tế tào, các polysaccharide giữ nhiều chức

năng quan trọng khác đối với tế bào nhƣ trao đổi chất và bảo vệ tế bào do

chúng có độ bền cơ học cao.

Từ rong biển, ngƣời ta đã sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm mà tổng

giá trị hàng năm đƣợc ƣớc tính đạt cỡ 5,5-6,0 tỷ USD. Trong đó, các

polysaccharide đóng góp phần lớn giá trị của rong. Các sản phẩm mỹ phẩm,

nhƣ kem bôi da, nƣớc hoa (mỹ phẩm lỏng) mà trong nhãn của nó có chứa các

cụm từ “marine extract”, “extract of alga”, “seaweed extract” hoặc tƣơng tự,

thƣờng có nghĩa là nó chứa một trong số các hydrocolloid đƣợc chiết từ rong

biển.

Các nghiên cứu về giá trị thành phần dinh dƣỡng của rong biển cho

thấy rong biển rất giàu dƣỡng chất, ngoài thành phần đạm rất cao, rong biển

còn chứa rất nhiều khoáng chất, các yếu tố vi lƣợng trong đó nổi bật là iodine

(yếu tố vi lƣợng tối cần thiết cho tuyến giáp), các vitamin (A, E, C, B12 và

13

B1) và chất xơ [2]. Hàm lƣợng sinh tố A trong rong biển cao gấp 2 - 3 lần so

với cà rốt, gấp 10 lần trong bơ, hàm lƣợng calcium cao gấp 3 lần so với sữa

bò, vitamin B2 cao gấp 4 lần trong trứng, vitamin C, E cao gấp nhiều lần

trong rau quả [5].

Thực tiễn cho thấy rong biển còn có tiềm năng sử dụng trong xử lý

nƣớc thải. Một số loài rong biển có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng

nhƣ: Zn và Cd từ nƣớc bị ô nhiễm. Cũng do khả năng hấp thụ cao mà một số

vi lƣợng có trong rong khá cao nên rong còn đƣợc dùng làm thức ăn bổ sung

để phòng bệnh thiếu một số chất nhƣ sắt, iodine….

Polysaccharide từ rong biển có tính chất đặc biệt là dễ tạo gel, có độ

nhớt cao rất dễ tạo màng nên chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành

kinh tế nhƣ: công nghệ thực phẩm (chế biến thịt, sữa, làm bánh kẹo), làm

thuốc đánh răng, dùng trong mỹ phẩm…ngoài ra chúng còn là nguồn nguyên

liệu để làm dƣợc phẩm. Do tính chất dễ tạo màng, có thể dùng polysaccharide

tự nhiên để tạo màng polymer sinh học, khi sử dụng polysaccharide để làm

vật liệu chế tạo màng sinh học, màng này giữ lại nhiều tính chất tốt của

polysaccharide tự nhiên… Một điều quan trọng là các phế thải của chúng

(màng sau khi sử dụng) không gây ô nhiễm môi trƣờng, vì các vật liệu này

sau khi thải ra môi trƣờng sẽ dần phân hủy bởi các hệ vi sinh vật có sẵn trong

tự nhiên.

Tại Hội nghị Bali về khí hậu trái đất, một nhóm nhà khoa học cho biết

rong và rêu biển có thể là một vũ khí hữu hiệu chống lại sự ấm dần của trái

đất do chúng có khả năng hút khí carbon dioxide trong khí quyển với một tốc

độ tƣơng đƣơng với những cánh rừng nhiệt đới rộng lớn.

Polysaccharide từ rong biển còn có tác dụng hấp thụ cholesterol thải ra

ngoài cơ thể, khiến hàm lƣợng cholesterol trong máu duy trì ở mức cân bằng.

Nhiều nghiên cứu khoa học trong thời gian gần đây cũng đã xác nhận, rong

biển có tác dụng phòng chống virus và phòng chống ung thƣ.

14

1.1.4. Sulfate polysaccharide từ rong biển

Polysaccharide là các hợp chất cao phân tử gồm nhiều đơn vị

monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside. Đây cũng là thành

phần quan trọng có trong các cơ thể sống nhƣ thực vật, rong biển, vi sinh vật.

Các polysaccharide sinh học đƣợc hình thành từ quá trình biến đổi sinh học

nhƣ: quá trình hoạt động sống của vi sinh vật, quá trình sinh trƣởng của thực

vật, động vật. Các polysaccharide khai thác từ thực vật đƣợc ứng dụng khá

phổ biến trong công nghệ thực phẩm, y dƣợc nhƣ tinh bột, agar, pectin,

galactomannan, carrageenan, alginate.

Polysaccharide có thể có cấu trúc mạch thẳng hoặc mạch nhánh, mức

độ phân nhánh ảnh hƣởng đến tính chất vật lý nhƣ khả năng tan trong nƣớc,

độ nhớt, khả năng tạo gel… Các nhóm hydroxyl chiếm đa phần trong

polysaccharide, đôi khi nó có thể đƣợc thay thế bằng các nhóm thế khác bởi

quá trình ester hóa, acetyl hóa, phosphate hóa. Polysaccharide thông thƣờng

đƣợc đƣợc phân lập từ thực vật hoặc quá trình chế biến thực phẩm bằng

phƣơng pháp chiết nóng với dung môi là nƣớc và đƣợc kết tủa bằng ethanol

hoặc acetone. Dung dịch polysaccharide thƣờng có độ nhớt cao, tính chất này

chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ, kích thƣớc, hình dạng phân tử,

nhiều polysaccharide có khả năng tạo gel.

1.1.4.1. Sulfate polysaccharide từ rong nâu [12]

Fucoidan là sulfate polysaccharide có trong rong nâu, fucoidan chiếm

hàm lƣợng khoảng 0,6 - 4% trọng lƣợng rong khô và cấu trúc của nó thay đổi

theo loài nhƣng thành phần chính vẫn là đƣờng fucose và nhóm sulfate. Cấu

trúc của fucoidan trong rong biển là vô cùng phức tạp và không giống nhau

với những thay đổi trong liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate và các

loại đƣờng đơn khác nhau. Cấu trúc của fucoidan còn phụ thuộc vào nguồn

gốc của chúng. Việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và

fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất

hữu cơ có gốc đƣờng. Các fucoidan có cấu trúc phức tạp bao gồm nhiều vấn

đề cần làm sáng tỏ nhƣ thành phần các đƣờng đơn, các dạng đồng phân của

đƣờng, mức độ phân nhánh và polymer hóa của chúng. Vì vậy, cho tới nay,

15

việc làm sáng tỏ cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề khó khăn, ngay cả khi

sử dụng các kỹ thuật NMR phân giải cao mới nhất. Hiện nay phƣơng pháp sử

dụng phổ khối ion hóa phun mù điện (ESI-MS) đang đƣợc nhiều nhà khoa

học trên thế giới quan tâm, ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc fucoidan.

Bằng phƣơng pháp sắc ký, phổ IR và NMR đã cho các thông tin về thành

phần đƣờng, kiểu liên kết của các đƣờng trong phân tử fucoidan, nhƣng các

thông tin về trật tự sắp xếp của các đƣờng cũng nhƣ vị trí của nhóm sulfate

trong phân tử vẫn chƣa đƣợc xác định, do đó chƣa giải thích đƣợc các đặc

tính sinh học khác nhau của các phân đoạn fucoidan một cách rõ ràng và

thuyết phục. Fucoidan có hoạt tính sinh học rất phong phú, nhiều hoạt tính

sinh học quí báu nhƣ hoạt tính chống khối u, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt

tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống đông tụ máu và hoạt tính chống lại các

virus nhƣ HIV. Ngoài ra, fucoidan còn đƣợc mô tả có nhiều tác dụng sinh học

lý thú khác nhƣ tác dụng hạ cholesterol, giảm mỡ máu, giảm LDL-

cholesterol, triglyceride máu, tăng HDL-cholesterol, ức chế miễn dịch nên có

thể sử dụng fucoidan trong các trƣờng hợp ghép phủ tạng…

1.1.4.2. Sulfate polysaccharide từ rong đỏ [40]

Carrageenan là sulfate polysaccharide mạch thẳng, có khả năng tạo gel

và làm đặc dung dịch. Carrageenan tồn tại trong một số rong đỏ thuộc họ

Rhodophyceae. Hiện nay, carrageenan thƣờng đƣợc chiết từ một số loài rong

nhƣ Gigartina, Chondrus, Iridaea, Eucheuma. Carrageenan đƣợc tạo thành từ

các đƣờng galactose mạch thẳng với hàm lƣợng sulfate khác nhau (trong

khoảng 15%-40%). Các loại carrageenan khác nhau thì khác nhau về thành

phần và cấu dạng, vì thế chúng tạo nên một khoảng biến đổi rộng các tính

chất lƣu biến cũng nhƣ các tính chất đặc biệt khác. Cũng nhƣ các

polysaccharide tự nhiên khác, carrageenan cũng không có khối lƣợng phân tử

xác định. Carrageenan thƣơng mại loại dùng trong ngành chế biến thực phẩm

có khối lƣợng trung bình nằm trong khoảng 200.000 g/mol.

1.1.4.3. Sulfate polysaccharide từ rong lục [36]

Trên thế giới, các loài rong lục cho sulfate polysaccharide đƣợc chia

thành 3 nhóm chính:

16

- Nhóm rong lục cho ulvan: Bao gồm các loài rong lục thuộc 2 chi Ulva

và Enteromorpha. Từ năm 2000, nhóm rong cho ulvan đƣợc gọi chung là chi

Ulva [http://www.algaebase]. Ulvan có thành phần đƣờng gồm: Rha, Xyl,

UroA, Glu, Gal, Man… và nhóm sulfate tạo thành chuỗi các disaccharide lặp

lại với tỉ lệ khác nhau, tạo nên cấu trúc rất đa dạng, phức tạp gồm nhiều kiểu

liên kết glycoside nhƣ: Ở Rha: α-(1→4)-, α-(1→3)-, α-(1→3,4)- và α-

(1→2,3,4)-, ở Xyl: β-(1→4)-, β-(1→2,4)-; ở Glu: β-(1→4)- và β-(1→3); ở

GlcA: β-(1→4)-. Nhóm sulfate trong phân tử ulvan đều ở vị trí carbon C-3

hoặc C-2 của Rha.

