i

PENINGKATAN RESPON IMMUN PADA IKAN NILA

(Oreochromis niloticus) DENGAN PEMBERIAN XANTONE

YANG DIEKSTRAK DARI KULIT BUAH MANGGIS

(Garcinia mangostana L)

TESIS

MARDIANA

PROGRAM STUDI ILMU PERIKANAN

PROGRAM PASCA SARJANA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2013

ii

LEMBAR PENGAJUAN TESIS

PENINGKATAN RESPON IMMUN PADA IKAN NILA

(Oreochromis niloticus) DENGAN PEMBERIAN XANTONE

YANG DIEKSTRAK DARI KULIT BUAH MANGGIS

(Garcinia mangostana L)

Disusun dan diajukan oleh

MARDIANA

Nomor Pokok P 33 002 11 401

Menyetujui:

Komisi Penasehat

Prof.Dr.Ir. Alexander Rantetondok , M.Fish Dr. Ir. Gunarto Latama,

M.Sc

Ketua Anggota

Ketua Program Studi

Ilmu Perikanan

Prof. Dr. Ir. Achmar Mallawa, DEA

Tanggal Pengesahan:

iii

ABSTRAK

MARDIANA. Peningkatan Respon Immun Pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Dengan Pemberian Xanton Yang Diekstrak dari Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana Linnaeus) (dibimbing oleh Alexander Rantetondok dan Gunarto Latama)

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh pemberian ekstrak kulit buah manggis berupa xantone terhadap peningkatan respon immun pada ikan nila. Penelitian ini dilakukan secara in vitro dan in vivo, Rancangan penelitian didesain menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan pengamatan parameter tingkat kelangsungan hidup, aktivitas lisozim, letupan respirasi dan aktifitas fagositosis.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa adanya pemberian ekstrak xantone pada ikan nila mampu menghambat pertumbuhan bakteri pathogen Aeromonas hydrophila. Hasil analisis ragam ANOVA menunjukkan bahwa ikan nila yang diberikan ekstrak xanton, berpengaruh nyata terhadap tingkat kelangsungan hidup ikan nila (P<0.05). Hasil uji lanjut W-Tukey menunjukkan bahwa tingkat kelangsungan hidup tertinggi ikan nila adalah pada pemberian xanton 2,10 ppm/ekor (perlakuan C) dan tidak berbeda dengan pemberian xanton 2,15 ppm/ekor (perlakuan D) tetapi berbeda terhadap pemberian xanton 2,5 ppm/ekor (perlakuan B) dan kontrol (perlakuan A). Hasil analisis ragam ANOVA menunjukkan bahwa aktivitas lisozim antar perlakuan berpengaruh nyata (P<0.05) dan hasil uji lanjut W-Tukey kontrol berbeda dengan pemberian xanton 2,10 ppm/ekor, 2,15 ppm/ekor dan 2,5 ppm/ekor. Aktifitas fagositosis juga berpengaruh nyata (P<0,05) antara setiap perlakuan, hasil uji lanjut W-Tukey perlakuan kontrol berbeda terhadap perlakuan B, C dan D tetapi antar perlakuan B dan perlakuan D tidak berbeda. Hasil uji lanjut W-Tukey pada letupan respirasi juga menunjukkan perbedaan antara perlakuan control dan C tetapi tidak berbeda antara perlakuan B dan perlakuan D. Kata kunci : Xanton, ikan nilai, Respon Immun.

iv

MARDIANA. The Increase of Immune Respons in Nile Tilapia

(Oreochromis niloticus) Given Xantone Extracted from the Peel of

Mangosteens (Garcinia Mangostana L) Supervised by Alexander

Rantetondok and Gunarto Latama)

This study aims to anlyse the influence xantone extract from

mangosteen peel on the increase of immune response innila tilapia.

The research was conducted in vitro and in vivo by using the

complete random design. The observation parameters were the l survival

rate, lysosyme activity, respiratory burst , and phagocytosis activity.

The result revealed that giving xantone extract to nile tilapia is able

to inhibit the growth of phatogen bacteria (A. hydrophilla). The results of

ANOVA variant analysis revealed that giving xantone extract had

significant difference on the rate survival of nile tilapia (P < 0,05). The

result test of W-Tukey revealed that the highest level of surviva ratel in

nile tilapia was found in C treatment (2,10 ppm), but it was not significand

compare to D treatment (2,15 ppm). It was significant between B

treatment (2,5 ppm) and A (control). The results of ANOVA( variant

analysis) revealed that the lysozyme activity between the treatments had

a real influence (P < 0,05), and the results of further test of W-Tukey on A

(control) were different from B, C and D treatments. The phagocytosis

activities also had a real influence (P < 0,05) in the treatments. The result

of further test of W-Tukey revealed that A treatment was different from B,

C and D treatments; but there was no difference between B and D

treatments. The result of further test of W-Tukey revealed on respiration

explosion also revealed a difference between A and C treatments, but

there was no any difference between B and D treatments.

Keywords: xantone, nile tilapia, immune response

v

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN PENGESAHAN ……………………………………………….. i

KEASLIAN TESIS ………………………………………………………….. ii

ABSTRAK ………………………………………………………………….. iii

ABSTRACT .......................................................................................... iv

KATA PENGANTAR ……………………………………………………….. v

DAFTAR ISI ............................................................................................. ix

DAFTAR TABEL .................................................................................... xii

DAFTAR GAMBAR …………………………………..……………………… xiii

DAFTAR LAMPIRAN …………………………………..……………………. xii

BAB I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang …………………………………………………………. 1

B. Rumusan Masalah …………………………………………………….. 4

C. Tujuan Penelitian ……………………………………………………… 6

D. Manfaat Penelitian ..…………………………………………………… 6

E. Hipotesis Penelitian ..………………………………………………….. 6

F. Kerangka Pikir Penelitian ……………………………………………… 6

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Klasifikasi dan Morfologi Ikan Nila …………………………………. 9

B. Habitat dan Penyebaran Ikan Nila ………………………………….. 10

C. Mekanisme Timbulnya Penyakit …………………………………… 11

D. Imunostimulan………………………………………..……………. 13

vi

E. Buah Manggis (Garcinia mangostana L) ..………………………. 15

F. Kandungan Kimia Buah Manggis serta Manfaatnya ……………. 19

G. Respon Imun………………………………………………………….. 24

H. Letupan respirasi (Respiratory burst) ……………………………… 25

I. Aktivitas Lisozim …………………………………………………….. 27

BAB III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat ……………………………………………………. 28

B. Alat dan bahan ………………………………………………………. 28

C. Prosedur Penelitian …………………………………………………… 29

1. Ekstrak Kulit Buah Manggis ……………………………………… 29

2. Populasi Bakteri ….. ……………………………………………… 31

3. Hewan uji dan Pemberian Imunostimulan …………………….. 32

4. Uji Tantang ………………………………………………………… 33

D. Peubah yang diamati ………………………………………….. 34

1. Aktivitas letupan respirasi ……………………………………… 34

2. Uji Aktifitas Fagositosis ……………………………..…………… 35

3. Aktivitas Lisosim ……………………………………………….... 36

4. Tingkat Kelangsungan Hidup …………………………………… 38

E. Kualitas Air ……………………………………………………………. 38

F. Analisis Data ……………………………………………………….. … 38

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Aktifitas Letupan Respirasi …………………………………………. 39

B. Aktifitas Fagositosis ………………………………………………… 44

vii

C. Aktifitas lisozim ……………………………………………………… 48

D. Sintasan (%) …………………………………………………………. 51

E. Parameter Kualitas Air …………………..…………………………. 53

BAB V. PENUTUP

A. Kesimpulan …………………………………………………………….. 54

B. Saran ……………………………………………………………………. 54

DAFTAR PUSTAKA

viii

DAFTAR TABEL

Tabel Teks Halaman

1. Rata-rata Nilai Aktifitas Letupan Respirasi .......…............... 39

2. Rata-rata nilai sel fagositosis dengan pemberian xantone yang diekstrak dari Kulit manggis

(Garcinia mangostana) …………………………………......... 44

3. Aktivitas lisozim ikan nila setelah uji tantang ………............ 50

ix

DAFTAR GAMBAR

Gambar Teks Halaman

1. Alur Pikir Penelitian .............................................................. 8 2. Morfologi Ikan Nila (Oreochromis niloticus) ………………... 9 3. Buah Manggis (Garcinia mangostana) …………………….. 16 4. Struktur Senyawa Dasar Xanton …………………………… 21 5. Struktur Senyawa Mongostin ………………………………… 22 6. Lintas Letupan Respirasi pada Neutrofil, Katalase Melakukan Fungsi yang Sama Seperti mieloperoksidase di dalam Macrophage …………. 26

7. Penempatan wadah penelitian setelah pemberian imunostimulan (3 Ulangan) ……………………………… 32

8. Penempatan wadah penelitian setelah uji tantang ...……. 34 9. Histogram Letupan respirasi setiap perlakuan dengan pemberian xantone yang diekstak dari kulit buah manggis (A (kontrol), B (2,5 ppm), C (2,10 ppm), D (2,15 ppm)) ………………………………. 41 10. Macrophage yang terfagosit (Pewarnaan Safranin, Pembesaran 1000x) ………………………………. 46 11. Histogram nilai rata-rata aktifitas fagositosis dengan pemberian xantone yang diekstrak dari kulit manggis. (A (kontrol), B (2,5 ppm), C (2,10 ppm), D (2,15 ppm)) …………………………………………………. 47 12. Grafik linier OD lisozim terhadap masing-masing perlakuan (A (kontrol), B (2,5 ppm), C (2,10 ppm), D (2,15 ppm)) ……………………………………………… 49

13. Sintasan ikan nila setelah uji tantang dengan A. hydrophila pada akhir pengamatan ( A (kontrol),

B (2,15 ppm), C (2,10 ppm), dan D (2,15 ppm)) ….............. 52

x

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Teks

1. Data Sintasan (%) pada Ikan Nila (Orheocromis niloticus)

2. Hasil Analisis Ragam ANOVA dan Uji W-Tukey Sintasan (%)

ikan nila

3. Data Letupan Respirasi pada Ikan Nila

4. Hasil Analisis Ragam dan Uji W-Tukey Letupan Respirasi

5. Data Aktifitas fagositosis Ikan Nila

6. Hasil Analisis Ragam dan Uji W-Tukey Aktifitas fagositosis

7. Nilai aktivitas lisozim ikan uji pada masing-masing perlakuan

8. Hasil Analisis Ragam dan Uji W-Tukey aktivitas lisozim pada

ikan Nila

9. Rata-rata Nilai Kualitas air Selama Penelitian

10. Perhitungan A.hydrophila dengan Metode Mac Farland

11. Sampel uji ikan nila (O. niloticus)

12. Tahapan Proses Penelitian

13. Gambar proses uji lisozim

14. Gambar proses aktifitas letupan respirasi

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Sektor perikanan dan kelautan merupakan salah satu sumber

andalan dalam pembangunan perikanan di Indonesia. Produksi perikanan

budidaya sendiri secara keseluruhan diproyeksikan meningkat rata-rata

4,9 % per tahun (KKP, 2010). Target tersebut antara lain didasarkan atas

potensi pengembangan daerah perikanan budidaya yang memungkinkan

di wilayah Indonesia. Melihat besarnya potensi pengembangan daerah

perikanan budidaya serta didukung pasar internasional yang masih

terbuka luas, maka diharapkan sumbangan produksi perikanan budidaya

semakin besar terhadap produksi nasional dan penerimaan devisa Negara

dan keterkaitannya dengan tujuan untuk kesejahteraan petani dan

nelayan (Khairul dkk., 2008)

Ikan nila (Oreochromis niloticus) merupakan spesies yang berasal

dari kawasan sungai Nil dan danau-danau sekitarnya di Afrika. Bentuk

tubuh memanjang, pipi kesamping dan warna putih kehitaman. Jenis ini

merupakan ikan konsumsi air tawar yang banyak dibudidayakan setelah

ikan mas (Cyrprinus carpio) dan telah dibudidayakan di ± 85 negara. Saat

ini, ikan ini telah tersebar ke negara beriklim tropis dan subtropis,

sedangkan pada wilayah beriklim dingin tidak dapat hidup dengan baik.

