Risa/ah Peltemuan //miah Penelilian dan Pengembangan Tekn%gi /salop dan RadiaSl; 2tXXJ

PENGGUNAAN METODE RADIOASSAYTEKNIK FASE PADAT DALAMREAKSI FIKSASI a-KaURA TOKSIN TERHADAP RESEPTOR

KOLINERGIKj

Nurlaila Z.

Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknik Nuklir-BA TAN, Bandung

ABSTRAK

PENGGUNAAN METODE RADIOASSAY TEKNIK FASE PADAT DALAM REAKSI FIKSASIa-KOBRA TOKSIN TERHADAP RESEPTOR KOLINERGIK. a-Kobratoksin merupakan suatu proteinyang terkandung dalam bisa ular Naja naja kaouthia. Bila masuk ke daIam tubuh akan terflksasi pada reseptorkolinergik sehingga mengakibatkan terjadinya kelumpuhan pada otot serta pernafasan. Penentuan gugus aktifdalam fiksasi ini dapat dilakukan dengan metode radioassay menggunakan teknik penyaringan berdasarkanreaksi kompetisi antara a-kobratoksin yang dimodifikasi pada gugus tertentu dengan a-kobratoksin bertandaradioaktif. Selain itu, gugus aktif tersebut dapat ditentukan juga dengan metode radioassay teknik rase padatmenggunakan reseptor kolinergik yang disalut pada lubang plat ELISA. Telah dilakukan penentuan kondisioptimal metode radioassay dengan teknik rase padat daIam reaksi fiksasi a-kobratoksin terhadap reseptorkolinergik menggunakan a-kobratoksu1 bertanda tritium rH-a-kobratoksin). Kondisi reaksi fiksasi optimaldicapai pada penggunaan 20 flg reseptor kolinergikyang disalut pada lubang plat ELISA dengan radioaktivitasantara 5,0.104 hingga 7,5.104 cpm dan waktu inkubasi minimal 4 jam pada temperatur kamar. Reaksi kompetisiantara ~-a-kobratoksin dan a-kobratoksin terhadap reseptor kolinergik memberikan harga kompetisi inhibisi(ICso) sebesar 6,50.10-9 M. Pengujian metode ini menggunakan derivat (N.-asetil-lisin-23)a-kobratoksinmenunjukkan bahwa senyawa tersebut terinhibisi untuk terfiksasi pada reseptor kolinergik dengan ICso = 9,50.10-9 M. Dari percobaan diperoleh bahwa metode ini dapat digunakan untuk menentukan gugus aktif suatu toksin,

yang berfungsi dalam reaksi fiksasi pada reseptor kolinergik.

ABSTRACT

USING OF SOLID PHASE RADIOASSAY MEnlOD IN THE FIXAllON REACTION OF a-COBRA TOXIN TO CHOliNERGIC RESEPTOR. a-cobratoxin is a protein tl1at is in the snake venom ofNaja naja kaouthia. If, it enter into the body, would be fixed specifically to the cholinergic receptor, causingmuscle and breathing paralyze. Determination of functional groups in this fixation could be accomplish byfiltration radioassay method with labelled radioactive a-cobratoxin. Beside that, the functional groups in thisfixation could be determined by solidPl1ase raaJoassay method. The determination of optimum condition of a-cobratoxin fixation to cholinergic receptor with labeled tritium a-cobratoxin (3H-a-cobratoxin) using this methodhas been carried out. Optimum condition of fixation was reached at 20 J:tg of cholinergic receptor coated on theELISA plat with ~-a-cobratoxin activity range 5.0 104 to 7.5 104 cpm and 4 hours of minimum time incubationat room temperature. Competitive reaction betweell ~-a-cobratoxin and a-cobratoxin to the cholinergic receptorgave 6.50 10-9 M of the 50% of inhibition competitive value (ICso) Evaluation of this method using (N.-acetyl-lysin-23)a-cobratoxin derivative showed tl1at the compound was inhibited in the fixation to cholinergic receptorwith IC5o = 9.50 10-9 M. From this experiment was obtained that this method could be used to determine theactive group of the toxin which function in the fixation reaction to cholinergic receptor.