Bảng 1.2. Phân loài rong lục trên thế giới có sulfate polysaccharide

Họ Chi Loài

Monostromataceae

Monostroma M. latissimum

M. nitidum

M. angicava

Ulvaceae

Enteromorpha

E. clathrata

E. compressa

E. intestinalis

E. linza

E. prolifera

Ulva

U. arasakii

U. armoricana

U. clathrata

U. conglobata

U. fasciata

U. lactuca

17

U. pertusa

U. reticulata

U. rigida

U. rotundata

Capsosiphonaceae Capsosiphon C. fulvescens

Cladophoraceae Chaetomorpha C. antennina

Bryopsidaceae Bryopsis B. plumose

Halimedaceae Halimeda H. monile

Caulerpaceae Caulerpa C. brachypus

C. cupressoides

C. lentillifera

C. prolifera

C. racemosa

C. sertularioides

Codiaceae Codium C. adhaerens

C. cylindricum

C. dwarkense

C. fragile

C. istmocladum

C. latum

C. pugniformis

C. tomentosum

C. vermilara

18

C. yezoense

- Nhóm rong lục cho sulfate arabinogalactan: Bao gồm các loài rong

lục thuộc chi Codium nhƣ C. fragile, C. adhaerens, C. cylindricum… Thành

phần đƣờng chủ yếu trong phân tử sulfate arabinogalactan là Ara, Gal với

lƣợng nhỏ Glc, Man, Xyl và nhóm sulfate tạo thành cấu trúc chuỗi các

disaccharide lặp lại với tỉ lệ khác nhau: β-(1→3)-D-Gal và β-L-Ara với hàm

lƣợng sulfate cao, Gal bị sulfate hóa ở carbon C-2 và C-4 hoặc chỉ ở C-4 và

phần nhỏ ở C-6; β-(1→3)-D-Gal và lƣợng nhỏ β-(1→3,6)-Gal, với nhóm

sulfate chủ yếu ở vị trí carbon C-4, phần nhỏ ở C-6.

- Nhóm rong lục cho sulfate galacotan: Bao gồm các loài thuộc chi

Caulerpa, chủ yếu là loài C. cupressoides và C. racemosa. Sulfate galacotan

là một loại polysaccharide hỗn hợp từ nhiều loại monosaccharide khác nhau

với thành phần chủ yếu là đƣờng Gal, lƣợng nhỏ các đƣờng Glc, Man, Xyl và

nhóm sulfate tạo thành chuỗi với nhiều kiểu liên kết glycoside: (1→3)- và

(1→3,6)-Gal, (1→4)-và (1→3,4)-Ara, (1→4)-Glu, với nhóm sulfate ở vị trí

carbon C-3 của (1→4)-Ara và C-6 của (1→3)-Gal, (1→3)-β-D-Gal và

(1→6)-β-D-Gal, nhóm sulfate ở vị trí carbon C-2.

1.1.4.4. Polysaccharide chiết xuất từ rong lục chi Chaetomorpha [37]

Arabinogalactan là polysaccharide tan trong nƣớc đƣợc tìm thấy chủ

yếu từ các loài rong thuộc chi Chaetomorpha nhƣ: Chaetomorpha linum, C.

area, C. capillaris… Các nghiên cứu chỉ ra rằng, arabinogalactan bao gồm

các thành phần đƣờng chủ yếu nhƣ: arabinose, galactose, với lƣợng nhỏ

glucose, xylose, mannose, rhamnose và nhóm sulfate tạo thành chuỗi các

disaccharide lặp lại với tỉ lệ khác nhau, tạo nên cấu trúc rất đa dạng, phức tạp

gồm nhiều kiểu liên kết glycoside nhƣ: β-(1→3)-D-Galactose và β-L-

Arabinose với hàm lƣợng sulfate cao, Galactose bị sulfate hóa ở carbon C-2

và C-4 hoặc chỉ ở C-4 và phần nhỏ ở C-6; β-(1→3)-D-Galactose và lƣợng

nhỏ β-(1→3,6)-Galactose, với nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí carbon C-4, phần

19

nhỏ ở C-6. Các liên kết glycoside trên vòng pyranose với cấu hình C-2, C-3,

C-4 là 2S, 3R, 4R hoặc 2R, 3S, 4S đối với galactose, fucose, arabinose.

Mặc dù rất khó để mô tả cấu trúc hoàn chỉnh của loại dị chất sunfat hóa

này, nhƣng nhiều nghiên cứu đã nhấn mạnh các hoạt tính sinh học nhƣ: trong

điều trị các bệnh về gan, chống đông máu hoặc khả năng chống oxy hóa của

polysaccharide sulfate đƣợc chiết xuất từ rong biển chi Chaetomorpha.

Trong đó: Gal: galactose, Pyr: pyranose, p: pyrannosyl.

Hình 1.5. Cấu trúc một số phân đoạn của arabinogalactan chiết từ rong lục chi

Chaetomorpha

1.1.4.5. Hoạt tính sinh học của polysaccharide chiết xuất từ một số loài

rong lục chi Chaetomorpha

Các polysaccharide từ rong lục thuộc chi Chaetomorpha, đƣợc biết đến

là các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên với nhiều hoạt tính sinh học quý báu

nhƣ là kháng khuẩn, chống nấm, chống oxy hóa, chống đông tụ máu, điều

chỉnh hệ miễn dịch, chống loét, hạ huyết áp, giảm đau, hỗ trợ điều trị tiểu

đƣờng và kháng vi sinh vật [30, 35]:

Hoạt tính chống oxy hóa: Polysaccharide chiết tách từ các loài chi

Chaetomorpha thể hiện hoạt tính oxy ở khả năng làm sạch gốc tự do

superoxide, khả năng quét gốc hydroxyl và gốc DPPH (1,1-diphenyl-2-

20

picrylhydrazyl), khả năng oxy hóa tổng và khả năng khử sắt. Khả năng chống

oxy hóa của các polysaccharide này phụ thuộc chủ yếu vào thành phần và cấu

trúc hóa học của chúng, đặc biệt phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử, hàm

lƣợng sulfate và sự phân bố của nhóm sulfate trong phân tử.

Hoạt tính chống đông tụ máu: Hoạt tính này phụ thuộc vào thành

phần đƣờng tự nhiên, vị trí nhóm sulfate và hàm lƣợng sulfate trong phân tử

và nhóm sulfate là yếu tố cần thiết cho hoạt tính chống đông tụ máu. Ngoài ra,

khối lƣợng phân tử cũng là yếu tố quan trọng tác động đến khả năng chống

đông tụ máu của polysaccharide, những polysaccharide có khối lƣợng phân tử

lớn hơn có khả năng ức chế sự nghẽn mạch máu tốt hơn. Acid uronic không

có hoạt tính chống đông tụ máu trực tiếp, nhƣng có thể làm tăng khả năng

chống đông tụ máu thông qua việc cải thiện độ linh hoạt của chuỗi đƣờng.

Một số loài cho polysaccharide có hoạt tính này nhƣ C. fracta, C.

glomerata…

Hoạt tính điều chỉnh hệ miễn dịch: Polysaccharide chiết tách từ các

loài thuộc chi Chaetomorpha đã đƣợc công bố là có khả năng hoạt hóa bạch

huyết cầu chuột và đƣợc chứng minh là do trong thành phần có chứa các

nhóm sulfate. Tác dụng tăng cƣờng miễn dịch của sulfate polysaccharide từ

rong lục nói chung chủ yếu dựa trên sự thay đổi bạch huyết cầu. Một vài

nghiên cứu trên thí nghiệm in vitro chỉ ra rằng, sulfate polysaccharide từ rong

lục thể hiện hoạt tính chống sự tăng sinh quá mức, ngăn chặn khối u phát triển

trên chuột rất tốt ở vài dạng tế bào ung thƣ.

Hoạt tính kháng viêm và giảm đau: Polysaccharide chiết tác từ chi

Chaetomorpha cũng đã đƣợc công bố là có tính chất kháng viêm, tác dụng

làm giảm phù nề ở chuột.

Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các polysaccharide phân

lập từ rong biển nói chung đều phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm thu

hái, vị trí địa lý và điều kiện xử lý sau thu hái. Do đó, việc sản xuất và ứng

dụng các sản phẩm từ galactan tự nhiên phục vụ cho mục đích chữa bệnh

đang đƣợc chú ý nhiều hơn. Tuy nhiên, chúng lại có cấu trúc đa dạng và

21

không đồng nhất, làm cho việc nghiên cứu cấu trúc gặp nhiều khó khăn, cản

trở sự phát triển của các sản phẩm chữa bệnh.

1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA

POLYSACCHARIDE

1.2.1. Phƣơng pháp sắc kí thẩm thấu gel (GPC)

Phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography –

GPC) là một kỹ thuật phân tích phân tách các đại phân tử hòa tan theo kích

thƣớc dựa trên sự rửa giải của chúng từ các cột chứa đầy một loại gel xốp.

Khi GPC đƣợc kết hợp với tán xạ ánh sáng, máy đo độ nhớt và máy dò

nồng độ , nó có thể đo trọng lƣợng phân tử tuyệt đối, kích thƣớc phân tử và

độ nhớt nội tại và tạo ra thông tin về cấu trúc phân tử, cấu tạo, tập hợp và

phân nhánh. Bằng cách sử dụng GPC để đo trọng lƣợng phân tử và các tính

chất khác này, các nhà khoa học có thể mô tả các phân tử nhƣ polymer tổng

hợp, cũng nhƣ các polymer tự nhiên nhƣ polysaccharide. GPC còn tách một

hợp chất cao phân tử phức tạp thành các bộ phận cấu thành của nó - polymer,

oligomer, monomer và các chất phụ gia [22].

Thiết bị GPC bao gồm một máy bơm để đẩy dung môi qua thiết bị,

cổng phun để đƣa mẫu thử lên cột, một cột để giữ pha tĩnh, một hoặc nhiều

máy dò để phát hiện các thành phần khi chúng rời khỏi cột và phần mềm để

điều khiển các phần khác nhau của thiết bị và tính toán và hiển thị kết quả

[23].

Mẫu tự động

Dung môi

Van phun

Bơm

Lò

nhiệt

Cột

Bộ kit chuẩn

Cảm

biến

Ghi và

phân

tích số

liệu

Hình 1.7. Sơ đồ khối thiết bị GPC

22

1.2.2. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR)

Phƣơng pháp quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy – IR) là

một trong những kỹ thuật hữu ích nhất để nghiên cứu xác định cấu trúc

polysaccharide trong thành tế bào thực vật dựa trên phân tích các đỉnh hấp thụ

ở các số sóng nhất định. Phƣơng pháp này mang đến những thông tin cấu trúc

quan trọng để xác định vị trí nhóm chức trong phân tử polysaccharide nhƣ

pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ

rong biển [24].