Nila disukai oleh semua kalangan karena mudah dipelihara, dapat

2

dikonsumsi oleh segala lapisan serta rasa daging yang enak dan tebal

(Khairul dkk., 2008). Tekstur daging Ikan nila memiliki ciri tidak ada duri

kecil dalam dagingnya. Apabila dipelihara di tambak akan lebih kenyal,

dan rasanya lebih gurih, serta tidak berbau lumpur. Oleh karena itu, Ikan

nila layak untuk digunakan sebagai bahan baku dalam industri fillet dan

bentuk-bentuk olahan lain. Ekspor nila dari Indonesia umumnya dalam

bentuk frozen fille (600 g) dan surimi (Wibowo dan Yunizal , 1998).

Nila adalah nama khas Indonesia yang diberikan oleh pemerintah

melalui Direktur Jenderal Perikanan (Sukardi, 2004). Ikan Nila merupakan

ikan berdaging putih, dapat tersedia dalam jumlah banyak dan harganya relatif

murah serta sebagai alternatif sumber protein non-kolesterol. Di dalam negeri,

nila juga digemari oleh karena itu telah banyak dibudidayakan, usaha budidaya

ikan sering terjangkit adanya penyakit ikan yang tidak jarang

menggagalkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup ikan sehingga

mengakibatkan kematian massal pada ikan yang dibudidayakan (gagal

panen). Penyakit ikan disebabkan adanya interaksi antara lingkungan,

organisme patogen dan ikan yang tidak seimbang. Penyakit ikan dapat

disebabkan oleh fisika, kimiawi, dan biologis (Feliatra dkk., 2004).

Penyakit yang diakibatkan oleh fisik maupun kimiawi pada umumnya tidak

menular (non-infeksi) misalnya penyakit yang diakibatkan oleh kekurangan

nutrisi, genetik, dan faktor lingkungan, sedangkan penyakit yang

ditimbulkan oleh penyebab biologis kebanyakan menular (infeksi) seperti

penyakit akibat infeksi parasit, bakteri, virus dan jamur.

3

Bakteri yang menyerang hampir semua jenis ikan air tawar yang

dipelihara di tambak adalah bakteri Aeromonas hydrophila (Triyanto,

1990). Penyakit infeksi yang ditimbulkan oleh serangan bakteri ini memiliki

ciri dimana ikan yang terserang umumnya memiliki mulut merah, tubuh

bercak kemerahan, perut kembung dan putus sirip, lemah, sering

berenang ke permukaan berputar-putar dan kehilangan nafsu makan.

Kerugian yang ditimbulkan sangat besar, sebab dalam waktu relatif

singkat ikan akan mati secara massal (Susanto, 1988). Penyakit ikan

biasanya timbul berkaitan dengan lemahnya kondisi ikan yang disebabkan

beberapa faktor antara lain penanganan ikan, pakan yang diberikan

sangat berlebihan dan keadaan lingkungan yang kurang mendukung.

Usaha penanggulangan penyakit dapat berupa pengobatan dan

pencegahan. Usaha penanggulangan yang paling efisien adalah berupa

pencegahan penyakit dengan cara pemberian imunostimulan.

Imunostimulan adalah zat kimia, obat-obatan, stressor, atau aksi

yang meningkatkan respon imun non-spesifik atau bawaan (innate-

immune respon) yang berinteraksi secara langsung dengan sel dari sistem

yang mengaktifkan respon imun bawaan tersebut (Syakuri dkk., 2003).

Selanjutnya imunostimulan adalah suatu zat yang mempunyai

kemampuan untuk meningkatkan ketahanan tubuh terhadap infeksi.

Bermacam-macam imunostimulan dapat digunakan salah satunya adalah

Jinten hitam (Nigella sativa) yang berpotensi sebagai imunostimulan

karena mampu meningkatkan system kekebalan tubuh dalam menghadapi

4

patogen. Tumar (2006) melaporkan bahwa ekstrak jinten hitam (Nigella

sativa) dapat menghambat atau bahkan dapat membunuh bakteri

Aeromonas hydrophila.

Imunostimulan dapat digunakan sebagai terapi tambahan untuk

penyakit yang disebabkan oleh infeksi virus, bakteri dan parasit serta

membantu meringankan gejala penyakit infeksi, serta mempercepat

proses penyembuhan pada ikan (Rantetondok, 2002). Jika belum terkena

penyakit, imunostimulan bisa dipakai sebagai tindakan preventif untuk

mencegah penyakit, serta untuk meningkatkan daya tahan tubuh. Terapi

tambahan disini berarti imunostimulan bukanlah merupakan obat utama

yang melawan penyakit, tetapi hanya membantu mempercepat proses

penyembuhannya saja. Namun demikian, imunostimulan akan lebih

bermanfaat pada kondisi dimana sistem kekebalan tubuh mengalami

penurunan. Oleh karena hal tersebut diatas, penelitian ini digunakan

xanton yang diekstrak dari kulit buah manggis sebagai salah satu alternatif

penanganan penyakit yang ramah lingkungan.

B. Rumusan Masalah

Ikan nila sangat terkenal sebagai ikan yang sangat tahan terhadap

perubahan lingkungan hidup, namun penggunaan beberapa antibiotik

dapat menyebabkan kerusakan lingkungan akibat penggunaan yang tidak

mengikuti aturan, olehnya itu sekarang banyak dilakukan penelitian untuk

usaha pencegahanan penyakit. Salah satu cara adalah dengan

5

penggunaan imunostimulan berupa pemberian Xanton yang diekstrak dari

kulit buah manggis yang dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh

baik spesifik maupun non-spesifik, karena dapat meningkatkan aktifitas

fagositosis dari pertahanan seluler dan respon imun (Suksamran, 2003).

Manggis (Garcinia mangostana L.) yang berasal dari suku gutiferae

merupakan salah satu buah-buahan tropis yang paling dikenal secara

luas dan memiliki daya tarik universal karena kualitas dalam warna,

bentuk dan flavour. Manggis dikenal sebagai “Queen of fruits” dan

tersebar di seluruh India, Myanmar, Malaysia, Philippina, Sri Lanka, dan

Thailand.

Pericarp (peel, kulit, dan isi) dan buah manggis yang telah matang

digunakan sebagai obat tradisional untuk mengobati sakit perut, diare,

disentri, luka infeksi, nanah, dan lambung kronis (Uksamrar, dkk., 2006).

Xanthones, terpenoids dan sugars telah dilaporkan dari berbagai bagian

(pericarp, buah utuh, kulit, dan daun) manggis dan beberapa dari mereka

telah menunjukkan berbagai kegiatan biologis (Peres dkk., 2000). Lebih

lanjut farmakologi itu juga memiliki beberapa properti termasuk antitumor,

antibakteri antifungal, anti-inflamasi antioksidan, antiplasmodial (Jung,

2006) dan kegiatan cytotoxic immunostimulating aktivitas manggis belum

banyak dieksplorasi. Oleh karena itu penelitian ini ini dimaksudkan untuk

mengevaluasi peningkatan respon immun non-spesifik pada ikan nila (O.

niloticus) yang diekstrak dari kulit buah manggis.

6

C. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis pengaruh

pemberian ekstrak kulit buah manggis berupa Xanton terhadap

peningkatan respon imun pada ikan nila yaitu berupa letupan respirasi,

aktifitas fagositosis dan aktivitas lisosim serta tingkat kelangsungan hidup

pada ikan nila.

D. Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah sebagai bahan informasi

mengenai fungsi dari imunostimulan yang diekstrak dari buah kulit

manggis berupa Xanton yang diberikan pada ikan nila sehingga dapat

meningkatkan produksi ikan nila.

E. Hipotesis

Respon imun pada ikan nila dengan pemberian Xanton dari ekstrak

kulit manggis dapat meningkatkan Immunostimulan pada ikan nila

sehingga dapat menunjang kelangsungan hidup.

F. Kerangka Pikir Penelitian

Ikan nila terkenal sebagai ikan yang sangat tahan terhadap

perubahan lingkungan hidup baik tawar maupun payau, tapi salah satu

kendala pembenihan maupun budidaya adalah serangan dari beberapa

penyakit yang menyebabkan gagal panen oleh sebab itu untuk

7

meningkatkan ketahanan tubuh maka ikan yang di budidaya diberi

imunostimulan berupa esktrak kulit buah manggis.

Penanganan penyakit ini dapat berupa pengobatan dengan

menggunakan obat-obatan dan bahan kimia, selain itu juga dapat

dilakukan dengan pemberian imunostimulan, vaksin, dan rekayasa

genetik, tetapi dengan pemakaian obat-obatan dan antibiotik dapat

menyebabkan resistensi bakteri dan berdampak negatif sehingga dapat

merugikan karena tindakan tersebut tidak ramah lingkungan. Dengan

meningkatkan imun berupa senyawa Xanton yang diekstrak dari kulit buah

manggis diharapkan menjadi alternatif dalam pertahanan terhadap

serangan penyakit khususnya bakteri Aeromonas hydrophila.

8

Gambar 1. Alur Pikir Penelitian

9

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Klasifikasi dan Morfologi Ikan Nila

Gambar 2. Morfologi Ikan Nila (Oreochromis niloticus)

Ikan nila mempunyai bentuk tubuh lebih pendek. Tubuhnya lebih

tebal, warna tubuhnya hitam keputihan, kepalanya relatif kecil, sisik

berukuran besar, kasar, tersusun rapi, matanya besar, menonjol dan

bagian tepinya berwarna putih. Gurat sisi (linea lateralis) terputus

dibagian tengah badannya, dagingnya cukup tebal dan tidak terdapat duri-

duri halus di dalamnya (Gambar 2).

Ikan nila memilki lima buah sirip, yakni sirip punggung (dorsal fin),

sirip dada (pectoral fin), sirip perut (ventral fin), sirip anus (anal fin) dan

sirip ekor (caudal fin). Sirip punggunya memanjang dari bagian atas tutup

ingsang hingga bagian atas sirip ekor, terdapat juga sepasang sisrip dada

dan sirip perut yang berukuran kecil. Sirip anusnya hanya satu buah dan

berbentuk agak panjang, sedangkan sirip ekornya berbentuk bulat dan

10

hanya berjumlah satu buah .Ikan nila merupakan jenis ikan konsumsi air

tawar dengan bentuk tubuh memanjang dan pipih ke samping dan warna

putih kehitaman.

Menurut Amri dan Khairuman (2003) secara taksonomi ikan nila

diklasifikasikan sebagai berikut :

Filum : Chordata

Sub filum : Vertebrata

Super kelas : Pisces

Kelas : Osteichtyes

Famili : Chilchilidae

Ordo : Percoidea

Genus : Oreochromis

Spesies : Oreochromis niloticus

B. Habitat dan Penyebaran Ikan Nila

Ikan nila bersifat euryhaline sehingga habitat hidupnya sangat

luas, meliputi perairan tawar, muara sungai dan payau, serta tahan

terhadap perubahan kondisi lingkungan yang cukup ekstrim. Akan tetapi,

pada fase benih masih rentan terhadap perubahan lingkungan yang

drastis terutama adalah salinitas (Arie U, 2000). Secara langsung,

salinitas air mempengaruhi tekanan osmotic cairan tubuh ikan. Apabila

osmotic lingkungan (salinitas) berbeda jauh dengan tekanan osmotic

cairan tubuh (kondisi tidak ideal) maka osmotic media/air akan menjadi

11

beban bagi ikan sehingga dibutuhkan tekanan yang osmotic besar untuk

mempertahankan osmotic tubuhnya agar tetap berada pada keadaan

yang ideal. Dengan demikian, semakin jauh perbedaan tekanan osmotik

antara cairan tubuh dan lingkungan, semakin banyak energi metabolisme

yang dibutuhkan untuk melakukan osmoregulasi sebagai upaya adaptasi.

C. Mekanisme Timbulnya Penyakit

Rantetondok (2011) mengemukakan penyakit didefinisikan sebagai

suatu keadaan patologi pada tubuh yang ditandai dengan adanya kondisi

abnormal baik secara histologi maupun fisiologi. Selanjutnya Austin dan

Austin (1999) mengemukakan terjadinya penyakit infeksi dalam sistim

budidaya disebababkan oleh interaksi inang, patogen dan lingkungan atau

stressor eksternal yaitu perubahan lingkungan yang tidak menguntungkan,

tingkat hygienik yang buruk dan stres.

