Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 1

Pflanzliche Symbiosen

Thomas Boller, Andres Wiemken und Vreni Wiemken

Herbstsemester 2009

Freitag, 14-18, alternierend mit"Geobotanik" (Christian Körner)

http://plantbiology.unibas.ch/teaching/teaching.htm

Gesamttitel

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 2

3. Bakterien als Pathogene

Titelblatt

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 3

Mutualistische Symbiose Bakterien-Pflanzen:Knöllchen-Symbiose der Leguminosen (Fabaceae)

Bilder aus dem WWW

Knöllchen-Symbiose

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 4

Antagonistische Symbiose Bakterien-Pflanzen:Agrobacterium tumefaciens (Erreger der Wurzelhalsgalle)

Bilder aus Schopfer und Brennicke, 1999

Agrobacterium (Schopfer)

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 5

Vielfalt der Bakterienkrankheiten

Vielfalt der Bakterienkrankheiten

Skript – p. 2

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Pseudomonas phaseolicola

Pseudomonas phaseolicola auf Bohnen

Bild aus dem WWW

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 7

Clavibacter michiganense

Clavibacter michiganense auf Tomaten

Bild aus dem WWW

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Xanthomonas campestris

Xanthomonas campestris auf Kohl

Bild aus dem WWW

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Xanthomonas vesicatoria

Xanthomonas vesicatoria auf Tomate

Bild aus dem WWW

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Titel Feuerbrand

Feuerbrand: eine gefährliche bakterielle Krankheit für Obstbäume

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Feuerbrand: Erreger

Erwinia amylovora, ein Bakterium (von Bienen übertragen)

Feuerbrand 1

Skript p. 3; Bilder aus dem WWW

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Vermehrungszyklus des Feuerbrandes

Feuerbrand 1

Skript p. 3; Bilder aus dem WWW

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Feuerbrand 2

Feuerbrand: Symptome beim Apfel

Bilder aus dem WWW

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Feuerbrand Karte

Feuerbrand: Quarantäne-Massnahmen

Skript – p. 3

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Feuerbrand: Befallskarte im Kanton Zürich im Jahr 2002

Feuerbrand Kt Zürich

Skript p. 3; Bild aus dem WWW

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Cotoneaster Friedhof

Cotoneaster, eine wichtige Wirtspflanze für Feuerbrand

Bild aus der Berner Zeitung

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Cotoneaster befallene Pflanze

Cotoneaster, eine wichtige Wirtspflanze für Feuerbrand

Bild aus dem WWW

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Massnahmen gegen Feuerbrand

"Beliebte Pflanze macht Ärger"

Cotoneaster z.B. in Friedhöfen, Gärten, Anlagen

Seit 1. Januar 2003 ist das In-Verkehr-Bringen und Vermehren sämtlicher Cotoneaster Arten

in der ganzen Schweiz verboten!

Feuerbrand-Bekämpfung: Entfernung von Cotoneaster

Bild aus dem WWW

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Titel Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens und "Genetic engineering" in der Natur

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 20

Antagonistische Symbiose Bakterien-Pflanzen:Agrobacterium tumefaciens (Erreger der Wurzelhalsgalle)

Agrobacterium (Schopfer)

Skript p. 4

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 21

Agrobacterium und "genetic engineering" in der Natur

Agrobacterium Transformation

T-DNA: in Bakteriumnicht "exprimiert"

T-DNA: in Pflanze"exprimiert"

T-DNA - Transfer

Wundsignal

Induktion desDNA-Transfers

Skript p. 4

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 22

Agrobacterium: das Ti-Plasmid

Agrobacterium: Ti-Plasmid

Tumor-Gene 1,2:Auxin-Synthese

Tumor-Gen 3:Cytokinin-Synthese

Octopin-Syntheseund-Transport

Skript p. 5

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 23

Agrobacterium: Octopin

Agrobacterium Octopin

Skript p. 5

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Erwinia chrysanthemi - Titel

Erwinia carotovora und Erwinia chrysanthemi:

Pectolytische Enzyme als Angriffswaffen

(Pathogenizitätsfaktoren bzw. Virulenzfaktoren)

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 25

Erwinia carotovora auf Karotte

Erwinia_carotovora_Karotte

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Erwinia carotovora auf Salat

Erwinia_carotovora_Salat

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 27

Erwinia carotovora auf Chicorino

Erwinia_carotovora_Chicorino

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 28

Erwinia carotovora auf Kartoffel

Erwinia_carotovora_Kartoffel

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Erwinia carotovora auf Radieschen

Erwinia_carotovora_Kartoffel

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 30

Angriffswaffen von Bakterien

Angriffswaffen von Bakterien

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Angriff eines Weichfäule-Bakteriums (Erwinia sp.)

