Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông

máu IX của người ở vi khuẩn E. coli

Nguyễn Văn Phòng

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: PGS.TS. Nông Văn Hải

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người. Phân lập

được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người. Thiết kế được vector biểu

hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người. Chuyển và biểu

hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn

E. coli.

Keywords: Sinh học phân tử; Gen mã hóa; Di truyền học hóa sinh

Content

MỞ ĐẦU

“Thu hẹp khoảng cách - Kết nối cộng đồng” là thông điệp được đưa ra tại Lễ mít tinh

hưởng ứng ngày Hemophilia thế giới (17/4/) diễn ra tại Hà Nội, với mong muốn cải thiện tình

hình chăm sóc bệnh nhân bị bệnh Hemophilia (hay còn gọi là bệnh máu khó đông) trên phạm

vi toàn cầu, hướng tới mục tiêu tất cả người bệnh máu khó đông đều có cơ hội được điều trị

và chăm sóc tốt. Ở Việt Nam, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương

ước tính hiện nay có khoảng 6.000 bệnh nhân bị bệnh Hemophilia, trong đó mới chỉ 20%

bệnh nhân được phát hiện và chăm sóc thường xuyên. Hemophilia là một rối loạn chảy máu di

truyền do bất thường gen gây nên, bệnh nhân bị chảy máu khó cầm ở khắp các bộ phận trên

cơ thể, đặc biệt là cơ và khớp. Bệnh xuất hiện do cơ thể thiếu hụt hoặc không có đủ các yếu tố

làm đông máu, thường gặp là yếu tố VIII (hemophilia A) và IX (hemophilia B).

Trên thế giới, việc nghiên cứu và sử dụng các thuốc giúp làm máu đông nhanh để điều

trị bệnh Hemophilia bằng công nghệ sinh học đã được bắt đầu từ cuối năm 1980. Cho tới nay,

việc áp dụng những kỹ thuật hiện đại của công nghệ gen và protein để phân lập và tách dòng

cDNA nhằm sản xuất các chể phẩm protein tái tổ hợp VIII và IX trong các tế bào vi khuẩn và

tế bào động vật đã phát triển vượt bậc. Người ta đã sản xuất được các chế phẩm VIII và IX có

giá trị trong điều trị với giá thành hạ, sản lượng tăng, độ tinh sạch cao... đáp ứng những nhu

cầu cấp bách của thực tiễn.

Cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có một công bố hay đề tài nào về nghiên cứu sản xuất

yêu tô đông mau IX tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn hay tế bào động vật được thực hiện . Do

2

nhưng nhu câu câp thiêt trong điêu tri bênh Hemophilia , chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề

tài nghiên cứu: “Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi

khuẩn E. coli”, nhằm tạo ra một bước tiền đề hướng tới việc nghiên cứu và phát triển chế

phẩm yếu tố đông máu IX tái tổ hợp, góp phần vào việc chăm sóc sức khỏe bệnh nhân

Hemophilia trong tương lai.

Đề tài thực hiện với mục tiêu cụ thể sau:

1. Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người.

2. Phân lập được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người.

3. Thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX

của người.

4. Chuyển và biểu hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của

người ở vi khuẩn E. coli.

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về bệnh Hemophilia

1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh Hemophilia

Hemophilia là một bệnh rối loạn đông máu di truyền mà trong dân gian thường hay

gọi là “bệnh máu loãng”, “bệnh máu không đông” hoặc “bệnh máu khó cầm”. Bệnh này đặc

trưng bởi sự thiếu hụt hoặc không có một trong các protein cần thiết cho quá trình đông máu.

Một số người mắc bệnh Hemophilia do thiếu hụt yếu tố đông máu VIII, được gọi là

Hemophilia A. Một số khác do thiếu yếu tố đông máu IX, được gọi là Hemophilia B. Ngoài

ra, có tỷ lệ rất hiếm người mắc bệnh Hemophilia C, bệnh do thiếu hụt yếu tố đông máu XI.

1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh Hemophilia

Hemophilia là bệnh rối loạn chảy máu di truyền, được gây ra bởi đột biến trong các

gen mã hóa cho các yếu tố đông máu VIII, IX và XI. Tuy nhiên, có khoảng 30% trường hợp

mắc bệnh Hemophilia được sinh ra từ một gia đình không có tiền sử về bệnh Hemophilia

trước đó.

1.1.3. Phân loại Hemophilia

Bệnh Hemophilia có thể được chia làm 3 loại chính: Hemophilia A, Hemophilia B và

Hemophilia C.

1.1.4. Biểu hiện của bệnh Hemophilia

Biểu hiện của bệnh rất đa dạng: chảy máu bất thường, tự nhiên hoặc sau phẫu thuật, có

thể xảy ra ở bất cứ vị trí nào trên cơ thể tuy nhiên cơ và khớp thường hay bị chảy máu hơn

đến nỗi nhiều người bệnh nhầm tưởng là bệnh của cơ, khớp.

1.1.5. Phƣơng pháp điều trị bệnh Hemophilia

3

Đến nay, bệnh này vẫn chưa thể điều trị tận gốc. Người bệnh phải phụ thuộc vào các

loại thuốc đặc trị và bổ sung suốt đời các yếu tố đông máu lấy từ nguồn máu hiến và họ có thể

chung sống với bệnh.