Timbulnya penyakit berhubungan erat dengan keadaan lingkungan.

Organisme penyebab penyakit seperti parasit, jamur, dan virus akan cepat

menimbulkan penyakit, karena lingkungan yang kurang baik. Hal ini

sejalan dengan pernyataan Tashlihan dalam Irianto (2005) bahwa

penyakit timbul apabila keadaan lingkungan yang tidak stabil, misalnya

salinitas yang tiba-tiba menurun secara drastis akibat turun hujan,

temperatur telalu tinggi, kadar oksigen terlalu rendah sehingga organisme

air mengalami stres. Menurut Rantetondok (2011) penyakit dapat

disebabkan oleh berbagai jenis penyebab penyakit seperti protozoa,

bakteri, cendawan, dan virus. Ditambahkan oleh Rukyani (1993) penyakit

12

pada organisme diklasifikasikan menjadi dua bentuk, yaitu (1) Penyakit

infeksi/parasit, apabila penyakit disebabkan oleh organisme seperti virus,

jamur, protozoa dan cacing; (2) Penyakit non-infeksi/non-parasiter,

apabila penyakit bukan disebabkan oleh organisme tetapi dapat

disebabkan berupa parameter lingkungan, defisiensi nutrisi, keracunan

dan faktor genetis.

Kemampuan organisme mempertahankan diri dari serangan

penyakit tergantung pada kesehatan organisme dan kondisi lingkungan.

Jika kesehatan organsime menurun atau kondisi lingkungan yang kurang

mendukung, maka organsime akan mengalami stres. Hal ini akan

menyebabkan kemampuan organisme mempertahankan diri dari

serangan penyakit menurun sehingga patogen dengan mudah menyerang

organisme. Selanjutnya Menurut Irianto (2005) stres adalah suatu

keadaan saat suatu hewan tidak mampu mengatur kondisi fisiologis yang

normal karena berbagai faktor merugikan yang mempengaruhi kondisi

kesehatannya. Lebih jauh dijelaskan bahwa stres adalah sebagai

pengaruh segala bentuk perubahan atau tantangan lingkungan yang

mendorong homeostatik atau proses-proses penyeimbang lainnya

melebihi batas kemampuan normal segala tingkatan organisasi biologis,

seperti populasi, atau ekosistim. Stres akan mempengaruhi faktor

perlindungan alami ikan seperti mukus, sisik, kulit, lisozim, antibodi, dan

reaksi inflamasi

13

D. Imunostimulan

Imunostimulan adalah zat yang dapat menyebabkan peningkatan

Innate Immunity dan Adative Immunity (Anderson dalam malina, 2005).

Sakai dalam Malina (2005) mengkaji penelitian status penggunaan

imunostimulan pada ikan. Imunostimulan seperti glucan, citin, lactoferin,

levamisol, serta faktor gizi seperti vitamin B dan C, hormon pertumbuhan

dan prolactin merupakan imunostimulan yang dapat meningkatkan

ininnate immunity seperti aktifitas sel fagositosis, aktivitas lisosim. Namun,

beberapa imunostimulan tidak dapat digunakan karena berbagai

kekurangan, seperti biaya tinggi, efektifitas terbatas dan lain-lain.

Imunostimulan adalah zat kimia, obat-obatan, stressor, atau aksi yang

meningkatkan respon imun non-spesifik atau bawaan innate immune respon)

yang berinteraksi secara langsung dengan sel dari sistem yang mengaktifkan

respon imun bawaan tersebut. Imunostimulan adalah zat-zat yang dapat

meningkatkan daya tahan tubuh terhadap infeksi penyakit, bukan meningkatkan

respon imun spesifik (acquired immune respon), tetapi meningkatkan respon

imun non-spesifik baik melalui mekanisme pertahanan humoral maupun

pertahanan seluler (Sakai, 1999). Ikan telah diketahui lebih mengandalkan

mekanisme sistem kekebalan non-spesifiknya atau bahawan (innate immune

sistem) dari pada sistem kekebalan spesifiknya atau adaptif (Anderson, 1992)

Keuntungan imunostimulan dalam budidaya;

1. Efektif dan ramah lingkungan

14

2. Tidak ada efek samping

3. Mengembangkan ketahanan terhadap resiko berbagai penyakit

4. Tersedia secara lokal

5. Imunostimulan bertindak melalui mekanisme sebagai berikut:

stimulator Limfosit- T,levamisol, adjuvant, glucan, murmyl

dipeptida

6. Stimulator sel-B, lipopolysaccharides

7. Agen inflamasi menginduksi chematoxis-silia dan partikel

carbon

8. Faktor Nutrisi-Vitamin C dan E

9. Cytokine leukotriene, interferon

Pada umumnya, imunostimulan meningkatkan aktifitas

macrophage, melengkapi, fagosit, limfosit dan sel toxic non-spesifik,

mengakibatkan perlawanan dan perlindungan terhadap berbagai penyakit.

Pengaruh senyawa β-glucan tergantung pada reseptor sel untuk

mengikat sistem imun. Setelah mengikat reseptor sinyal intraseluler dapat

terjadi yang mengakibatkan produksi enzim, melengkapi komponen,

oksida radikal dan sitokin sebagai komponen dasar imunostimulan.

Beberapa imunostimulan bisa merangsang sel-sel pertahanan untuk

memproduksi antibody misalnya melengkapi komponen, memfasilitasi

lisis bakteri sedangkan imunostimulan lain dapat menyebabkan

peningkatan pemberantasan mikroorganisme tergantung pada reseptor

yang terlibat.

15

Imunostimulan dapat digunakan sebagai terapi tambahan untuk

penyakit yang disebabkan oleh infeksi virus, membantu meringankan

gejala penyakit infeksi, serta mempercepat proses penyembuhannya. Jika

belum terkena penyakit, imunostimulan bisa dipakai sebagai tindakan

preventif untuk mencegah penyakit, serta untuk meningkatkan daya tahan

tubuh. Terapi tambahan disini berarti imunostimulan bukanlah merupakan

obat utama untuk mengobati penyakit, tetapi hanya membantu proses

pengobatan dan penyembuhan. Namun demikian, imunostimulan akan

lebih bermanfaat pada kondisi dimana sistem kekebalan tubuh mengalami

penurunan. Dan imunostimulan tidak dianjurkan bagi orang yang

menderita penyakit dimana sistem kekebalan tubuhnya sendiri beraksi

berlebihan (disebut penyakit autoimun), seperti lupus, multipel sklerosis,

rematoid artritis; atau juga pada pasien yang telah menjalani transplantasi

organ tubuh dan mendapatkan obat untuk menekan reaksi penolakan

tubuh terhadap organ transplant (Raa, 1996).

E.. Buah Manggis (Garcinia mangostana L)

Taksonomi dari tumbuhan buah Manggis dapat dilihat pada

sistematika di bawah ini :

Divisi : Spermatophyta

Sub Divisi : Angiospermae

16

Kelas : Dicotyledoneae

Bangsa : Parietales

Suku : Gutiferae

Marga : Garcinia

Spesies : Garcinia mangostana L (Anonim, 2005).

Secara jelasnya buah manggis dapat dilihat pada gambar 3

Gambar 3. Buah Manggis (Garcinia mangostana)

Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan tanaman buah

berupa pohon yang berasal dari hutan tropis yang teduh di kawasan Asia

Tenggara yaitu hutan belantara Malaysia atau Indonesia. Di Indonesia

manggis disebut dengan berbagai macam nama lokal, seperti manggu

(Jawa Barat), manggus (Lampung), manggusto (Sulawesi Utara),

manggista (Sumatera Barat).

G. mangostana adalah salah satu dari genus tumbuhan buah

dalam famili Guttiferae dengan jumlah spesies yang banyak. Genus

tumbuhan ini terkenal dengan nama kelompok manggis-manggisan,

Daun

Kelopak

Tangkai buah

Kulit sebagai

bahan ekstrak

Isi/Biji

17

tersebar di daerah dataran rendah hutan tropis Asia, Afrika, New

Caledonia, dan Polynesia. Di Indonesia sekitar 91 spesies tersebar di

pulau Sumatera, Jawa, Sulawesi, dan Maluku. Secara tradisional

beberapa spesies dari genus ini telah digunakan untuk pengobatan.

Buah manggis (G. mangostana L.), termasuk dalam family

Guttiferae dan merupakan species terbaik dari genus Garcia. Manggis

termasuk buah eksotik karena memiliki warna yang menarik dan

kandungan gizi yang tinggi, karena itu buah manggis memiliki prospek

yang cukup baik untuk dikembangkan. Potensi manggis tidak hanya

terbatas pada buahnya saja, tetapi juga hampir seluruh bagian tumbuhan

manggis menyimpan potensi yang sangat bermanfaat bagi kehidupan

manusia (Heyne, 1987).

Beberapa spesies dari genus ini telah diteliti secara

berkesinambungan baik kandungan kimia maupun aktivitas biologinya.

Pada genus Garcinia ini banyak ditemukan senyawa xanton, benzofenon,

depsidon dan triterpen yang bersifat anti bakteri, antoksidan, dan

antikanker (Uksamranr dkk., 2006). Beberapa senyawa antioksidan

yang ditemukan dari genus ini menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi,

dibandingkan dengan senyawa antioksidan yang sudah dikenal.

Ekstrak manggis mempunyai efek anti mikroba terhadap

Propionibacterium acne. Alfa mangostin juga mempunyai aktivitas anti

bakteri terhadap Mycobacterium tuberkulosis. Tanaman manggis yang

18

mengandung xanton telah terbukti dapat digunakan sebagai antioksidan,

anti inflamasi, anti malaria, antiacne, dan anti mikroba (Melviani, 2010).

Kulit kayu, kulit buah, dan lateks kering Garcinia mangostana

mengandung sejumlah zat warna kuning yang berasal dari dua metabolit

yaitu alfa mangostin dan β-mangostin yang berhasil diisolasi.Alfa

mangostin merupakan komponen utama sedangkan β-mangostin

merupakan konstituen minor. Metabolit baru yaitu 1,3,6,7-tetrahidroksi-2,8-

di(3-metil-2-butenil) santon yang diberi nama alfa mangostanin dari kulit

buah Garcinia mangostana (Mardawati dkk, 2008).

Alfa mangostin adalah serbuk tak beraturan yang berwarna kuning,

dengan titik lebur antara 180-181 °C, pada pengukuran dengan UV λ

maksimum yang diperoleh adalah 215, 243, 317 nm, sedangkan pada IR

diperoleh λ maksimum sebesar 3422, 2922, 1642, 1610 nm. Alfa

mangostin larut dalam heksan (Suksamrarn dkk, 2003).

Buah manggis selain terkenal karena rasanya, ternyata

mengandung banyak sekali nutrisi. Buah ini banyak mengandung serat

dan karbohidrat, serta mengandung banyak sekali vitamin A, B2, B6 dan

vitamin C dan berbagai mineral seperti zat besi, kalsium, dan kalium.

Kandungan stilbenes pada buah manggis Garcinia mangostana L juga

sangat bermanfaat sebagai anti fungi (Suksamrarn, 2006).

F. Kandungan Kimia Buah Manggis Serta Manfaatnya

Kandungan senyawa kimia hasil metabolit sekunder buah

manggis adalah xanton, mangostin dan tanin (Heyne, 1987). Menurut

19

hasil penelitian, kulit buah manggis memiliki aktivitas HIV tipe I (Chen,

1966), antibakteri, antioksidan dan anti metastasis pada kanker usus

(Tambunan, 1998). Tumbuhan ini menghasilkan berbagai macam

senyawa aktif yang memberikan efek farmakologi. Umumnya, senyawa

aktif tersebut tidak berperan penting dalam metabolisme tumbuhan,

sehingga sering disebut sebagai metabolit sekunder (Stepp dan

Moerman, 2001). Metabolit sekunder telah lama diketahui sebagai

sumber terapi medis yang efektif dan penting, misalnya sebagai obat anti-

bakteri dan anti-kanker (Sukamat dan Ersam. 2006). Senyawa ini secara

terus menerus menjadi sumber utama berbagai obat berkhasiat penting

(Harvey, 2000).