Erwinia_carotovora_Radies

Bakterien "mazerieren" das Gewebe!(Auflösung der Mittellamelle aus Pectin)

Skript p. 6

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 32

Struktur von Pectin; pectolytische Enzyme

Struktur von Pectin; pectolytische Enzyme

Polygalacturonsäure (Pectin)

Hydrolase: Pectinase

Lyase: Pectolyase

+ H2O

Skript p. 6

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 33

Klassische Fragestellung der (molekularen)Phytopathologie

Pathogenitätsfaktor/ Virulenzfaktor

"Ist ein gegebenes Molekül (Enzym, Toxin etc.) kausal für die Krankheit wichtig?"

Ist es ein Pathogenitätsfaktor?

Ist es ein Virulenzfaktor?

Ist es ein (unwichtiges) Begleitprodukt?

Pathogenitätsfaktoren sind qualitativ wichtig: Krankheit ja oder nein ...

Virulenzfaktoren sind quantitativ wichtig: stärkere oder geringere Symptome

Skript p. 7

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Klassische Fragestellung der Pathologie

Kochsche Postulate

"Ist ein gegebener Mikroorganismus kausal für die Krankheit wichtig?"

Der Mikroorganismus muss stetig im kranken Gewebe vorhanden sein.

Der Mikroorganismus muss in Reinkultur isoliert werden können.

Der isolierte Mikroorganismus muss die Krankheits- symptome auslösen

Koch'sche Postulate

Skript p. 7

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 35

Robert Koch, der Entdecker des Tuberkulose-Erregers

Robert Koch

1843 Robert Koch wird in Clausthal (Harz) geboren. Er wächstgemeinsam mit zehn Geschwistern auf.

1866 Abschluß seines vierjährigen Medizinstudiums in Göttingen

1867- 1880 Tätigkeit als praktischer Arzt

1876 Bei Versuchen zur Entstehungsgeschichte der gefürchtetenTierseuche Milzbrand weist Koch erstmals spezifischeKrankheitserreger als Krankheitsursache nach. Bisher führte mandiese Krankheit auf "Miasmen", d.h. die Luft verunreinigendeGifte, zurück. Publikation der Versuchsergebnisse in "Beiträgezur Biologie der Pflanzen".

1881 Koch gelingt der Nachweis des Tuberkulose-Bakteriums

1884 Er entwickelt mit den "Kochschen Postulaten" eine Definitionbakteriologischer Erregernachweise, die in abgewandelter Formbis heute Gültigkeit hat.

1885 Berufung zum Professor an der Berliner Universität

1897-1906 Wiederholte Forschungsreisen in die Tropen. Er untersuchtEntstehung und Ausbreitung der Pest, der Malaria, derSchlafkrankheit und der Rinderpest.

1905 Nobelpreis für Medizin.

1910 Koch stirbt in Baden-Baden

Bild aus dem WWW

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Robert Koch auf einer seiner Expeditionen

Robert Koch, Expedition

Bild aus dem WWW

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 37

Die Koch'schen Postulate (publiziert 1884)

Kochsche Postulate

... so müssen sich jene drei Postulate erfüllen lassen, deren Erfüllung für den stricten Beweis der parasitären Natur einer jeden derartigen Krankheit unumgänglich nothwendig ist:

1.) Es müssen constant in den lokal erkrankten Partien Organismen in typischer Anordnung nachgewiesen werden.

2.) Die Organismen, welchen nach ihrem Verhalten zu den erkrankten Theilen eine Bedeutung für das Zustandekommen dieser Veränderung beizulegen wäre, müssen isolirt und rein gezüchtet werden.

3.) Mit den Reinculturen muss die Krankheit experimentell wieder erzeugt werden können.

Skript p. 7

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Entsprechendes Vorgehen für molekulare Studien

Molekulare Version Kochsche Postulate

"Ist ein gegebenes Molekül kausal für die Krankheit wichtig?"

Das Molekül muss stetig im kranken Gewebe vorhanden sein.

Das Molekül muss isoliert und gereinigt werden können.

Das isolierte Molekül muss die Krankheitssymptome auslösen.

Mutanten des Krankheitserregers, die das Molekül nicht bilden, müssen avirulent sein.

Skript p. 7

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 39

Beispiel: Pectolytische Enzyme von Erwinia chrysanthemi

Beispiel: pectolytische Enzyme

"Sind die pectolytischen Enzyme kausal für die Krankheit wichtig?"

Enthält das kranke Gewebe pectolytische Enzyme?

Können pectolytische Enzyme isoliert werden?

Lösen isolierte pectolytische Enzyme die Krankheits- symptome aus?

Ja!

Ja!

Ja!

Aber: Erwinia chrysanthemi besitzt mehrere verschiedene pecto-lytische Enzyme! Welche davon sind Virulenz-/bzw. Pathogenitäts-faktoren?

