PH10pH3 Parma, 8 Novembre 2001 step1 proteine acide proteine basiche +anodo 3500 V La prima...
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Transcript of PH10pH3 Parma, 8 Novembre 2001 step1 proteine acide proteine basiche +anodo 3500 V La prima...
pH10pH10pH3pH3
Parma , 8 Novembre 2001
step1step1
proteine acideproteine acide
proteine proteine basichebasiche
++
anodanodoo
3500 V
La prima dimensione : Isoelectric La prima dimensione : Isoelectric focusing (IEF)focusing (IEF)
v=Ev=E··zz··ff-1-1 v = velocità di migrazione della proteina in un campo elettricoE = forza del campo elettricoz = carica netta della proteinaf = coefficiente frizionale = 6r = viscosità del mezzo
pI, punto isoelettrico pI, punto isoelettrico Z= Z=Ø Ø v= v= ØØ
--
catodcatodoo
Sample preparationFirst dimensionSecond dimensionDetectionImage AnalysisMALDI-TOF MSESI MS/MS
Tot 76 kVhTot 76 kVh
-- step2step2 ++
--step3step3 ++ ++
La I° dimensione : IPG stripsLa I° dimensione : IPG strips
Una Una I° dimensioneI° dimensione eccellente assicura che gli spots eccellente assicura che gli spots (peptidi) siano ben separati (= risolti) nella (peptidi) siano ben separati (= risolti) nella II° II° dimensionedimensione, anche quando una grande quantità di , anche quando una grande quantità di proteine viene analizzataproteine viene analizzata
Perché la I° dimensione è così Perché la I° dimensione è così importante nella 2-DE ?importante nella 2-DE ?
I° dimensione : l’importanzaI° dimensione : l’importanza Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001
Sample preparationFirst First dimensiondimensionSecond dimensionDetectionImage AnalysisMS analysis
IImmobilized mmobilized PPH H GGradient radient stripstrip = =
IPG stripIPG strip
Perché le IPG strips sono così importanti nella Perché le IPG strips sono così importanti nella I° dimensione ?I° dimensione ?1.1. il il gradiente di pH immobilizzatogradiente di pH immobilizzato è stabile ed evita il è stabile ed evita il fenomento della “catodic drift” ;fenomento della “catodic drift” ;
2.2. se sono noti i valori di pI delle proteine d’interesse, se sono noti i valori di pI delle proteine d’interesse, l’intervallo di separazione IEF viene ristretto e ne l’intervallo di separazione IEF viene ristretto e ne consegue un’consegue un’analisi estremamente mirataanalisi estremamente mirata (> (>accuratezzaaccuratezza e e precisioneprecisione) ;) ;
3.3. elevata elevata risoluzione proteicarisoluzione proteica ; ;
4.4. alta alta riproducibilitàriproducibilità dei risultati ; dei risultati ;
5.5. le proteine estremamente acide o basiche sono più le proteine estremamente acide o basiche sono più facilmente separabili ;facilmente separabili ;
6.6. IPG buffersIPG buffers con stesso intervallo di pH delle IPG strips con stesso intervallo di pH delle IPG strips sono disponibili e il loro utilizzo fa notevolmente ridurre sono disponibili e il loro utilizzo fa notevolmente ridurre o elimina il background nella colorazione del gel ….o elimina il background nella colorazione del gel ….
La seconda dimensione : 2D SDS-La seconda dimensione : 2D SDS-PAGEPAGENella II° dimensione in condizioni denaturanti
(“elettroforesi monodimensionale SDS-PAGE”) le proteine sono separate in un gel di poliacrilamide in base alla loro massa molecolare (MM)
HH33C-(CHC-(CH22))1010-CH-CH22OSOOSO33--NaNa++
Sodio dodecil solfato (SDS)Sodio dodecil solfato (SDS)
= detergente anionico = detergente anionico che spezza tutte le che spezza tutte le interazioni non covalenti interazioni non covalenti delle proteine nativedelle proteine native++
Mercaptoetanolo e Mercaptoetanolo e ditiotreitoloditiotreitolo
= riducono i ponti = riducono i ponti disolfurodisolfuro
Sottoposte ad un C.E. le proteine migrano dal Sottoposte ad un C.E. le proteine migrano dal catodocatodo- - all’anodoall’anodo++ in base alla loro MM in base alla loro MM
I° dimensione : l’importanzaI° dimensione : l’importanza Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001
La miscela proteica è sottoposta a :La miscela proteica è sottoposta a :1.1.