Kulit buah manggis merupakan bagian buah manggis yang

membungkus daging buah dan kulit buah manggis mengandung air

62,05%, abu1,0%, lemak 0,63%, protein 0,71%, total gula 1,17%, dan

karbohidrat 35,61% (Llinuma dkk., 1996). Sedangkan kandungan yang

terdapat dalam daging buah manggis antara lain gula sakarosa,

dekstrosa, dan levulosa. Rasio bagian buah yang dikonsumsi dengan

bagian buah yang dibuang, dalam hal ini kulit buahnya yang mencapai 2/3

bagian buah atau 66,6% (Suksamranr, 2006). Oleh sebab itu diperlukan

upaya untuk memanfaatkannya.Kendala dalam pemanfaatan kulit buah

manggis adalah rasanya pahit. Rasa pahit pada kulit buah manggis

tersebut ada kaitannya dengan kandungan tanin yang terdapat di dalam

jaringan kulit buah manggis. Senyawa tannin merupakan asam tannat,

20

secara teoritis suatu senyawa yang bersifat asam basa dapat dinetralkan

dengan larutan basa, yang akan membentuk garam tannat dan air.

Menurut Heyne (1987) kandungan senyawa kimia hasil metabolism

sekunder buah manggis adalah :

1. Xanton

Xanton merupakan derivat dari difenil-γ-pyron, yang memiliki

nama IUPAC 9H-xantin-9-on. Xanton terdistribusi luas pada tumbuhan

tinggi, tumbuhan paku, jamur, dan tumbuhan lumut. Sebagian besar

xanton ditemukan pada tumbuhan tingkat tinggi yang dapat diisolasi dari

empat suku, yaitu Guttiferae, Moraceae, Polygalaceae dan Gentianaceae

(Herlina dan Taslim, 2006). Xanton dilaporkan memiliki aktivitas

farmakologi sebagai anti bakteri, antifungi, antiinflamasi, antileukemia,

antiagregasi platelet, selain itu xanton dapat menstimulasi sistem saraf

pusat dan memiliki aktivitas antituberkulosis secara in-vitro pada bakteri

Mycobacterium tuberculosis (Bruneton, 1999). Xanton jenis gentisin dan

mangiferin memiliki aktivitas sebagai antitumor dan inhibitor monoamin

oksidase (Robinson, 1995). Disamping itu juga xanton sebagai anti

mikrobakteri (Suksamrarn dkk, 2003), dan juga sebagai antiradikal

bebas atau antioksidan (Lannang dkk, 2005).

Gambar 4. Struktur Senyawa Dasar Xanton (Uksamranr, 2006)

21

Xanton adalah senyawa polifenol dari senyawa keton siklik

polifenol dengan rumus molekul C13H8O2. Strukture dasar xantone terdiri

atas tiga benzene dengan satu benzene yang terdapat ditengahnya

berupa keton (Gambar 4). Khasiat Xanton dari kulit buah manggis

merupakan substansi kimia alami yang tergolong senyawa polyphenolic.

Senyawa Xanton dan derivatnya dapat diisolasi dari kulit buah manggis

(pericarp) dan mengandung 3-isomangostin, alpha-mangostin, beta-

mangostin, gamma-mangostin, garcinone A, garcinone B, C, dan D,

maclurin, mangostenol, catechin, potassium, calsium, posphor, besi,

vitamin B1, B2, B6, dan vitamin C. Xanton sebagai antioksidan yang

kuat, sangat dibutuhkan dalam tubuh sebagai penyeimbang prooxidant

(reducing radicals, oxidizing radicals, carboncentered, sinar UV metal, dll).

(Suksamrarn, 2006).

2. Mangostin

Mangostin merupakan senyawa turunan dari xanton (Gambar 5)

yang dihasilkan oleh buah manggis yang sangat berperan sebagai

antioksidan. Senyawa ini dapat menghambat HIV-AIDS (Chen, 1966).

Untuk menghambat separuh virus HIV membutuhkan 5,7 µg/mL ekstrak

G. mangostana. Semakin kecil dosis berarti semakin kuat ekstrak dalam

menghambat virus.

Kulit buah manggis mengandung senyawa antioksidan tinggi yaitu

alfa mangostin dan gammamangostin. Berkat antioksidan itu kekebalan

tubuhpun meningkat. Antioksidan bereaksi dengan radikal bebas dengan

22

cara mengurangi konsentrasi oksigen, mencegah pembentukan singlet

oksigen yang reaktif, mencegah inisiasi rantai pertama dengan

menangkap radikal primer seperti radikal hidroksil, mengikat katalis ion

logam, mendekomposisi produk-produk primer radikal bebas. Radikal

bebas adalah molekul yang sangat reaktif karena memiliki elektron tidak

berpasangan pada orbital luarnya sehingga dapat bereaksi dengan

molekul sel tubuh dengan cara mengikat elektron sel tersebut, dan

mengakibatkan reaksi berantai yang menghasilkan radikal bebas baru

(Putri, 2007).

Gambar 5. Struktur Senyawa Mongostin (Uksamranr, 2006)

Kandungan alpha-mangostin dan gamma-mangostin pada buah

manggis juga bersifat sebagi anti bakteri. Alpha-mangostin juga diketahui

mempunyai efektivitas yang sama baiknya dengan antibiotika yang berada

di pasaran seperti amphicillin dan minocycline (Uksamranr, 2006).

3. Tanin

Tanin secara umum didefinisikan sebagai senyawa polifenol yang

memiliki berat molekul cukup tinggi (lebih dari 1000 µg/mL) dan dapat

23

membentuk kompleks dengan protein. Berdasarkan strukturnya, tanin

dibedakan menjadi dua kelas yaitu taninterkondensasi (condensed

tannins) dan tanin-terhidrolisiskan (hydrolysable tannins). Tanin-

terhidrolisiskan merupakan derivat dari asam galat (1) yang teresterkan.

Berdasarkan strukturnya, tanin ini dibedakan menjadi dua kelas yaitu,

gallotanin danellagitanin.Perbedaan struktur keduanya adalah adanya

ester asam galat (1) pada gallotanin dan ester asam heksahidroksidifenat

(HHDP) (2) pada ellagitanin.Kedua ester asam tersebut berikatan dengan

glukosa. Ellagitanin yang dihidrolisis akan menghasilkan asam elagat (3)

(Harbone, 1996). Oksidasi perangkaian (oxidative coupling) pada gugus

galoil (4) dari gallotanin akan menghasilkan ellagitanin.Seperti halnya

dengan metabolit sekunder lainnya, sejauh ini ellagitanin diketahui tidak

memiliki fungsi yang penting bagi metabolisme tumbuhan.Justru dalam hal

fungsi morfologi dan ekologi, ellagitanin menunjukkan perannya.Lepas

dari fungsi tersebut, ellagitanin diketahui memiliki nilai tersendiri bagi

manusia, khususnya dalam dunia kesehatan (Moosophin dkk., 2010).

Aktivitas biologis dan farmakologi yang telah diketahui antara lain,

penghambatan karsinogenensis, anti-tumor, antivirus, anti-oksidasi

(peroksidasi lipida, lipoksigenase, oksidasi xanthin, dan oksidasi

monoamin), anti hipertensi, anti bakteri dan jamur, anti diabetes.Tanin

dapat menghambat pembentukan oksigen aktif yang dapat menyebabkan

oksidasi. Baik gallotanin maupun ellagitanin, merupakan senyawa anti-

oksidan yang cukup berpotensi (Moosophin dkk., 2010).

24

G. Respon Imun

Menurut Yuwono (2008), Imun atau kekebalan merupakan sistem

mekanisme pada organism yang melindungi tubuh dari pengaruh biologis

luar dengan mengidentifikasi dan membunuh pahogen serta sel tumor.

Sistem ini mendeteksi berbagai macam pengaruh biologis luar yang luas,

organisme akan melindungi tubuh dari infeksi bakteri, virus sampai cacing

parasit serta menghancurkan zat-zat asing dan memusnahkan dari sel

organisme yang sehat dan jaringan agar tetap dapat berfungsi seperti

biasa. Deteksi sistem ini sulit karena adaptasi pathogen dan memiliki cara

baru agar dapat menginfeksi organisme.

Agen asing yang terdapat dalam imunitas dapat dikenali dan dapat

memicu produksi molekul protein khusus secara umum disebut antibody.

Anti bodi merupakan senjata utama respon humoral. Reseptor sel T yang

akan mengenali agensia asing tersebut secara spesifik dan mengikatnya

molekul yang dapat diikat oleh reseptor sel T yang disebut antigen

(antibody generating surface).

Salah satu yang berperan dalam sistem imun pada ikan yaitu sel

darah, yang membawa oksigen, bahan makanan, produk eksresi melalui

tubuh pada jaringan dan organ yang berbeda. Darah disirkulasi oleh aksi

mekanis organ khusus yang disebut jantung. Darah terdiri dari sel-sel

darah dan plasma darah yang berperan dalam sel darah putih. Sel darah

putih dikenal dengan leukosit. Leukosit berbeda dengan sel lain di dalam

tubuh karena leukosit tidak berasosiasi secara ketat dengan organ atau

25

jaringan tertentu. Melainkan bekerja secara independen seperti organism

sel tunggal dan mampu bergerak secara bebas dan berinteraksi dan

menangkap serpihan seluler, partikel asing atau mikroorganisme

penyusup (Yuwono, 2008).

H. Letupan respirasi (Respiratory burst)

Bila partikel (mikroorganisme) ditelan oleh neutrofil terjadilah suatu

rangkaian peristiwa biokimiawi yang meningkatkan penghancuran partikel

dan pertama terjadi peningkatan glikolisis yang menyebabkan produksi

sejumlah besar asam laktat dalam fagolisosim.Keadaan ini membantu

menyediakan Iingkungan yang optimal bagi aktivitas enzim proteolitik

lisozom. Kedua adalah peningkatan dan “heksosa monofosfat langsir”

yang tercerinin dari peningkatan nyata konsumsi zat asam di dalam sel.

“letupan respirasi” ini mengakibatkan peningkatan pergantian nikotinamid

adenine dinukleotida fosfat tereduksi (NADPH2) Pemutaran kembali

NADPH2 dengan perantaran enzim dismufase superoksida (SOD) dan

meoliperoksidase menghasilkan pembentukan metabolit zat asam yang

sangat reaktif. Termasuk di dalamnya hydrogen peroksida, superoksida

anion (O2-), zat asam singlet (O), radikal hidroksil, kloramin dan aldehida

yang bersifat toksik bagi mikroorganisme.Pentingnya letupan respirasi ini

diperlihatkan oleh pengamatan bahwa hewan yang kekurangan dismutase

superoksida atau mieloperoksidase menderita infeksi bakteri berulang

(Tizard, dalam Rantetondok, 2002).

26

Untuk jelasnya letupan respirasi dapat dilihat pada Gambar 6 di

bawah ini: .

PRODUK YANG BAKTERISIDAL

Gambar 6. Lintas Letupan Respirasi pada Neutrofil., Katalase

Melakukan Fungsi yang Sama Seperti mieloperoksidase di

dalam Macrophage (Tizard, dalam Rantetondok, 2002).

27

I. Aktivitas Lisozim

Lisozim merupakan respon imun non-spesifik yang sangat berperan

dalam pertahanan tubuh ikan. lisozim adalah enzim yang memutuskan

ikatan β-1,4-glikosida antara asam-N-asetil glukosamin dengan asam-N-

asetil muramat pada peptidoglikan sehingga dapat merusak dinding sel

bakteri. Air kemudian dapat masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel

menggelembung dan akhirnya pecah, proses tersebut disebut dengan lisis

(Gabriel, et al., 2009). Lisozim dapat ditemukan pada sekresi hewan

termasuk air mata, saliva, dan cairan tubuh yang lainnya sebagai

mekanisme pertahanan tubuh terhadap infeksi bakteri.