Skript p. 7

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 40

Alan Collmer (Cornell University, Ithaca, New York)

Alan Collmer

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 41

Jagd auf pectolytische Enzyme

Jagd auf pectolytische Enzyme

Bakterium wird auf Medien mit Pectin gezüchtet (Pectin als C-Quelle).

Pectolytische Enzyme werden isoliert, gereinigt, charak- terisiert, ansequenziert.

Gene für die entsprechenden Proteine werden identi- fiziert, kloniert.

Sechs verschiedene pectolytische Enzyme identifiziert und deren Gene kloniert: pehX, pelX, pelA, pelB, pelC und pel E!

Skript p. 7

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 42

Funktioneller Nachweis der Aktivität der Genprodukte

Funktionstest

Klonierte Gene werden in Escherichia coli exprimiert (Laborstamm, der kein Pectin spalten kann).

Transgene Escherichia coli werden auf Pectin-Platten ausplattiert.

Kolonien, welche pectolytische Enzyme produzieren, machen "Löcher" in die Platte.

Alle sechs Gene liefern funktionelle Enzyme!

Skript p. 7

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 43

Funktioneller Nachweis der Aktivität der Genprodukte

Pectinagar-Test

JOURNAL OF BACTERIOLOGY 179 (8): 2503-2511 APR 1997

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 44

Knock-out der entsprechenden Gene in E. chrysanthemi

Knock-out Mutanten

Homologe Rekombination ("Marker-Austausch") mit Hilfe eines DNA-Stücks, das aussen Homologie zum Ziel-Gen aufweist und im Zentrum einen "Resistenz-Marker".

Mutierte Stämme werden mit Hilfe des "Resistenz- Markers" selektioniert; Mutationen werden kombiniert

Der sechsfach mutierte Stamm sollte keine "Löcher" mehr in Pectin-Platten machen.

Grosse Überraschung: Der sechsfach mutierte Stamm ist auf Chrysanthemen-Blattstücken immer noch pathogen!!

Stimmt!

Skript p. 8

Wie geht es jetzt weiter?

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 45

Suche nach weiteren pectolytischen Enzymen!

Abstract Kelemu/Collmer 93

Appl. Environ. Microbiol., Jun 1993, 1756-1761, Vol 59, No. 6 Copyright © 1993, American Society for Microbiology Erwinia chrysanthemi EC16 Produces a Second Set of Plant-Inducible Pectate Lyase Isozymes S Kelemu and A Collmer Department of Plant Pathology, Cornell University, Ithaca, New York 14853-5908 The enterobacterium Erwinia chrysanthemi causes soft-rot diseases involving extensive tissue maceration in a wide variety of plants and secretes multiple pectic enzymes that degrade plant cell walls and middle lamellae. An E. chrysanthemi mutant with directed deletions or insertions in genes pehX, pelX, pelA, pelB, pelC, and pelE, which encode exo-poly-(alpha)-d-galacturonosidase, exopolygalacturonate lyase, and four isozymes of pectate lyase, respectively, was constructed by the marker exchange of a cloned pehX::TnphoA fragment into E. chrysanthemi CUCPB5010, a (Delta)(pelA pelE) (Delta)(pelB pelC)::28bp (Delta)(pelX)(Delta)4bp derivative of strain EC16. This mutant, E. chrysanthemi CUCPB5012, no longer caused pitting in a standard pectate semisolid agar medium used to detect pectolytic activity in bacteria. Nevertheless, the mutant still macerated leaves of chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium), although with reduced virulence. The mutant was found to produce significant pectate lyase activity in rotting chrysanthemum tissue and in minimal media containing chrysanthemum extracts or cell walls as the sole carbon source. Activity-stained, ultra-thin-layer isoelectric focusing gels revealed the presence in these preparations of several pectate lyase isozymes with pIs ranging from highly acidic to highly alkaline. Sterile culture fluids containing these isozymes were able to macerate chrysanthemum leaf tissue. Unlike the products of the pelA, pelB, pelC, and pelE genes in E. chrysanthemi EC16, these plant-inducible pectate lyase isozymes were not produced in minimal medium containing pectate. The results suggest that E. chrysanthemi produces two sets of independently regulated pectate lyase isozymes that are capable of macerating plant tissues.

Skript p. 8

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Schlussfolgerung

Schlussfolgerung

Die neu entdeckten Enzyme kommen im kranken Gewebe vor!

Die neu entdeckten Enzyme können isoliert werden!

Die isolierten Enzyme verursachen die Krankheits- symptome (Mazerierung des Gewebes)!

Wie geht es jetzt weiter?

Die Koch'schen Postulate sind erfüllt!