Phổ IR là một kỹ thuật dựa vào sự dao động và quay của các nguyên tử

trong phân tử. Nói chung, phổ IR nhận đƣợc bằng cách cho tia bức xạ IR đi

qua mẫu và xác định phần tia tới bị hấp thụ với năng lƣợng nhất định. Năng

lƣợng tại pick bất kì trong phổ hấp thụ xuất hiện tƣơng ứng với tần số dao

động của một phần của phân tử mẫu [2].

Một trong các lợi thế của phổ IR là hầu nhƣ bất kỳ mẫu nào và trạng

thái nào cũng có thể nghiên cứu đƣợc [5]. Kỹ thuật này cũng thể hiện hai ƣu

điểm chính: lƣợng mẫu sử dụng để đo phổ nhỏ (miligam) và kết quả cho độ

chính xác đáng tin cậy. Tuy nhiên, quang phổ hồng ngoại thông thƣờng đòi

hỏi các thủ tục tốn nhiều công sức để thu đƣợc phổ với tỷ lệ tín hiệu / nhiễu

tốt [24].

Hạn chế này đã đƣợc khắc phục với sự phát triển của kỹ thuật phổ kế

IR biến đổi Fourier (đƣợc gắn với máy tính) nên chất lƣợng phổ cải thiện

đáng kể và giảm bớt thời gian đo mẫu, đƣợc gọi là quang phổ FT - IR

(Fourier Transform IR).

Phân tích phổ hồng ngoại cho thông tin về các dao động của các liên

kết điển hình trong cấu trúc của polysaccharide: các dải sóng hấp thụ ở 820 –

850, 1220 – 1260 và 1640 – 1650 cm-1

là đặc trƣng cho dao động hóa trị của

liên kết C – O – S của nhóm sulfate ở vị trí axial, liên kết S=O của nhóm

sulfate, liên kết COO- của acid uronic và các dải hấp thụ ở 3420 – 3450 và

1050 – 1070 cm-1 đƣợc gán cho dao động của liên kết O – H và C – O – C

tƣơng ứng [7].

23

Bảng 1.3: Một số nhóm đặc trƣng của phổ FT-IR của polysaccharides.

Tần số (cm-1

) Nhóm đặc trƣng Liên kết Chất đặc

trƣng

1740 ν(C=O) Ester, pectin

1426 δ CH2 Cellulose

1371 δ CH2 Xyloglucan

1362, 1317 δ CH2 Cellulose

1243 ν(C-O) Pectin

1160 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Pectin

1146 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Pectin

1130 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Xyloglucan

1115 ν(C-O), ν(C-C) C-2-O-2 Cellulose

1100 ν(C-O), ν(C-C) Vòng Pectin

1075 ν(C-O), ν(C-C) Vòng Xyloglucan

1060 ν(C-O), ν(C-C) C-3-O-3

1042 ν(C-O), ν(C-C) Vòng

1030 ν(C-O), ν(C-C) C-6H-2-O-6

1015, 1000 ν(C-O), ν(C-C) C-6H-2-O-6 Cellulose

1019 ν(C-O), ν(C-C) C-2-C-3, C-2-O-2, C-1-

O-1

Pectin

960 δ(CO) Pectin

944 δ(C-1-H) Cellulose

Xyloglucan

895 Vòng Β-anomeric

833 Vòng Pectin

24

1.2.3. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)

Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là phƣơng pháp hữu hiệu

trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide, phổ NMR [3, 21] đƣợc thể hiện

bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TPP, DSS…). Đặc

trƣng phổ 1H- và

13C-NMR của polysaccharide đƣợc thể hiện theo Hình 1.7.

Phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của

mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid)

[12]. Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide từ số các tín hiệu cộng

hƣởng proton anomer với độ chuyển dịch hóa học ở khoảng δ4,4-5,8 ppm.

Nhƣ vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tƣơng đối của các tín hiệu cộng hƣởng ở

vùng anomeric cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide.

Về mặt này kết quả phân tích thành phần hoá học của polysaccharide có thể

phù hợp với kết quả phân tích phổ 1H-NMR. Dựa vào phổ hai chiều đồng hạt

nhân 1H-

1H NMR, các nhóm thế có thể đƣợc xác định hoặc dự đoán đƣợc sự

có mặt của chúng. Tiếp theo, số lƣợng của các monosaccharide có thể đƣợc

khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomeric của phổ 2 chiều dị

hạt nhân 1H-

13C-HSQC.

25

Hình 1.6. (a) Phổ 1H-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan;

(b) Phổ 13

C-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan

26

So với tín hiệu cộng hƣởng từ phổ 1H-NMR, phổ

13C-NMR thƣờng có

tín hiệu yếu hơn nhƣng nó có lợi thế hơn so với phổ 1H-NMR trong phân tích

cấu trúc polysaccharide là do độ dịch chuyển hóa học (δ) trong phổ 13

C-NMR

đƣợc trải rộng trên thang đo (từ 0 ppm đến 200 ppm), nên đã khắc phục đƣợc

hiện tƣợng chồng chéo của các tín hiệu trên phổ 1H-NMR (thang đo chỉ từ 0-

12 ppm). Thực vậy, trên phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học của proton

anomer (δ4,4 – 5,8 ppm) đƣợc tách biệt một cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi

các tín hiệu cộng hƣởng ở các vị trí nonanomeric proton (δ3,2 – 4,5 ppm)

trong khi đó, trên phổ 13

C-NMR, độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu

anomeric carbon (δ90–110 ppm) lại tách biệt rất rõ và không hề trùng chập

với các tín hiệu cộng hƣởng của các nonanomeric carbon

(δ60 – 85 ppm). Với

polysaccharide có nhóm de-oxygen nhƣ nhóm –CH3, tín hiệu xuất hiện tại

vùng trƣờng cao hơn (δ15–20 ppm).

Bảng 1.4. Độ chuyển dịch hoá học δ (ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của

dạng glucose và galactose

Monosacc

haride

H-1

C-1

H-2

C-2

H-3

C-3

H-4

C-4

H-5

C-5

H-6a

C-6

H-6b

-D-Glc 5,11 0,30

97,5 4.5

3.520,06

72,51,0

3,760,10

73,80,4

3,410,05

70,70,6

3,740,10

72,90,5

3,640,16

61,40,4

3,780,08

-D-Glc 4,840,46

102,92,4

3,310,05

74,11,1

3,550,07

76,31,4

3,510,13

70,41,0

3,550,09

76,01,3

3,770,05

61,51,0

3,940,05

-D-Gal 5,160,35

99,13,1

3,890,12

68,91,3

3,930,16

70,21,7

4,120,19

68,61,9

4,110,29

71,02,0

3,730,07

61,70,8

3,730,04

-D-Gal 4,680,26

103,52,4

3,530,17

71,72,1

3,800,16

73,51,7

4,080,18

67,92,0

3,740,20

75,51,1

3,740,05

61,80,7

3,740,05

27

Độ chuyển dịch hóa học của các proton anomer và carbon anomer của

mỗi monosaccharide đều đƣợc nhận biết riêng, phụ thuộc vào cấu hình α hay

β: tín hiệu α-proton anomer sẽ xuất hiện tại vùng có độ chuyển dịch hóa học

δ5–6 ppm trong khi đó với α-proton anomer là tại vùng δ4–5 ppm; tín hiệu

của α-carbon anomer xuất hiện tại vùng δ95–100 ppm trong khi đó tín hiệu

của hầu hết α-carbon anomer xuất hiện tại vùng δ100-105 ppm. Với

polysaccharide có chứa thành phần acid uronic, các tín hiệu của carbon trong

nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại vùng δ170–180 ppm. Các tín hiệu của carbon

bậc một có chứa nhóm hydroxyl nhƣ C-6 trong pyranose và C-5 trong

furanose sẽ chuyển dịch về vùng trƣờng cao (δ60–64 ppm), trong khi đó độ

chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C-

2, 3, 4 trong pyranose và C-2, 3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng δ65–85

ppm. Với nguyên tử carbon alkxoylate (C-5 trong pyranose và C-4 trong

furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển về phía trƣờng yếu với δ5–10

ppm.

Trong phân tử polysaccharide, các vị trí đƣợc thế của monosaccharide

đƣợc gọi là vị trí aglycon, tƣơng ứng với nguyên tử C ở các vị trí không phải

anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu phổ NMR, vị trí liên kết đƣợc suy

ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của 13

C so

với độ dịch chuyển hoá học của các monosaccharide không thế. Trật tự các

đơn phân trong mạch của polysaccharide đƣợc xác định chính là chuỗi các

liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu đƣợc từ

hai loại phổ HMBC và NOESY.

Một cách tổng quát về độ chuyển dịch hóa học của polysaccharide theo

Hình 1.7

28

Hình 1.7. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong phân tử polysaccharide

29

1.2.4. Phƣơng pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)

Hiện nay, các phƣơng pháp tán xạ là rất hữu hiệu đƣợc các nhà khoa

học ứng dụng hiệu quả để nghiên cứu cấu trúc không gian của phân tử chất

tan trong dung dịch, nguyên tắc của các phƣơng pháp này là dựa vào đƣờng

cong tán xạ, có thể biết đƣợc các thông số cấu trúc nhƣ trọng lƣợng, kích

thƣớc và hình dạng của phân tử chất tan.

Các quá trình tán xạ đều tuân theo phƣơng trình Bragg:

=dsin

Với d và là bƣớc sóng của tia tới, kích thƣớc của vật tán xạ và góc

tán xạ. Nhƣ vậy, với góc tán xạ nhỏ thì có thể nghiên cứu đƣợc phân tử lớn.

Đƣờng tán xạ phản ánh sự phụ thuộc của cƣờng độ tán xạ vào góc tán xạ.

Hình 1.8. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo SAXS

Phƣơng pháp SAXS với bƣớc sóng nhỏ (λ = 0,154 nm) có thể đo đƣợc

các kích thƣớc của phân tử ở kích thƣớc cỡ nano, là phƣơng pháp rất hữu hiệu

trong việc nghiên cứu kích thƣớc, hình dạng của các chất ở kích thƣớc nhỏ từ

1-100 nm trong dung dịch, dựa vào giá trị của bán kính từ hồi chuyển để xác

định hình dạng của phân tử chất tan. Ví dụ: với phân tử chất tan có dạng hình

trụ đƣờng tán xạ biểu diễn bằng phƣơng trình:

30

I(q) = exp (-q2R

2gc/2)

Với Rgc là bán kính hồi chuyển của mặt cắt; I(q) là cƣờng độ tán xạ và q

là biên độ của vector tán xạ. Rgc đƣợc xác định bởi độ dốc của đƣờng

ln(q.I(q)) và q2 – đƣợc gọi là “Guinier plot”, với điều kiện qRgc<1.

