PFGE PFGE 

PPulsed ulsed FField ield GGel el EElectrophoresislectrophoresis

dr hab. Beata Krawczyk

Katedra Mikrobiologii PG

Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 1

PFGEPFGEPFGEPFGE

Elektroforeza Elektroforeza pulsowapulsowa jest to technika jest to technika polegająca na wymuszonej zmianie kierunku polegająca na wymuszonej zmianie kierunku p g ją y jp g ją y j

migracji cząsteczek DNA, migracji cząsteczek DNA, rozdziale ich w zależności od wielkościrozdziale ich w zależności od wielkościrozdziale ich w zależności od wielkości rozdziale ich w zależności od wielkości pod wpływem zmieniającego się pola pod wpływem zmieniającego się pola 

elektrycznegoelektrycznegoelektrycznegoelektrycznegopojęcie elektroforezy pulsowej wprowadzili Schwatrz i Cantor

1983 kw 1983 roku

2

Jakie DNA będziemy rozdzielać za pomocą PFGE ?Jakie DNA będziemy rozdzielać za pomocą PFGE ?Jakie DNA będziemy rozdzielać za pomocą PFGE ?Jakie DNA będziemy rozdzielać za pomocą PFGE ?

T h iki l k fT h iki l k f ł l l kł l l kTechniki elektroforetyczne Techniki elektroforetyczne w stałym polu elektrycznymw stałym polu elektrycznymrozdzielają fragmenty DNA do 20 rozdzielają fragmenty DNA do 20 kbkb; ; dłuższe rangidłuższe rangi 2x102x1044 do 10do 1077 par zasad [20par zasad [20 kbkb ‐‐ 12 Mb]12 Mb] musząmusządłuższe, rangi dłuższe, rangi 2x102x10 do 10do 10 par zasad  [20 par zasad  [20 kbkb 12 Mb]12 Mb] muszą muszą być rozdzielane z zastosowaniem elektroforezy w być rozdzielane z zastosowaniem elektroforezy w pulsowympulsowympolu elektrycznym;polu elektrycznym;technika PFGE ma zastosowanie do rozdziału chromosomów technika PFGE ma zastosowanie do rozdziału chromosomów komórkowych o rozmiarze od komórkowych o rozmiarze od 5x105x1055 par zasad (par zasad (chromosomy chromosomy drożdżydrożdży) do) do 22‐‐3 x 103 x 1088 par zasad (par zasad (zwierzęce i roślinnezwierzęce i roślinnedrożdżydrożdży) do ) do 22 3 x 103 x 10 par zasad (par zasad (zwierzęce i roślinne zwierzęce i roślinne chromosomychromosomy); ); bardzo duże chromosomy muszą być trawione do bardzo duże chromosomy muszą być trawione do fragmentów 10fragmentów 1077 par zasad lub mniej. par zasad lub mniej. 

3

Migracja DNA (do 20 Migracja DNA (do 20 kbkb)  )  w w żelu konwencjonalnym żelu konwencjonalnym ::

różny różny ładunek pomiędzy fragmentami DNAładunek pomiędzy fragmentami DNA

efekt sita molekularnegoefekt sita molekularnegoefekt sita molekularnegoefekt sita molekularnego

DNA fragmenty migrują jako sferyczne DNA fragmenty migrują jako sferyczne i li lspirale spirale 

stałe pole elektrycznestałe pole elektrycznep yp y

4

PFGEPFGEPFGEPFGE

f i k iż 20f i k iż 20 kbkb d i jid i jifragmenty większe niż 20 fragmenty większe niż 20 kbkb podczas migracji tworzą podczas migracji tworzą mocno rozciągnimocno rozciągnięętą spiralętą spiralę, , która nie migruje na która nie migruje na zasadzie sita molekularnego tylko pełzazasadzie sita molekularnego tylko pełza snaksnakee likelike””zasadzie sita molekularnego, tylko pełza zasadzie sita molekularnego, tylko pełza „snak„snake e likelikefragmenty > 20 fragmenty > 20 kbkb nie będą migrowały zgodnie z nie będą migrowały zgodnie z efektem ładunkuefektem ładunkuefektem ładunkuefektem ładunkuPFGE PFGE pracuje na zasadzie pracuje na zasadzie okresowej zmiany okresowej zmiany orientacji pola elektrycznegoorientacji pola elektrycznego czas potrzebny doczas potrzebny doorientacji pola elektrycznegoorientacji pola elektrycznego, czas potrzebny do , czas potrzebny do reorientacji DNA jest zależny od rozmiaru cząsteczkireorientacji DNA jest zależny od rozmiaru cząsteczki