1.2. Vai trò của yếu tố đông máu IX trong quá trình đông máu

Được tổng hợp chủ yếu ở gan sau đó được tiết vào máu, yếu tố đông máu IX đóng vai

trò rất quan trọng trong việc hoạt hóa yếu tố đông máu X thành dạng hoạt hóa Fxa.

1.3. Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX

Gen FIX là gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX (human factor IX, protein FIX), nằm

trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể giới tính X tại vị trí Xq27.1. Gen FIX có kích thước

khoảng 34 kb gồm 8 exon và 7 intron.

1.4. Cấu trúc và những biến đổi sau dịch mã của yếu tố đông máu IX

1.4.1. Cấu trúc của phân tử protein FIX

Ở người, phân tử protein FIX là một protein phụ thuộc vào vitamin K, tham gia vào

quá trình đông máu. Phân tử protein FIX được tổng hợp ở các tế bào của mô gan dưới dạng

một protein tiền chất của một serine protease-FIXa. Sau khi được tổng hợp, protein tiền chất

này là một chuỗi polypeptide đơn gồm 461 amino acid, khối lượng khoảng 56 kDa.

1.4.2. Những biến đổi sau dịch mã của phân tử protein FIX

1.5. Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX

Để yếu tố đông máu IX (protein FIX) trở thành một protease chức năng trong quá

trình đông máu, đoạn peptide hoạt hóa phải được loại bỏ khỏi chuỗi polypeptide của protein

FIX tiền chất. Phân tử protein FIX có thể được hoạt hóa trở thành dạng protease (protein

FIXaβ) bởi phức hợp TF/FVIIa hoặc FXIa (dạng hoạt hóa của yếu tố XI) cùng với sự có mặt

của màng phospholipid và ion Ca2+

.

1.6. Vector biểu hiện pET32a

Vector pET32a là một vector thuộc hệ vector pET của hãng Novagen. Đây là vector

được thiết kế với mục đích để chọn dòng và biểu hiện ở mức độ cao của các gen ngoại lai ở vi

khuẩn E. coli. Vector pET32a (5.900 bp) thường được sử dụng với mục đích chính là biểu

hiện gen.

1.7. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3)

E. coli BL21 là chủng được bắt nguồn từ E. coli B, được phát hiện vào năm 1946. E.

coli là vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy tiện và không sinh bào tử. Tế bào E. coli có khả năng

sinh sản với tốc độ nhanh trên môi trường nuôi cấy tối thiểu, trung bình khoảng 20 phút chúng

lại phân chia một lần.

1.8. Các hệ thống biểu hiện dùng trong tạo protein tái tổ hợp

4

Đối với dược phẩm sinh học tái tổ hợp, hệ thống biểu hiện có thể là hệ thống nhân sơ

(prokaryote) hoặc nhân chuẩn (eukaryote).

1.9. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc

Hướng nghiên cứu biểu hiện gen/protein có giá trị để tiến tới sản xuất sinh phẩm sử

dụng trong y dược là hướng rất quan trọng, cấp thiết mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta

trong thời gian gần đây.

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

Mẫu nghiên cứu

Các mẫu gan sinh thiết được lấy từ những người Việt Nam khỏe mạnh do bệnh viện K

cung cấp.

Chủng vi sinh vật

Chủng E.coli DH5α của hãng Invitrogen được sử dụng để chọn dòng và nhân dòng

gen.

Chủng E. coli BL21(DE3) của hãng Bio-Rad được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa

yếu tố đông máu IX ở người.

Các vector

Vector tách dòng: pJET1.2/blunt (Fermentas).

Vector biểu hiện: pET32a (Novagen).

Các cặp mồi

Các cặp mồi dùng để phân lập, chọn dòng và biểu hiện gen được thiết kế dựa trên trình

tự cDNA chuẩn công bố trên Genbank (NM_000133) và đặt tổng hợp hãng IDT (Mỹ) có trình

tự như sau:

Bảng 1. Trình tự các cặp mồi được sử dụng.

STT Tên mồi Trình tự nucleotide

1 FIX-F1 5’- GCT AGC AAA GGT TAT GCA GCG C- 3’

FIX-R1 5’- GGA AAT CCA TCT TTC ATT AAG TG- 3’

2 FIX-F4-NcoI

5’-TTC TGG TGC ACC ATG GTT TTT CTT GAT CAT GAA AAC GCC-3’

FIX-R5-XhoI

5’- ATATG CTC GAG TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AGT GAG CTT TGT TTT TTC C- 3’

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế cặp mồi (F1/R1) để nhân toàn bộ cDNA mã

hóa FIX từ mRNA được tách từ mô gan sinh thiết ở người. Trong khi biểu hiện, chúng tôi

thiết kế cặp mồi (F4/R5) với mục đích nhân đoạn cDNA mã hóa FIX với chuỗi polypeptide

cắt vùng tín hiệu tiết (signal peptide) ở đầu N để biểu hiện đoạn cDNA này trong tế bào vi

khuẩn E. coli. Protein mã hóa từ cDNA được nhân với cặp mồi (F4/R5), kí hiệu là FIXnoSP.

Hóa chất

5

Các enzyme giới hạn NcoI, XbaI, XhoI...; các hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR (đệm,

MgCl2, dNTPs, enzyme Taq DNA polymerase, enzyme Pfu DNA polymerase được đặt mua

tại hãng Fermentas.

Các hóa chất dùng để tách RNA, DNA plasmid hay điện di protein của hãng

Amersham Bioscien (Anh), BioRad (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merk (Đức).