31

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tƣợng nghiên cứu là sulfate polysaccharide chiết tách từ loài rong lục

Chaetomorpha linum đƣợc thu thập từ vùng biển Nha Trang của Việt Nam.

Ngoài ra sulfate polysaccharide từ loài Chaetomorpha ligustica cũng đƣợc

nghiên cứu nhằm so sánh về 2 loài rong phổ biến nhất của chi này

2.2. THU THẬP VÀ XỬ LÝ RONG

a)

b)

Hình 2.1. Hình ảnh rong Chaetomorpha linum a) và Chaetomorpha ligustica b)

32

Thu thập mẫu: Mẫu rong lục Chaetomorpha linum và Chaetomorpha

ligustica đƣợc thu thập ở Nha Trang, ngày 8/3/2018. Mẫu rong nghiên cứu

đƣợc định danh bởi TS. Võ Thành Trung (Viện Nghiên cứu và ứng dụng công

nghệ Nha Trang) và đƣợc lƣu trữ tại Trung tâm các phƣơng pháp phổ và ứng

dụng – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Mẫu rong lục sau khi thu hái đƣợc làm sạch sơ bộ bằng nƣớc biển để

loại bỏ các chất bẩn cơ học, sau đó đƣợc rửa sạch và phơi trong bóng râm.

Rong đƣợc sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 500C. Rong sau khi sấy có màu

xanh lục, hơi ngả nâu. Rong khô đƣợc nghiền nhỏ và cất giữ, bảo quản ở nơi

khô ráo, thoáng mát.

2.3. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ SULFATE POLYSACCHARIDE

Quy trình chiết tách [8]: Chiết tách polysaccharide từ rong lục đƣợc

thực hiện theo quy trình đã công bố: 10g bột rong khô, đƣợc xử lý với hỗn

hợp MeOH-CHCl3 để loại màu và chất béo, sau đó đƣợc chiết với dung dịch

HCl tại pH=6, ở nhiệt độ 85-900C trong 3h, với tỷ lệ dung môi:nguyên liệu =

30:1, lọc lấy dung dịch chiết. Bã tảo đƣợc chiết tiếp lần 2 ở điều kiện nhƣ

trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần đƣợc 800ml, rồi cô quay để giảm thể tích, ly

tâm lấy dịch trong. Cô quay tiếp dịch trong thu đƣợc cho đến khi thể tích còn

100ml. Lọc qua giấy lọc, rồi cho cồn vào để tủa polysaccharide (Vcồn : Vdịch =

4 : 1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 960

thu đƣợc

polysaccharide thô.

Quy trình tinh chế: Hòa tan mẫu thô thu đƣợc trong nƣớc (2%wt), thẩm

tách với 10 mM EDTA sau đó cho qua cột IR-120 và IR-400J và trung hòa

ngay lập tức với NaOH 1N, đông khô thu đƣợc polysaccharide.

Quy trình chiết tách và tinh chế thể hiện trên sơ đồ khối nhƣ sau:

33

Quy trình chiết tách:

Lọc

Kết tủa

Dung dịch chiết lần 1

Lọc

Bã tảo

Chiết

Lọc

85-900C trong 3h

Dung dịch chiết

lần 1 và lần 2

10g bột rong khô

Xử lý

(loại bỏ màu và chất béo)

MeOH-CHCl3

Chiết

85-900C trong 3h

Cô quay

Ly tâm Cô quay

Lọc Cồn (Vcồn:Vdịch=4:1)

Ly tâm

Polysaccharite thô

Rửa tủa bằng cồn 960

34

Quy trình tinh chế:

2.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

2.4.1. Phân tích thành phần hóa học

2.4.1.1. Phương pháp xác định thành phần hóa học của rong

Phân tích độ ẩm, hàm lƣợng tro, protein thô, chất béo thô, carbohydrate

theo phƣơng pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ AOAC [32].

a) ác định độ m của rong:

- Nguyên tắc của phƣơng pháp xác định độ ẩm: dùng nhiệt để làm bay

hơi nƣớc có trong mẫu. Từ chênh lệch khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy,

tính đƣợc độ ẩm của mẫu.

- Thực nghiệm: Cân khoảng 5g mẫu vào trong đĩa đáy bằng, sấy ở nhiệt

độ 100º-1100C tại áp suất khí quyển và sấy đến khối lƣợng không đổi. Độ ẩm

của mẫu đƣợc tính theo công thức:

Hòa tan

Plysaccharite thô Nƣớc (2%wt)

Thẩm tách

10mM EDTA

IR-120 và IR-400J

Trung hòa

NaOH 1N

Đông khô

35

Độ ẩm (%) =

khối lƣợng mẫu trƣớc sấy (g) - khối lƣợng sau sấy (g)

X 100

khối lƣợng mẫu trƣớc sấy (g)

b) Hàm lượng tro:

- Nguyên tắc của phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tro: Mẫu đƣợc nung

ở nhiệt độ 550º - 600°C để nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, đem cân

phần tro của mẫu sau khi nung và tính ra phần trăm tro có trong mẫu.

- Tiến hành thí nghiệm: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 550º –

600°C đến khối lƣợng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân ở cân phân

tích chính xác đến 0,0001g. Cho vào chén sứ khoảng 5g mẫu. Cân tất cả ở cân

phân tích với độ chính xác nhƣ trên, cho tất cả vào lò nung và nâng nhiệt độ

từ từ cho đến 550º - 600°C. Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết các

chất hữu cơ, thƣờng khoảng 6-7 giờ. Trƣờng hợp còn tro đen, lấy ra để nguội,

cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại đến tro trắng.

Để nguội trong bình hút ẩm và cân đến độ chính xác nhƣ trên. Tiếp tục

nung thêm ở nhiệt độ nhƣ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm

và cân cho đến khối lƣợng không đổi.

- Tính toán kết quả: Hàm lƣợng tro theo % đƣợc tính theo công thức:

X = ((G2 - G)/(G1 - G)) × 100

Trong đó G: khối lƣợng chén (g)

G1: khối lƣợng chén và mẫu trƣớc khi nung (g)

G2: khối lƣợng chén và mẫu sau khi nung (g)

c) Protein thô:

Lƣợng nitơ có trong mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp micro-

Kjeldahl, đƣợc tiến hành nhƣ sau: Cân khoảng 2g mẫu rong khô, cho vào bình

cầu 100ml, cho thêm vào 30ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, tiếp theo 10g

K2SO4 và 1g CuSO4.5H2O. Hỗn hợp này đƣợc đun nhẹ cho đến khi hết sủi bọt

36

thì đun tăng mạnh nhiệt độ lên. Khi dung dịch chuyển thành không màu hoặc

trong suốt, tiếp tục đun thêm 1 giờ nữa, để nguội, pha loãng với nƣớc cất và

chuyển vào bình Kjeldahl 800ml. Thêm vào 100ml dung dịch NaOH 40%, lắp

bình với hệ thống chƣng cất, bình hứng có 25 ml dung dịch H2SO4 0,1N và

tiến hành chƣng cất. Khi hai phần ba lƣợng chất lỏng đã đƣợc cất, kiểm tra

xem phản ứng đã xảy ra hoàn toàn chƣa. Bình hứng đƣợc lấy ra chuẩn độ với

dung dịch KOH 0,1N. Khi đó, lƣợng protein thô đƣợc tính theo công thức

sau:

Protein = Nitơ x 6,25

d) Hàm lượng lipid:

Hàm lƣợng lipid trong mẫu đƣợc phân tích theo phƣơng pháp của Bligh

và CS (1959). Cân chính xác 2 g rong khô, cho vào bình cầu 100ml. Thêm

vào 20ml methanol và 10ml chloroform, lắc kỹ. Sau đó thêm 10ml

chloroform, tiếp tục lắc kỹ rồi thêm 10ml nƣớc cất, tiếp tục lắc mạnh, lọc bỏ

bã. Dịch lọc đƣợc ly tâm với tốc độ quay 1000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt

độ phòng. Dịch sẽ đƣợc tách thành hai pha, tách bỏ pha nƣớc, thu pha hữu cơ

và cất quay loại dung môi trên máy cất quay chân không ở nhiệt độ 60°C.

Quá trình tách chiết đƣợc thực hiện 3 lần cho đến khi thu đƣợc toàn bộ lƣợng

chất béo thô trong mẫu rong nghiên cứu, làm khô sản phẩm bằng nitơ lỏng,

đƣa vào bình hút ẩm đến khối lƣợng không đổi.

e) Phân tích tổng carbohydrate

Đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phenol-acid sulfuric. Hỗn hợp gồm

1ml dung dịch mẫu có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml đƣợc cho vào ống so màu,

thêm 1ml phenol 4,0%, 5,0 ml acid H2SO4 đậm đặc 95,5% (d=1,84g/ml) và

lắc mạnh, sau đó để yên 10-20 phút. Sau đó, hỗn hợp đƣợc đo mật độ quang

tại bƣớc sóng 490 nm. Dung dịch chuẩn đƣợc dùng là glucose hoặc galactose.

2.4.1.2. Phân tích thành phần hóa học của sulfate polysaccharide [33,

34]

- ác định hàm lượng sulfate: Xác định hàm lƣợng sulfate bằng

phƣơng pháp khối lƣợng. Mẫu đƣợc thủy phân hoàn toàn bằng dung dịch HCl

37

1M ở nhiệt độ 100°C trong 8 giờ. Dung dịch BaCl2 1M đƣợc thêm dƣ vào

dung dịch thủy phân để tạo kết tủa BaSO4, ly tâm lấy tủa, sấy tủa ở 80ºC đến

khối lƣợng không đổi. Sau đó định lƣợng BaSO4. Hàm lƣợng sulfate có trong

mẫu đƣợc tính theo công thức sau:

10096

233(%)

4

xm

xm

DS

BaSO

Trong đó DS: hàm lƣợng sulfate (%); mBaSO4: khối lƣợng của BaSO4

(g); m: khối lƣợng mẫu thử nghiệm (g).

- Xác định hàm lượng acid uronic: Xác định bằng phƣơng pháp của

Bitter và CS. Thủy phân hỗn hợp gồm 1 ml dung dịch mẫu nồng độ 100

µg/ml và 6 ml H2SO4 đậm đặc ở 100ºC trong 20 phút, sau đó để nguội tới

nhiệt độ phòng. Tiếp theo thêm 0,2 ml dung dịch carbazol 0,1% trong ethanol

96º và lắc đều, phản ứng đƣợc tiến hành tiếp ở 100ºC trong 10 phút. Đem đo

mật độ quang ở bƣớc sóng 527 nm. Acid glucuronic đƣợc dùng làm chất

chuẩn.