5

Model ruchu cząsteczek DNA Model ruchu cząsteczek DNA podczas elektroforezy podczas elektroforezy pulsowejpulsowej

Propono an model r ch c ąstec ek DNA podc as elektrofore kon encjonalnej (A) i p lso ej (B) (schemat g książki H man Molec lar Genetics 2Proponowany model ruchu cząsteczek DNA podczas elektroforezy konwencjonalnej (A) i pulsowej (B). (schemat wg książki Human Molecular Genetics 2,wydanie drugie Strachan, Tom and Read, Andrew P. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 1999.)

6

W technice PFGE zostały wykorzystane dwa W technice PFGE zostały wykorzystane dwa zjawiska:zjawiska:zjawiska:zjawiska:

II.. ZZmianamiana konformacjikonformacji cząsteczekcząsteczek podpod wpływemwpływemprzyłożonegoprzyłożonego napięcianapięcia orazorazprzyłożonegoprzyłożonego napięcianapięcia orazoraz

IIII.. IIchch powrótpowrót dodo stanustanu pierwotnegopierwotnego popo usunięciuusunięciu napięcianapięciapp p gp g pp ęę p ęp ę

Oba zjawiska są funkcją czasu trwania Oba zjawiska są funkcją czasu trwania przyłożonego napięcia i siły pola elektrycznegoprzyłożonego napięcia i siły pola elektrycznego

nnajistotniejszym czynnikiem w PFGE jestajistotniejszym czynnikiem w PFGE jest czas trwaniaczas trwaniannajistotniejszym czynnikiem w PFGE jest ajistotniejszym czynnikiem w PFGE jest czas trwania czas trwania pulsupulsu oraz oraz czas reorientacji cząsteczkiczas reorientacji cząsteczki, impuls zwrotny , impuls zwrotny musi być zoptymalizowany musi być zoptymalizowany –– dla dłuższych cząsteczek dla dłuższych cząsteczek 

DNA potrzebny jest dłuższy czas zwrotnyDNA potrzebny jest dłuższy czas zwrotnyDNA potrzebny jest dłuższy czas zwrotnyDNA potrzebny jest dłuższy czas zwrotny

7

R d j t h iki PFGER d j t h iki PFGERodzaje techniki PFGERodzaje techniki PFGE

Powstało wiele odmian technik PFGE, Powstało wiele odmian technik PFGE, różniących się głównie sposobem różniących się głównie sposobem ą y ę g pą y ę g p

rozmieszczenia elektrod, czyli kątem, pod rozmieszczenia elektrod, czyli kątem, pod jakim ustawione są pola elektryczne przez niejakim ustawione są pola elektryczne przez niejakim ustawione są pola elektryczne przez nie jakim ustawione są pola elektryczne przez nie 

wytwarzanewytwarzane

8

CHEFCHEF((angang. . ContourContour ClampedClamped HomogenousHomogenous Electric Field Electric Field 

ElectrophoresisElectrophoresis) ) Elektroforeza w zmiennym, homogennym polu o Elektroforeza w zmiennym, homogennym polu o 

kształcie sześciokąta foremnego)kształcie sześciokąta foremnego)elektrody

Za pomocą metody CHEF możliwy Za pomocą metody CHEF możliwy jest rozdział cząstek o wielkości jest rozdział cząstek o wielkości okołookoło 1010 MpzMpz 2 (-)1 ( )około około 10 10 MpzMpz. . Technika ta została wykorzystana Technika ta została wykorzystana między innymi do stworzenia mapy między innymi do stworzenia mapy fizycznej ludzkiego genomu.fizycznej ludzkiego genomu.