Lisozim dapat membunuh bakteri apabila lingkungan tempat

bakteri tersebut tidak berada dalam keadaan isotonis yaitu konsentrasi zat

terlarut di dalam sel dan di luar sel (lingkungan) seimbang sehingga

sekalipun dinding sel bakteri pecah, air tidak akan masuk ke dalam sel

dan lisis tidak terjadi. Dalam hal ini, sel yang sudah kehilangan dinding

sel tersebut dinamakan sebagai protoplas. Keadaan isotonis tersebut

dapat dibuat dengan cara menambahkan zat terlarut seperti sukrosa pada

lingkungan sel (biasanya berupa cairan seperti air). Sebaliknya, apabila

sel berada dalam lingkungan yang hipotonis yaitu konsentrasi zat terlarut

di dalam sel lebih tinggi daripada lingkungannya, air akan berdifusi masuk

ke dalam sel dan menyebabkan sel pecah (lisis).

28

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada Februari sampai dengan Juni

2013. Ekstraksi Xanton dilakukan di Laboratorium Farmakologi Fakultas

Farmasi UNHAS, Kultur bakteri dilakukan di Balai Besar Karantina Ikan

Hasanuddin Makassar, Uji Imunologis di lakukan di Laboratorium Parasit

dan Penyakit Ikan Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan (FIKP)

Universitas Hasanuddin. Pemeliharaan Ikan Nila dan pemberian

imunostimulan serta uji tantang dilakukan di Hatchery Mini FIKP

Universitas Hasanuddin.

B. Alat dan bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini terbagi atas beberapa

bagian yaitu untuk ekstraksi menggunakan kertas saring whatman no.

40, timbangan elektrik, rotary evaporator dan erlenmeyer, untuk uji

aktifitas lysosim menggunakan plate well 96 well, mikropipet dan

microplate reader (Biored model 450), tabung reaksi, cawan petri. Untuk

uji letupan respirasi menggunakan sentrifuge merk heraeus dan

mikroplate reader (Biored model 450). Uji aktifitas fagositosis

menggunakan mikroskop, mikropipet, incubator,oven, lampu spiritus,spoit

29

(gauge hypodermic needle) haemocytometer, Sedangkan pemeliharaan

ikan nila menggunakan akuarium, toples, gelas ukur,aerator, selang aerasi

dan batu aerasi.

Sedangkan bahan yang digunakan adalah kulit buah manggis,

ethanol, akuades, Aeromonas hydrophila, Micrococcus luteus, PBS pH 7,4

ikan nila (O. niloticus) yang berukuran 10-12 cm. Nitrobule Tetrazolium

(HBSS) (Gibco) ininus phenol red, Methanol, DMSO4 (Dimethyl sulfoxide)

(SIGMA), Phenol Red Solution (PRS) (Sigma) dan Hank’s balance salt

solution yang digunakan pada uji letupan respirasi.

C. Prosedur penelitian

1. Ekstrak Kulit Buah Manggis

Pembuatan ekstrak kulit buah manggis dilakukan dengan

menggunakan metode maserasi. Bagian kulit yang diambil adalah bagian

kulit terluar, kemudian kulit buah dicuci hingga bersih lalu dikeringkan

dengan suhu ruangan dan bantuan cahaya matahari selanjutnya

dihaluskan dengan menggunakan blender dan diayak dengan saringan

hingga didapatkan bubuk halus berupa tepung.

a. Ekstraksi Etanol (Doughari 2006)

Metode ini berdasarkan pada penelitian Doughari (2006). Sampel

yang sudah digiling, kemudian ditimbang sebanyak ± 100 g. Setelah itu,

sampel diekstraksi secara maserasi dengan etanol 70%, lalu disaring dan

dipekatkan dengan rotary evaporator sampai diperoleh residu kering

30

(ekstrak etanol). Ekstrak ditimbang dan dihitung rendemennya dengan

persamaan sebagai berikut.

Rendemen ekstrak = �

� x 100% x fk

Keterangan:

a = bobot ekstrak (g)

b = bobot contoh awal (g)

fk = faktor koreksi = (1-kadar air)

b. Uji Fitokimia (Harborne 1987)

Ekstrak yang telah diperoleh kemudian dilakukan uji kualitatif

kandungan senyawa (uji fitokimia), seperti,alkoloid, flavonoid, saponin,

steroid dan β-glucan dengan menggunakan metode Harbonne (1987).

c. Uji Flavonoid

Sebanyak 1 ml ekstrak dilarutkan dalam 1-2 ml methanol 50% dan

dipanaskan pada suhu 500C kemudian didinginkan dan ditambahkan

logam Mg ke dalam tabung reaksi bertutup, Kenudian ditambahkan 4-5

tetes larutan HCl pekat. Adanya Flavonoid ditunjukkan dengan perubahan

warna merah, kuning atau jingga.

31

d. Uji Toksisitas terhadap ikan Nila (Meyer dkk. 1982)

Uji toksisitas dengan menentukan nilai konsentrasi dilakukan untuk

menentukan konsentrasi ambang untuk pengujian in vitro. Uji toksisitas

ekstrak dilakukan dengan menggunakan benih ikan nila ukuran 11-12 cm

sebanyak 5 ekor per wadah dimasukkan ke dalam toples yang berisi air

tawar yang sudah disterilkan dan dilengkapi aerator kemudian diberi

ekstrak dengan dosis 2,5 ppm, 2,10 ppm dan 2,15 ppm dan akan diamati

selama 24 jam, jumlah hewan uji yang mati dihitung.

2. Populasi Bakteri

Populasi bakteri Aeromonas hidrophyla dihitung dengan

menggunakan metode Mac Farland. Isolat dikultur pada media broth

selama 24 jam sebanyak 10 mL, selanjutnya dikultur pada media 100 mL

dan 1 L. bakteri dipanen dan disentrifus sebanyak dua kali dengan

penambahan PBS sebanyak 10 mL. Hasil panen bakteri diambil 1 mL,

diukur absorbansinya pada spektrofotometer dan selanjutnya diukur

dengan metode Mac-Farland. Populasi bakteri Aeromonas hydrofila

adalah 106 cfu/mL.

3. Hewan uji dan Pemberian Imunostimulan

Ikan yang digunakan adalah ikan nila dengan ukuran ± 10–12 cm

yang diperoleh dari Hatchery Mini Fakultas ilmu Kelautan Universitas

Hsanuddin dan dipelihara dalam akuarium ukuran 30 x 30 x 30 dengan

32

kepadatan 10 ekor/bak. Aklimatisasi dilakukan selama 1 minggu dan

penggantian/penambahan air sebanyak 10-25% total volume.

Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah

rancangan acak lengkap (RAL) dengan dosis penambahan berupa

Xantone dan ekstrak kulit buah manggis. Penelitian ini menggunakan 4

unit percobaan dengan 3 kali ulangan yaitu:

(A) : Kontrol (Larutan Fisiologis 0,85%)

(B) : 2,5 ppm/ekor

(C) : 2,10 ppm/ekor, dan

(D) :2,15 ppm / ekor

Penyuntikan imunostimulan berupa Xanton diekstrak dari kulit buah

manggis dengan konsentrasi larutan 2:1 (Ekstrak Xantone dan

aquadest/miliQ), penyuntikan ikan uji menggunakan spoit syringe

berukuran 1 ml dilakukan secara intramuscular. Masa pemeliharaan

setelah pemberian imunostimulan 96 jam dengan pengacakan unit-unit

percobaan.

Adapun penempatan wadah penelitian adalah sebagai berikut:

Gambar. 7. Penempatan wadah penelitian setelah pemberian

imunostimulan (3 Ulangan)

D2 C3 D1 B1

A2 B3 B2 A1

C2 D3 A3 C1

33

(A) : Kontrol (Larutan Fisiologis 0,85%)

(B) : 2,5 ppm/ekor

(C) : 2,10 ppm/ekor, dan

(D) : 2,15 ppm/ekor

4. Uji Tantang

Uji tantang dilakukan untuk melihat ketahanan terhadap bakteri

setelah pemberian imunostimulan ekstrak kulit buah manggis selama 96

jam dengan kontak Iangsung antar individu dan ikan uji. Adapun prosedur

yang akan dilakukan adalah sebagai berikut:

a. Uji tantang dengan Aeromonas hydrophila dilakukan setelah

pemeliharaan ikan selama 96 jam (±4 hari);

b. Ikan yang diuji tantang dipelihara di hatchery mini Fakultas Ilmu

Kelautan dan Perikanan Universitas Hasanuddin masing-masing

sebanyak 10 ekor ikan tiap ulangan;

c. Selanjutnya ikan dimasukkan ke dalam akuarium dan dilakukan

penginfeksian dengan Aeromonas hydrophila melalui pemaparan.

d. Setelah pemaparan dengan Aeromonas hydrophila dilakukan

pemeliharaan ikan suhu dibawah 30°C (suhu optimum untuk

perkembangbiakan bakteri Aeromonas hydrophila) selama 96 jam.

e. Selama pemeliharaan ikan di akuarium dilakukan pengamatan

tingkah laku ikan dan gejala klinis, penghitungan parameter darah

setelah uji tantang, dan RPS (Relative Percent Survival);

f. Penempatan wadah penelitian dengan menggunakan Akuarium

sebanyak 12 unit adalah sebagai berikut:

34

Gambar 8. Penempatan wadah penelitian setelah uji tantang

D. Peubah yang diamati

Indikator yang digunakan untuk menguji efektifitas imunostimulan

adalah aktivitas bakterisidal menurut Rantetondok (2002), aktivitas letupan

respirasi, aktivitas fagositosis, aktifitas lysozim dan survival rate setelah uji

tantang menurut Song dkk. dalam Rantetondok (2002).

1. Aktivitas letupan respirasi

Untuk mengukur intensitas “Letupan respirasi” dilakukan

pengukuran anion superoksida (O2-) karena anion superoksida adalah

produk utama yang dilepaskan dan letupan respirasi. Adapun prosedur

yang dilakukan adalah :

1. Darah ikan yang akan diambil yaitu pada pangkal ekor sebanyak 1

ml dengan menggunakan gouge hypoderinic needle srying volume 2

ml yang berisi antikoagulant (0,01 Mtris Had, 0,25 M sucrose, 0,1 M

Sodium citrat, pH 7,6)

2. Darah ikan disentrifugasi pada kecepatan 300 rpm selama 10 menit.

D2 C3 D1 B1

A2 B3 B2 A1

C2 D3 A3 C1

35

3. Resultant pellet leukosit diresuspensi pada 107 sell/ml dalam MCHBSS

(10 mM CaCl2, 3 mM mgCl2, 5 mM MgS04, 24 mg HBSS),

4. 100 µL leukosit suspensi ditambahkan ke dalam tiap well (106

leukosit/well), kemudian disimpan dalam incubator shaker selama 1

jam pada suhu kamar yang dikocok secara terus menerus

menggunakan shaker.

5. Sesudah supernatan dikeluarkan 100 µL MCHBSS ditambahkan dan

leukosit distain dengan fenol red selama 30 menit pada suhu kamar.

6. Ditambahkan metanol absolute dan dicuci dengan metanol 70%

sebanyak 3 kali.

7. Leukosit dikeringkan dan dicuci dengan larutan H2SO4 2,5 N sebanyak

2 µL dan 140 µL DMSO4 untuk melarutkan cytoplasinic formazan.

8. Diletakkan di atas microplate reader OD(Optical Density) 450 nm

9. Untuk memperoleh nilai n mol O2-/ 106 sel hasil pembacaan OD(Optical

Density) dikali dengan 15.87( faktor koreksi) darah yang dikumpulkan

dari ikan uji secara individual.

10. Untuk melihat pengaruh dan imunostimulan, di tera di atas mikroplate

reader nilainya dibandingkan dengan kontrol dan dianalisa data

menggunakan RAL.