- ác định thành phần đường: Xác định theo phƣơng pháp của Billan

và CS. Nguyên tắc là thủy phân ulvan thành các monosaccharide, chuyển các

monosaccharide sang dẫn xuất alditol acetate rồi định lƣợng bằng GC.

+ Thủy phân khử từng phần trên hệ NaBH4/TFA

Cân 15 mg ulvan vào trong ống nghiệm (có nắp) chứa 1ml TFA 2,0M.

Đem đun nóng ống nghiệm ở nhiệt độ 80oC trong 3h. Sau khi để nguội thêm

chính xác 1ml dung dịch inositol 1mg/ml, lắc đều. Dung dịch đƣợc lọc, loại

tủa, rồi thêm 2ml ethanol và cô quay đến cạn. Sau đó thêm 1ml NH4OH 1M

để đuổi acid còn dƣ, sấy khô bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC. Cặn

thu đƣợc đƣợc hoà tan trong 0,5 ml dung dịch NaBH4 10% vừa pha trong

NH4OH 1M, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng và để qua đêm. NaBH4 dƣ đƣợc phân

huỷ bằng 0,5ml CH3COOH đậm đặc. Tách acid boric và trimethyl borat bằng

cách cho bay hơi nhiều lần ở nhiệt độ 40oC với methanol để cặn thu đƣợc chỉ

còn là alditol.

38

+ Phản ứng acetyl hoá các alditol

Cho 1ml acid anhydric acetic và 1ml pyridine vào bình có chứa ulvan

đã đƣợc thuỷ phân ở trên và đem đun nóng ở 100oC trong 1 giờ. Sau đó làm

lạnh, bay hơi khô ở nhiệt độ 40oC. Alditol acetat trong hỗn hợp đƣợc chiết

bằng ethyl acetat. Xác định thành phần đƣờng đơn trên máy sắc kí GC-FID

Agilent (Mỹ).

2.4.2. Phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

Phép đo khối lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp GPC đƣợc thực hiện ở

Phòng Thí nghiệm Phân tích Trung Tâm - Ðại học Khoa học Tự nhiên - Hồ

Chí Minh, trên máy HPLC Agilent 1100 với pha động là dung dịch NaNO3

0,1N, pha tĩnh là cột Ultrahydrogel 500 (300 mm x 7.8 mm ID), tốc độ dòng

1ml/phút. Đầu dò RID.

2.4.3. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại đƣợc đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại

Bộ môn Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà

Nội.

2.4.4. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)

Mẫu nghiên cứu đƣợc hòa tan trong dung môi D2O (nồng độ 3mg/ml)

và đƣợc đo phổ NMR ở nhiệt độ 70ºC với chế độ đo khử tín hiệu của nƣớc,

trên máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam, DSS (acid 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-

sulfonic) đƣợc dùng làm chất chuẩn nội.

2.4.5. Phƣơng pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)

Phƣơng pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) đƣợc thực hiện tại BL19B2,

SPring-8, Hyogo, Nhật Bản.

Tia X đƣợc phát ở bƣớc sóng = 0,149 nm. Phép đo kéo dài 600 giây

để đảm bảo đủ thời gian đo cần thiết mà mẫu không bị phá hủy bởi tia X. Kết

quả đƣợc tính toán bằng đồ thị Kratky (q2I(q) vs q) và đồ thị Guinier

(ln(qI(q)) vs q2). Ở đây, I(q) là cƣờng độ tán xạ và q đƣợc định nghĩa bằng

39

(4)sin( với là bƣớc sóng, là góc tán xạ. Từ đồ thị Guinier, bán kính

từ hồi chuyển Rgc có thể xác định đƣợc. Giá trị Rgc cho biết cấu trúc không

gian của chất đo ở kích thƣớc cỡ nano.

Chu n bị mẫu đo:

Mẫu PCL nồng độ 1 mg/ml trong nƣớc và trong dung dịch NaCl 0,5M

đƣợc chuẩn bị cho phép đo SAXS.

2.5. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC

2.5.1. Hoạt tính chống oxy hóa

- Xác định hoạt tính oxy hóa tổng số theo phƣơng pháp Prieto và CS

[16]:

Lấy 0,3 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml, thêm vào 3 ml chất phản ứng (0,6

M acid sulfuric, 28 mM natri phosphate và 4 mM amoni molybdat). Phản ứng

đƣợc tiến hành tại nhiệt độ 95ºC trong 3h, để nguội đo tại bƣớc sóng 695nm.

Độ hấp thụ của hỗn hợp tăng tại bƣớc sóng 695nm chỉ ra khả năng oxy hóa

tổng của mẫu nghiên cứu. Hoạt tính oxy hóa tổng số tính theo acid ascorbic.

- Xác định khả năng khử sắt theo phƣơng pháp Zhu và CS [5]:

Lấy 0,2 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml thêm hỗn hợp gồm 0,2 ml đệm

phốt phát pH= 7,2 và 0,2 ml dung dịch kali ferricyanide 1%. Hỗn hợp đƣợc

giữ ở 50ºC trong 20 phút. Sau đó, thêm tiếp 0,2 ml CCl3COOH 10%. Sau

cùng, lấy 0,125 ml hỗn hợp trên và 0,125 ml nƣớc cất đƣợc đặt vào giếng 96

lỗ cùng với 0,02 ml FeCl3. Độ hấp thụ của hỗn hợp tăng tại bƣớc sóng 655nm

chỉ ra khả năng khử sắt của mẫu nghiên cứu.

2.5.2. Hoạt tính chống đông tụ máu [17, 18]

Hoạt tính chống đông tụ máu đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của

Davie và cộng sự: Máu thỏ đƣợc lấy từ ven sau đó cho vào ống sạch có chứa

muối Natri citrate để chống tạo cục máu đông. Mẫu máu đƣợc đem li tâm loại

tế bào máu, thu huyết tƣơng. Sau đó, 0,1ml huyết tƣơng đƣợc cho vào các ống

đã có sẵn mẫu nghiên cứu ở các nồng độ hoặc mẫu đối chứng. Hỗn hợp đƣợc

ủ ấm 37ºC, trong 3 phút. Sau đó cho TT, PT đã đƣợc ủ ấm vào và xác định

40

thời gian tạo cục trong hỗn hợp. Với thí nghiệm APTT đƣợc thực hiện nhƣ

sau: trộn 100 μl mẫu nghiên cứu ở các nồng độ cần kiểm tra hoặc mẫu đối

chứng với 100 μl thuốc thử APTT (acid ellagic, phospholipid) và ủ ở 37ºC

trong 3 phút. Sau đó, thêm 100 μl dung dịch CaCl2 (0,025 mol/l) vào hỗn hợp

và tiến hành đo APTT. Dung dịch DMSO 100% để pha mẫu đƣợc sử dụng

làm đối chứng âm. Thời gian đƣợc đo bằng máy tự động Sta-Evolution của

hãng Stago, quy trình đƣợc thực hiện theo đúng hƣớng dẫn của nhà cung cấp.

Phƣơng pháp định lƣợng Fibrinogen: Cho Thrombin vào huyết tƣơng,

huyết tƣơng sẽ đông và thời gian đông tuỳ thuộc vào lƣợng Fibrinogen. Hàm

lƣợng Fibrinogen đƣợc đo bằng máy tự động Sta-Evolution của hãng Stago,

quy trình đƣợc thực hiện theo đúng hƣớng dẫn của nhà cung cấp.

41

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT

- Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết polysaccharide

Trong quá trình chiết, khi tăng nhiệt độ thì hiệu suất chiết tăng. Điều

này đƣợc giải thích là do khi tăng nhiệt độ, các liên kết giữa các

polysaccharide với nhau và với các thành phần khác trong rong nhƣ protein bị

bẻ gãy, tạo điều kiện cho chúng khuếch tán vào dung môi đƣợc dễ dàng hơn.

Điều này đƣợc thể hiện trên bảng 3.1 khi tăng nhiệt độ chiết từ 50 đến 950C

thì hiệu suất chiết tăng từ 8,17 % đến 15,15 %.

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hiệu suất chiết polysaccharide

Nhiệt độ (0C) Hiệu suất chiết (%)

50 8,17

60 10,29

70 11,77

80 13,13

85 13,51

90 14,23

95 14,28

100 15,15

-Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi:nguyên liệu lên quá trình chiết

Khi tăng tỷ lệ dung môi: Nguyên liệu từ 10:1 lên 35:1 thì hiệu suất

chiết tăng từ 10,28 đến 15,73 % (Bảng 3.2). Mặc dù hiệu suất chiết đạt giá trị

42

cao nhất tại tỷ lệ 35:1 nhƣng tỷ lệ dung môi:nguyên liệu càng cao thì dung

dịch polysaccharide càng loãng gây khó khăn trong việc thu hồi và tinh chế

polysaccharide.

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ DM:NL lên hiệu suất chiết polysaccharide

Tỷ lệ

DM:NL (ml/g) Hiệu suất chiết (%)

10:1 10,28

15:1 11,21

20:1 12,78

25:1 13,08

30:1 14,19

35:1 15,73

- Ảnh hưởng của thời gian chiết lên quá trình chiết

Khi tăng thời gian chiết, thì hiệu suất chiết tăng nhanh từ 10,37 % khi

chiết đƣợc 30 phút đến 13,86 % sau 3 giờ chiết và sau đó hiệu suất chiết thay

đổi không đáng kể. (Bảng 3.3).

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian chiết lên hiệu suất chiết polysaccharide

Thời gian (h) Hiệu suất chiết (%)

0.5 10,37

1 11,69

2 12,66

3 13,86

4 14,10

43

5 14,33

- Ảnh hưởng của pH lên quá trình chiết

pH dung dịch chiết ảnh hƣởng lên hiệu suất chiết polysaccharide rất rõ

rệt, tại môi trƣờng acid và môi trƣờng kiềm, mặc dù hiệu suất chiết

polysaccharide tăng mạnh (bảng 3.4). Kết quả này có thể do các dạng khác

của polysaccharide không tan trong nƣớc nhƣ cellulose hay hemicellulose,

polysaccharide tan đƣợc trong môi trƣờng kiềm nhƣ xyloseglucan, khi chiết

tại môi trƣờng acid và môi trƣờng kiềm mạnh xảy ra quá trình thủy phân,

không thể tách sản phẩm polysaccharide khỏi dung dịch bởi quá trình lọc và

ly tâm. Vì vậy, để hạn chế hàm lƣợng sản phẩm phụ không mong muốn, giới

hạn giá trị pH của dung dịch chiết trong khoảng từ 5 đến 7.