2 (-)

120°

1 (-)

y j g gy j g g

Układ Układ 24 elektrod tworzy dwa 24 elektrod tworzy dwa jednorodne pola skierowane do jednorodne pola skierowane do j pj psiebie pod kątem 120siebie pod kątem 120°°..Strzałka przedstawia wypadkowy Strzałka przedstawia wypadkowy tor migracji DNA tor migracji DNA 

2 (+)1 (+)

9

PACEPACEPACEPACE((ProgrammableProgrammable, , AutonomouslyAutonomously ControlledControlled ElectrodesElectrodes))

k l i hk l i hJest to ekstremalnie wszechstronny system Jest to ekstremalnie wszechstronny system oparty na CHEF, wszystkie elektroforetyczne oparty na CHEF, wszystkie elektroforetyczne 

parametry są kontrolowane w każdej parametry są kontrolowane w każdej elektrodzieelektrodzie

10

FIGEFIGEFIGEFIGE((angang. Field . Field InversedInversed GelGel ElectrophoresisElectrophoresis); ); 

Elektroforeza w odwracalnym polu elektrycznymElektroforeza w odwracalnym polu elektrycznymElektroforeza w odwracalnym polu elektrycznymElektroforeza w odwracalnym polu elektrycznym

Metoda ta polega naMetoda ta polega na okresowej zmianie 

polarności jednorodnego pola elektrycznego pod 

kątem 180 °

11

FIGEFIGEFIGEFIGEpojedyncza para elektrod, które okresowo pojedyncza para elektrod, które okresowo 

odwracają pole o kąt 180 odwracają pole o kąt 180 °°CCw jedną i w drugą stronęw jedną i w drugą stronęw jedną i w drugą stronęw jedną i w drugą stronę

Z zastosowaniem różnego czasu trwania Z zastosowaniem różnego czasu trwania impulsuimpulsu

12

Wypadkowa ruchliwość z obu tych pól, nazywanych umownie „przód” Wypadkowa ruchliwość z obu tych pól, nazywanych umownie „przód” ((ForwardForward) i „tył” () i „tył” (ReversedReversed), osiągana jest dzięki dłuższym impulsom w), osiągana jest dzięki dłuższym impulsom w((ForwardForward) i „tył  () i „tył  (ReversedReversed), osiągana jest dzięki dłuższym impulsom w ), osiągana jest dzięki dłuższym impulsom w 

kierunku F niż R. kierunku F niż R. Optymalny rozdział dla danego zakresu wielkości fragmentów DNA uzyskuje się przez dobranie Optymalny rozdział dla danego zakresu wielkości fragmentów DNA uzyskuje się przez dobranie 

odpowiedniego czasu trwania pulsu (ramp). odpowiedniego czasu trwania pulsu (ramp). 

Strzałki ilustrują przyrost czasu migracjiprzyrost czasu migracji DNA w kierunkach zwanych umownie 

ód” ( )→( ) i„przód” (‐)→(+) i „wstecz” (‐)→(+)

13

W klasycznej technice FIGE stosowany jest asymetryczny ramp w celu uzyskania optymalnego 

rozdziału, przy zachowaniu stosunku F:R= 3:1, p yMożna również zastosować asymetryczne 

napięcie F:R (1 5:1)napięcie F:R (1.5:1)

R d i ł t kR d i ł t k 0 10 1 700700 kkRozdział cząsteczekRozdział cząsteczek 0.10.1‐‐700 700 kpzkpz

14

Schemat Schemat przygotowania i przeprowadzenia rozdziału przygotowania i przeprowadzenia rozdziału PFGEPFGE

Osad bakteryjny Agaroza niskotopliwa (low melting)

Agaroza wysokotopliwa

(high melting point)wirowanie

Uwięzienie bakterii bl k h

Inkubacja z 

( g g p )

w bloczkach

Pory  w agarozie

jproteinazą K i SDS

Inaktywacja Proteinazy K i usunięcie resztek bakteryjnych 

Wsadzenie bloczka do studzienek żelu

Uwięzione w agarozie DNA 

wysokocząsteczkowe 

Enzymy restrykcyjne rzadko‐tnące

studzienek żelu agarozowego

15

Parametry PFGEParametry PFGE

Z i k ó ł j d i ł i hli ść kZ i k ó ł j d i ł i hli ść kZmienne, które wpływają na rozdział i ruchliwość cząsteczek Zmienne, które wpływają na rozdział i ruchliwość cząsteczek podczas elektroforezy PFGE:podczas elektroforezy PFGE:Napięcie ( V) i siła polaNapięcie ( V) i siła polaNapięcie ( V) i siła polaNapięcie ( V) i siła polaDługość trwania impulsu (ramp Długość trwania impulsu (ramp –– zmiana czasu trwania pulsu)zmiana czasu trwania pulsu)Stosunek impulsu „w przód”: „ w tył”Stosunek impulsu „w przód”: „ w tył”Stosunek impulsu „w przód : „ w tyłStosunek impulsu „w przód : „ w tyłKąt reorientacjiKąt reorientacjiBuforBuforRodzaj i stężenie Rodzaj i stężenie agarozyagarozyTemperatura komory buforowejTemperatura komory buforowejStężenie DNAStężenie DNA