Các bộ Kit tổng hợp cDNA, tinh sạch sản phẩm PCR, tinh sạch DNA plasmid... của

hãng Promega (Mỹ), Invitrogen (Mỹ).

Trang thiết bị

Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các trang thiết bị của Viện Công

nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen.

2.2. Phƣơng pháp

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số

Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô gan sinh thiết người bằng Trizol.

2.2.2. Tổng hợp cDNA

cDNA sợi một được tổng hợp từ khuôn RNA tổng số được tiến hành theo hướng dẫn

của Kit tổng hợp cDNA SuperScriptTM

First-Strand Synthesis System for RT-PCR

(Invitrogen).

2.2.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR

2.2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose

2.2.5. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế

Sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu

dính tại các vị trí xác định nhờ trình tự nhận biết đặc hiệu.

2.2.6. Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose

Các sản phẩm PCR bằng cách điện di chúng trên gel 0,8% agarose, sau đó cắt phần gel

có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard®SV.

2.2.7. Ghép nối DNA

Dưới sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase, các cầu nối phosphodieste sẽ được hình

thành giữa hai nucleotide sát cạnh nhau trên cùng một mạch (gốc phosphat đầu 5’ của

nucleotide đoạn DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của nucleotide của đoạn DNA kia), đồng

thời giải phóng một phân tử nước.

2.2.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt

Dưới tác dụng của CaCl2 0,1 M, thành tế bào vi khuẩn E.coli đang ở giai đoạn sinh

trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua các lỗ xốp trên màng tế bào chất

khi thay đổi nhiệt độ đột ngột.

2.2.9. Tách chiết DNA plasmid

6

Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS,

NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn, biến tính các phân tử protein và

giải phóng các plasmid của vi khuẩn.

2.2.10. Xác định trình tự DNA

Trình tự nucleotide quan tâm được xác định trên nguyên tắc của phương pháp Sanger.

2.2.11. Biểu hiện gen mã hóa cho protein FIX

Sau khi các plasmid tái tổ hợp (pET32a; pET32a/FIXnoSP) được biến nạp vào chủng E.

coli BL 21(DE3), chọn các khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên đĩa môi trường chọn lọc LBA và

nuôi cấy lắc qua đêm vào môi trường LBA qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút. Hòa dịch nuôi

cấy qua đêm vào môi trường LBA theo tỷ lệ 1% và nuôi cấy ở cùng điều kiện trên trong

khoảng thời gian 2h đến khi OD600nm của dịch tế bào đạt 0,6 - 0,8 thì bổ sung IPTG vào môi

trường nuôi cấy với nồng độ cuối cùng là 0,5 mM. Nuôi tiếp tục khoảng 3h ở 37oC, 200

vòng/phút để tổng hợp FIXnoSP-Trx. Mẫu tế bào được thu ở các thời điểm 0h, 1h và 3h sau

cảm ứng. Tế bào được thu bằng cách ly tâm 6.000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Màng

ngoài tế bào được phá bằng siêu âm. Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp được kiểm tra

bằng điện di SDS-PAGE.

2.2.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE

SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Laemmli UK, 1970 với các thiết bị

của hãng Bio-Rad. Để phân tách các protein có trọng lượng từ 12 - 68 kDa, chúng ta sử dụng

gel ở nồng độ 12,6% (w/v).

2.3.1. Sơ đồ thí nghiệm

Nội dung nghiên cứu được chia làm hai phần và thực hiện qua các bước sau:

a. Phân lập gen mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô gan sinh thiết ở người.

b. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa FIXnoSP và biểu hiện trong tế bào vi

khuẩn E. coli BL21(DE3).

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập gen mã hóa yêu tố đông máu IX ở ngƣời

3.1.1. Thu thập mẫu mô gan sinh thiết ngƣời

Do yếu tố đông máu IX người được tổng hợp chủ yếu ở các tế bào mô gan nên chúng

tôi đã chọn mô gan làm nguyên liệu nghiên cứu. Phối hợp với Bệnh viện K, chúng tôi đã chọn

được mẫu mô gan sinh thiết từ 2 trong số 7 người.

3.1.2. Tách chiết RNA tổng số

Sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ 2 mẫu mô gan sinh thiết bằng phương pháp trizol

được điện di biến tính trên gel agarose 1% (Hình 1). Kết quả điện di thể hiện rõ các băng 28S,

18S và 5S rRNA, không có hiện tượng bị phân hủy do quá trình tách chiết.

7

Hình 1. Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1%.

1 - 2: Sản phẩm RNA tổng số của 2 mẫu mô gan sinh thiết người.

Như vậy, chúng tôi đã tách chiết được RNA tổng số từ 2 mẫu mô sinh tiết gan ở

người. Mẫu RNA tổng số tách từ mẫu mô gan sinh thiết của Lương Mỹ H. được sử dụng làm

nguyên liệu cho việc tổng hợp cDNA mã hóa FIX ở người.

3.1.3. Tạo dòng và xác định trình tự gen FIX

Thiết kế cặp mồi và PCR

Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa protein FIX của người đã công bố trên Ngân hàng

trình tự gen Quốc tế GENBANK/DDBJ/EMBL (mã số NM_000133), chúng tôi đã thiết kế

cặp mồi nhân cDNA mã hóa FIX là F1/R1.

Sản phẩm RT-PCR sau đó được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose

0,8% (Hình 2). Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR thu được một băng đặc hiệu có kích

thước khoảng 1,4 kb phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của cDNA mã hóa cho FIX.