PENDAHULUAN enzyme immunoassay. Cara yang paling seringdigunakan adalah metode filtrasi menggunakan penmutradioaktif berdasarkan reaksi kompetisi antaraneurotoksin yang dimodifikasi pacta gugus tertentudengan penmut yang digunakan dimana modifikasi kimiagugus tertentu suatu neurotoksin dapat mempengaruhiaktivitas biologik neurotoksin tersebut. Adanya reaksiyang spesifik antara neurotoksin dengan reseptorkolinergik serta besamya molekul senyawa reseptormembran mengakibatkan basil ikatan kedua senyawatersebut dapat dipisahkan dari pereaksi lainnya dengancara penyaringan.

Dalam metode ini, penyaringan untuk satu seripengerjaan memerlukan waktu yang cukup lama, selainitu, volume pereaksi yang digunakan relatif besar dirnanavolume akhir larutan ::!: 1,2 mi. Untuk itu dikembangkan

a-Kobratoksin yang dikenal dengan toksin 3adalall suatu neurotoksin yang terkandung di dalam bisaular jenis Naja naja kaouthia. Senyawa ini merupakansuatu protein yang sangat toksik yang terdiri dari 71asam amino dengan 5 jembatan disulfur (Gambar 1) [1].Bila terkena gigitan ular, bisa ular tersebut masuk kedalam tubuh daD akan terfiksasi pada reseptor kolinergikyang terdapat pada membran post sinaptik sehinggamenghambat neurotransnutter pada junction sarafmotorik d.m otot, yang mengakibatkan terjadinyakelumpuhan pada otot serta pernafasan [2].

Beberapa metode dapat digunakan untukmengetallui gugus yang berfungsi dalam reaksi fiksasiterhadap reseptor kolinergik antara lain radioassay daD

45

Risalah Pertemuan "miah Penelitian dan Pengembangan feknologi lsotop dan Radias~ llXJO

Nunc Irnmuno type Maxisorb serra alat penunjang

lainnya.

TATA KERJA

metode altematif yaitu metode radioassay dengan teknikCase padat. Dalam metode ini digunakan juga isotopradioaktif sebagai perunut daD sebagai Case padat adalahreseptor kolinergik dalam jumlah tertentu yang disalutpacta lubang plat ELISA, daD volume akhir per lubangplat ELISA relatif kecil yaitu 250 ~l.

Dalam penelitian ini, dilakukan penentuan kondisioptimal teknik tersebut untuk senyawa a-kobratoksindengan memvariasi beberapa parameter antara lainjumlah reseptor kolinergik yang disalut pacta lubang platELISA, jurnlah perunut radioaktif 3H-a-kobratoksin danwaktu inkubasi. Selain itu, dilakukan pula reaksikompetisi antara a-kobratoksin dan derivatnya dengan3H-a-kobratoksin terlmdap reseptor kolinergik tersebutpacta kondisi optimal yang diperoleh dari percobaan diatas.

Penentuan jumlah optimal reseptor kolinergik yangdisalut pada plat ELISA

Penyalutao plat ELISA dengan reseptor kolinergikdilakukan dengan memodifikasi metode Nilson [4].