16

Kąt reorientacjiKąt reorientacjiKąt reorientacjiKąt reorientacji

Z b d ń d i l óż i k fi j i ólZ b d ń d i l óż i k fi j i ólZ badań nad wieloma różnymi konfiguracjami pól Z badań nad wieloma różnymi konfiguracjami pól elektrycznych zastosowanych w PFGE wynika, że kąt elektrycznych zastosowanych w PFGE wynika, że kąt między dwoma polami jestmiędzy dwoma polami jest krytyczną zmiennąkrytyczną zmiennąmiędzy dwoma polami jest między dwoma polami jest krytyczną zmiennąkrytyczną zmiennąwpływającą na przebieg elektroforezy  wpływającą na przebieg elektroforezy  Kąty mniejsze od 90Kąty mniejsze od 90°° są nieefektywne są nieefektywne prawdopodobnie dlatego, że cząsteczki DNA zbyt prawdopodobnie dlatego, że cząsteczki DNA zbyt łatwo i szybko ulegają reorientacji.  łatwo i szybko ulegają reorientacji.  R hli ść t k dl któ h ki k hR hli ść t k dl któ h ki k hRuchliwość cząstek, dla których kierunek ruchu Ruchliwość cząstek, dla których kierunek ruchu zmieniał się od zmieniał się od 105 do 165 105 do 165 °° jest bardzo zbliżona i w jest bardzo zbliżona i w tym zakresie kątów między polami uzyskujemytym zakresie kątów między polami uzyskujemytym zakresie kątów między polami uzyskujemy tym zakresie kątów między polami uzyskujemy najlepsze rozdziałynajlepsze rozdziały

17

Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA y yj gy yj gpołączona z elektroforezą połączona z elektroforezą pulsowąpulsową REAREA‐‐PFGEPFGE

((ang.ang. RRestriction estriction EEnzyme nzyme AAnalysisnalysis‐‐PPulsed ulsed FField ield GGel el (( gg yy yyEElectrophoresis)lectrophoresis)

Chromosomalne DNA trawione jest enzymamiChromosomalne DNA trawione jest enzymamiChromosomalne DNA trawione jest enzymami Chromosomalne DNA trawione jest enzymami restrykcyjnymi o długich sekwencjach rozpoznania restrykcyjnymi o długich sekwencjach rozpoznania 

kl dkl d ff88‐‐mio nukleotydowe np. mio nukleotydowe np. NotNot I, I, ApaApa I  I  SfiSfi II, , 

66‐‐nukleotydowe np. nukleotydowe np. SmaSma I, I, XbaXba I, I, BspBspII 201201 w w zależności od % par zależności od % par G+CG+C na genomie.na genomie.

18

Wyniki różnicowania metodą REA Wyniki różnicowania metodą REA ‐‐ FIGEFIGE CHEF    CHEF    EnterococcusEnterococcus faeciumfaecium

M– marker wielkości DNA (194; 145; 97; 48; 23; 9,4; 6,6; 4,4; 2,3; 2,0; 0,6; 0,1 kpz.1 - 11– chromosomy kolejnych izolatów K. pneumoniae ESBL (+) trawionych enzymem restrykcyjnym Xba I 12 - 13 - chromosomy kolejnych izolatów K. pneumoniae ESBL (-) trawionych enzymem restrykcyjnym Xba I y yj yParametry rozdziału:Czas rozdziału – 31 hNapięcie – F = 10V/cm, R = 6,7 V/cm (F=150V, R=100V, długość żelu 15 cm).Stosunek napięcia F / R = 1.5 / 1,Czas trwania impulsów – 0,1 – 8,5 s, ramp liniowy1% żel agarozowy

19

Wykorzystanie PFGEWykorzystanie PFGEWykorzystanie PFGEWykorzystanie PFGE

Typowanie szczepów z zastosowaniem Typowanie szczepów z zastosowaniem enzymów restrykcyjnychenzymów restrykcyjnych‐‐ zastosowanie w zastosowanie w y y yj yy y yj yepidemiologii molekularnej do określania epidemiologii molekularnej do określania pokrewieństwa i różnicowania szczepówpokrewieństwa i różnicowania szczepówpokrewieństwa i różnicowania szczepów.pokrewieństwa i różnicowania szczepów.