2. Uji Aktifitas Fagositosis

Untuk melakukan pengukuran darah pada ikan nila , kapiler

hematokrit dipotong pada batas antara eritrosit dan leukosit. Bagian

leukosit ditampung pada tabung effendorf. Leukosit sebanyak 100 µl

36

dimasukkan pada microplate well, kemudian ditambah dengan Aeromonas

hydrophila (kepadatan 105 sel/ml) dengan volume yang sama. Leukosit

dengan Aeromonas hydrophila dicampur dengan cara pipeting, kemudian

diinkubasi selama 20 menit. Selanjutnya 5 µl sampel dan mikroplate well

diletakkan diatas obyek glas dan dibuat preparat ulas dan di diamkan

hingga kering angin. Fiksasi dengan ethanol/methanol absolut selama 5

menit dan dikeringkan selanjutnya diwarnai dengan safranin (0,15%) atau

Giemsa (7%) selama 10 menit dan diamati dibawah mikroskop dengan

pembesaran 1000 X. Aktifitas fagositosis dinyatakan dengan jumlah sel

yang memfagosit bakteri/100 sel fagosit yang diamati dikali 100% (Wagner

dan Jurcic, dalam Wulansari, 2009).

Preparat hapus dari masing-masing perlakuan diamati dibawah

mikroskop dan dihitung aktivitas fagositosis (SFA) yaitu, jumlah sel yang

aktif memfagosit sel bakteri dalam 100 sel fagositosis yang dinyatakan

dalam persen (Wagner dan Jurcic dalam Wulansari (2009).

Aktifitas fagositosis = �����������������������

��������������������x 100%

3. Aktivitas Lisosim

Pengukuran lisis dan dinding sel bakteri akan digunakan

spektrofotometer dengan metode turbidimetri mengikuti petunjuk Ellis

(1996). Adapun prosedur yang dilakukan adalah :

37

1. Menyiapkan micrococcus luteus yang telah ditumbuhkan selama 1 x 24

jam dalam inkubator.

2. Mengambil darah sampel dan kontrol.

3. Memasukkan dalam plate well

a. 1940 µl (2 x 970 µl) larutan micrococcus luteus + 60 µl PBS 7,4

buffer (kontrol positif)

b. 1940 µl (2 x 970 µl) larutan micrococcus Iuteus + 60 µl darah pada

sampel perilakuan

c. 1940 µl (2 x 970 µl) larutan micrococcus luteus menambahkan 60

µl darah pada sampel kontrol

d. 2000 µl kontrol dissolved water (aquadest solution). Perhitungan

nilai lisosim menggunakan regresi linier sederhana (Gaspersz,

1991).

e. Hasil pembacaan pada Bioo Microplate Reader dianalisis

menggunakan persamaan regresi. Enzim unit (EU) merupakan

jumlah enzim yang menyebabkan penurunan absorbansi

0,001/menit. Cara menghitung aktivitas lisozim, yakni :

Aktivitas Lisozim (EU/mL) = (OD awal – OD akhir) x 1000 = A menit

= A A Volume darah (mL)

38

4. Tingkat Kelangsungan Hidup

Tingkat kelangsungan hidup dihitung dengan menggunakan

rumus:

SR= ��

��X 100%

Keterangan:

SR = survival rate (%)

Nt = jumlah ikan pada waktu t (ekor)

No = jumlah ikan pada awal (ekor)

E. Kualitas Air

Sebagai data penunjang dilakukan pula pengukuran beberapa

parameter kualitas air dalam penelitian ini seperti suhu, pH, oksigen

terlarut dan amoniak. Untuk suhu dan pH dilakukan setiap hari

sedangkan oksigen dan amoniak dilakukan pada pertengahan dan akhir

penelitian.

F. Analisis Data

Untuk melihat pengaruh perlakuan data dianalisis dengan

menggunakan sidik ragam (ANOVA) Jika perlakuan berpengaruh nyata

dilanjutkan dengan Uji W-Tukey dengan menggunakan program

SPSS 16.

39

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Aktifitas Letupan Respirasi

Tabel 1. Rata-rata nilai aktifitas letupan respirasi

Perlakuan Rata-rata letupan respirasi (N mol O2-/106 sel)

A 0,5396 ± 0,1474a

B 2,0102 ± 0,9005a

C 3,7242 ± 0,2550b

D 2,6027 ± 0,7222ab

Keterangan : Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan perbedaan

pengaruh antar perlakuan pada taraf 0,01 (P<0,01)

Rata-rata letupan respirasi (N mol O2-/106 sel darah/ml) pada

perlakuan B 2,0102 N mol O2-/106 sel , perlakuan C 3,7242 N mol O2

-/106

sel dan perlakuan D 2,6027 N mol O2-/106 sel sedangkan nilai rata-rata

letupan respirasi pada kontrol (perlakuan A) adalah 0,5396 N mol O2-/106

sel . Nilai rata-rata letupan respirasi tersebut menunjukkan bahwa setiap

perlakuan pada penelitian yang diperoleh pada uji sampel darah yang

diberi xanton yang diekstrak dari kulit manggis seperti yang terlihat pada

analisis sidik ragam menunjukkan bahwa pemberian xanton memberikan

pengaruh terhadap letupan respirasi dari hematokrit ikan nila.

40

Uji jarak berganda Tukey (Lampiran 3) menunjukkan kontrol

(perlakuan A) tidak berbeda nyata dengan perlakuan B (2,5 ppm) tetapi

berbeda nyata dengan perlakuan C (2,10 ppm). Perlakuan B dengan

perlakuan C juga berbeda nyata tetapi tidak berbeda nyata dengan

perlakuan D (2,15 ppm). Perbedaan ini disebabkan adanya ekstrak xanton

pada perlakuan dimana ekstrak kulit manggis ini memiliki kemampuan

untuk menghambat poliferase sel bakteri karena mengandung senyawa

antioksidan berupa xanton (Soosean, 2010), sejalan dengan pendapat

Gopalakrishan dkk (1997) bahwa tanaman yang mengandung produk

seperti D-limone, Ugenol, hinokinol, Citral andally-isothiocyanate, xanton

memiliki aktifitas antimikroba dan imunostimulan.

Letupan respirasi merupakan lintasan metabolik yang tidak nampak

pada sel dalam keadaan tenang karena dimaksudkan untuk menghasilkan

substansi yang sangat mematikan bakteri dengan cara reduksi oksigen

secara partial. Letupan respirasi timbul pada setiap gangguan membran

sel macrophage dan tidak tergantung pada proses fagositosis. Hal ini

dibuktikan dengan memberikan zat yang larut termasuk imun kompleks

dapat terjadi letupan respirasi tanpa adanya fagositosis (Subowo, 2007).

Pada letupan respirasi dilakukan pengukuran anion superoksida (O2-)

karena anion superoksida adalah produk utama yang dilepaskan dari

letupan respirasi.

41

Rata-rata letupan respirasi dalam bentuk histogram seperti terlihat

pada gambar 9 dibawah ini :

Gambar 9. Histogram Letupan respirasi setiap perlakuan dengan

pemberian xanton yang diekstak dari kulit buah manggis (A

(kontrol), B (2,5 ppm), C (2,10 ppm), D (2,15 ppm))

Perlakuan memberikan pengaruh terhadap letupan respirasi pada

sampel darah ikan nila. Nilai letupan respirasi ini memperkuat nilai uji

tantang dengan bakteri Aeromonas hydrophila dimana penggunaan

ekstrak xanton sebesar 2,10 ppm juga memperlihatkan tingkat

kelangsungan hidup yang tinggi.

Sebagaimana yang dijelaskan oleh Noguchi dan Niki (1999) bahwa

oksigen esensial dapat berubah menjadi molekul yang memiliki toksisitas

yang tinggi. Satu dari kebanyakan senyawa reaktif adalah superoksida

0,0000

0,5000

1,0000

1,5000

2,0000

2,5000

3,0000

3,5000

4,0000

4,5000

kontrol Xanton (2,5 ppm) Xanton (2,10 ppm) Xanton (2,15 ppm)

Letu

pan

Re

spir

asi

(N

mo

l O2

- /1

06 s

el)

Perlakuan

C

B

D

B

A AB

A

42

anion (O2-) yang merupakan radikal bebas. Radikal bebas adalah atom

atau molekul yang mengandung elektron yang tidak berpasangan pada

orbit luarnya. Molekul terdiri atas atom dengan elektron yang berpasangan

pada kulit terluarnya, sedangkan radikal bebas umumnya merusak

molekul lain terutama molekul pada sel.

Nitrogen oksida adalah molekul yang penting dan mempengaruhi

ststem kardiovaskuler, NO merupakan senyawa yang besifat toksik dan

berumur pendek, berupa molekul gas yang diproduksi oleh enzim NO

sintase dengan cara mengubah asam amino arginin menjadi NO dan

sitrulin (Becker, dkk 2000). Molekul ini diproduksi oleh neuron dan

macrofage, memiliki jumlah electron ganjil dan sebahai radikal bebas.

Molekul ini relatif stabil namun berekasi cepat bila bertemu dengan

senyawa yang mengandung elektron yang tidak berpasangan.

Radikal bebas diproduksi secara normal pada fungsi imunitas,

diperlukan oleh sel imun untuk membunuh patogen dan

mengeluarkannya, dalam keadaan over produksi pada kondisi patogenik

menyebabkan kerusakan sel imun dan menimbulkan imunosupresi.

Dibutuhkan keseimbangan oksidan-antioksidan untuk mengatur fungsi

sistem imun dalam menjaga integritas dan fungsi lipida membran, protein

seluler, asam nukleat serta mengatur ekspresi gen (Wu dan Medani

1999).

Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan adanya kemampuan

ekstrak kulit buah manggis yang menghambat poliferase sel bakteri

43

karena mengandung senyawa antioksidan berupa xanton. Sebagaimana

pendapat Zoosean (2010) bahwa xanton merupakan salah satu bahan

aktif dari Garcinia mangostana yang berperan dalam meningkatkan

system pertahanan tubuh terhadap serangan mikroorganisme melalui

sustem yang kompleks.

Antioksidan adalah senyawa kimia yang memiliki kemampuan

untuk memberikan hydrogen radikal. Sebagai akibatnya senyawa tersebut

mampu mengubah sifat radikal menjadi non radikal dan terjadi perubahan

non oksidasi radikal oleh antioksidan. Struktur molekul antioksidan bukan

hanya memiliki kemampuan melepas atom hidrogen tetapi juga mengubah

radikal menjadi reaksi aktifitas rendah sehingga tidak terjadi reaksi dengan

lemak. Antioksidan terdiri atas antioksidan endogen yang dihasilkan oleh

tubuh sendiri dan antioksidan eksogen yang berasal dari luar

(imunostimulan) (Jadav dkk., 1996; Manampiring dkk., 2000).

Tingginya nilai absorbansi mengindikasikan tingginya konsentrasi

oksigen peroksida yang merupakan unsur penting bagi kehidupan

organisme.

44

B. Aktifitas Fagositosis

Tabel 2. Rata-rata nilai sel fagositosis dengan pemberian xanton yang

diekstrak dari Kulit manggis (Garcinia mangostana)

Perlakuan Aktifitas fagositosis (%)

A 10,3407 ± 0,7811a

B 39,8140 ± 6,2598b

C 90.6343 ± 1,5062c

D 47,1477 ± 2,7417b

Keterangan : Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan perbedaan

pengaruh antar perlakuan pada taraf 0,01 (P<0,01)

Berdasarkan persentase nilai jumlah sel yang memfagositosis

maka didapatkan persentase jumlah sel yang memfagosit dari dua

sumuran (duplo) dan dihitung rata-ratanya terlihat bahwa persentase sel

macrophage yang aktif Nampak adanya perbedaan yang nyata antara

setiap kelompok yang diberi imunostimulan dengan kelompok tanpa

pemberian imunostimulan (Kontrol). Hasil tertinggi didapatkan pada sel

darah ikan nila yang diberi dosis 2,10 ppm yaitu 90,6343% dibandingkan

dengan kontrol yang hanya 10,3407%.

Berdasarkan hasil analisis ragam perlakuan yang diberikan

berpengaruh nyata terhadap aktifitas fagositosis (P<0,05) dan

berdasarkan uji lanjut W-tukey didapatkan bahwa perlakuan A (Kontrol)

berbeda dengan perlakuan B (2,5 ppm), C (2,10 ppm) dan D (2,15 ppm),

tetapi antar perlakuan B dan perlakuan D tidak berbeda nyata. Hal ini

45

menandakan aktifitas fagositosis pada ikan uji berbeda dengan ikan yang

tidak diberi bahan uji berupa xanton. (Lampiran 4). Aktifitas fagositosis ini

menyebabkan ikan uji memiliki kemampuan yang tinggi untuk melawan

penyakit yang disebabkan oleh A. hydrophyla.