Ke dalam lubang plat ELISA dari kolom 3 sampaidengan 12 dimasukkan 100 Ililarutao reseptor kolinergikdalam dapar reseptor (dapar fosfat 0,1M, pH 7,4; BSA0,1%) denganjumlah yang bervariasi untuk setiap lubang(0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 50 ~g). Plat diinkubasi selamaminimal 8 jam pacta temperatur 4 DC, kemudian dicucidengan dapar pencuci (dapar fosfat 0,1M, pH 7,4).Selanjutnya dijenuhkan dengan penambahan 250 IIIlarutao BSA 0,3% dalam dapar fosfat O,IM, pH 7,4(termasuk kolom 2 yang dipakai sebagai blanko atauuntuk penentuan ikatan non spesifik) dan diinkubasiselama minimum 6 jam pacta temperatur 4 DC. PlatELISA yang telah disalut dengan reseptor kolinergik,dicuci beberapa kali dengan dapar pencuci, kemudian kedalam masing-lnasing lubang ditambahkan 200 III 3H-a-kobratoksin dengan radioaktivitas :t 105 cpm dandiinkubasi selama minimal 8 jam pacta temperatur 4 DC.Plat dicuci kembali, kemudian ditambahkan 250 ~larutan NaOH 0,05M daD dinkubasi selama 2 jam pactatemperatur kamar. Selanjutnya larutao NaOH tersebutdicacah mengglli)akan pencacah sintilasi cair denganbantuan aqualuma. Secara paralel dilakukan jugapenentuan fiksasi non spesifik dimana selainditambahkan larutao 3H-a-kobratoksin pacta masing-masing lubang, ditambahkan juga larutao a-kobratoksindalam jumlah berlebih (200 kali) terhadap 3H-a-kobratoksin.

Gambar 1. Struktur primer a-kobratoksin Naja "ajakaouthia

Keterangan ..A (alanin), C ( sistein), F (fenilalanin), G ( glisin), H(lustidin), I (isoleusin), K (lisin), L (leusin), H(asparagin), P (prolin), Q (glutaInin), R (arginin), S(serin), T (treonin), V (valin), W (triptofan), Y (tirosin)

Penentuan radioaktivitas optimal 3H-a.-kobratoksindalam reaksi fiksasi terhadap reseptor kolinergikyang disalut pad a plat ELISA

Plat ELISA yang telah disalut dengan reseptorkolinergik dengan jumlah optimal seperti yang diperolehpada percobaan di atas, dicuci beberapa kali dengaodapar pencuci. Pada masing-masing lubang ditambahkan200 ~ larutao 3H-a.-kobratoksin dengan aktivitas yangbervariasi dan diinkubasi selama minimal 8 jam padatemperatur 4 °c. Pengerjaao selanjutnya dilakukanseperti di atas tennasuk juga penentuan fiksasi nonspesifik.

Penelitian ini dimaksudkan untuk memperolehkondisi optimal metode radioa.~say tekIrik rase padat,yang dapat digunakan untuk menentukan gugus aktifsuatu toksin dalam reaksi biologiknya terhadap reseptorkolinergik.

BAHAN DAN PERALATANPenentuan waktu inkubasi 3H-a.-kobratoksinterfiksasi pada reseptor kolinergik

Lubang plat ELISA yang telah disalut denganjumlah optimal reseptor kolinergik, dicuci beberapa kalidengan dapar pencuci. Kemudian ke dalarn lubangtersebut ditarnbahkan 200 ~ larutao 3H-o.-kobratoksindengan radioaktivitas optimal clan plat diinkubasi denganwaktu yang bervariasi. Pengerjaan selanjutnya dilakukanseperti di atas terrnasuk juga penentuan fiksasi nonspesifik.

a-kobratoksin dan derivatnya (N.-asetil-lisin-23)a-kobratoksin, 3H-a-kobra-toksin, reseptor kolinergikdaTi organ elektrik Torpedo marmorata diperoleh dariLIP-Commisariat l'Energy d' Atomic, Perancis. BovineSerum Albmnin (BSA) dari Fluka, Aqualmna, sertapereaksi-pereaksi lain dengan kualitas untuk analisisbuatan E.Merck dan Prolabo.