Như vậy, sản phẩm PCR đã đạt độ đặc hiệu về kích thước và đảm bảo về nồng độ để sử dụng

cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 2. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa FIX

trên gel agarose 0,8%.

M: Marker 1 kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR nhân gen FIX.

Tạo dòng đoạn cDNA mã hóa protein FIX trong vector pJET1.2

Để tạo cơ sở cho thí nghiệm thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho FIX,

chúng tôi đã tiến hành tạo dòng phân tử sản phẩm RT-PCR (tức là nhân bản chúng trong tế

bào chủ dưới dạng một plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA này).

8

Tinh sạch sản phẩm PCR và gắn vào vector tách dòng

Tách chiết DNA plasmid

Chúng tôi đã tiến hành tách chiết plasmid từ 11 khuẩn lạc. Sản phẩm tách chiết

plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3). Các plasmid có kích

thước lớn hơn kích thước của plasmid đối chứng âm là các plasmid có khả năng mang sản

phẩm RT-PCR.

Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid, chúng tôi có thể sơ bộ kết luận các dòng

vi khuẩn (2, 4 và 9) chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn sản phẩm RT-PCR.

Hình 3. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8%.

1: Đối chứng âm (vector pJET1.2 không mang đoạn đoạn sản phẩm RT-PCR); 2- 12:

Plasmid tái tổ hợp của 3 dòng vi khuẩn mang (giếng số 2, 4 và 9) và không mang sản

phẩm RT-PCR (giếng số 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11 và 12).

Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế

Hình 4. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang cDNA của gen FIX

bằng enzyme hạn chế XbaI và XhoI.

M: Marker 1kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIX; 2, 3, 4: Sản phẩm xử lý pJET1.2/FIX_p18; pJET1.2/FIX_p19, pJET1.2/FIX_p22 bằng XbaI + XhoI; 5: Sản phẩm xử lý pJET1.2/XbaI + XhoI.

Chúng tôi đã tiến hành xử lý plasmid của các dòng số hai, bốn và chín (ký hiệu: dòng

pJET1.2/FIX_p18, pJET1.2/FIX_p19 và pJET1/FIX_p22) bằng hai enzyme hạn chế XbaI và

XhoI. Kết quả cho thấy, plasmid của 3 dòng này khi được xử lý bằng hai enzyme nói trên đã

cho hai băng: một băng có kích thước khoảng 3,0 kb (tương đương với kích thước của vector

pJET1.2) và một băng có kích thước khoảng 1,4 kb (tương đương kích thước của sản phẩm

PCR) (Hình 4).

9

Như vậy, đoạn cDNA mã hóa cho protein FIX đã được tách dòng thành công trong

vector pJET1.2. Các plasmid tái tổ hợp được tách chiết với lượng lớn và được tinh sạch cho

phản ứng xác định trình tự.

Trình tự nucleotide của FIX

Để khẳng định chính xác sản phẩm tách dòng là đoạn cDNA của gen FIX, sản phẩm

được tiếp tục xác định trình tự nucleotide. Sau khi phân tích trình tự cả 3 dòng plasmid tái tổ

hợp, đoạn cDNA có chiều dài 1386 bp, khung dịch mã được xác định mã hóa yếu tố đông

máu IX gồm 461 amino acid kể cả mã kết thúc.

Khi so sánh trình tự cDNA đầy đủ của gen FIX được phân lập từ mô gan sinh thiết của

người Việt Nam với trình tự trên ngân hàng GenBank (NM_000133), chúng tôi thấy ở dòng

p19 có độ tương đồng là 100% ở cả mức độ nucleotide và amino acid.

3.2. Thiết kế vector biểu hiện FIX (pET32a/FIXnoSP)

3.2.1. Khuếch đại cDNA mã hóa FIXnoSP

Trong nghiên cứu này, vector pJET1.2/FIX_p19 đã được sử dụng làm khuôn để nhân

bản gen cần biểu hiện. Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa FIX của người công bố trên Ngân

hàng trình tự gen Quốc tế GenBank (NM_000133), chúng tôi đã thiết kế cặp mồi nhân cDNA

mã hóa FIXnoSP là F4/R5. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.

Kết quả điện di được thể hiện ở Hình 5.

Kết quả điện di đồ cho thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước phân tử khoảng

1,3 kb, kích thước này phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết. Băng sản phẩm PCR sáng,

đậm và rõ nét đủ điều kiện cho việc tạo dòng vector tái tổ hợp. Sản phẩm PCR này được xử lý

với enzyme hạn chế NcoI và XhoI, sau đó tinh sạch trước khi sử dụng để tiến hành ghép nối

gen.

Hình 5. Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa FIXnoSP.

M: Marker 1 kb (Fermentas); 1 : Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIXnoSP nhân từ khuôn là pJET1.2/FIX (p19).

3.2.2. Ghép nối cDNA mã hóa FIXnoSP vào vector biểu hiện pET32a

Vector pET32a và sản phẩm PCR sau khi được xử lý với hai enzyme hạn chế (NcoI và

XhoI) sẽ được tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trước khi thực hiện phản

ứng ghép nối với nhau (Hình 6).

10

Hình 6. Ảnh điện đi đồ sản phẩm PCR và vector pET32a sau khi

tinh sạch trên gel agarose 0,8%.

M: Marker 1 kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR (FIXnoSP)/ (NcoI và XhoI); 2: Vector pET32a/( NcoI và XhoI).

