LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Selasa, 4 Maret 2015

Kelompok III

Selasa , Pukul 10.00 13.00 WIB

Nama NPM

WIRNA GRACE .S 260110130092

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Casuarina) (Andini) ( Emanuella)

PEWARNAAN TAHAN ASAM

I. TUJUAN

Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri tak

tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam

pewarnaan (Ziehl-Neelsen). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi

kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

II. PRINSIP

1.Penetrasi zat warna

Bakteri ini dikenal tahan asam sebab bakteri tersebut resisten

terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam. Dalam prosedur pewarnaan

tahan asam, Karbol fuchsin merupakan pewarna dasar, yang mengandung

fenol untuk membantu melarutkan dinding sel. Pemanasan biasanya

diperlukan untuk memperkuat penetrasi pewarna dasar ke dalam sel

bakteri.

2.Pewarnaan tahan asam

Pewarnaan tahan asam adalah tipe pewarnaan diferensial lebih dari

satu pewarna untuk membedakan suatu mikroorganisme dengan

kandungan dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari 60% lipid

kompleks yang tahan terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam.

3. Pemanasan

Untuk mewarnai spora dan di dalam proses pewarnaannya

melibatkan proses pemanasan, yaitu; spora dipanaskan bersamaan dengan

zat warna tersebut sehingga memudahkan zat warna tersebut untuk

meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri.

4. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam

Bakteri tahan asam memiliki kandungan senyawa dari

peptidoglikan dan lipid kompleks yang disebut asam mycolat yang

membangun struktur dinding selnya, sehingga menjadi impermeabel

terhadap macam-macam prosedur pewarnaan termasuk pewarnaan gram.

III. TEORI DASAR

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak

berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.

Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk

diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga

berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding

sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.

Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat

tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus

dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam

(BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan

larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia

contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium

tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil

pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain

menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan kera.

Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan

Chan, 1988).

Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan

pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan

pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah

besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan

pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel

terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika

proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam

sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997).

Pewarnaan diferensial artinya pewarnaan yang menggunakan lebih dari

satu macam zat warna, seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.

Sedangkan pewarnaan khusus artinya pewarnaan yang dipakai untuk mewarnai

bagian-bagian sel atau bakteri tertentu yang sukar diwarnai dengan menggunakan

pewarnaan biasa. Pewarnaan khusus dipakai untuk mewarnai bagian-bagian sel

kuman atau kuman tertentu yang sukar diwarnai (Noverita, 2009).

Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson,

Kinyoun Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau

ludah) untuk analisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis

sputum:

Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun

pagi.

Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu.

Collection sputum : sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam

Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu

minggu.

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat

warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada

pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat

mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin basa yang dilarutkan

dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan

dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke

dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk

melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu

BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama

tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk

menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna

merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol

fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat

warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru

(Lay, 1994).

Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai

sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang

tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai

menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan

perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat

yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Kurniawati et al., 2005).

Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau

berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non

motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, sekali

mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat

dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai

Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki

sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan

protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak

berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini

menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari

antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel

mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M.

tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat

tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk

tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid, protein,

dan polisakarida (Thomas, 1999).

Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang

panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat

(2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia.

Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk, serum,

dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang

lurus dengan ukuran sekitar 0,4 3 m. Pada media buatan, bentuk kokoid dan

filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah

diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol,

tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum

dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan

mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif

berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi

yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua

media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10

dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media)

(Jawetz et al., 2001).

Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari

oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan

pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan

pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk

menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh

lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23C, untuk menghasilkan

pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk cepat asam daripada bentuk

patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada

bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil

tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu

yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi,

virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan

atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).

Larutan kimia yang digunakan adalah alkohol asam 3% , carbol

fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi

antara lain asam alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai

fungsi membuka lapisan lilin agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus

masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat

lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri akan tetap berwarna merah

dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk., 1980).

IV. ALAT

BAHAN

Alat :

1. Bak warna

2. Botol semprot

3. Kaca objek

4. Kapas

5. Kertas saring

6. Mikroskop

7. Ose

8. Pipet tetes

9. Spiritus

10. Tabung reaksi

V.