Alat yang digunakan aIuara lain pencacah sintilasicair, spektrometer UV-VIS model Cary 210, plat ELISA

46

Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Teknologi lsotop dan Radias~ Z()(XJ

Reaksi kompetisi JH-<x-kobratoksin pada reseptorkolinergik dengan adanya a-kobratoksin daDde rivatn y a (N &-aseti I-Ii sin- 23 )a-kob ratoksin

Lubang plat ELISA yang telall disalut denganjumlall optilnal reseptor kolinergik, dicuci dengan daparpencuci. Pada masing-lnasing lubang ditambahkanberturut-turut 100 ~l a-kobratoksin atau derivatnya (N&-asetil-lisin-23)a-kobratoksin dengan konsentrasi yangbervariasi serta 100 ~ 3H-a.-kobratoksin denganradioaktivitas optimal seperti yang diperoleh padapercobaan di alas, kemudian diinkubasi pada temperaturkamar selama 4 jam (kondisi optimal). Setelah dicucidengan dapar pencuci, pada masing-masing lubangditambahkan 250 ~llarutan NaOH O,05M dan diinkubasiselama 2 jam pada temperatur kamar, selanjutnya dicacahmenggunakan pencacall sintilasi cair dengan bantuanaqualurna.

Gambar 2. Penentuan jumlah optimal reseptor kolinergikyang disalut pada lubang plat ELISA dalamreaksi fiksasi dengan Ju-{X-kobratoksin.

BASIL DAN PEMBAHASAN belurn cukup untuk bereaksi dengan seluroh reseptoryang ada. Pemakaian 3H-a-kobratoksin denganradioaktivitas yang lebih tinggi rnernberikan basil yangrelatif konstan, karena jumlah tersebut rnelebihi jurnlahreseptor kolinergik yang ada dimana kelebihan tersebutakan ikut terbuang pada tahap pencucian.

Gambar 3. Penentuan radioaktivitas optimal Ju-a-kobratoksin dalam reaksi fiksasi terhadapreseptor kolinergjk (20 ~) yang disalut padalubang plat EliSA

Penentuan waktu inkubasi 3H-o.-kobratoksinterfiksasi pada reseptor kolinergik dapat dilihat padaGambar 4. Hasil percobaan menunjukkan bahwaradioaktivitas 3H-a-kobratoksin yang optimal telahdiperoleh dengan waktu inkubasi selama 4 jam,perpanjangan waktu inkubasi memberikan basil yangrelatif konstan. Hal ini berarti bahwa reaksi fiksasi 3H -a-kobratoksin pada reseptor kolinergik telah sempurnapada waktu tersebut dimana semua reseptor yang disalut

3pada lubang plat ELISA telah bereaksi dengan H-a-kobratoksin.

Untuk mengetalmi gugus-gugus yang memegangperanan penting dalarn aktivitas biologik suatuneurotoksin dapat dilakukan dengan beberapa metodeantara lain radioac\"say dengan teknik penyaringanmenggunakan perunut radioaktif, Enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA) dan lain-lain berdasarkansuatu reaksi kompetisi antara neurotoksin yangdimodifikasi pacta gugus tertentu dengan perunut yangdigunakan terbadap reseptor kolinergik.

Dalmn penelitian ini dikembangkan suatu metodedengan prinsip yang sanm seperti radioassay tetapimenggunakan plat ELISA yang disalut dengan reseptorkolinergik sebagai media rase padat dimana penyalutandilakukan dengan prinsip adsorpsi. Penarnbahan larutanNaOH pacta lubang plat ELISA setelah reaksi selesaidimaksudkan untuk melepaskan basil reaksi daripennukaan plat ELISA yang kemudian dicacallmenggunakan sintilasi cair dengan bantuan aquaJuma.