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của pH đến hiệu suất chiết polysaccharide

pH Hiệu suất chiết (%)

1 18,17

3 16,29

5 14,3

6 13,8

7 13,13

9 13,95

11 15,23

13 17,28

Kết quả khảo sát cả 04 yếu tố cho thấy các yếu tố nhiệt độ, thời gian

chiết, tỷ lệ dung môi:nguyên liệu đều ảnh hƣởng rõ rệt đến hiệu suất chiết

polysaccharide từ rong biển. Do đó, nhằm thu đƣợc sản phẩm polysaccharide

44

đạt hiệu suất cao và xem xét đến các yếu tố ảnh hƣởng khác, chúng tôi lựa

chọn các điều kiện chiết nhƣ sau:

- Nhiệt độ: 85-900C

- Tỷ lệ DM:NL: 20:1

- Thời gian: 3h

- pH: 6

Với điều kiện chiết nhƣ trên, hiệu suất chiết tách polysaccharide từ rong

C.linum (SP1) và C.ligus (SP2) đƣợc đƣa ra trên bảng 3.5

Bảng 3.5. Hiệu suất chiết tách polysaccharide (% khối lƣợng rong khô)

Mẫu Khối lƣợng

rong

Polysaccharide

thu đƣợc (g)

Hiệu suất

(%)

SP1 10g 1,37 13,7

SP2 10g 1,12 11,2

Độ sạch của mẫu đƣợc kiểm tra bằng phổ 1H

45

Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của polysaccharide C.ligus a) và C.linum b)

Phổ 1H-NMR của polysaccharide chiết tách từ 2 loài rong lục C.ligus

và C.linum là đặc trƣng cho dạng phổ của polysaccharide, có các vùng

anomeric tại khoảng 4,5-5,5 ppm, proton vòng pyranose và furanose nằm

trong vùng 3,2-4,4 ppm. Trên phổ không thấy các tín hiệu của các chất béo và

các hợp chất màu (vùng 6-7ppm), chứng tỏ rằng 2 mẫu polysaccharide chiết

tách đƣợc có độ sạch cao. Các tín hiệu đặc trƣng cho polysaccharide ở cả 2

mẫu đều bị trùng chập, phổ có độ phân giải thấp nhƣng với mức độ khác

nhau, cụ thể các tín hiệu trên hình phổ C.ligus a) bị trùng chập nhiều hơn hình

phổ C.linum b) và phổ C.ligus a) có độ phân giải thấp hơn phổ C.linum b),

điều này chứng tỏ mức độ polymer hóa của phân tử polysaccharide từ rong

lục C.ligus cao hơn mức độ polymer hóa của phân tử polysaccharide từ rong

lục C.linum thể hiện qua trọng lƣợng phân tử đƣợc xác định qua kết quả đo

GPC.

46

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Để có các đánh giá sơ bộ chất lƣợng của rong mục đích định hƣớng quy

trình tách chiết, chúng tôi tiến hành phân tích một số thành phần hóa học của

2 mẫu rong, kết quả phân tích đƣợc chỉ ra trên bảng 3.6. Kết quả cho thấy, các

loài rong sinh trƣởng trong vùng nƣớc lợ C.linum và C.ligus đều có hàm

lƣợng polysaccharide tan trong nƣớc ít hơn so với loài rong sinh trƣởng ngoài

biển, hàm lƣợng các chất hữu cơ là cao hơn, độ ẩm và tro là tƣơng đƣơng [30,

31].

Bảng 3.6. Thành phần hóa học của rong (% trọng lƣợng rong khô)

Mẫu Độ

ẩm Độ tro

Hàm

lƣợng

chất hữu

cơ

Polysaccharide tan

trong nƣớc

Polysaccharide

không tan trong

nƣớc

SP1 13,5 14,0 72,5 10,2 41,5

SP2 11,5 16,4 72,1 15,3 44,8

Kết quả phân tích thành phần polysaccharide và một số thành phần

khác trong rong xanh cho thấy hàm lƣợng tro, độ ẩm và hàm lƣợng các chất

hữu cơ trong các loài rong xanh tƣơng đƣơng với các loài rong đỏ, rong xanh

và rong nâu trong nghiên cứu của Dina Rodrigues và cộng sự trên đối tƣợng

rong sinh trƣởng tại vùng biển biển Bồ Đào Nha [38]. So với các loài rong đỏ

và rong nâu, rong xanh có hàm lƣợng chất hữu cơ cao hơn, kết quả này có thể

do trong rong xanh có hàm lƣợng polysaccharide tổng số cao hơn nhiều, trong

đó hàm lƣợng polysaccharide không tan trong nƣớc dao động trong khoảng từ

(26,9 đến 48,4 %), polysaccharide tan trong nƣớc dao động từ (6,6 đến 19,1

%). Sự thay đổi của hàm lƣợng polysaccharide trong các mẫu phụ thuộc vào

các loài rong, chi rong và môi trƣờng cây rong sinh sống. Polysaccharide

không điện tích tan và không tan trong nƣớc có thành phần chủ yếu là dạng

cellulose tan và không tan trong nƣớc. Kết quả nghiên cứu này tƣơng tự với

47

công bố của Guillaume Pierre và cộng sự khi nghiên cứu polysaccharide chiết

từ loài rong Chaetomorpha aerea thuộc họ Cladophoraceae [39].

Thành phần hóa học chính của rong lục

Tên loài rong Độ ẩm Độ tro

Hàm

lƣợng

chất

hữu cơ

A

B

A1 A0

Ulva lactuca 17,1 17,8 65,1 17,4 1,7 26,9

Ulva

reticulata 16,2 20,6 63,2 15,6 0,8 29,6

Enteromorpha

Intestinalis 13,2 21,5 65,3 9,4 2,1 41,5

Enteromorpha

torta 17,1 17,6 65,3 5,8 1,4 44,8

Chaetomorpha

linum 13,5 14,0 72,5 6,3 3,9 43,8

Cladophora

socialis 11,5 16,4 72,1 5,2 1,4 48,4

A: Polysaccharide tan trong nước, A0: Polysaccharide không điện tích

A1: Polysacchride điện tích

B: Polysaccharide không tan trong nước

Kết quả phân tích thành phần hóa học của 2 mẫu polysaccharide thu

đƣợc theo quy trình chiết tách đƣa ra ở phần thực nghiệm đƣợc đƣa ra trên

bảng 3.7. Kết quả cho thấy polysaccharide từ hai loài rong lục chi

Cheatomorpha nghiên cứu đều có thành phần đƣờng chủ yếu là galactose và

arabinose cùng với lƣợng nhỏ các đƣờng xylose, manose. Hàm lƣợng sulfate

48

của polysaccharide từ 2 loài rong C.linum và C.ligus này từ 12-12,5%w là

thấp so với các polysaccharide tách từ các loài rong khác thuộc chi

Chaetomorpha (12,8-19,7%) [30, 31]. Kết quả này chứng tỏ polysaccharide

chiết tách từ hai rong lục Chaetomorpha nghiên cứu có dạng sulfate

arabinogalactan.

Bảng 3.7. Thành phần hóa học của polysaccharide (%w/w)

Mẫu Gal Ara Xyl Man Sulfate

SP1 58,0 19,0 8,0 3,0 12,0

SP2 55,5 21,0 9,0 2,0 12,5

3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SİNH HỌC

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của polysaccharide phân lập từ

rong lục chi Chaetomorpha cho thấy chúng thể hiện hoạt tính chống oxi hóa

và đông tụ máu rất tốt [2, 20]. Do vậy, chúng tôi thử hoạt tính chống đông tụ

máu và oxi hóa của mẫu polysaccharide chiết tách đƣợc.

Hoạt tính chống oxy hóa cuả sulfate polysaccharide đƣợc đánh giá bằng

cách đo hiệu ứng làm sạch các gốc tự do DPPH và hoạt tính khử sắt, kết quả

đƣợc đƣa ra trên Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả đánh giá hoạt tính oxi hóa của SP1 và SP2

Mẫu Hoạt tính khử sắt

(mg Fe2+

/g mẫu pCS)

Khả năng bắt gốc Sc(%) của

tính theo 2mg/ml

SP1 232,7 69,2

SP2 131,3 49,3

BHT 95,7

BHT (Butylated Hydroxytoluene): chất chống oxy hóa tham chiếu.

49

Kết quả cho thấy SP1 và SP2 có hoạt tính oxi hóa khá tốt thông qua

khả năng khử sắt cao và tác dụng khá tốt trong việc ức chế sự hình thành của

các gốc tự do DPPH, trong đó SP1 có hoạt tính tốt hơn.

Kết quả hoạt tính chống đông tụ máu thu đƣợc ở Bảng 3.9 cho thấy các

chỉ số APTT (activated partial thromboplastin time), PT (prothrombin time)

và TT (thrombin time) là đều tăng so với đối chứng. Chỉ số fibrinogen giảm

có thể do tiêu thụ (đông máu rải rác), tiêu sợi huyết, hay mắc bệnh không có

fibrinogen, kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ số fibrinogen khi có mẫu là thấp

hơn so với đối chứng. Kết quả trên chứng tỏ rằng 2 mẫu sulfate

polysaccharide nghiên cứu SP1 và SP2 đều thể hiện hoạt tính chống đông

máu rất tốt ở mức liều thử nghiệm và SP1 có hoạt tính tốt hơn.

Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của SP1 và SP2 cho thấy: SP1 và

SP2 có thành phần hóa học là gần nhƣ tƣơng đƣơng nhƣng rất khác nhau ở

trọng lƣợng phân tử dẫn đến hoạt tính sinh học khác nhau, chúng cùng thể

hiện hoạt tính nhƣng ở các mức độ khác nhau. Kết quả này của chúng tôi một

lần nữa góp phần khẳng định các kết quả nghiên cứu đã công bố là trọng

lƣợng phân tử là một yếu tố rất ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học. Điều này có

thể giải thích do mức độ cồng kềnh của phân tử sẽ dẫn đến sự kém linh hoạt

khi tham gia vào các quá trình sinh học.