Bak warna Botol semprot Kaca objek

Kertas saring Mikroskop

Kapas

Tabung reaksi

Spiritus

Pipet Tetes

Bahan

1. Alkohol 70% 2.Air suling 3. Emerge oil

4.Suspensi Bakteri 5. Zat warna biru 6.Zat warna

saprofit Metilen karbol fuksin

VI. PROSEDUR

Mula-mula disediakan alat dan bahan yang diperlukan. Disiapkan kaca

obyek yang bersih dan buat olesan dari suspensi bakteri, olesan bakteri

digenangi dengan pewama karbol fuksin selama 5 menit, sambil

dipanaskan di atas penangas air. Jaga jangan sampai terlalu panas,

mendidih atau kering. Dibuang zat wama yang berlebih, lalu dibilas

dengan air suling. Dibilas dengan zat pemucat alkohol-asam selama 15

detik atau sampai latar belakang olesan berwarna merah muda pucat.

Digenangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 2 menit,

dibuang zat warna yang berlebih, dibilas dengan air suling, lalu

dikeringkan dengan kertas saring. Diteteskan sedikit minyak imersi pada

preparat, lalu periksa di bawah mikroskop. Dimulai dengan obyektif

berkekuatan terendah 10X, lalu ganti dengan lensa obyektif berkekuatan

100X. Diamati dan digambarkan hasilnya. Bakteri tahan asam (ZN + )

akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam (ZN -) akan berwarna

biru.

VII. DATA PENGAMATAN

SAMPEL LITERATUR

Bentuk dan warna bakteri tidak

terlihat jelas

(http://textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html)

Bentuk Bakteri teramati,yaitu batang

Warna bakter teramati yaitu merah

VIII. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini, percobaan untuk pewarnaan bakteri tahan asam

tidak dilakukan. Hanya dilakukan pengamatan pada preparat bakteri yang

telah disediakan. Pewarnaan pada bakteri tahan asam tidak dilakukan

karena bakteri sampel yang digunakan merupakan bakteri yang berbahaya.

Bakteri yang digunakan adalah bakteri Mycobacterium tuberculosis

Hal pertama yang dilakukan dalam praktikum ini adalah

menyiapkan alat dan bahan yag diperlukan . Setelah menyiapkan preparat

olesan bakteri. Langkah yang dilakukan sebelum menyiapkan preparat

yaitu membersihkan kaca obyek dengan cara merendam dalam alkohol

70% lalu keringkan dengan menggunakan lap/tissue yang telah ditetesi

dengan alkohol. Proses ini bertujuan untuk menghilangkan lemak dan

mikroorganisme yang menempel pada permukaan kaca obyek yang dapat

mengganggu hasil pengamatan. Kemudian pada salah satu sisi kaca

preparat dibuat lingkaran dengan menggunakan spidol. Hal ini bertujuan

sebagai batas pengamatan bakteri agar lebih mudah diamati dibawah

mikroskop.

Lalu,ose difiksasi melalui api hingga kawat ose berubah menjadi

merah dan didinginkan dekat api, yang menandakan bahwa ose sudah

panas dan bebas dari kontaminasi. Ini bertujuan untuk membunuh bakteri

yang menenmpel pada ose yang dapat mengganggu hasil pengamatan. Ose

yang digunakan harus dingin sebab jika masih panas dapat menyebabkan

pecahnya dinding sel bakteri sehingga bakteri sulit untuk diamati. Setelah

itu,tabung reaksi yang berisi suspense bakteri saprofit. dikocok dan dibuka

dekat sumber api untuk mengurangi kontaminasi. Pengocokan dilakukan

bertujuan agar suspense bakteri tercampur secara merata tidak berkumpul

di bagian bawah tabung. Lalu suspense bakteri diambil dengan

menggunakan ose. Setelah itu,penutup tabung dan mulut tabung difiksasi

untuk menghilangkan kontaminasi dan tabung ditutup. Kemudian olesan

bakteri dibuat dengan mengoleskan secara merata ose pada kaca preparat.