20

Zdarzenia genetyczne wpływające na obraz elektroforetyczny Zdarzenia genetyczne wpływające na obraz elektroforetyczny 

Zmiana we żadna pojawienie się utrata insercja delecja fragmencie miejsca restrykcyjnego 400kp

Powstające 400 250 i 150 600 450 350 fragmenty A B C D E 600 500

400 400 Żel 200

100

75 Liczba Różniących 0 3 3 2 2 fragmentów

21

Kryteria analizy wzoru elektroforetycznego Kryteria analizy wzoru elektroforetycznego wg wg Tenover’aTenover’awgwg Tenover aTenover a

Liczba różnic Liczba różnic genetycznych wgenetycznych w

Liczba fragmentów Liczba fragmentów 

KategoriaKategoria

genetycznych w genetycznych w porównaniu ze porównaniu ze 

szczepem szczepem pochodzącym zpochodzącym z

odróżniających od odróżniających od szczepu szczepu 

pochodzącego z pochodzącego z  Interpretacja Interpretacja epidemiologicznaepidemiologicznapochodzącym z pochodzącym z 

epidemiiepidemiiepidemiiepidemii epidemiologicznaepidemiologiczna

szczepy szczepy i óż i li óż i l

00 00Izolat pochodzi z Izolat pochodzi z 

id iiid iinierozróżnialnenierozróżnialne epidemii epidemii 

szczepy blisko szczepy blisko k ik i

11 22‐‐33IzolatIzolat

prawdopodobnie prawdopodobnie spokrewnionespokrewnione

p pp ppochodzi z epidemiipochodzi z epidemii

szczepy potencjalnieszczepy potencjalnie22 66

izolatizolatl il i

szczepy potencjalnie szczepy potencjalnie spokrewnionespokrewnione

22 44‐‐66 przypuszczalnie przypuszczalnie pochodzi z epidemiipochodzi z epidemii

szczepyszczepy izolatizolat nie pochodzi znie pochodzi zszczepy szczepy niespokrewnioneniespokrewnione

≥3≥3 ≥7≥7izolatizolat nie pochodzi z nie pochodzi z 

epidemiiepidemii

22

W USA korzysta się z W USA korzysta się z wystandaryzowanychwystandaryzowanychprotokołów, a rezultaty zestawia się w protokołów, a rezultaty zestawia się w p y ęp y ę

centralnych bazach danych centralnych bazach danych (http://www cdc gov/pulsenet/)(http://www cdc gov/pulsenet/)(http://www.cdc.gov/pulsenet/)(http://www.cdc.gov/pulsenet/)

23

ł d k ł dlZostały wystandaryzowane protokoły dla E. coli 0157:H7, nietyfoidalnych serotypówSalmonella, Shigella, Listeria monocytogenes i S. aureus. W Stanach Zjednoczonych, Centers for Disease Control and Prevention poleca REA‐pPFGE jako metodę referencyjną do nadzoru nad patogenami powodującymi zatrucianad patogenami powodującymi zatrucia pokarmowe. 

24

W ik ół i k ó h k jóW wyniku współpracy niektórych krajów europejskich z PulseNet, powstał PulseNet Europe. REA PFGE j ó i ż k d kiREA‐PFGE jest również rekomendowana przez takie instytucje jak Network for Prevention and Control of Zoonoses czy MED VET NETZoonoses, czy MED‐VET‐NEThttp://www.medvetnet.org. W Europie grupa “Salmgene Project”W Europie grupa  Salmgene Project  (http://www.salmgene.net) kieruje swój wysiłek na standaryzację techniki PFGE i nowszych metodstandaryzację techniki PFGE i nowszych metod typowania salmonellozy. 

25