Jumlah reseptor kolinergik yang digunakan untukmenyalut pennukaan lubang plat ELISA mernpakanparmneter penting dalmu metode ini. Gambar 2memperlilmtkan lmsil penentuan jmnlah optimal reseptorkolinergik. PengguIlaa11 sebmlyak 20 Ilg per lubang platELISA memberikml fiksasi 3H-a.-kobratoksin yangmaksimal, pemakaian dalmn jmnlall yang lebih kecil danlebih besar dati jumlall tersebut memberikan fiksasi yangrendah. Dari Imsil pengujian ini dapat dijelaskan bahwapemakaian reseptor dengan jumlall yang lebih kecil dari20 Ilg bel urn cukup lmtuk menyalut seluruh pennukaanlubang plat ELISA.

Pacta percobaan penentuan radioaktivitas optimal3H-a.-kobratoksin, dapat diketalmi jmnlah optilnal 3H-a.-kobratoksin yang terfiksasi pacta reseptor kolinergik(radioaktivitas spesifik 3H-a.-kobratoksin 80 Ci/mmoleatau I pmole = 64 103 cpm). Hasil percobaan penentuan

radioaktivitas optitnal 3H-a.-kobratoksin menggunakanreseptor kolinergik sebesar 20 Ilg ditarnpilkan pactaGambar 3. Penggunaan 3H-a.-kobratoksin denganradioaktivitas antara 2,5 103 hingga 5,0 103 memberikanhasil yang terns meningkat di mana jumlah tersebut

47

Risalah Pertemuan Ilmiah Penelilian dan Pengemhangan Teknologi IsOlop dan Radias~ 2000

dapat mengubah struktur molekul a.-kobratoksinsehingga akan mempengaruhi afinitasnya untuk terfiksasipada reseptor kolinergik terlihat dengan meningkatnyaharga IC5o senyawa tersebut (9,50 10-9 M).

10

KESIMPULAN

0

Kondisi optimal metode radioassay teknik rasepactat untuk {X-kobratoksin dicapai pacta penggunaan 20f.lg reseptor kolinergik yang disalut pacta lubang platELISA dengan radioaktivitas 3H-<x-kobratoksin antara5,0 104 hingga 7,5 104 cpm dan waktu inkubasi minimal4 jam pacta temperatur karnar.

Metode radioassay teknik rase padat ctapatdigunakan untuk menentukan afmitas gugus amino yangberperan dalam reaksi fiksasi pacta reseptor kolinergikserta dapat digunakan untuk menentukan gugus aktifsuatu toksin, yang berfungsi dalam aktivitas biologiknyauntuk terfiksasi pacta reseptor tersebut.

Gambar 4. Penentuan waktu inkubasi ~-<x-kobratoksin(7,5 104 cpm) terfiksasi pada reseptorkolinergik (20 ~g) yang disalut pada lubangplat ELISA.

UCAPAN TERIMA KASm

Penulis mengucapkan terima kasih kepadaDr.A.Menez, Kepala Laboratoriurn Service de Biochimiedes Proteines -LIP, Centre d'Etudes Nucleaire,Commissariat L , Energie Atomique, Saclay, Perancis,

alas izin yang diberikan untuk dapat bekerja pactalaboratoriurn yang dipimpinnya. Ucapan terima kasihkarni sampaikan pula kepada Dr.M.Leonetti yang telahbanyak memberikan saran daD komentar sehinggaterlaksananya penelitian ini.

DAFTARPUSTAKAGambar 5. Reaksi kompetisi a-kobratoksin daD

derivatnya N.-asetil-lisin-23-<1-kobratoksindengan ~-<1-kobratoksin pada reseptorkolinergik. -0- (a-kobratoksin), -8-- (N.-asetil-1 is in- 23-<1-kob ratoksin)

KARLSSON, E. Handbook of ExperimentalPharmacology, ed. Lec, C.Y., Springer Verlag,Berlin, in Snake Venom, (1979), 52, 159 -212.