Olesan yang baik adalah olesan yang tidak terlalu tebal atau terlalu tipis

dan tahan terhadap pencucian satu kali atau lebih. Pada olesan yang terlalu

tebal, sel-sel bakteri akan bertumpuk sehingga sulit untuk diamati.

Sedangkan pada olesan yang terlalu tipis, akan sulit menemukan sel-sel

tersebut. ,lalu kaca preparat difiksasi dan dibiarkan dingin dan kering.

Lalu kaca preparat dibiarkan kering dan difiksasi. Fiksasi pada olesan

yang belum kering akan menyebabkan sel-sel bakteri seakan-akan terebus

dan bentuknya menjadi tidak karuan. Fiksasi adalah adalah proses

pengawetan dan pelekatan atau penempelan struktur sel mikroorganisme

pada suatu posisi. Hal yang diperhatikan dalam fiksasi adalah dilakukan

dengan cara melewatkan kaca preparat di atas api. Fiksasi dilakukan

sampai kaca preparat terasa hangat apabila ditempelkan pada punggung

tangan. Fiksasi yang dilakukan tidak boleh terlalu panas dan lama, karena

bakteri yang ada pada preparat bisa hangus terpanggang dan terjadi

perubahan bentuk dan penyusutan sel selain itu . Tujuan dari fiksasi adalah

pelekatan bakteri supaya pada saat pencucian, bakteri tersebut tidak ikut

hilang tercuci dan untuk menonaktifkan enzim lytic sehingga bakteri tidak

mengalami lisis dan berubah bentuk pada saat diamati.

Kemudian olesan bakteri digenangi dengan pewarna pertama

karbol fuksin,yang telah dicampur fenol selama 5 menit,sambil dipanaskan

diatas penangas air ( jaga jangan sampai terlalu panas,mendidih,atau

kering).Menunggu selama 5 menit setelah pewarnaan dengan warna carbol

fuchsin dan dilakukan pemanasan bertujuan agar cat ini dapat diserap dan

melekat sempurna pada dinding bakteri dan dinding selnya kembali seperti

semula setelah dilakukan pemanasan

Pada Bakteri Tahan Asam,pewarnaan pertama ini, akan sulit

menembus dinding dari Bakteri tahan asam yang memiliki lapisan lilin

( lemak ) yang tebal, sehingga dilakukan pemanasan untuk memuaikan

dinding sel bakteri tersebut sehingga warna carbol fuchsin ini mampu

diserap oleh sel-sel bakteri. Namun perlu diperhatikan, pemanasan

dilalukan jangan sampai mendidih cukup sampai menguap agar sel-sel

bakteri tersebut tidak rusak sedangkan fenol digunakan sebagai pelarut

untuk membantu pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri . Namun

dalam dinding sel bakteri non BTA lapisan lemaknya tidak banyak

sehingga untuk melakuka penyerapan warna tidak perlu dilakukan

pemanasan dan pelunturan warna pun sangatmudah dilakukan saat

penambahan asam alkohol.

Setelah itu zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air

suling yang bertujuan untuk membilas zat warna yang berlebih sebelum

dilanjutkan dengan pewarnaan berikutnya. Pencucian juga menyebabkan

lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali

Kemudian olesan bakteri dibilas dengan pemucat alcohol-asam

selama 15 detik atau sampai latar belakang olesan berwarna merah muda

pucat. Penambahan alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan

zat warna (decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel

bakteri sudah mampu menyerap warna carbol fuchsin maka dinding sel

tersebut akan kembali tertutup dalam pada saat pencucian dengan air

sulinh.

Menunggu selama 15 detik setelah penambahan larutan asam

alkohol bertujuan agar zat warna dapat luntur secara sempurna dan tidak

ada yang tersisa. Saat penambahan asam alcohol ini, maka bakteri yang

bukan BTA akan dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut

karena tidak mampu mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA yang

mampu mempertahankan zat warna karbol fuksin Karena BTA memiliki

lapisan lipid yang sangat tebal sehingga alkohol sukar menembus dinding

sel bakteri tersebut dan warna merah akibat pemberian carbol fuchsin tidak

hilang.