I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa negativa MM proteica MM proteica
3.3.
Gli anioni dell’SDS si legano alle catene principali in un Gli anioni dell’SDS si legano alle catene principali in un rapporto di :rapporto di :
~ 1 molecola SDS • 2 residui di amminoacidi~ 1 molecola SDS • 2 residui di amminoacidi
2.2.
La seconda dimensione : 2D SDS-La seconda dimensione : 2D SDS-PAGEPAGE - CATODO
+ ANODO
45 mA45 mA
-- ++
IPG strip
Gel di poliacrilamide
tGiorno Giorno 1116.00 13.0
0 Equilibrazione
9.30Giorno Giorno 22
Reidratazione o.n.
SeparazioSeparazione IEFne IEF
12.00
Giorno Giorno 33
Preparazione 2°dimensione
Equilibrazione
Preparazione 2° dimensione (GELS)
17.00
Separazione Separazione 2D-PAGE2D-PAGE
16.00
Preparazione 2° dimensione
Giorno Giorno 44
Giorno Giorno 55
Fissazione e colorazione
Sistemi di analisi 2DE - strumentiSistemi di analisi 2DE - strumenti
Multiphor II Multiphor II (APB)(APB)
I° DIMENSIONE (IEF)I° DIMENSIONE (IEF) : :
12 IPG strips 12 IPG strips / corsa/ corsa
II° DIMENSIONE (2D-PAGE)II° DIMENSIONE (2D-PAGE) : :
Hoefer DALT Hoefer DALT unit (APB)unit (APB)
10 gels / 15-20 10 gels / 15-20 oreore
Ettan DALT II Ettan DALT II System (APB)System (APB)
12 12 gels / gels / 4-6 4-6 oreore
IPG Phor (APB)IPG Phor (APB)
12 IPG 12 IPG strips / strips / corsacorsa
Analisi 2DE : le apparecchiatureAnalisi 2DE : le apparecchiature Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001
VantaVantaggiggi Grande capacità di separazione e risoluzione di Grande capacità di separazione e risoluzione di miscele proteiche (2.000–3.000 proteine)miscele proteiche (2.000–3.000 proteine) Riproducibiltà e affidabilità dei risultatiRiproducibiltà e affidabilità dei risultati Possibilità di confronto dei dati tra laboratori differentiPossibilità di confronto dei dati tra laboratori differenti Capacità di rilevazione di modificazioni post-Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle proteine traduzionali delle proteine
fosforilazionefosforilazione
glicosilazione, glicosilazione,
tagli proteolitici, tagli proteolitici, Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di riferimento disponibili in reteriferimento disponibili in rete Identificazione MIRATA di uno specifico pattern Identificazione MIRATA di uno specifico pattern proteico cellulareproteico cellulare
2DE2DEVantaVantaggi ggi SvantSvantaggiaggi
2DE : vantaggi vs svantaggi2DE : vantaggi vs svantaggi
Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001Vantaggi vs vantaggiVantaggi vs vantaggi
2DE2DEVantaVantaggi ggi SvantSvantaggiaggi
SvantaggiSvantaggi metodica lungametodica lunga
molto dispendiosa in termini di : tempo, costo, molto dispendiosa in termini di : tempo, costo, fatica fisicafatica fisica
bassa capacità di risoluzione delle bassa capacità di risoluzione delle proteine proteine idrofobicheidrofobiche
difficile separazione delle difficile separazione delle proteine molto acide o proteine molto acide o basichebasiche
scarsa risoluzione di proteine con scarsa risoluzione di proteine con MM > 150 kDaMM > 150 kDa
bassa risoluzione delle bassa risoluzione delle proteine poco proteine poco rappresentativerappresentative nel campione proteico nel campione proteico
mancanza di linearità o sensibilità tra mancanza di linearità o sensibilità tra abbondanza della proteina nel campione proteico abbondanza della proteina nel campione proteico e capacità di risoluzione tramite colorazione sul e capacità di risoluzione tramite colorazione sul gelgel Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001
2DE : vantaggi vs svantaggi2DE : vantaggi vs svantaggi
Vantaggi vs SvantaggiVantaggi vs Svantaggi