Trên cơ sở kết quả điện di (Hình 6), vector pET32a và cDNA mã hóa FIXnoSP được

ghép nối với nhau nhờ xúc tác của enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm phản ứng ghép nối gen

được biến nạp vào tế bào E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt và chọn lọc trên môi

trường có bổ xung kháng sinh Amp với nồng độ 100 μg/ml. Kết quả, chúng tôi đã nhận được

một số dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp.

3.2.3. Kiểm tra sự có mặt của cDNA mã hóa FIXnoSP trong vector pET32a

Để xác định các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành

chọn lọc các khuẩn lạc mọc trên môi trường có kháng sinh Amp, nuôi cấy thu sinh khối để

tách DNA plasmid của các khuẩn lạc, cắt kiểm tra các plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn

chế (NcoI và XhoI) và giải trình tự gen.

a. Tách chiết DNA plasmid

Chúng tôi tiến hành nhặt 5 khuẩn lạc và sản phẩm tách chiết plasmid được kiểm tra

bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 7). Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid,

chúng tôi thấy cả 5 dòng vi khuẩn (2 3, 4 và 5) đều có kích thước lớn hơn kích thước đối

chứng (1). Từ đó, chúng tôi có thể sơ bộ kết luận 5 dòng vi khuẩn này chứa plasmid tái tổ hợp

mang đoạn cDNA mã hóa FIXnoSP.

Hình 7. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8%.

1: Đối chứng âm (vector pET32a không mang đoạn DNA ngoại lai); 2 - 6: DNA plasmid của 5 dòng vi khuẩn.

b. Kiểm tra các plasmid bằng enzyme giới hạn

11

Hình 8. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng

enzyme hạn chế trên gel agarose 0,8%.

M: Marker 1kb; 1: Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIXnoSP; 2 - 4: Sản phẩm xử lý pET32a/ FIXnoSP với enzyme NcoI + XhoI; 5: Sản phẩm xử lý pET32a với enzyme NcoI + XhoI.

Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid Hình 7, chúng tôi tiến hành lựa chọn 3

trong 5 dòng vi khuẩn này để cắt kiểm tra bằng hai enzyme hạn chế (NcoI và XhoI) để kiểm

tra kích thước đoạn chèn (Hình 8). Kết quả trên ảnh điện di Hình 8 cho thấy, tại các đường

chạy số 2, 3 và 4 xuất hiện các băng có kích thước đúng như tính toán. Từ đó, chúng tôi có thể

kết luận rằng đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện pET32a/FIXnoSP.

c. Kiểm tra độ chính xác trình tự nucleotide của đoạn cDNA mã hóa FIXnoSP trong

vector tái tổ hợp pET32a/FIXnoSP

Chúng tôi đã lựa chọn một trong số ba dòng plasmid tái tổ hợp đã được cắt kiểm tra

thành công bằng enzyme trước đó để tiến hành giải trình tự nucleotide và so sánh với trình tự

cDNA (GenBank: NM_000133). Sau khi phân tích trình tự dòng plasmid tái tổ hợp này, đoạn

cDNA mã hóa FIXnoSP có kích thước 1302 bp và khung dịch mã được xác định yếu tố đông

máu IX với chuỗi polypeptide cắt đoạn tín hiệu đầu N tương ứng với 433 amino acid.

Như vậy có thể kết luận, chúng tôi đã thiết kết thành công vector tái tổ hợp

pET32a/FIXnoSP mang cDNA mã hóa cho FIXnoSP và cấu trúc này đã được chọn dòng trong vi

khuẩn E. coli DH 5α.

3.3. Biểu hiện cDNA mã hóa FIXnoSP ở vi khuẩn E. coli BL21(DE3)

Kết thúc thí nghiệm, chúng tôi thu được dịch tế bào có chứa protein tái tổ hợp. Để

kiểm tra kết quả biểu hiện chúng tôi đã tiến hành điện di biến tính protein trên gel

polyacrylamide 12,6% có SDS. Kết quả điện di protein tổng số của các mẫu được trình bày ở

Hình 9.

Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp cho thấy, protein tổng số của các mẫu tế bào ở

phân đoạn không tan thu tại các thời điểm khác nhau sau khi được cảm ứng bằng IPTG (các

đường chạy từ 4 - 6), có xuất hiện một băng protein mới có khối lượng phân tử khoảng 67

kDa so với mẫu đối chứng sau khi cảm ứng bởi IPTG (các đường chạy từ 1 - 3). Như đã trình

bày ở trên, ở đây sản phẩm protein lai FIXnoSP-Trx biểu hiện sẽ bao gồm trình tự đoạn lai (158

aa) và trình tự FIXnoSP (433 aa), tương đương với băng có kích thước khoảng 67 kDa. Như

12

vậy protein mới này có trọng lượng phân tử phù hợp với tính toán lý thuyết về trọng lượng

phân tử của protein FIXnoSP-Trx.

Hình 9. Điện di kết quả biểu hiện protein trên gel polyacrylamide 12,6%. M: Marker protein (Fermentas); 1: Protein tổng số của đối chứng (pET32a), tại thời điểm 0h (trước cảm ứng); 2-3: Protein tổng số của đối chứng (pET32a), sau 1h và 3h cảm ứng bằng IPTG; 4-6: Protein tổng số của mẫu tế bào E.coli mang pET32a/FIXnoSP ở pha không tan sau 0h, 1h và 3h cảm ứng bằng IPTG.