Bảng 3.9. Kết quả đánh giá hoạt tính chống đông tụ máu của SP1 và SP2

Mẫu Nồng độ

mẫu

aPTT

(s)

PT

(s)

Fibrinogen

(g/l)

TT

(s)

Đối chứng

âm

DMSO

(33,33%) 141,9 15,5 1,84 17,4

SP1 200 µg/ml >180 30,4 1,76 65,9

SP2 200 µg/ml >180 20,4 1,51 45,0

50

Mẫu SP1 tiếp tục đƣợc đánh giá tại các mức liều thử nghiệm khác nhau,

kết quả đƣợc đƣa ra ở bảng 3.10. Nồng độ của SP1 có thể có ảnh hƣởng đến

có hoạt tính chống đông tụ máu. Trong thử nghiệm này, nồng độ tƣơng ứng

của mẫu 400µg/ml, 200µg/ml, 100 µg/ml và 50µg/ml đƣợc sử dụng nhƣ một

chất chống đông máu. Kết quả (Bảng 3.10) chỉ ra rằng các hoạt động APTT,

PT và TT đƣợc kéo dài rõ rệt khi có mặt mẫu.

Bảng 3.10. Khả năng chống đông tụ máu của SP1

Mẫu Nồng độ mẫu aPTT

(s)

PT

(s)

Fibrinogen

(g/l)

TT

(s)

Đối chứng âm DMSO

(33,33%)

140,7 9,6 1,88 25,0

Chaeto L 400 µg/ml >180 35,3 1,71 67,4

200 µg/ml >180 30,4 1,76 65,9

100 µg/ml >180 24,1 1,80 47,3

50 µg/ml >180 17,6 1,82 41,7

Từ các kết quả về hiệu suất chiết tách cũng nhƣ kết quả đánh giá hoạt

tính sinh học ở trên cho thấy loài rong C.linum cho hiệu suất cao hơn cũng

nhƣ hoạt tính tốt hơn. Do vậy, chúng tôi lựa chọn mẫu polysaccharide này để

tiếp tục nghiên cứu cấu trúc.

3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC

Trong nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharide, một trong các yếu tố

cấu trúc đầu tiên cần phải đƣợc xác định là trọng lƣợng phân tử trung bình

khối Mw, trọng lƣợng phân tử trung bình số Mn và độ phân tán khối lƣợng

phân tử Mw/Mn. Trong luận án, các thông số này của mẫu SP1 đƣợc xác định

bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC, kết quả đƣợc đƣa ra ở bảng

3.11 cùng với kết quả đo của mẫu SP2 để so sánh. Kết quả đo GPC của

sulfate polysaccharide chiết tách từ 2 loài rong lục C.linum và C.ligus cho

51

thấy, chúng có trọng lƣợng phân tử trung bình cao và độ phân bố trọng lƣợng

phân tử rộng nhất là đối với mẫu SP2.

Hình 3.2. Sắc ký đồ phép đo GPC của 2 mẫu SP1 Và SP2

Bảng 3.11. Kết quả đo GPC của SP1 và SP2

Mẫu Mw (g/mol) Mw/Mn

52

SP1 194 940 1,82

SP2 570 380 2,85

Phổ IR (Hình 3.3) có các dải hấp thụ đặc trƣng cho sulphate

polysaccharide: tín hiệu tại 3438cm-1

là của nhóm OH, tín hiệu 2921cm-1

là

của nhóm C-H của đƣờng. Tín hiệu tại 1072 và 1141cm-1

đặc trƣng cho liên

kết C-OH và C-O-C của liên kết glycoside. Tín hiệu tại 1241 và 832cm-1

khẳng định sự có mặt của nhóm sulphate tại vị trí equatorial của vòng

pyranose.

Hình 3.3. Phổ IR

Bảng 3.12. Kết quả phân tích phổ IR của SP1

Nhóm dao động Hình dạng Tần số (cm-1

)

-OH hóa trị (có liên kết H) Rộng, rất mạnh 3438,59

COO- của uronic acid Nhọn, mạnh 1644,37

C-O-S của nhóm sulfate Nhọn, trung bình 832,41

C-O-C của liên kết glycoside Nhọn, trung bình 1072,90

53

C-H liên kết hóa trị Rộng, vừa 2921,18

Phổ 1H NMR (Hình 3.4) của polysaccharide chiết tách từ rong lục

Chaetomorpha linum đặc trƣng cho dạng phổ của polysaccharide, có các vùng

anomaric tại khoảng 5,0-5,5ppm chứng tỏ các thành phần đƣờng trong SP1

đều có dạng , proton vòng pyranose nằm trong vùng 3,2-4,8ppm. Phổ 13

C

NMR (Hình 3.5) cho thấy 2 tín hiệu của carbon anomeric, tín hiệu tại khoảng

98ppm của galactose và arabino, carbon vòng pyranose nằm trong vùng 67-

76ppm, các tín hiệu tại 61ppm và 64ppm là chứng tỏ sự có mặt của CH2 của

galatose và arabinopyranose.

54

Hình 3.4. Phổ 1H NMR

G1

A1

55

Hình 3.5. Phổ 13

C NMR

G1, A1

G4, A3

A5

56

Hình 3.6. Phổ COSY

57

Từ các vị trí của proton H6 của galactose và H5 của arabinose, dựa vào

phổ COSY (Hình 3.6) và HSQC (Hình 3.7) xác định đƣợc tất cả các tín hiệu

proton và carbon từ C1, H1 đến C6, H6 của galactose và từ C1, H1 đến C5,

H5 của arabinose. Tín hiệu C3 và C4 của galactose bị đẩy về phía trƣờng thấp

chứng tỏ nhóm sulphate gắn vào vị trí này hoặc C3 và C4 tham gia liên kết

glycoside. Kết hợp cùng kết quả IR ở trên là nhóm sulfate nằm ở vị trí

equatorial ở vòng pyranose nên chúng tôi kết luận rằng galactose có liên kết

1-4 và nhóm sulphate nằm ở vị trí số 3.

58

Hình 3.7: Phổ HSQC

AH1/AC1 GH1/GC1

A1, G1

A1 G1 A3 G4

A2

GH4/GC4 AH3/AC3 A3, G4

G2

G2

AH2/AC2 A2

GH2/GC2

G3

G2

G3

G6

G6

59

Liên kết glycoside đƣợc xác định qua phổ HMBC (Hình 3.8). Trên phổ

cho thấy liên kết của H1 của galactose với C3 của arabinose, chứng tỏ liên kết

glycoside 1→3 giữa galactose và arabinose. Ngoài ra còn có liên kết giữa H1

của galactose và C4 của galactose chứng tỏ liên kết glycoside →4) -

galactose

Hình 3.8: Phổ HMBC

A3/G1

A1/G4

60

Kết quả phân tích trên cho thấy polysaccharide chiết tách từ rong lục

Chaetomorpha linum thuộc dạng arabinogalactan sulphate: galactose-3S-

(1→3)-arabinose.

Bảng 3.13. Kết quả phân tích phổ 1H và

13C NMR

C-1/

H-1

C-2/

H-2

C-3

/H-3

C-4

/H-4

C-5/

H-5

C-6/

H-6

→4) --galactose-3S 97,6/

5,12

67,4/

4,15

74,1/

4,32

76,65/

4,01

70.79/

4,32

60,7/

3,80

→3)--arabiose 98,2/

5,41

69,20/

4,05

76,65/

4,70

70,1/

3,97

64,1/

3,85 -

O

OH

OHH

H

OH

H

H

H

H

O

HH

H

R

H OH

H

OH

O

HH

OH

H

R

H OH

H

OH

O

O

R = SO3H- hoặc OH

Hình 3.9. Cấu trúc hóa học của arabinogalactan sulphate chiết tách từ rong lục

Chaetomorpha linum

Hiện nay, các phép đo tán xạ là phƣơng pháp hiện đại để xác định cấu

trúc không gian của phân tử polymer. Kết quả đo SAXS của dung dịch SP1

trong nƣớc và trong NaCl biểu diễn dƣới dạng đƣờng cong tán xạ trên biểu đồ

Kratky (Hình 3.10) và Guinier (Hình 3.11).

61

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

q2I(

q)

43210

q, nm-1

クラットキープロット

Linum

water

0.5M NaCl

solution7mM

solution70mM

Hình 3.10. Biểu đồ Kratky của dung dịch SP1 1% trong nƣớc

và trong NaCl 0,5 M

Biểu đồ Kratky thể hiện sự biến thiên của cƣờng độ tán xạ (q2I(q), với

I(q) là cƣờng độ tán xạ tại q) theo góc tán xạ q. Qua biểu đồ Kratky của mẫu

SP1 trên Hình 3.10, mẫu đo trong dung dịch nƣớc, tại góc tán xạ nhỏ có peak

tạo thành do tƣơng tác tĩnh điện và peak này bị mất khi dung dịch đƣợc thêm

NaCl do các nhóm mang điện bị che phủ (screening). Sự xuất hiện của peak

này là một minh chứng về sự có mặt của các nhóm mang điện (nhóm sulfate)

trong phân tử sulfate polysaccharide từ loài rong này.

62

-5

-4

-3

-2

ln(q

I(q

))

1614121086420

q2, nm

-2

ギニエプロット

Linum

water

0.5M NaCl

solution7mM

solution70mM

Hình 3.11. Biểu đồ Guinier của dung dịch SP 1%

trong nƣớc và trong NaCl 0,5 M

Áp dụng công thức gần đúng của Guinier cho hình dáng phân tử kiểu

que (rod-like) tƣơng tự các sulfate polysacchrie chiết tách từ các loài rong

biển khác nhƣ carrageennan từ rong đỏ hay fucoidan từ rong nâu, biểu đồ mặt

cắt ngang Guinier (cross-sectional Guinier plot) của SP1 biểu diễn trên hình

3.8 với trục tung là ln(qI(q)) và trục hoành là q2. Độ dốc của phần tuyến tính

của biểu đồ cho phép xác định giá trị của bán kính hồi chuyển của SP1là

Rgc=0,35nm (trong nƣớc) và 0,37nm (trong dung dịch NaCl 0,5M). Đối với

các polysaccharide mạch thẳng không phân nhánh nhƣ carrageenan hay

heparin thì giá trị Rgc khoảng 0,4 nm, điều này cho thấy SP1có cấu trúc

mạch thẳng, giống nhƣ carrageenan chiết tách từ các loài rong đỏ.

63

Ngoài ra, trên các biểu đồ Guinier có đoạn tăng lên đột ngột (up-turn

behavior) khi tiến đến góc tán xạ nhỏ có thể đƣợc cho là do có sự tập hợp

(aggregation) của các phân tử sulfate polysaccharide trong dung dịch.

64

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Qua quá trình nghiên cứu, đề tài đã thu đƣợc các kết quả sau:

1. Đã thu thập và xử lý mẫu rong lục Chaetomorpha linum.