Dekolorisasi merupakan fase yang paling kritis. Pemberian asam

alkohol jangan sampai berlebih karena akan menyebabkan

overdekolorization sehingga sel BTA hampir sama dengan Non BTA yang

menyebabkan sulit membedakannya, tetapi jangan juga terlalu sedikit

dalam memberikan alkohol (underdecolorization) karena tidak akan

melunturkan warna secara sempurna sehingga sel Non BTA bisa saja

berwrna ungu mendekati warna sel BTA.

Olesan bakteri digenangi dengan pewarna tanding metilen biru

selama 2 menit,lalu zat warna yang berlebih dibuang dan preparat dibilas

dengan air suling. Tujuan pemberian methylen blue adalah memberi warna

background ( pewarna sekunder ). Zat ini berfungsi untuk mewarnai

kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan

dengan asam alkohol. Zat warna methylene blue masuk ke dalam sel

bakteri non BTA yang permeabilitas dinding selnya membesar akibat

lapisan lipid pada bakteri non BTA terekstraksi oleh asam alkohol,

sehingga menyebabkan sel bakteri non BTA tersebut menjadi berwarna

biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah terdehidrasi dengan

perlakuan alkohol, sehingga pori pori mengkerut, daya rembes dinding

sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak dapat

masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna merah.

Lalu preparat dikeringkan dikeringkan dengan kertas saring.

Penotolan dengan kertas saring harus hati-hati agar olesan bakteri tidak

terbawa pada kertas saring. Lalu,kaca preparat ditetesi dengan

menggunakan minyak imersi. Hal ini dikarenakan, cahaya yang datang

dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara dan kaca. Oleh

karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu membiaskan cahaya dari

medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis

normal. Bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan

medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal adalah

minyak imersi. Selain itu, minyak imersi juga mempunyai indeks bias

yang mendekati atau identik dengan kaca.Setelah itu diamati dibawah

mikroskop

Hasil Pengamatan pada praktikum kali ini sel bakterinya sulit untuk

diamati dan berbeda dengan hasil literature. Pada praktikum kali

ini,,bentuk sel bakteri Mycobacterium tubercolosis tidak terlihat batang

dan warnanya juga tidak merah sebagaimana literature.

Hal ini mungkin dapat disebabkan oleh :

1.Olesan bakteri tidak rata dan terlalu tipis sehingga sulit untuk diamati

pada mikroskop/ hasil pengamatan tidak jelas

2.Pada saat pengolesan bakteri dengan ose,ose yang digunakan masih

panas sehingga dinding bakteri pecah dan bentuknya tidak dapat diamati

3.Pembilasan dengan air suling yang terlalu keras menyebabkan olesan

bakteri terbawa oleh air

4.Proses penotolan dengan kertas saring yang tidak benar dan terlalu keras

sehingga bakteri sampel malah menempel pada kertas saring.

5. Zat warna tidak merata masuk ke dalam dinding bakteri / proses

pewarnaan yang kurang lama

6.Fiksasi yang terlalu lama dapat menyebabkan dinding bakteri pecah

sehingga sulit untuk diamati

IX. SIMPULAN

1.Dapat mengamati dua jenis bakteri yaitu bakteri tahan asam dan bakteri

tidak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam

Pada bakteri tahan asam akan mempertahankan warna merah sedangkan

bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.

2. Bakteri tahan asam yang digunakan adalah sel Mycobacterium

tubercolosis

3.Praktikan dapat memahami cara pewarnaan bakteri tahan asam

DAFTAR PUSTAKA

Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. John Wiley & Sons,

New

Fardiaz, S., 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Jawetz, E., Joseph Melnick&Edward Aldeberg.1996. Mikrobiologi

Kedokteran, diterjemahkan oleh Edi Nugroho dan R. F

Maulany.Jakarta: Penerbit Buku kedokteran EGC.

Jutono dkk, 1980. PEDOMAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM (untuk

perguruan tinggi). Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta.

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo

Persada.

Pelczar, M J.dan E.C.S Chan.1986.Dasar- dasar Mikrobiologi Jilid 1Jakarta:

UI Press.

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SPORA

Selasa, 4 Maret 2015

Kelompok III

Selasa , Pukul 10.00 13.00 WIB

Nama NPM

WIRNA GRACE .S 260110130092

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Casuarina) (Andini) ( Emanuella)

PEWARNAAN SPORA

I. TUJUAN

Mengamiati endospora bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan

spora (pewarnaan Klein). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi

kimia yang terjadi daam prosedur tersebut.

II. PRINSIP

1.Pewarnaan spora

Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan

malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul

warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu

pada Bacillus subtilis.

2.Teknik aseptis

Teknis aseptis merupakan suatu teknis yang dilakukan dalam

pemindahbiakan bakteri agar bakteri yang dibiakan tidak mengalami

kontaminasi, dengan teknis aseptis diharapkan bakteri yang

dipindahbiakan mempertahankan kemurniannya.

3. Impermeabilitas spora

Sifat spora yg tidak bisa ditembus oleh apapun. Maksudnya pori-pori

spora tersebut sangat rapat jadi tidak bisa dilewati oleh benda lain.

4. Penetrasi zat warna

Dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu

yang dapat menembus dinding tebal spora. Namun ada juga zat warna

khusus untuk mewarnai spora dan di dalam proses pewarnaannya

melibatkan proses pemanasan, yaitu; spora dipanaskan bersamaan dengan

zat warna tersebut sehingga memudahkan zat warna tersebut untuk

meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri.

III. TEORI DASAR

Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup

bertahun-tahun bahkan berabad-abad jika berada dalam kondisi

lingkungan yang normal. Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu

60-70oC, namun spora tetap hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam

air mendidih bahkan selama 1 jam lebih. Selama kondisi lingkungan tidak

menguntungkan, spora akan tetap menjadi spora, sampai kondisi

lingkungan dianggap menguntungkan, spora akan tumbuh menjadi satu sel

bakteri yang baru dan berkembangbiak secara normal (Volk & Wheeler,

1988).

Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha

mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri

mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam

bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase

dimana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri

terhadap faktor luar yang tidak menguntungkan.(Dwidjoseputro, 2001)

Sepanjang pengetahuan yang kita miliki sekarang, hanya golongan

basillah yang dapat membentuk spora, akan tetapi tidak semua basil

mampu berbuat demikian. Beberapa spesies Bacillus yang aerob dan

beberapa spesies Clostridium yang anaerob dapat membentuk spora. Spora

ini lazim disebut endospora, dikarenakan spora itu dibentuk di dalam sel.

(Dwidjoseputro, 2001)

Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan tubuh

berdinding tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten, dihasilkan oleh

semua spesies Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina. Bakteri yang

mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama

banyak generasi sebagai sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di

dalam pertumbuhannya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam

sitoplasma vegetatifnya yang dimaksudkan untuk menjadi spora.

(Pelczar,1986)

Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang, hal ini

bergantung pada spesies. Endospora ada yang lebih kecil dan ada pula

yang lebih besar daripada diameter sel induk. (Dwidjoseputro, 2001)

Letak endospora di dalam sel serta ukurannya selama

pembentukannya tidaklah sama bagi semua spesies. Sebagai contoh,

beberapa spora adalah sentral yaitu dibentuk di tengah-tengah sel, yang

lain terminal yaitu dibentuk di ujung; dan yang lain lagi subterminal yaitu

di dekat ujung. (Pelczar,1986)

Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi, jika keadaan medium

memburuk, zat-zat yang timbul sebagai pertukaran zat bertimbun-timbun

dan faktor-faktor luar lainnya merugikan. Tetapi pada beberapa spesies

mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor luar.

Sporulasi dapat dicegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke

medium yang baru. Beberapa spesies bakteri dapat kehilangan

kemampuannya untuk membentuk spora. Spora dapat tumbuh lagi menjadi

bakteri biasa apabila keaadaan di luar menguntungkan. Mula-mula air

meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora

menjadi retak karenanya. Keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung,

tetapi juga dapat terjadi pada tengah-tengah atau dekat tengah-tengah

spora. Hal ini merupakan ciri khas bagi beberapa spesies Bacillus. Jika

kulit spora pecah di tengah-tengah, maka masing-masing pecahan akan

merupakan suatu tutup pada kedua ujung bakteri. (Dwidjoseputro, 2001)

Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah

dibuat apusan preparat.Kemudian preparat diberikan malakit hujau yang

berfungsi sebagai pewarna primer yangdigunakan untuk melumuri fiksasi

panas. Preparat diuapkan diatas air mendidih dengan tujuanuntuk

memperbesar pori-pori bakteri agar pada saat pewarnaan dapat menembus

dindingendospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian

dicuci dengan air dialirkan dariatas, yang bertujuanuntuk menghilangkan

malacite green dari seluruh bagian sel endospora.Pewarnaan safranin

bertujuan untuk counterstein yang digunakan untuk melumuri bagian

warnadari sel yang lain dari pada endospora. Hasil uji bakteri

Bacillus subtilis menghasilkan bakteri

gram positif. Prinsip pewarnaan spora didasarkan pada penggunaan zat wa

rna malachite green dan safranin dimana pada hasil pewarnaan akan

menghasilkan warna hijau pada spora dan warna merah pada sel

vegatitifnya (Lay 1994).

IV. ALAT BAHAN

Alat :

1. Bak warna

2. Botol semprot

3. Kaca objek

4. Kapas

5. Kertas saring

6. Mikroskop

7. Ose

8. Pipet tetes

9. Spiritus

10. Tabung reaksi

Botol semprot Kaca objek Bak warna

Kertas saring Mikroskop

Kapas

Tabung reaksi Spiritus

Pipet tetes

Bahan

1. Alkohol 70% 2.Air suling 3. Emerge oil

4.Asam Sulfat 1% 5.Supensi 6.NaCl Fisiologis

Bacillus subtilis

7. Zat warna 8. Zat warna

Biru Metilen Karbol Fuksin

V. PROSEDUR

Mula-mula disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan. dibuat suspensi

bakteri yang terdiri dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis di tabung

reaksi. Ditambahkan korbol fuksin sebanyak 1:1 ke dalam suspensi

tersebut. Dipanaskan campuran tersebut dalam pemanas air bersuhu 800C

selama 10 menit. Daga jangan sampai mendidih atau kering. Disediakan

kaca obyek yang bersih dan buat olesan dari campuran tersebut. Digenangi

olesan dengan H2S04 1% selama 2 detik, lalu dicuci dengan air suling.

Digenangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen selama 5 menit,

dibuang zat warna yang berlebih, dibilas dengan air suling, lalu

dikeringkan dengan kertas saring. Diteteskan sedikit minyak imersi pada

preparat, lalu diperiksa di bawah mikroskop. Dimulai dengan obyektif

berkekuatan terendah 10X, lalu ganti dengan lensa obyektif berkekuatan

100X. Diamati dan digambarkan hasilnya. Endospora akan berwarna

merah dan badan vegetative akan berwarna biru.

VI. DATA PENGAMATAN

SAMPEL LITERATURE

Bentuk bakteri : Batang

Warna Bakteri : Biru

Warna Spora : Tidak dapat

teramati

http://www.austincc.edu/microbugz/endospore_sta

in.php

Bentuk bakteri : Batang

Warna Bakteri : Biru

Warna Spora : Merah

VII. PEMBAHASAN

Telah dilakukan praktikum pewarnaan spora. Yang pertama kali harus

dilakukan adalah menyediakan alat dan bahan yang dibutuhkan diatas

meja. Hal ini dilakukan agar praktikum dapat berjalan dengan baik tanpa

kekurangan bahan-bahan yang diperlukan. Meja harus dibersikan dahulu

menggunakan desinfektan. Ini bertujuan untuk membunuh bakteri yang

ada pada meja yang mungkin akan mengontaminasi preparat bakteri yang

akan kita buat.