2. HUCHO, F. The Nicotinic Acetylcholine Receptorand It's Ion Channel, Em. J. Biochem. 158,(1986) 211 -226.Untuk mengetahui ballwa kondisi optilnal yang

diperoleh dari percobaan di atas dapat digunakan untlIkmenentukan gugus aktif a.-kobratoksin, maka dilakukanreaksi kompetisi antara 3H-a.-kobratoksin daD a.-kobratoksin serta derivatnya dalmn berbagai konsentrasi.Derivat a.-kobratoksin yang digunakan adalah a.-kobratoksin yang dimodifikasi secara kimia pacta guguslisin-23 dalam bentuk asetil yaitu N,,-asetil-lisin-23-a.-kobratoksin. Dari percobaan diperoleh bahwa harga ICsoa.-kobratoksin adalall sebesar 6,50 10.9 M dilnana hargaini mendekati harga ICso a.-kobratoksin yang diperolehdari metode radioassay dengan teknik filtrasi ataupenyaringan (ICso = 5,50 10.9 M) [5]. Percobaan

menggunakan derivat N,,-asetil-lisin-23-a.-kobratoksinmemmjukkan bahwa senyawa tersebut terinhibisi dalamreaksi fiksasi terlmdap reseptor kolinergik (Gambar 5).Gugus lisin-23 dari a.-kobratoksin mempakan gugus aktifyang berfungsi dalmn reaksi fiksasi terhadap reseptorkolinergik [5]. Modifikasi kilnia gugus amino tersebut

3. LENTZ, T.L.and WILSON, P.T. Neurotoxin Bindingsite on the Acetylcholine Receptor, Int. Rev.Neurobiol. 29, (1988) 117 -160.

4. NILSON, B. YORCK, L. AKERSTROM, B. EnzymeLinked lmmunosorbent Assay Using AlkalinePhosphatase Conjugated with StreptococcalProtein G., J. Immunoassay, 9 (2), (1988) 207-225.

5. CHARPENTIER I. Immunologie Moleculaire d'uneNeurotoxine Longue Postsynaptique : 1'0.-cobratoxine de Venin de Naja naja kaouthia,These de Doctorat de L 'Universite ReneDescartes de Paris, (1990) 28 -32.

VAN WEEMAN, B.K., SCHUURS, A.H.W.M.Immunoassay Using Antigen EnzymeConjugates, FEBS Lett., 15, (1971) 232 -236.

6.

48

'\

Risalah PertemlJan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan Teknologi Isolop dan Radias~ Z(XJ()

DISKUSI

SUDRADJAT ISKANDAR HENDIG WINARNO

Pada Corsi mana tritimn dilabelkan pada (X.-kobratoksin?

I. Dalarn menentukan gugus aktif suam toksin, apakahselain metode radioassay teknik rase padat acta jugateknik rase cair ?

2. Bila acta bagaimana ditinjau dari teknik rnaupunbiaya, apakall acta perbedaan dari kedua tekniktersebut ?

NURLAILA Z

NURLAILA Z

Tritiwn (3H) dilabelkan paa gugus Histidin yangterdapat pacta a-kobratoksin dengan 2 tahap :I. Iodinasi dengan I Cl, a-kobratoksin + I Cl ~ a-

kobratoksin -I (pada gugus histidin)2. Dehalogenasi katalitik dengan gas tritiwn aktif, a-

kobratoksin -I + 3H ~a-kobratoksin -3H.

I. Selain metode "radioassay" teknik rase padat,memang acta juga teknik rase cair dimana metodefiltrasi merupakan teknik rase cairo

2. Bila ditinjau daTi segi teknik pengerjaaJl teknikfasepadat relatif lebih mudall karena tidak perludilakukan penyaringall saul persatu. Bila ditinjau daTisegi biaya teknik rase padat relatif lebih murnh karenauntuk beberapa segi pengerjaan cukup digunakan,plat ELISA sedangkan bila metode filtrasi dipakaibanyak tabung reaksi.

49