Fagositosis adalah suatu proses aktif yang dimulai dengan engulf

patogen oleh sel macrofage, kemudian patogen akan dimasukkan

kedalam fagosome yang akan mengalami reaksi oksidase-reduksi

sehingga derajat keasamannya meningkat. Selain fagosome di dalam

macrofage juga terdapat lysosom yang berisi lebih dari 50 macam enzim

yang berfungsi untuk mencerna zat-zat yang masuk kedalamnya. Enzim

yang paling khas di dalam lysozom yaitu acid phosphatase. Makrofage

yang teraktifasi mempunyai jumlah lysozom yang meningkat dan

menghasilkan serta melepaskan interleukin-1 yang sangat berperan

dalam proses inflamasi. Selanjutnya macrofage akan mempresentasikan

antigen kepada sel limfosit T sebagai awal Antigen Presenting Cells dan

ini merupakan awal respon imun spesifik (Raa, 1992).

Aktifitas fagositosis macrophage merupakan suatu fenomena yang

kompleks dan dipengaruhi oleh macrophage activating factor (MAF) akan

merangsang transkripsi berbagai gen yang menyandi berbagai protein

yang diperlukan untuk aktifasi macrophage. Oleh karena itu aktifitas

macrophage akan meningkat setelah pemberian imunostimulan berupa

xanton yang diekstrak dari kulit manggis dan mengandung zat yang dapat

berperan sebagai macrophage activating factor . Makrophage mempunyai

46

masa hidup yang lebih lama daripada sel fagosit granulositik dan tetap

dapat bekerja pada pH yang rendah, Makrophage terlihat pada Gambar

10 dibawah ini.

Gambar 10. Macrophage yang terfagosit (Pewarnaan Safranin,

Pembesaran 1000x)

Makrophage dapat mengenali adanya phatogen karena adanya

reseptor permukaan yang dapat membedakan antara patogen dan sel

inang. Reseptor permukaan yang dapat ditemukan pada sel macrophage

yaitu scavenger reseptor yang dapat mengikat lipoteichoid acids yang

merupakan komponen dinding bakteri gram positif, mannose receptors

dan glucan receptor yang dapat berikatan dengan komponen karbohidrat

dari bakteri, dan toll-like reseptor yang dapat mengenali komponen-

komponen yang terdapat pada mikroorganisme.

47

Gambar 11. Histogram nilai rata-rata aktifitas fagositosis dengan

pemberian xanton yang diekstrak dari kulit manggis. (A

(kontrol), B (2,5 ppm), C (2,10 ppm), D (2,15 ppm))

Aktifitas fagositosis ditandai dengan tehnik pewarnaan bakteri yang

terfagosit dalam neutrophil. Dalam pewarnaan antara sel yang aktif dan

yang tidak aktif akan terwarnai. Nilai aktifitas fagositosis merupakan salah

satu indikator untuk menentukan patogenitas bakteri yang difagosit.

(Wulansari, 2009) (Gambar 11). Semakin rendah nilai aktifitas fagositosis

maka semakin patogen bakteri tersebut. Dalam penelitian yang dilakukan,

aktifitas fagositosis terendah terjadi pada perlakuan kontrol dimana tidak

diberikan ekstrak xanton tetapi diberikan larutan fisiologis. Hal ini sejalan

dengan Salasia (1998) dalam penelitiannya membuktikan bahwa bakteri

patogen dan non patogen dapat difagosit oleh neutrophil, namun bakteri

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

kontrol Xanton (2,5 ppm) Xanton (2,10 ppm) Xanton (2,15 ppm)

Akt

ifit

as f

ago

sito

sis

(%)

Perlakuan

A

A

B

AB

48

patogen difagosit dalam jumlah yang lebih sedikit bila dibandingkan

dengan bakteri non patogen.

Proses fagositosis diawali oleh pergerakan (kemotaktik), pelekatan

(adhesi/attachment), penelanan (ingestion), degranulasi dan pembunuhan

(killing). Inisiasi pergerakan karena dilepaskannya zat mediator tertentu

yaitu factor leukotaktik/kemotaktik dari antigen/neutrophil/makrofag

sebelumnya telah berada di lokasi antigen. Proses penempelan hingga

penghancuran terlihat dilakukan oleh sel-sel fagosit seperti monosit dan

neutrophil. Proses penelanan bakteri terjadi karena sel fagosit membentuk

tonjolan pseudopodia, membentuk kantong yang mengelilingi bakteri

sebingga terperangkap dalam vakuola fagosom, dalam sel fagosit ini,

bakteri akan didegradasi oleh fagolisosom (Bratawijaya, 2002)

C. Aktifitas lisozim

Hasil regresi linier (Gambar 12) menunjukkan bahwa optical

density lisozim pada ikan uji yang mendapat perlakuan dengan ekstrak

kulit buah manggis memperoleh nilai R2 yang lebih tinggi dibandingkan

kontrol. Nilai R2 tertinggi pada perlakuan D (2,15 ppm), diikuti oleh

perlakuan B (2,5 ppm), perlakuan C (2,10 ppm) dan terendah pada

kontrol. Hasil perhitungan aktivitas lisozim dapat dilihat pada Lampiran 7.

49

Gambar 12. Grafik linier OD lisozim terhadap masing-masing

perlakuan

(A (kontrol), B (2,5 ppm), C (2,10 ppm), D (2,15 ppm))

Berdasarkan hasil analisis ragam, perlakuan yang diberikan

berpengaruh nyata terhadap aktivitas lisozim (P<0.05) dan hasil uji lanjut

W-Tukey menunjukkan bahwa perlakuan A (kontrol) berbeda nyata

terhadap perlakuan B (2,5 ppm) , terhadap perlakuan C (2,10 ppm) dan

perlakuan D (2,15 ppm) (Lampiran 8). Aktivitas lisozim ini menyebabkan

ikan uji mempunyai kemampuan yang tinggi untuk melawan penyakit yang

disebabkan infeksi A. hydrophila. Perbedaan aktivitas lisozim pada ikan

dapat bervariasi sesuai dengan umur, strain genetik, fisiologis, infeksi

50

patogen yang berbeda dan lingkungan yang berbeda (Saurabh dkk.,

2008).

Tabel 3. Aktivitas lisozim ikan nila setelah uji tantang

Perlakuan Aktifitas lisozym (mg/mL)

A 21,115 ± 0,08532a

B 120,796 ± 0,02572b

C 153,333 ± 0,05536c

D 135,369 ± 0,13336d

Keterangan: Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan hasil yang

berbeda nyata (p<0.05).

Ellis (1990) mengemukakan lisosim adalah enzim yang mempunyai

aktivitas anti bakteri yang bertindak sebagai hidrolase dengan merusak

ikatan β (1-4) pada lapisan peptidoglikan pada dinding sel bakteri. Bakteri

dihancurkan baik secara langsung ataupun diopsonisasi melalui

fagositosis. Pada saat itulah lisozim pada darah ikan akan bersifat anti

bakteri yang berarti unsur kekebalan telah diaktifkan. Ini menunjukkan

senyawa-senyawa anti mikroba pada xanton kulit manggis dapat

meningkatkan mekanisme macrofage sehingga mekanisme

fagositosisnya meningkat yang pada akhirnya sistem pertahanan tubuh

akan naik melalui peningkatan enzim lisozim. Selain memberikan

pengaruh langsung sebagai antibakteri lisozim juga dilaporkan dapat

meningkatkan fagositosis (Engstad dkk, 1992).

51

Irianto (2003) melaporkan penggunaan probiotik sebagai

suplemen pakan hewan aquatik menunjukkan adanya aktivitas

imnostimulasi, paling tidak terlihat dari aktivitas lisosim. Hal ini terlihat dari

hasil penelitian pemberian probiotik A3-51 yang dicampur pada pakan

ikan rainbow trout dapat meningkatkan aktivitas lisosim.

D. Sintasan (%)

Berdasarkan uji lanjut W-Tukey (Lampiran 5) sintasan ikan nila

tertinggi pada perlakuan C (2,10 ppm), tetapi tidak berbeda dengan

perlakuan D (2,15 ppm), namun berbeda dengan perlakuan A (kontrol)

dan perlakuan B (2,5 ppm). Perlakuan A (kontrol) berbeda terhadap

perlakuan C (2,10 ppm), tetapi tidak berbeda dengan perlakuan B (2,5

ppm), dan perlakuan D (2,15 ppm). Perlakuan B (2,5 ppm) berbeda

terhadap seluruh perlakuan C tetapi tidak berbeda dengan perlakuan A

dan D. Perlakuan C tidak berbeda dengan perlakuan B dan D , tetapi

berbeda tehadap perlakuan A (kontrol).

Data sintasan (%) ikan nila yang telah diberi perlakuan konsentrasi

ekstrak xanton setelah diuji tantang dengan bakteri A. hydrophila pada

akhir pengamatan, disajikan pada Lampiran 3 dan Gambar 13.

52

Gambar 13. Sintasan ikan nila setelah uji tantang dengan A. hydrophila

pada akhir pengamatan ( A (kontrol), B (2,15 ppm), C (2,10

ppm), dan D (2,15 ppm))

Hasil analisis ragam (ANOVA) menunjukkan pengaruh konsentrasi

ekstrak xanton terhadap A. hydropila yang menginfeksi ikan nila

berpengaruh nyata (P<0.05) terhadap sintasan ikan nila (Lampiran 2).

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak xanton pada kulit

manggis mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen A.

hydrophyla yang ditandai dengan tingginya sintasan ikan nila pada

perlakuan dengan pemberian ekstrak xanton dibanding dengan kontrol.

Tingginya sintasan ikan nila dengan pemberian ekstrak xanton berkaitan

dengan kemampuan xanton yang memiliki aktivitas farmakologi sebagai

immmunomodulator, anti bakteri, antifungi, antiinflamasi, antileukemia,

antiagregasi platelet. Selain itu xanton juga dapat menstimulasi sistem

saraf pusat dan memiliki aktivitas antituberkulosis secara in-vitro pada

bakteri Mycobacterium tuberculosis (Bruneton, 1999). Xanton jenis

0

20

40

60

80

100

120

kontrol Xanton (2,5 ppm) Xanton (2,10 ppm) Xanton (2,15 ppm)

Tin

gka

t K

ela

ngs

un

gan

Hid

up

(%)

Perlakuan

A A

B AB

53

gentisin dan mangiferin memiliki aktivitas sebagai antitumor dan inhibitor

monoamin oksidase (Robinson, 1995).

Beberapa penelitian mengenai pemanfaatan ekstrak xanton

menunjukkan adanya pengaruh terhadap pertumbuhan dan sintasan baik

ikan maupun udang.

E. Parameter Kualitas Air

Pengamatan parameter kualitas air dilakukann setiap hari (pagi dan

sore hari) selama penelitian, kecuali amoniak pada awal dan akhir

penelitian (Lampiran 9). Suhu berkisar antara 29 – 30 0C, pH 7,19 –

7,25. Kandungan amoniak pada awal penelitian dan akhir penelitian

berkisar antara 0,001 – 0,091 ppm. Nilai parameter kualitas air masih

layak untuk kondisi lingkungan budidaya ikan nila.

Amri dan Khairuman (2003) menjelaskan suhu yang ideal bagi

kehidupan ikan nila adalah berkisar 27 – 30o C, pH berkisar antara 7,0 –

8,0. Sedangkan Arie, U (2000) parameter kualitas air yang cocok untuk

pertumbuhan ikan nila antara lain suhu 27 – 29o C, pH 7 – 8, oksigen

terlarut diatas 4 ppm dan kandungan amoniak dan nitrit < 0,1 ppm.

54

BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian, analisis data serta pembahasan yang

telah diuraikan dapat diambil kesimpulan bahwa :

1. Pemberian Xanton yang diekstrak dari kulit manggis dapat

meningkatkan respon imun yaitu aktifitas letupan respirasi, aktifitas

fagositosis dan aktifitas lysozim pada ikan nila sebagai hewan uji.