Menyiapkan alat dan bahan. Suspensi bakteri dibuat dari biakan bakteri

dan NaCl fisiologis steril di dalam tabung reaksi. Fungi NaCl Fisiologis

berfungsi sebagai pengencer agar suspense sampel yang akan digunakan

steril dan menghindari adanya kontaminan pada sampel. Selain itu,NaCl

Fisiologis juga mempertahankan kondisi pH dari sampel suspensi.

Sebagaimana telah diketahui bahwa pertumbuhan mikroorganisme sangat

peka terhadap perubahan pH . Larutan pengencer NaCl Fisiologis steril

merupakan larutan netral sehingga tidak mempengaruhi kondisi pH.

Lalu ditambahkan karbol fuksin sebanyak 1 : 1 ke dalam suspense

tersebut. Kemudian dipanaskan campuran tersebut dalam penangas air

bersuhu 80o C selama 10 menit. Penambahan karbol fuksin adalah sebagai

pewarna untuk mewarnai bakteri dengan warna merah. Hal ini bertujuan

untuk memperbesar pori-pori bakteri agar zat warna dapat menembus

dinding endospora serta jaga jangan sampai mendidih atau kering karena

dinding bakteri akan hancur jika terlalu panas.Pemanasan pada suhu 80o C

bermaksud untuk membunuh sel vegetative bakteri.Sedangkan sel spora

tidak akan mati pada suhu 80o C,bahkan spora masih dapat hidup selama 1

jam dalam air mendidih. Pada praktikum kali ini,pembuatan suspense

bakteri dilakukan dengan mencampurkan zat warna dengan suspense

bakteri secara bersama pada saat pemanasan. Hal ini bertujuan agar

memudahkan zat warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding

pelindung bakteri. Spora sangat sulit untuk diwarnai,tetapi ketika sekali

diberikan pewarnaan maka zat warna tersebut akan sulit untuk dilepaskan

dari dinding spora Karena dinding spora mengandung asam

dupikolinat,yang mana substansi ini tidak dapat ditemui pada sel

vegetative atau dengan kata lain senyawa ini khas dimiliki oleh spora.

Karena mengandung senyawa ini lah spora memiliki dinding yang relatif

tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara

memanaskan preparat,selain itu senyawa ini juga menyebabkan

metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik

dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia.Oleh

sebab itu dengan bantuan pemanasan maka pori-pori pada dinding spora

akan melebar sehingga zat warna karbol fuksin lebih mudah masuk.

Selanjutnya adalah membuat olesan bakteri. Mengambil sebuah kaca

obyek dari larutan alcohol. Kaca obyek yang akan digunakan untuk

membuat olesan bakteri haruslah bersih dan steril. Itulah sebabnya kaca

obyek direndam terlebih dahulu pada larutan alcohol. Kaca obyek

kemudian dikeringkan dengan menggunakan kapas steril. Kaca obyek

dilap searah hingga kering. Hal ini bertujuan agar tidak ada sisa kapas

yang menempel pada kaca obyek yang dapat mengganggu hasil

pengamatan. Pada satu sisi kaca obyek diberi lingkaran dengan

menggunakan spidol, tidak terlalu besar dan tidak terlalu kecil. Hal ini

dilakukan untuk membuat batas pengamatan yang akan kita kerjakan.

Nyalakan pembakar spiritus menggunakan korek api. Panaskan

(fiksasi) ose hingga membara. Hal ini bertujuan untuk membunuh sisa

bakteri yang menempel di ose yang dapat mengganggu hasil pengamatan.

Ose didinginkan di dekat pembakar spiritus. Ambil suspensi bakteri

dengan menggunakan tangan kiri. Buka penutup tabung dan miringkan.