Kết quả điện di trên gel acrylamide 12,6% cho thấy protein dung hợp FIXnoSP-Trx

được biểu hiện tốt nhất ở nhiệt độ 37oC, 0,5 mM IPTG và thời gian nuôi cấy là 3h sau cảm

ứng (Hình 29). Các kết quả nhận được cho thấy các điều kiện đã sử dụng để biểu hiện protein

tái tổ hợp là tương đối phù hợp.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi có một số kết luận sau:

Từ mô gan sinh thiết của người Việt Nam khỏe mạnh, chúng tôi đã tách được RNA

tổng số có chất lượng đảm bảo, làm nguyên liệu tổng hợp cDNA mã hóa cho FIX.

Đã nhân được đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu ở người (FIX). Đoạn cDNA

mã hóa FIX có độ dài tương ứng khoảng 1,4 kb mã hóa 461 amino acid đã được tách

dòng và giải trình tự.

Đã thiết kế được vector biểu hiện pET32a/FIXnoSP mang đoạn cDNA mã hóa FIXnoSP

và biểu hiện được gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX ở E. coli.

Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện cDNA mã hóa FIXnoSP trong vector pET32a ở vi khuẩn

E.coli.

Nghiên cứu phương pháp biến tính, hồi tính cho protein dung hợp FIXnoSP-Trx thể vùi

để thu được protein FIXnoSP ở dạng tan. Từ đó, nghiên cứu phương pháp tinh sạch

protein FIXnoSP để từng bước tiến tới sản xuất chế phẩm.

References

Tài liệu tiếng việt

13

1. Bùi Thị Huyền, Đặng Thành Nam, Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Hoàng Quốc

Trường, Phan Văn Chi (2005), “Biểu hiện và xác định interleukin-2 của người”, Tạp

chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 143-148.

2. Chu Kỳ Nam, Hoàng Văn Quốc Chương, Trần Linh Thước (2005), “Tạo dòng và biểu hiện

mini-proinsulin của người tái tổ hợp trong Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh

học, 3(2), tr. 155-160.

3. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), “Biểu hiện

gen interleukin-2 của người rh-IL2MM bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc

cysteine 125 trong Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học. 3(2), tr. 149-154.

4. Lã Thị Huyền, Nguyễn Phương Hoa, Đặng Thị Thu, Lê Quang Huấn (2009), “Biểu hiện

kháng nguyên CD25 tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,

7(3), tr. 319-324.

5. Lê Thu Ngọc (2009), “Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin P của vi khuẩn

Enterococcus faecium P13 trong tế bào Escherichia coli ER2566”, Luận văn thạc sĩ

Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

6. Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005), “Nghiên cứu và phát triển sản xuất vaccine ăn

được trong thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 133-142.

7. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp

dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB Khoa

học và Kỹ thuật, Hà Nội.

8. Nguyễn Đình Cường, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi

(2004), “Tinh chế và phân tích khối phổ protein bất hoạt ribosome tái tổ hợp từ cây

mướp đắng (Momordica charantia L.)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(2), tr. 217-

226.

9. Nguyễn Đình Cường, Nguyễn Thùy Dương, Lê Thị Thu Hiền, Lương Thị Thu Hường,

Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải (2003),

“Biểu hiện gen mã hóa protein bất hoạt ribosome của cây mướp đắng ở vi khuẩn

Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1(4), tr. 451-460.

10. Nguyễn Đình Huyên (1998), Sinh học phân tử ADN, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

11. Nguyễn Hải Hà, Nguyễn Văn Phòng, Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Huy Hoàng, Quyền

Đình Thi, Nông Văn Hải (2010), “Biểu hiện yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (h-tPA)

người ở tế bào”, Kỷ yếu hội nghị sinh học phân và hóa sinh y học, tr. 185-191.

14

12. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005), “Tách dòng gen mã hóa

interleukin-2 của người”, Y học Việt Nam 310(5), tr. 26-30.

13. Nguyễn Thu Thúy, Trần Vân Khánh, Phạm Đăng Khoa, Tạ Thành Văn (2008), “Nghiên

cứu tách dòng gen mã hóa yếu tố đông máu VIII ở người”, Tạp chí nghiên cứu Y học,

tr. 7-12.

14. Nguyễn Thúy Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu, Phan Văn Chi (2003), “Khả năng ức

chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro của Trichobakin tái tổ hợp”, Y học Việt

Nam, 284, tr. 26-30.

15. Vũ Ngọc Tân, Vũ Minh Đức, Lê Thị Lan Anh, Bùi Khánh Chi, Trương Nam Hải (2009),

“Biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 của người trong tế bào Escherichia coli”, Tạp chí

Công nghệ sinh học, 7(1), tr. 35-39.

Tài liệu tiếng anh

16. Amphlett G. W., Kisiel W., Castellino F. J. (1981), "The interaction of Ca2+

with human

Factor IX", Arch Biochem Biophys, 208(2), pp. 576-585.

17. Anson D. S., Choo K. H., Rees D. J., Giannelli F., Gould K., Huddleston J. A., Brownlee

G. G. (1984), "The gene structure of human anti-haemophilic factor IX", EMBO J,

3(5), pp. 1053-1060.

18. Bajaj S. P., Sabharwal A. K., Gorka J., Birktoft J. J. (1992), "Antibody-probed

conformational transitions in the protease domain of human factor IX upon calcium

binding and zymogen activation: putative high-affinity Ca2+

-binding site in the

protease domain", Proc Natl Acad Sci U S A, 89(1), pp. 152-156.

19. Bovill E. G., Mann K. G. (1987), "Warfarin and the biochemistry of the vitamin K

dependent proteins", Adv Exp Med Biol, 214, pp. 17-46.

20. Brandstetter H., Bauer M., Huber R., Lollar P., Bode W. (1995), "X-ray structure of

clotting factor IXa: active site and module structure related to Xase activity and

hemophilia B", Proc Natl Acad Sci U S A, 92(21), pp. 9796-9800.

21. Bristol J. A., Freedman S. J., Furie B. C., Furie B. (1994), "Profactor IX: the propeptide

inhibits binding to membrane surfaces and activation by factor XIa", Biochemistry,

33(47), pp. 14136-14143.

22. Broze G. J., Jr., Gailani D. (1993), "The role of factor XI in coagulation", Thromb

Haemost, 70(1), pp. 72-74.

23. Chalmers E. A. (2004), "Haemophilia and the newborn", Blood Rev, 18(2), pp. 85-92.

15

24. Chavin S. I., Weidner S. M. (1984), "Blood clotting factor IX. Loss of activity after

cleavage of sialic acid residues", J Biol Chem, 259(6), pp. 3387-3390.

25. Chen S. H., Yoshitake S., Chance P. F., Bray G. L., Thompson A. R., Scott C. R., Kurachi

K. (1985), "An intragenic deletion of the factor IX gene in a family with hemophilia

B", J Clin Invest, 76(6), pp. 2161-2164.

26. Derian C. K., VanDusen W., Przysiecki C. T., Walsh P. N., Berkner K. L., Kaufman R. J.,

Friedman P. A. (1989), "Inhibitors of 2-ketoglutarate-dependent dioxygenases block

aspartyl beta-hydroxylation of recombinant human factor IX in several mammalian

expression systems", J Biol Chem, 264(12), pp. 6615-6618.

27. Di Scipio R. G., Kurachi K., Davie E. W. (1978), "Activation of human factor IX

(Christmas factor)", J Clin Invest, 61(6), pp. 1528-1538.

28. Doolittle R. F., Feng D. F., Johnson M. S. (1984), "Computer-based characterization of

epidermal growth factor precursor", Nature, 307(5951), pp. 558-560.

29. Fernlund P., Stenflo J. (1983), "Beta-hydroxyaspartic acid in vitamin K-dependent

proteins", J Biol Chem, 258(20), pp. 12509-12512.

30. Furie B., Bouchard B. A., Furie B. C. (1999), "Vitamin K-dependent biosynthesis of

gamma-carboxyglutamic acid", Blood, 93(6), pp. 1798-1808.

31. Furie B., Furie B. C. (1988), "The molecular basis of blood coagulation", Cell, 53(4), pp.

505-518.

32. Furie B., Furie B. C. (2005), "Thrombus formation in vivo", J Clin Invest, 115(12), pp.

3355-3362.

33. Galeffi P., Brownlee G. G. (1987), "The propeptide region of clotting factor IX is a signal

for a vitamin K dependent carboxylase: evidence from protein engineering of amino

acid -4", Nucleic Acids Res, 15(22), pp. 9505-9513.

34. Green P. M., Bentley D. R., Mibashan R. S., Nilsson I. M., Giannelli F. (1989),

"Molecular pathology of haemophilia B", EMBO J, 8(4), pp. 1067-1072.

35. Hoag H., Gore J., Barry D., Mueller C. (1999), "Gene therapy expression vectors based on

the clotting Factor IX promoter", Gene Ther, 6(9), pp. 1584-1589.

36. Hoffman M., Monroe D. M., 3rd (2001), "A cell-based model of hemostasis", Thromb

Haemost, 85(6), pp. 958-965.

37. Hoffman M., Monroe D. M., Oliver J. A., Roberts H. R. (1995), "Factors IXa and Xa play

distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation", Blood, 86(5), pp.

1794-1801.

16

38. Kaufman R. J. (1998), "Post-translational modifications required for coagulation factor

secretion and function", Thromb Haemost, 79(6), pp. 1068-1079.

39. Kurachi K., Davie E. W. (1982), "Isolation and characterization of a cDNA coding for

human factor IX", Proc Natl Acad Sci U S A, 79(21), pp. 6461-6464.

40. Laemmli U. K. (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4", Nature, 227(5259), pp. 680-685.

41. LaVallie E. R., DiBlasio E. A., Kovacic S., Grant K. L., Schendel P. F., McCoy J. M.

(1993), "A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body

formation in the E. coli cytoplasm", Biotechnology (N Y), 11(2), pp. 187-193.

42. Lawson J. H., Mann K. G. (1991), "Cooperative activation of human factor IX by the

human extrinsic pathway of blood coagulation", J Biol Chem, 266(17), pp. 11317-

11327.

43. Lenting P. J., Christophe O. D., Maat H., Rees D. J., Mertens K. (1996), "Ca2+

binding to

the first epidermal growth factor-like domain of human blood coagulation factor IX

promotes enzyme activity and factor VIII light chain binding", J Biol Chem, 271(41),

pp. 25332-25337.

44. Lin S. W., Dunn J. J., Studier F. W., Stafford D. W. (1987), "Expression of human factor

IX and its subfragments in Escherichia coli and generation of antibodies to the

subfragments", Biochemistry, 26(17), pp. 5267-5274.