Skript p. 8

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 47

Angriffswaffen von Bakterien

Abwehrkräfte der Pflanzen

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 48

Review Innate Immunity

"Erkennung": Flagellin-Erkennung und "innate immunity"

Skript p. 9

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 49

Review Innate Immunity

"Innate immunity" bei Tieren und Pflanzen

Skript p. 9

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 50

Review Innate Immunity

Ablauf der Immun-Abwehr bei PFlanzen

Skript p. 9

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 51

Titel Zipfel

Nature 428, 764-767, 2004 Skript p. 10

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 52

Zipfel Fig. 1a

Fig. 1a: Bakterien-Wachstum in Pflanzen,die mit flg22 vorbehandelt wurden

Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004

Dieses Experiment zeigt auch, dass es bei Infiltration keinen Unterschied in der Anfälligkeit von Wildtyp und fls2 gibt ...

Skript p. 11

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 53

Zipfel Fig. 3a

Fig. 3a: Krankheits-Anfälligkeit bei Sprüh-Inokulation

Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004

... aber bei Sprüh-Inokulation sind die fls2 Mutanten deutlich empfindlicher!

Skript p. 11

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 54

Zipfel Fig. 3b

Fig. 3b: Bakterielles Wachstum nach Sprüh-Inokulation

Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004

Skript p. 11

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 55

Zipfel Fig. 3c

Fig. 3c: Ökotyp Ws-0 (eine natürliche fls2 Mutante)wird durch Transformation mit dem FLS2-Gen resistenter!

Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004

Skript p. 11

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 56

Die flg22-induzierte Resistenz ist auch in Mutanten aktiv!

Skript p. 11

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 57

Zipfel Fig. 2

Fig. 2: Es muss noch weitere MAMPs geben!

Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004

Skript p. 11

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 58

Angriffswaffen von Bakterien

Hrp-Gene und das "Wettrüsten"zwischen Bakterien und Pflanzen

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 59

Entdeckung von Hrp-Genen

Entdeckung von hrp-Genen

Interessante Beobachtung: Bestimmte Mutationen bei phytopathogenen Bakterien (Beispiel: Pseudomonas syringae) führen:

1) zum Verlust der Fähigkeit, in der inkompatiblen Inter-aktion eine "Hypersensitive Reaktion" (HR) auszulösen, und gleichzeitig

2) zum Verlust der Pathogenität in der kompatiblen Interaktion.

Die entsprechenden Gene wurden hrp genannt.

Skript p. 12

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 60

Der "Hrp gene cluster"

Hrp-Gen-Cluster

Skript p. 12

Mehrere Transkripte und viele Proteine für den gleichen "Injektionsapparat"!

Transkripte/Proteine im Genom anders gruppiert, dienen dem gleichen Zweck ("Injektionsapparat")

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 61

Bakterielle Sekretionssysteme

Bakterielle Sekretionssysteme

z.B. pectolytischeEnzyme z.B. Proteasen

"Effektor-Proteine"

"Injektions-Kanüle"

Skript p. 12

T-DNA!

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 62

Vergleich von Pflanzen und Tieren (I)

Vergleich Pflanzen/Tiere I

Skript p. 13

Effektor-Proteine fördern Endocytose!

Effektor-Proteine unterdrücken Abwehr!

Effektor-Proteine unterdrücken Abwehr!

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 63

Vergleich von Pflanzen und Tieren (II)

Vergleich Pflanzen/Tiere II

Skript p. 13

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 64

Induktion und Funktion der "Effektor-Proteine"

Induktion und Funktion Effektor-Proteine

Induktion von hrp- und Effektor-Genen

"Normaler" Wirt:Effektor-Proteine schwächen Abwehr:Resultat Krankheit

Wirt mit Resistenzgen:Effektor-Proteine werden "erkannt":Resultat HR,keine Krankheit

Skript p. 14

R

>30 "xop"-Gene für "Effektor-Proteine"!

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 65

Zusammenfassung zur Funktion der "Effektorproteine"

Schlussfolgerung

Die Effektorproteine sind Virulenzfaktoren, welche u.a. die allgemeine Abwehrbereitschaft der Pflanze reduzieren.

Wenn die Pflanze aber ein Resistenzgen gegen ein gegebenes Effektorprotein besitzt, wird dieses ein Avirulenzfaktor und löst eine HR aus.

Doppelnatur der Effektorproteine: HR - P ...

Nicht im Skript!

Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 66

"Effektorproteine", AVR-Faktoren und Co-Evolution

Schlussfolgerung

Schritt 1: Pflanze "erkennt" Bakterium (z.B. via Flagellin)

Schritt 2: Bakterium unterdrücktErkennung via Effektor A

Schritt 3: Pflanze "erkennt" Effektor A

Schritt 4: Bakterium unterdrücktErkennung via Effektor B

Schritt 5: Pflanze "erkennt" Effektor B

Evolution

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Skript p. 14