Ambil suspensi bakteri dengan menggunakan ose didekat api. Tabung

suspense dan penutupnya difiksasi didekat api dan disimpan pad arak

tabung. Suspensi bakteri pada ose dioleskan pada kaca obyek yang telah

diberi lingkaran secara merata. Ose difiksasi kembali hingga membara

untuk membunuh sisa bakteri yang menempel pada kawat ose. Olesan

yang baik adalah olesan yang tidak terlalu tebal atau terlalu tipis serta

tahan terhadap pencucian satu kali atau lebih. Pada olesan yang terlalu

tebal, sel-sel bakteri akan bertumpuk sehingga sulit untuk diamati pada

mikroskop. Sedangkan pada olesan yang terlalu tipis, akan sulit

menemukan sel-sel tersebut. Setelah itu fiksasi kaca obyek diatas

pembakar spiritus. Olesan bakteri harus betul-betul kering, olesan yang

belum kering akan menyebabkan sel-sel bakteri seakan-akan terbawa dan

bentuknya menjadi tidak karuan. Fiksasi ini berfungsi supaya bakteri

selain bakteri target yang akan diamati mati sehingga tidak mengganggu

hasil pengamatan, selain itu untuk menempelkan bakteri pada kaca supaya

bakteri tidak hilang saat mencuci. Fiksasi ini tidak boleh terlalu lama

karena dinding sel bakteri akan pecah jika terkena panas terlalu lama atau

panas yang berlebihan. Fiksasi yang baik adalah fiksasi yang tidak

merubah bentuk bakteri atau tidak menyusutkan / mengkerutkan bakteri.

Kemudian olesan bakteri ditetesi dengan H2SO4 1% dan dicuci dengan air

suling. Proses pencucian ini menyebabkan por-pori dinding spora yang

semula melebar,kembali mengecil. Tahapan ini lah yang mengakibatkan

dekolorisasi dengan asam-alkohol tidak akan melarutkan zat warna karbol

fuksin pada spora .Kemudian olesan digenangi dengan pewarna tanding

biru metilen selama 5 menit. Tujuan pemberian methylen blue adalah

memberi warna background ( pewarna sekunder ). Hal ini berfungsi untuk

mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah

perlakuan dengan asam alkohol. Bakteri yang tidak berspora cenderung

tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai

oleh karbol fuksin, sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur

setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan

selanjutnya dengan metilen biru, sel vegetatif mudah mengikat warna

kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah biru dari metilen

biru.

Lalu zat warna yang berlebih dibilas dengan air suling dan

dikeringkan dengan kertas saring. Penotolan dengan kertas saring harus

hati-hati agar olesan bakteri tidak terbawa / menempel pada kertas saring.

Lalu,kaca preparat ditetesi dengan menggunakan minyak imersi. Hal ini

dikarenakan, cahaya yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda,

yaitu udara dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu

membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan

pembiasan yang mendekati garis normal. Bahan yang mampu membiaskan

cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang

mendekati garis normal adalah minyak imersi. Selain itu, minyak imersi

juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau identik dengan

kaca.Setelah itu preparat diamati dibawah mikroskop

Bakteri yang diamati adalah bakteri Bacillus subtilis memiliki sel

vegetative yang berwarna biru, spora yang berwarna merah tidak dapat

diamati. Hal ini mungkin disebabkan oleh :

1.Biakan spora suspense bakteri belum matang, seharusnya umur biakan

bakteri yang digunakan 36 jam. Tapi pada praktikum kali ini umur biakan

hanya 24 jam. Menyebabkan spora belum matang,sehingga karbol fuksin

tidak masuk secara sempurna dan sulit diamati

2.Proses pencucian yang terlalu lama dapat menyebabkan sel bakteri

terbawa air/ tercuci oleh air.

VIII. SIMPULAN

1.Endospora bakteri dapat diamati dengan mengggunakan prosedur

pewarnaan spora .

2. Hasil pengamatan :

Badan vegetative : warna biru

Spora : warna merah muda

Sel vegetative : bentuk batang

3. Praktikan dapat memahami pewarnaan spora dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.2005. Dasar- dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT Penerbit

Djambatan.

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo

Persada.

Pelczar, M J.dan E.C.S Chan.1986.Dasar- dasar Mikrobiologi Jilid 1Jakarta:

UI Press.

Volk, W.A dan Margaret Fwheeler.1988.Mikrobiologi Dasar, diterjemahkan oleh:

Markham, M.sc.Jakarta: Erlangga.