45. Lindquist P. A., Fujikawa K., Davie E. W. (1978), "Activation of bovine factor IX

(Christmas factor) by factor XIa (activated plasma thromboplastin antecedent) and a

protease from Russell's viper venom", J Biol Chem, 253(6), pp. 1902-1909.

46. Mannucci P. M., Ruggeri Z. M., Pareti F. I., Capitanio A. (1977), "1-Deamino-8-d-

arginine vasopressin: a new pharmacological approach to the management of

haemophilia and von Willebrands' diseases", Lancet, 1(8017), pp. 869-872.

47. Nemerson Y. (1992), "The tissue factor pathway of blood coagulation", Semin Hematol,

29(3), pp. 170-176.

48. Park C. H., Seo J. Y., Kim H. J., Jang J. H., Kim S. H. "A diagnostic challenge: mild

hemophilia B with normal activated partial thromboplastin time", Blood Coagul

Fibrinolysis, 21(4), pp. 368-371.

49. pET system manual of Novagen (2003), 10th Edition Rev.B0403, pp. 11-13.

50. Presnell S. R., Stafford D. W. (2002), "The vitamin K-dependent carboxylase", Thromb

Haemost, 87(6), pp. 937-946.

17

51. Sambrook J., Russel W. D. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd

, ed,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

52. Siguret V., Amselem S., Vidaud M., Assouline Z., Kerbiriou-Nabias D., Pietu G.,

Goossens M., Larrieu M. J., Bahnak B., Meyer D., et al. (1988), "Identification of a

CpG mutation in the coagulation factor-IX gene by analysis of amplified DNA

sequences", Br J Haematol, 70(4), pp. 411-416.

53. Singh S. M., Panda A. K. (2005), "Solubilization and refolding of bacterial inclusion body

proteins", J Biosci Bioeng, 99(4), pp. 303-310.

54. Sona P.S, Lingam C. M. (2010). "Hemophilia: An overview", International journal of

pharma ceutical review and rechear, 5, pp. 18-26.

55. Stenina O., Pudota B. N., McNally B. A., Hommema E. L., Berkner K. L. (2001),

"Tethered processivity of the vitamin K-dependent carboxylase: factor IX is efficiently

modified in a mechanism which distinguishes Gla's from Glu's and which accounts for

comprehensive carboxylation in vivo", Biochemistry, 40(34), pp. 10301-10309.

56. Studier F. W., Moffatt B. A. (1986), "Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct

selective high-level expression of cloned genes", J Mol Biol, 189(1), pp. 113-130.

57. Sunnerhagen M. S., Persson E., Dahlqvist I., Drakenberg T., Stenflo J., Mayhew M.,

Robin M., Handford P., Tilley J. W., Campbell I. D., et al. (1993), "The effect of

aspartate hydroxylation on calcium binding to epidermal growth factor-like modules

in coagulation factors IX and X", J Biol Chem, 268(31), pp. 23339-23344.

58. Suttie J. W. (1980), "Mechanism of action of vitamin K: synthesis of gamma-

carboxyglutamic acid", CRC Crit Rev Biochem, 8(2), pp. 191-223.

59. Wang L., Zoppe M., Hackeng T. M., Griffin J. H., Lee K. F., Verma I. M. (1997), "A

factor IX-deficient mouse model for hemophilia B gene therapy", Proc Natl Acad Sci

U S A, 94(21), pp. 11563-11566.

60. Wasley L. C., Rehemtulla A., Bristol J. A., Kaufman R. J. (1993), "PACE/furin can

process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory

pathway", J Biol Chem, 268(12), pp. 8458-8465.

61. Wojcik E. G., Van Den Berg M., Poort S. R., Bertina R. M. (1997), "Modification of the

N-terminus of human factor IX by defective propeptide cleavage or acetylation results

in a destabilized calcium-induced conformation: effects on phospholipid binding and

activation by factor XIa", Biochem J, 323 (3), pp. 629-636.

62. Wolberg A. S., Morris D. P., Stafford D. W. (1997), "Factor IX activation by factor XIa

proceeds without release of a free intermediate", Biochemistry, 36(14), pp. 4074-4079.

18

63. Yoshitake S., Schach B. G., Foster D. C., Davie E. W., Kurachi K. (1985), "Nucleotide

sequence of the gene for human factor IX (antihemophilic factor B)", Biochemistry,

24(14), pp. 3736-3750.

Tài liệu trang Website

64. http://ghr.nlm.nih.gov/gene/F9.

65. http://hemoviet.org.vn/detail-disease-c4-i9.html.

66. http://hemoviet.org.vn/detail-intro-c4-i22.html.

67. http://scholar.lib.vt.edu/theses/available/edt-12212004-143333/unrestricted/chap

ter2-Backgroupd.pdf.

68. http://www.cdc.gov/ncbddd/hemophilia/diagnosis.html.

(Accessed June 19, 2012).

69. http://www.daviddarling.info/encyclopedia/H/hemophilia.html.

(Accessed December 29, 2009).

70.http://www.hemophilia.org/NHFWeb/MainPgs/MainNHF.aspx?menuid=180&contentid=4

5&rptname=bleeding.

(Accessed December 18, 2009).

71.http://www.hemophilia.org/NHFWeb/MainPgs/MainNHF.aspx?menuid=181&conentid=4

6&rptname=bleeding.

(Accessed December 18, 2009).

72. http://www.umds.ac.uk.

73. http://www.wfh.org/index.asp?lang=EN.

(Accessed March 8, 2012).

74. www.ahcdc.ca/publications.html.