2. Đã chiết tách và tinh chế sulfate polysaccharide từ loài rong này với

hàm lƣợng 13,7% theo khối lƣợng rong khô.

3. Polysaccharide chiết từ loài rong Chaetomorpha linum là sulfate

arabinogalactan, phân tử của chúng đƣợc hình thành bởi các thành phần

đƣờng là galactose và arabino đƣợc sulfat hóa. Cấu trúc hóa học của

disaccharide của nó là galactose-3S-(1→3)-arabinose.

4. Polysaccharide chiết từ loài rong Chaetomorpha linum thể hiện hoạt

tính chống oxi hóa và đông tụ máu rất tốt, là một nguồn tiềm năng cho

công nghệ dƣợc phẩm.

4.2. KIẾN NGHỊ

Polysaccharide chiết tách từ loài lục chi Chaetomorpha là một hƣớng

nghiên cứu hứa hẹn có nhiều kết quả có ý nghĩa khoa học, đề nghị đƣợc tiếp

tục nghiên cứu trên các loài rong lục khác.

65

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tham khảo tiếng Việt

1. Lê Thị Hƣờng, Ngành rong biển Việt Nam: Triển vọng kinh tế gắn với phát

triển bền vững, Tạp chí môi trƣờng, số 8, 9/5/2017.

2. Phạm Hoàng Hộ, 1969. Rong biển Việt Nam (phần phía Nam). Trung tâm

học liệu Sài Gòn, 558 tr.

4. Quách Thị Minh Thu (2017), Nghiên cứu cấu trúc của Ulvan có hoạt tính

sinh học từ rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata, Luận án tiến sĩ hóa học –

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tài liệu tham khảo tiếng Anh

5. Ghada F. El-Said&Amany El-Sikaily (2013), Chemical composition of

some seaweed from Mediterranean Sea coast, Egypt, Environ Monit Assess,

185, 6089–6099.

6. Godard M., Rouanet J. M. (2009) - Polysaccharides from the green alga

Ulva rigida improve the antioxidant status and prevent fatty streak lesions in

the high cholesterol fed hamster, an animal model of nutritionally-induced

atherosclerosis, Food Chem. 115 176–180.

7. W Mao, X. Zang, Y. Li & Huijuan Z. (2006). Sulfated polysaccharides

from marine green algae Ulva conglobata and their anticoagulant activity. J.

Appl. Phycol., 18, 9–14.

8. Huimin Qi, Tingting Zhao, Quanbin Zhang, Zhien Li, Zengqin Zhao,

Ronge Xing, (2005). Antioxidant activity of different molecular weight

sulfated polysaccharides from ULVA PERTUSA Kjellm (Chlorophyta),

Journal of Applied Phycology , 17, 6, 527-534.

9. Alves A., Sousa R. A., and Reis R. L., (2012). In vitro cytotoxicity

assessment of ulvan, a polysaccharide extracted from green algae,

Phytotherapy Research, doi:10.1002/ptr.4843.

10. Lahaye, M. and Robic, A. (2007). Structure and Functional Properties of

66

Ulvan, a Polysaccharide from Green Seaweeds. Biomacromolecules, 8, 6,

1765-1774.

11. Rao EV, Ramana KS., (1991), Structural studies of a polysaccharide

isolated from the green seaweed Chaetomorpha anteninna, Carbohydr Res.

18; 217, 163-70.

12. Huynh QN, Nguyen HD. (2006), The seaweed resources of Vietnam. In

Seaweed Resources of the World, Critchley AT, Ohno M (Eds), Japan

International Cooperation Agency, Yokosuka, , 62-69.

13. Thanh Thi Thu Thuy, Quach Thi Minh Thu, Nguyen Thi Nu, Dang Vu

Luong, Tran Thi Thanh Van, (2016) Structure and cytotoxic activity of ulvan

extracted from green seaweed Ulva lactuca, International Journal of

Biological Macromolecules. 93, 695-702.

14. Bilan MI, Grachev AA, Ustuzhamina NE, Shashkov AS, Nifantiev NE,

Usov AI., (2002) Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus

evanescens C.Ag. Carbohydr. Res., 337 719-730.

15. Bitter T, Muir HM. A Modified Uronic Acid Carbazole Reaction. Anal

Biochem 4, 330-334 (1962).

16. Chong, A. Y, Blann, A. D. and Lip, G. Y. (2003) Assessment of

endothelial damage and dysfunction: observations in relation to heart failure.

QJM 96, 253-267.

17. Davie, E. W. (1995) Biochemical and molecular aspects of the

coagulation cascade. Thromb. Haemost. 74, 1-6.

18. Davie, E. W., Fujikawa, K. and Kisiel, W. (1991) The coagulation

cascade: initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry 30, 10363-

10370.

19. J. D. Palmer, D. E. Soltis, M. W. Chase, The plant tree of life: an overview

and some points of view, American Journal of Botany 91(10), 2004, pages

1437–1445.

20. Yimin Qin, Bioactive Seaweeds for Food Applications Natural Ingredients

67

for Healthy Diets, Seaweed Bioresources, 2018, Chapter 1, Pages 3-24.

21. Guillaume Pierre, Valérie Sopena, Camille Juin, Amira Mastouri, Marianne

Graber, Thierry Maugard, Antibacterial activity of a sulfated galactan

extracted from the marine alga Chaetomorpha aerea against Staphylococcus

aureus, Biotechnology and Bioprocess Engineering 2011, 16, 5, 937-945.

22. Pusey P. N. (1974), In Photon Correlation and Light Beating

Spectroscopy, (H. Z. Cummings and E. R. Pike, eds.), Plenum Press, New

York, 387-428.

23. An Introduction to Gel Permeation Chromatography and Size Exclusion

Chromatography, Agilent Technologies, Inc. 2015, Printed in US., April 30,

2015, 5990-6969 EN.

24. Leonel Pereira, Ana M. Amado, Alan T. Critchley, Fred van de Velde,

Paulo J.A. Ribeiro-Claro, Identification of selected seaweed polysaccharides

(phycocolloid) by vibrational spectroscopy (FTIR-ATR and FT-Raman), Food

Hydrocolloids 23 (2009), pp.1903–1909.

25. A. I. Usov, NMR Spectroscopy of Red Seaweed Polysaccharides: Agars,

Carrageenans, and Xylans, Botanica Marina, Volume 27, Issue 5, Pages 189–

202.

26. Berna Kılınç, Semra Cirik, Gamze Turan, Hatice Tekogul and Edis Koru

(2013). Food Industry, Seaweeds for Food and Industrial Applications,

chapter 31, Edited by Innocenzo Muzzalupo, January 16, 2013.

27. Titlyanov, E. A., Titlyanova, T. V., Li, X., & Huang, H. (2017). Common

Marine Algae of Hainan Island (Guidebook), Coral Reef Marine Plants of

Hainan Island, chapter 4, pages 75–228.

28. Gour Gopal Satpati and Ruma Pal, New and rare records of filamentous

green algae from Indian Sundarbans Biosphere Reserve, Journal of Algal

Biomass Utilization, 2016, 7 (2): 159- 175, eISSN: 2229 – 6905.

29. Ruperes, P. (2002), Mineral content of edible marine seaweeds, Food

Chemistry, vol 79, pp 23-26.

68

30. Massoumeh Farasat, Ramazan-Ali Khavari-Nejad, Seyed Mohammad

Bagher Nabavi and Foroogh Namjooyan. Antioxidant Properties of Some

Filamentous Green Algae (Chaetomorpha Genus). Brazilian Archives of

Biology and Technology, 2013, 56(6), 921-927.

31. Ms. J. Jebamalar & Dr. V. Judia Harriet Sumathy. A Comparartive

Analysis of the Anticoagulant Property of Chaetomorpha Antennina and

Ceratophyllum Submersum. IOSR Journal of Biotechnology and

Biochemistry, 2018, 4(5), 6-14.

32. AOAC International. Official Methods of Analysis of the Association of

Official Analytical Chemists., 16th edition, Gaithersburg, USA, 1996.

33. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B., A new procedure

for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds,

Carbohydr. Res., 1999, 322, 32-39.

34. Dodgson KS. Determination of inorganic sulphate in studies on the

enzymic and non-enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate

esters. Biochem J, 1961, 78, 312-319.

35. E. Anand Ganesh, Sunita Das, G. Arun, S. Balamurugan and R. Ruban

Raj. Heparin like Compound from Green Alga Chaetomorpha antennina – As

Potential Anticoagulant Agen. Asian Journal of Medical Sciences, 2009, I(3),

114-116.

36. Lingchong Wang, Xiangyu Wang, Hao Wu and Rui Liu. Overview on

Biological Activities and Molecular Characteristics of Sulfated

Polysaccharides from Marine Green Algae in Recent Years, Mar. Drugs.,

2014, 12, 4984-5020.

37. E. Anand Ganesh, Sunita Das, G. Arun, S. Balamurugan and R. Ruban

Raj. Heparin like Compound from Green Alga Chaetomorpha antennina - As

Potential Anticoagulant Agen. Asian Journal of Medical Sciences, 2009, 1(3),

114-116.

38. Dina R., Ana C., Teresa A. P., Marta W. (2015). Chemical composition of

69

red, brown and green macroalgae from Buarcos bay in Central West Coast

of Portugal, Food Chemistry, 183, 197–207.

39. Guillaume Pierre, Valérie Sopena, Camille Juin, Amira Mastouri,

Marianne Graber, Thierry Maugard (2011). Antibacterial activity of a

sulfated galactan extracted from the marine alga Chaetomorpha aerea against

Staphylococcus aureus, Biotechnology and Bioprocess Engineering,

Volume 16, Issue 5, pp 937-945.

40. Matsuhiro B. et at. (2005), “Structural analysis and antiviral activity of a

sulfated galactan from the red seaweed Schizymenia binderi (Gigartinales,

Rhodophyta)”, Carbohydr. Res., 340(15), pp. 2392 – 2402.

70

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1. SULFATE POLYSACCHARIDE CHIẾT TÁCH TỪ RONG LỤC CHI

CHEATOMORPHA: ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH

CHỐNG ĐÔNG TỤ MÁU. Quách Thị Minh Thu, Nguyễn Hải Minh,

Đặng Vũ Lƣơng, Trần Thị Thanh Vân, Nguyễn Thị Nụ, và Thành Thị

Thu Thủy, Tạp chí Hóa học, trang 117-120, số 57(6E1,2), tháng 12

năm 2019-Hội nghị Hóa học toàn quốc lần thứ 8.