2. Dosis Xanton yang paling baik dan dapat merespon sistem imun

pada ikan nila adalah 2,10 ppm/ekor ikan.

B. Saran

Diharapkan pada penelitian selanjutnya perlu dilakukan kajian lebih

lanjut mengenai zat aktif xanton yang dapat meningkatkan sistem imun

serta mekanisme pemberian xanton melalui oral atau perendaman.

55

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2005. Teknologi Tepat Guna Warintek-Menteri Negara Riset dan Teknologi.

Anderson D.P. 1992. Immunostimulants, Adjuvants And Vaccine Carriers In Fish: Application To Aquaculture. Annual Rev Of Fish Diseases. 2:281-307.

Amri, K dan Khairuman. 2003. Budidaya Ikan Nila Secara Intensif. Agro Media Pustaka. Jakarta.

Appler , A. NH. 1985. Evaluation of Hydrodictyon reticulatum as a protein source for Oreochromis nilotica and Tilapia zillii. J Fish Biol 1985; 27: 327-333.

Arie, U. 2000. Pembenihan dan Pembesaran Nila GIFT. Penebar Swadaya. Jakarta.

Austin, B., & Austin, A. 1999. Bacterial Fish Pathogen . Desease of Formed anf wild Fish. John Wiley and Sons. New York. p457.

Boyd, C.E., 1990. Water Quality in Pounds For Aquaculture. Albama: Birmingham Publishing. p496.

Bratawijaya, K.G. 2002. Imunologi Dasar. Edisi Kelima. Balai Penerbit FK-UI. Jakarta. 457 hal.

Bruneton J. 1999. Pharmacognosy : Phytochemistry Medical Plants. Ed 2nd . Paris : Intercept Ltd. p 297-301.

Chen X. S. 1966. Active Constituent Against HIV-I Protease from Garcinia Mangostana L. Planta Med. 62 (3) pp 381-382.

Ellis, A.E. 1990. Lysozyme Assays. Techniques in Fish Immunology (eds). SOS Publ, 43 DeNormandie Ave, Fair Haven, NJ, USA Fish Immunology Technical Communication. 1:101-103

Engstad, R.E, Robertson B., and Frifold E. 1992. Yeast Glucan Induced Increase in Lysozyme and Complement-Mediated Haemolytic Activity in Atlantic Salmon Blood. Fish and Shelfish Immunology, 2:287-297.

56

Feliatra, Efendi, I, Suryadi, S. 2004. Isolasi dan identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan Kerapu macan (Ephinephelus fuscoguttatus) dala Upaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal Nature Indonesia 6(2): 75-80.

Gasperz, V. 1991. Metode Perancangan Percobaan: Untuk ilmu-ilmu Pertanian. Ilmu-ilmu Teknik dan Biologi. Penerbit CV. Armico Bandung 472p.

Gabriel, B. 2009. Wastewater Microbiology 3rd edition. John Wiley & Sons Inc. New Jersey.

Gatesoupe, FJ. 1999. The Use of Probiotics in Aquaculture. Aquaculture 180:147-165.

Gopalakrishnan,G, B. Banumathi and G. Suresh. 1997. Evaluation of the antifungal activity of natural xanthones from Garcinia mangostana and their synthetic derivatives. Journal of Natural Products 60(5): 519-524.

Harvey A. 2000. Strategies for discovering drugs from previously unexplored natural products. Drugs Discovery Trends 5 (7): 294-300.

Harbonne. 1987. Metode Fitokimia . ITB : Bandung

Heyne, K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia III. Penerjemah : Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan. Yayasan Sarana Wahajaya. Jakarta. pp 1385 –1386 .

Irianto, A. 2003. Probiotik Aquakultur. Gadjah Mada University Press. 125 hal.

Irianto. A. 2005. Patologi Ikan Teleostei. Gadjah Mada University Press. 256 hal.

Jankauskiene, R. 2002. Bacterial Flora of Fishes from Aquaculture: The Genus Lactobacillus. Institute of Ecology Akademijos 2, Vilnius 2600. Lithuania.

Khairul, A, Khairuman, dan S. Judantari. 2008. Pospek Bisnis dan Tehnik Budidaya Nila Unggul Nila Nirwana. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Lannang, A.M., Komguem, J., Ngninzeko, F.N., Tangmouo, J.G., Lontsiji, D., Ajaz, A., Choudhary, M.I., Ranjit, R., Devkota, K.P., Sodengam, B.L. 2005. Bangang xanthone A and B, two

57

xanthones from the Stem bark of Garcinia poliantha Oliv., Phytochemistry, 66, 2351-2355.

Le Moullac, G., & Haffner, P. 2000. Environmental Factors Affecting Immune Responses in Crustacea. Aquaculture, 191(1-3), 121-13.

Lee JN Lee DY, In Hye J., Gi-Eun K., and Kim HN. 2001. Purification of soluble β-Glucan With-enhancing immune activity from the cell wall of yearst. Bioscience Biotecnology and Biochemistry.

LIinuma, M, H. Tosa, T. Tanaka, F. Asai, Y. Kobayashi, R. Shimano and KI. Miyauchi, 1996. Antibacterial activity of xanthones from guttiferaeous plants against methicillin resistant Staphylococcus aureus. Journal of Pharmacy and Pharmacology 48(8):861-865.

Malina, A.C.T. CpG oligodeoxynucleotides Stimulates the immune system Of Common Carp (Cyprinus carpio L). A Disertation Submited to The United Graduated School of Agriculture Sciences. Kagoshima University. Miyazaki. Japan.

Mardawati, E., C.S. Achyar, dan H. Marta. 2008. Kajian Aktifitas Antioksidan Ekstrak Kulit Manggis (Garcinia mangostana) dalam Rangka Pemanfaatan Limbah Kulit Manggis di Kecamatan Puspahiang Kabupaten Tasikmalaya Laporan Akhir Penelitian Peneliti Muda (LITMUD). Lembaga Penelitian Universitas Padjajaran (UNPAD). Bandung. 29 hal.

Melviani. 2010. Efek Antibakteri Alfa Mangostin Dan Kombinasinya Dengan Beberapa Antibiotik Terhadap Staphylococcus Aureus Multiresisten. Surakarta.

Moosophin K., Wetthaisong T., Seeratchakot L., and W. Kokluecha. 2010. Tannin Extraction from Mangosteen Peel for Protein Precipitation in Wine. KKU Res J 15 (5): May.Thailand.

Noguchi,N dan Niki, E. 1999. Chemistry of active Oxygen Spesies and Antioxsidant, diet, nutrition and health. Edited by Papas A M. CRC Press Boca Roton. London. New York. Washinton DC.

Ooi, V.E.C. and F. Liu, 2000. Immunomodulation and Anti-Cancer Activity of Polysaccharida-Protein Complexes, Current Medicinal Chemistry.

Panase, A, Piyanuch, N, Nalin W, Thitiporn,L, and Jiraporn, R. 2012. 2nd International Conference on Chemical, Biological and Environment Sciences. In Bali.

58

Putri, D.N. 2007. Keterkaitan Antara Pemupukan N, P, K terhadap Kadar Xanthon Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.). Skripsi. Prog Studi Agronomi Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Raa JG, Rorstad G, Engstad R, Robertson B. 1990. The use of immunostimulants to increase resistance of aquatic organisms to microbial infections. In: Diseases in Asian Aquaculture. M. Shariff, RP. Subasinghe, JR. Arthur (Eds). Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Phillippine. Vol. 1, pp.1992; 39-50.

Raa, J., 1996. The Use of Immunostimulatory Substances in Fish and Shellfish Farming. Reviews in Fisheries Science, 4(3), 229-288. CRC Press.

Raa, J., Rørstad, G., Engstad, R., Robertsen, B., 1992. The use of immunostimulants to increase resistance of aquatic organisms to microbial infections. In: Diseases in Asian Aquaculture.

Rantetondok, A. 2002. Pengaruh Imunostimulan -Glucan dan Lipopolisakarida terhadap respon imun dan sintasan udang windu. (Penaeus monodon Fab) Disertasi. Program Pascasarjana. Universitas Hasanuddin. Makassar.

Rantetondok, A. 2011. Penyakit dan Parasit Budidaya Udang/Ikan dan Pengendaliannya. Brilian Internasional. Surabaya. 132 hal.

Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. ITB : Bandung.

Salasia, S.I.O. 1998. Sifat Adhesive dan fagositosis Steptococus equi Sub Sp Zooepidemicus Isolat Indonesia. Jurnal sains Veteriner. 16:42-50pp.

Soosean, C. K. Marimuthu, S.Sudhakaran dan R. Xavier. 2010. Effect of Mangosteen (Garcinia mangostana L) extract as a feed additive on growth and hematological parameters og African catfish (Clarias geripeneus) Fingerlings. Europian Review for Medical and Pharmacological Science; 14:605-611pp.

Stepp, J.R. and D.E. Moerman. 2001. The importance of weeds in ethno-pharmacology. Journal of Ethnopharmacology 75: 19-23.

Subowo. 2007. Immunobiologi. Penerbit Angkasa. Bandung.

Sukamat dan Ersam, T. 2006. Dua Senyawa Xanton Dari Kayu Batang Mundu Garcinia Dulcis (Roxb.) Kurz. Sebagai Antioksidan. ITS, Surabaya.

59

Suksamrarn, S., Suwannapoch, N., Phakhodee, W., Thanuhiranlert, J., Ratananukul, P., Chimnoi, N., and Suksamrarn, A. 2003, Antimycobacterial Activity of Prenylated Xanthones from the Fruit of Garcinia mangostana, Chem. Pherm. Bull, 51 (7), 857-859 (Gentianaceae), Drukkerij Elinkwijk bv, Utrecht, pp 109 –114.

Susanto, H. 1988. Membuat Kolam Ikan. Penebar Swadaya. Jakarta. 85 hal.

Syakuri, H., Triyanto dan K.H. Niitimulyo. 2003. Perbedaan Daya Tahan Non Spesifik Lima Spesies Ikan Air Tawar Terhadap Infeksi Aeromonas hydrophila. Jurnal Perikanan Universitas Gadjah Mada Vol V (2): hal 1-10.

Tambunan, R. M., 1998. Telaah Kandungan dan Aktivitas Antimikroba Kulit Buah Manggis (Garcinia Mangostana L.). Thesis Magister Farmasi, Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, ITB, Bandung, pp 1- 4.

Tompo, A., M. Atmotmarsono, M.I. 2007. Laporan Teknis Hasil Penelitian. Riset Budidaya Udang Windu. Balai Riset Perikanan Perikanan Budidaya Air Payau Maros.

Tumar. 2006. Pengaruh Pemberian Ekstrak Jinten Hitam sebagai Imunostimulan terhadap Hematologi Ikan Lele Dumbo. Prosiding Seminar nasional II Penyakit Ikan dan Udang. Balai Penelitian Perikanan Air Tawar. Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Hal 116 – 122.

Triyanto. 1990. Patogenitas Beberapa Isolat Aeromonas hydrophila Terhadap Ikan Lele (Clarias batracus L). Prosiding Seminar nasional II Penyakit Ikan dan Udang. Balai Penelitian Perikanan Air Tawar, Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Hal 116-122.

Uksamranr S, Komutib O, Ratanukul P, C Himnol N, Lartpornmmatuleen, Sukamranr. 2006. A. Cytotoxic prenylated xanthones from the young fruit of Garcinia mangostana. Chem Pharm Bull. 54: 301-305.

Wibowo S, dan Yunizal. 1998. Penanganan Ikan Segar. Instalasi Penelitian Perikanan Laut Slipi. Balai Penelitian Perikanan Laut. Jakarta: Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan

60

Wu, D dan Medani, S.N. 1999. Antioxidant and Immmune Function, Diet Nutrition and Health.Edited by Papas A.M. CRC Press Boca Roton. London. New York. Washington DC.

Wulansari. 2009. Pengaruh Ekstrak Air dan Ethanol Alpinia spp terhadap aktifitas dan Kapasitas Fagositosis Sel Macrophage yang Diinduksi dari Bakteri Stapilococcus Epidermis Secara In Vitro. Pusat Penelitian Biologi LIPI. Bogor.

Yuwono, T. 2008. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta.